Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Poistettu in maksasyövän 1 (DLC1) toimii tärkeänä RhoGTPase aktivoiva proteiini (RhoGAP) proteiini, joka päättyy aktiivinen RhoA signalointi ihmisen syövissä. Lisääntyvä todistusaineisto on osoittanut, että tuumoria tukahduttavan aktiivisuuden DLC1 riippuu paitsi RhoGAP toimintaa, vaan vetoaa myös asianmukainen polttovälin tarttuvuus lokalisoinnin kautta vuorovaikutuksessa tensin proteiinit. Viime aikoina on olemassa raportteja, jotka osoittavat, että DLC1 löytyy myös tumaan; kuitenkin, olemassaolo ja suhteellinen tuumoria tukahduttavan aktiivisuuden ydinvoiman DLC1 ole koskaan selvästi osoitettu.

Menetelmät ja tärkeimmät havainnot

Tässä tarjota uutta näyttöä, joka DLC1 proteiinia, jotka pääasiassa liittyvät paikallisessa tarttumisessa ja lokalisoitu sytosoliin, dynaamisesti edestakaisin välillä sytoplasman ja tuman. Solujen käsittely tumasta esto, Leptomycin B (LMB), säilytti DLC1 tumassa. Ymmärtää ydin- tulo DLC1 tunnistimme aminohapot 600-700 of DLC1 uutena alue, joka on tärkeä sen tumaanohjaussignaali. Kasvain tukahduttava aktiivisuus ydin- DLC1 määritettiin suoraan käyttämällä tumalokalisaatiosignaalin (NLS) fuusio variantti DLC1 (NLS-DLC1) etuuskohtelun tumaanohjaussignaali. In SMMC-7721 HCC-soluissa, ilmentyminen NLS-DLC1 ei tukahduttaa pesäkkeiden muodostumisen ja aktiini stressi kuidunmuodostukseen

in vitro

. Kumottujen tuumoria tukahduttavan aktiivisuuden ydin- DLC1 osoitettiin ensimmäistä kertaa

in vivo

mukaan ihon alle suonensisäisten p53

– /- RasV12 hepatoblasteja vakaat NLS-DLC1 ilmentymistä nude-hiirissä. Injektoitu hepatoblasteja kanssa NLS-DLC1 ilmaisun tehokkaasti muodostunut kasvaimia verrattuna kuin ydinenergian kohdistettuja DLC1.

Johtopäätökset /merkitys

Tutkimuksemme tunnistaneet uuden alueen vastaa ydinvoiman tulon DLC1 ja osoitti toiminnallinen ero DLC1 eri solun osiin sekä

in vitro

ja

in vivo

.

Citation: Chan LK, Ko FCF, Sze KM-F, Ng IO -L, Yam JWP (2011) Nuclear-Kohdennettu Poistettu in Maksasyöpä 1 (DLC1) ole yhtä tehokkaita näissä aiheuttaa sitä tuumoria tukahduttavan Activity Molemmat

in vitro

ja

in Vivo

. PLoS ONE 6 (9): e25547. doi: 10,1371 /journal.pone.0025547

Editor: Tšad Creighton, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 7. kesäkuuta, 2011; Hyväksytty: 06 syyskuu 2011; Julkaistu: 26 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Chan et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Hongkongin tutkimusapurahoja neuvoston (HKU7798 /07m), Hong Kong Research Grants neuvosto Collaborative Research Fund (HKU 1 /06C ja HKU 7 /CRG /09) ja Vuoden Nuori tutkija palkinnon (ja JWP Yam). I.O.L. Ng on Loke Yew professori Pathology. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

poistettu Liver Cancer 1 (DLC1) ensin kloonattiin vähentävän hybridisaation kuin geenifragmentti, joka usein poistettu ihmisen maksasolusyövän (HCC) [1]. Kertyvät todisteita viime vuosikymmenen aikana on tukenut tätä DLC1 on ali-ilmentynyt erilaisissa ihmisen syövissä lisäksi HCC [2], [3], [4], [5], [6], [7]. Palauttaminen DLC1 mukaan kohdunulkoisen ilmentyminen soluissa, joilla on alhainen tai olematon endogeeninen ilmentyminen DLC1 hidastaa solujen lisääntymistä, indusoi apoptoosin, hidastaa solujen liikkumista ja hajoaa aktiinisytoskeletonver- rakenne

in vitro

[8], [9], [10 ]. Toisaalta DLC1 knockdown edistää kasvainten synnyssä on Myc ajettu

in vivo

hiiri hepatokarsinogeneesin malli, jossa on p53-tyhjä tausta [11]. Luonne usein patologinen ali DLC1 ja vankka kokeellisen kasvaimen tukahduttava aktiivisuus sekä tukevat voimakkaasti DLC1 toimii

bona fide

kasvaimia estävä.

tuumoria tukahduttavan aktiivisuuden DLC1 on tiukasti sidoksissa sen luontainen RhoGAP toimintaa, joka alas-säätelee Rho välittämän biologisen vasteen. DLC1 on havaittu olevan RhoA-, B-, C- ja Cdc42-spesifinen [12], [13]. Fokaalisen adheesion lokalisointi vuorovaikutuksen kautta tensin perheen proteiini on yksi ominaisuuksista DLC1 ja liittyy toiminnallisesti sen tuumoria tukahduttavan aktiivisuuden. Tätä tukevat todisteet, jotka DLC1 mutantti ehjät RhoGAP domain mutta ei kohdistaa paikallisiin tarttumisiin näytteillä kasvun hidastumista tukahduttava aktiivisuus

in vitro

[10], [14]. Koska fokaalisen adheesion kohdistaminen sivustoja DLC1 päällekkäisyyttä tensin proteiinin sitoutumiskohtaa, on hyväksytty se, että DLC1 parit tensin ja toimii tuumoria tukahduttavan monimutkainen päättämisestä fokaalisen adheesion liittyvä Rho toimintaa [10], [14], [15 ].

Tuoreessa tutkimuksessa on ehdottanut perusteollisuuden jäämien rikas aihe DLC1 muistuttava Maanmittauslaitoksen [16]. Lisäksi on ehdotettu, että seriini /treoniini-proteiinikinaasin D fosforyloi DLC1 luoda 14-3-3 telakointi päällä. Kompleksimuodostuksesta 14-3-3 sequesters DLC1 sytoplasmassa ja pysähtyy sen ydin- tulo [17]. Kuitenkin olemassaolo ja sääntelyn ydin- DLC1 ole perusteellisesti tutkittu. Mikä tärkeintä, suhteellisen tuumoria tukahduttavan aktiivisuuden ydin- DLC1 ei ole koskaan osoitettu suoraan. Tässä tutkimuksessa olemme antaneet täydelliset todisteet DLC1 proteiini jatkuvasti sukkulat välillä sytoplasmassa ja tumassa. Olemme suorittaneet ensimmäisen toiminnallisen kuvauksen ydin- kohdennettuja DLC1 tutkia sen perus- ja tuumoria tukahduttavan aktiivisuuden sekä

in vitro

ja

in vivo

. Tutkimalla solunosasijaintia eri DLC1 mutantteja, olemme tunnistaneet uuden alueen sisällä RhoGAP verkkotunnus, joka on tärkeä ja riittää tämän ydinvoiman tuonnin.

Tulokset

DLC1 sukkuloi välillä sytoplasmassa ja tumassa

Expression of Myc-merkityn DLC1 (Myc-DLC1) in SMMC-7721 solut paljasti sen olemassaolon paikallisessa tarttumisessa, soluliman ja tuman (Fig. 1A). Kvantitatiivinen tarkastelu DLC1 ilmentymisen soluissa osoitti määräävää sytoplasman lokalisoinnin kanssa pistemäinen fokaalisen adheesion kuvio solussa reuna. Tutkia liikkeen DLC1 välillä sytoplasmassa ja tumassa, Myc-DLC1 lokalisointi soluissa tutkittiin soluissa, joita käsiteltiin exportin esto, LMB. Hoito LMB johtanut ydinvoiman säilyttäminen Myc-DLC1 in SMMC-7721 ja BEL7402 soluja (Fig. 1 B,

vasen paneeli

). Erityisesti fokaalisen adheesion lokalisoitu DLC1 havaittiin vielä, syyllistämättä vain ei-fokaalisen adheesion lokalisoitu DLC1 oli edestakaisin ja säilytetty tumassa. Cellular fraktiointi edelleen tukevat läsnäolo DLC1 ydinvoiman osa solulysaatin (Fig. 1 B,

oikea paneeli

). Samanlainen havainto saatiin GFP-merkityn DLC1 (GFP-DLC1) (tuloksia ei ole esitetty). Dynaaminen liikkuvuus DLC1 havaittiin alle peruuttaminen LMB eri ajankohtina (Fig. 1 C). Re-kuviointi sytoplasman ja fokaalisen adheesion oli tapahtunut 24 tunnin kuluessa. Olemme laajentaneet tutkimuksen tutkimalla lokalisoinnin endogeenisen DLC1 erilaisissa solulinjoissa. Subsellulaariset Hep3B-, HLE ja SK-HEP1 solujen seurasi immunoblottauksella käyttämällä DLC1-spesifistä vasta-ainetta tukee läsnäolo DLC1 tumassa (Fig. 1 D). Immunofluoresenssimenetelmällä endogeenisen DLC1 SK-HEP1 soluista osoittivat samanlaisia ​​solunosasijaintia sytoplasmassa ja tumassa (kuvio. 1 E). Johdonmukaisesti, endogeeninen DLC1 vuonna Hep3B säilyi tumassa jälkeen LMB hoidon (Fig. 1 F). Tukevan käsitystä, että DLC1 sukkulat välillä sytoplasmassa ja tumassa alle fysiologista tilaa, suoritimme immunohistokemia vastaan ​​DLC1 on ihmisen ei-neoplastisia maksan (Kuva. 1G). Positiivinen DLC1 värjäytymistä havaittiin sekä sytoplasmassa ja tumassa, mikä tukee edelleen, että DLC1 on läsnä tumassa.

(A) SMMC-7721-soluja transfektoitiin ohimenevästi Myc-merkityn DLC1. DLC1 visualisoitiin anti-Myc-vasta-ainetta ja sen jälkeen FITC: hen konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta. Tuma vastavärjättiin DAPI. Solunosasijaintia rakenteessa DLC1 241 DLC1 transfektoitujen solujen laskettiin ja luokitellaan ryhmään A-E esitetyllä. (B) SMMC-7721 ja BEL7402 soluja transfektoitiin ohimenevästi Myc-merkityn DLC1 ja alistettiin LMB käsittely ja sen jälkeen immunofluoresenssivärjäyksen anti-Myc-vasta-aineen (

vasen paneeli

). Transfektoidut solut fraktioitiin soluliman ja ydinvoiman osuudet seurasi immunoblottaus vastaan ​​Myc eksogeenisen DLC1, tubuliinia (sytoplasminen markkeri), LaminB ja c-jun (ydinvoima merkki) (

oikea paneeli

). (C) SMMC-7721-soluja transfektoitiin ohimenevästi Myc-merkityn DLC1, minkä jälkeen LMB käsittely 6 tuntia. Sen jälkeen LMB hoito (joka nimettiin t = 0), soluja viljeltiin tuoreella kasvualustalla ja kiinnitettiin osoitetussa ajankohtana. Eksogeeninen DLC1 visualisoitiin anti-Myc-vasta-ainetta. (D) Hep3B, HLE soluja ja SK-HEP1 solut fraktioitiin soluliman ja ydinvoiman osuudet seurasi immunoblottaus käyttämällä vasta-aineita endogeenisen DLC1, tubuliinin, LaminB ja c-kesäkuu (E) Endogeeninen DLC1 SK-HEP1 solut visualisoitiin polyklonaalinen anti-DLC1 vasta-ainetta, jota seurasi FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta. Palvella negatiivisena kontrollina, SMMC-7721-soluilla ilman DLC1 ilmentyminen värjättiin polycloncal anti-DLC1 vasta-aine. DLC1 vasta-aine voi tunnistaa vain signaali SMMC-7721-solujen eksogeenisen DLC1 yliekspressioon mutta ei ei-transfektoiduista soluista. (F) Hep3B-soluja käsiteltiin LMB 6 tuntia. Endogeeninen DLC1 jälkeen visualisoitiin polyklonaalinen anti-DLC1 vasta-ainetta, jota seurasi FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta. (G) Osa ihmisen ei-neoplastisia maksasta immunovärjättiin DLC1 (Brown). Tumat vastavärjättiin hematoksyliinillä (Blue). Soluja, jotka osoittivat positiivista ydin- DLC1 värjäystä osoitettu yhtenäisellä otsikkona nuolet. Solun tumassa osoittaa negatiivista DLC1 värjäytyminen oli merkitty ajattelematon nuolia. Mitta-asteikko: 10 um.

DLC1 600-700 jäämiä yhteistyötä NLS säätelyssä DLC1 ydinvoiman tulon

Proteiinit suuren molekyylikoon omaavat ydinvoiman liikenteen signaalit aktiivisen liikenteen poikki ydinvoiman kirjekuori tuella ydinvoiman liikenteen monimutkainen. On ehdotettu, että monopartite NLS (423-431) [17] ja kahdenvälistä NLS (415-431) [16] ovat läsnä DLC1 jotka helpottavat ydinvoiman tulon DLC1. Kiinnittämään erityistä huomiota lokalisoinnin DLC1 ilman ehdotettua Maanmittauslaitoksen kun LMB hoito, rakensimme DLC1Δ415-431 mutantti nimenomaan puuttuu ehdotettu NLS (Fig. S1A ja S1B). Expression of DLC1Δ415-431 in SMMC-7721 solut osoittivat samat solunosasijaintia kuin villityypin DLC1. Yllättäen DLC1Δ415-431 oli edelleen herkkä LMB hoitoon ja säilyi tumassa yhtä tehokkaasti kuin villityypin DLC1 (Fig. S1C). On myös raportoitu, että fosforylaatio seriinillä 431 (S431) ja DLC1 proteiinikinaasi D (PKD) [17] helpottaa välistä sitoutumista DLC1 ja 14-3-3-proteiinien, mikä estää ydin- pääsyn DLC1. Olemme kuitenkin havainneet, että DLC1 S431 fosfo-viallisen mutantin, S431A osoittivat samanlaisia ​​aste ydinvoiman säilyttäminen jälkeen LMB hoidon (Fig. S1D). Yhdessä emme voineet tarjota riittävää näyttöä tukemaan toiminnallisuus ehdotetun Maanmittauslaitoksen sekä roolia S431 fosforylaation säätelyssä ydinvoiman kuljetusta DLC1.

epäilivät, lukuun ottamatta ydin- kohdistaminen motiivi ehdotettu jota muut, ylimääräinen alue DLC1 on mukana ydinvoiman lokalisoinnin DLC1. Tilanteen korjaamiseksi, me kloonattu ja ilmennetty GFP-DLC1 häviämämutantit ja tutkittiin niiden lokalisointi jälkeen LMB hoidon HeLa-soluissa (kuvio. 2A). Huomasimme, että DLC1 Δ292-646 sisäinen häviämämutantilla osoitti merkittävää vähentämistä tumaanohjaussignaali upon LMB hoitoon (Fig. 2B ja 2C). Toisaalta, ydin- säilyttäminen DLC1 1-807 C-terminaalinen deleetio mutantti ei vaikuttanut verrattuna villityypin DLC1 kun LMB hoitoon. Mielenkiintoista, 1-807 mutantti joka sisälsi ehdotetun fokaalisen adheesion kohdistaminen alue (alue 200-500) [18] ei voida tehokkaasti kohdistettu paikallisia tarttumista ja hajanaisesti ilmaistu sytoplasmassa.

(A) esittävä kaavio rakennetta villityypin DLC1 (DLC1 WT) ja sen deleetiomutanttien (Δ292-646 ja 1-807). (B) HeLa-soluja transfektoitiin ohimenevästi GFP-merkityn DLC1 ekspressiorakenteet luetellut (A), minkä jälkeen LMB hoitoon. Paikallisessa tarttumisessa vastavärjättiin anti-vinkuliini vasta-aine. Sijainti solussa on DLC1 kirjattiin laskemalla vähintään 100 transfektoiduista soluista näytettä kohti. (C) Pylväsgrafiikka yhteenveto solunosasijaintia DLC1 ja sen mutanttien (B) kanssa tai ilman LMB hoitoa. Tulokset edustavat kaksoiskappale kahdessa riippumattomassa kokeessa. Prosenttiosuudet fokaalisen adheesion positiivisen DLC1 yksittäisissä ryhmässä korostettiin myös.

On ehdotettu, että N-terminaalista aluetta DLC1 säätelee negatiivisesti sen ydin- tulo [16]. Useita mahdollisia tumasta signaali (NES) on kartoitettu klo 62-71, 764-773 ja 792-801 jäämiä DLC1 mukaan

in silico

hakuun (Fig. S2A). Tärkeys Näiden signaalisekvensseinä säätelemällä sytoplasman sijaintia arvioitiin sitten immunofluoresenssilla. Toimivuus NES at 764-773 ja 792-801 tähteitä poissuljettu sytoplasmisen ilmaus 1-291 ja 1-400-mutantteja (kuvio. S2B). Koska 609-stop ja 648-839 mutanttien tehostunut ydinvoiman lokalisointi, rooli NES klo 62-71 tähteiden analysoitiin edelleen luomalla DLC1 Δ62-71 mutantti. Tämä DLC1 mutantti osoitti ominainen polttovälin tarttuvuus lokalisointi samanlainen villityypin, osoittamatta mitään lisäystä ydinvoiman säilyttäminen (Fig. S2B). Selventää puuttuminen ydinvoiman säilyttäminen ei ollut vahvan fokaalisen adheesion yhdistys, DLC1 1-807Δ62-71, mutantti ei lokalisoida pesäkekohdissa kiinnikkeistä ilmaistiin. Kuitenkin, tämä mutantti havaittiin myös olla pääasiassa paikallistaa sytoplasmaan. Yhdessä huomasimme, että poistaminen ennustettu NES N-päähän DLC1 ei vaikuta sen nucleocytoplasmic jakelu.

jälkeen esiin ydin- kohdistettu alueen keskialueen DLC1, teimme ensimmäinen yksityiskohtainen lokalisointi analyysi paneelin GFP-DLC1 mutantteja (Fig. 3A). Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että ilmentyminen 350-807 mutantti osoitti hallitseva tumaanohjaussignaali. Vastaavia näkyvä tumaanohjaussignaali havaittiin Myc-DLC1 291-807 (tuloksia ei ole esitetty). Tutkiminen 600-807 mutantti osoittivat samanlaisia ​​ydinvoiman lokalisointi, kun taas 700-807 mutantti lokalisoitu sekä sytoplasmassa ja tumassa HeLa-soluissa (kuvio. 3B ja 3C). Lisääntynyt ydinvoiman lokalisointi 600-807 mutantti tukivat myös vahvin DLC1 ilmaisua tumafraktios- saatu biokemiallisia fraktiointi määrityksessä verrattuna muihin DLC1 mutantteja (Fig. 3d). Yhdessä olemme huomanneet, että DLC1 alue 600-700 on RhoGAP domain oli mukana ydinalan tulo DLC1.

(A) Kaavamainen piirros esittäen rakennetta paneelin DLC1 fragmenttien lopetetaan aminohapon 807 ja sarjan DLC1 sisäisen deleetion mutantit kartoittamiseksi avain ydin- kohdistaminen päällä. Rakenteet Villityypin DLC1 ja Δ292-646 myös listattu vertailua. (B) HeLa-soluja transfektoitiin ohimenevästi GFP-merkityn DLC1 ekspressiorakenteita ilmoitettu. Paikallisessa tarttumisessa vastavärjättiin anti-vinkuliini vasta-aine. Sijainti solussa on DLC1 kirjattiin laskemalla vähintään 100 transfektoiduista soluista näytettä kohti. (C) Pylväsdiagrammi yhteenveto prosenttiosuus solujen soluliman ja ydinvoiman lokalisointi DLC1 ja sen mutanttien (B). Tulokset edustavat kaksoiskappale kahdessa riippumattomassa kokeessa. (D) HeLa-soluja transfektoitiin ohimenevästi ilmoitetuilla GFP-merkityn DLC1 ekspressiorakenteiksi seuraa subsellulaarifraktiointikokeet. Fraktioitu sytoplasminen ja ydin- lysaatit altistettiin immunoblottaus vasta-aineita GFP, tubuliinin (sytoplasminen merkkiaine) ja c-jun (ydin-markkeri). (E) HeLa-soluja transfektoitiin ohimenevästi ilmoitetuilla GFP-merkityn DLC1 ekspressiorakenteita, jonka jälkeen LMB hoitoon. (E) Pylväsdiagrammi yhteenveto prosenttiosuus solujen soluliman ja ydinvoiman lokalisointi DLC1 ja sen mutanttien (D). Tulokset edustavat kaksoiskappale kahdessa riippumattomassa kokeessa. Mitta-asteikko: 10 um.

varmistamiseksi edelleen, että on tärkeää tämän uuden alueen, Poistimme alue 601-689 in DLC1 ja arvioi sen lokalisointi. Mielenkiintoista, löysimme vähentynyt selvästi ydinvoiman lokalisoinnin DLC1Δ601-689 mutantti jälkeen LMB hoidon (Fig. 3E ja 3F). Mistä osoituksena Δ415-431Δ601-689 mutantti, jossa aiemmin raportoitu Maanmittauslaitoksen ja meidän kartoitettu sivuston poistettiin, poistamista 415-431 ei supistettua ydinvoiman säilyttäminen paljon jälkeen LMB hoidon. Tuloksemme ehdotti, että kartoitettu uuteen kohtaan on merkittävä rooli kohdistamisessa DLC1 tumaan.

Nuclear DLC1 menettänyt estoaktiivisuus tukahduttamaan pesäkkeiden muodostumiseen ja aktiinin stressi kuidunmuodostukseen

in vitro

Toistaiseksi ei ole tutkimus, jossa arvioidaan suoran toiminnallisen yhdistyksen välillä ydinvoiman lokalisointi ja biologisen toiminnan DLC1. Mitata toimintakykyä ydin- DLC1

in vitro

loimme ja vahvisti ilmaus ydin- kohdennettua DLC1 (NLS-DLC1) (Fig. 4A ja 4B). Immunofluoresenssilla, olemme vahvistaneet, että NLS-DLC1 on pääasiassa tumassa in SMMC-7721-soluja. NLS-driven DLC1 RhoGAP mutantti, NLS-K714E voitaisiin myös kohdentaa tumaan yhtä tehokkaasti kuin villityypin DLC1 (Fig. 4C). Sitten tutkittiin eheys aktiini stressin kuitujen SMMC-7721 solut transfektoitiin väliaikaisesti näiden mutantit. Toisin kuin purkaminen aktiini stressin kuitujen DLC1 transfektoiduissa soluissa, NLS-DLC1 voitiin vain osittain tukahduttaa aktiini stressisäikeiden muodostumista (Kuva. 4D). Negatiivisena kontrollina solut transfektoitiin DLC1 K714E näytetään ehjä aktiini rasitukseen liittyviä säikeitä. Samanlaisia ​​malli havaittiin soluissa, jotka ilmentävät NLS-K714E tukee edelleen, että ydin- kohdistusjärjestelmä ei aiheuttanut epäspesifistä vaikutusta aktiini stressisäikeiden muodostumista. RhoGAP aktiivisuus DLC1 on osoitettu olevan tiukasti liittyy sen kasvua suppressoivaa aktiivisuutta. Sitten suoritetaan pesäkemuodostusta arvioida

in vitro

kasvua suppressoivaa aktiivisuutta NLS-DLC1 sekä SMMC-7721 ja HeLa-soluissa (tietoja ei ole esitetty). Mukaisesti vaikutus stressisäikeiden muodostumiseen, NLS-DLC1 osoitti pitkälti kasvu vähenee tukahduttava aktiivisuus verrattuna DLC1 (Fig. 4E) Kun yhdessä, huomasimme, että ydinvoiman DLC1 menetetty kyky tukahduttaa solujen kasvua.

( A) Kaavamainen piirros, joka esittää rakennetta ydin- kohdennettujen DLC1 (NLS-DLC1), jota käytetään tilapäisen ilmentymisen koe. DNA-sekvenssi, joka koodaa monopartite NLS, joka koostuu viidestä emäksisiä aminohappoja KKKRK insertoitiin eteen avoimen lukukehyksen Myc-merkityn DLC1. Käännös manipuloitu ekspressiokonstruktin koodataan Myc-merkityn NLS-DLC1. (B) HEK293T lysaatteja ilmentynyt Myc-merkityn DLC1 tai NLS-DLC1 immunoblotattiin anti-Myc-vasta-ainetta. (C) SMMC-7721-soluja transfektoitiin ohimenevästi ilmoitetuilla villityypin DLC1 tai RhoGAP mutantti (K714E) konstrukteja. Myc-merkitty proteiini visualisoitiin anti-Myc-vasta-ainetta ja sen jälkeen FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta. Sijainti solussa on DLC1 kirjattiin laskemalla vähintään 100 transfektoituja soluja kutakin näytettä. Pylväsgrafiikka ilmaisee prosenttiosuuden soluista ydin- DLC1 värjäystä. Tulokset edustavat kaksoiskappale kahdessa riippumattomassa kokeessa. (D) SMMC-7721-soluja transfektoitiin ohimenevästi ilmoitetuilla Myc-merkityn DLC1 rakentaa ja aktiini stressiä kuidut värjättiin TRITC-konjugoidun phalloidin 1 tunnin kuluttua seerumin induktioon. Tähti (*) merkitsee DLC1-transfektoiduissa soluissa. (E) Pylväsdiagrammi, joka osoittaa suhteellisen pesäkkeiden muodostumisen tehokkuutta SMMC-7721-solut on transfektoitu ilmaistuilla DLC1 rakentaa ja pEGFP-C1-vektori, jossa neomysiiniresistenssigeeni on 10:01 suhteessa. Transfektoidut solut valittiin G418 2 viikkoa. Pesäkkeet muodostuvat visualisoitiin kristalliviolettivärjäys- värjäys ja määrällisesti. Keskimääräinen ero ilmoitetaan ryhmän havaittiin olevan tilastollisesti merkitseviä (***

P

0,005; parittomia

t

-testi). Mitta-asteikko: 10 um.

Nuclear DLC1 ei tukahduttaa

in vivo

kasvainten muodostumiseen

arvioimiseksi tuumoria tukahduttavan aktiivisuuden ydin- DLC1

in vivo

teimme stabiili retrovirus-ilmentyminen ydin- kohdennettujen Myc-merkityn hiiren DLC1 p53 null hiiri hepatoblasteja stitutiivisella RasV12 aktivointi [11]. DLC1 on kohdennettu tumaan lisäämällä tandem-toisto kolme monopartite NLSs (NLS3) edessä aloituskodonin hiiren DLC1 retroviraalisessa ekspressiokonstruktin (Fig. 5A). Kun valinta on puromysiini, resistentit kloonit laajennettiin ja yli 95%: resistentit kloonit havaittiin olevan GFP-positiivisten, vahvistaa suuri retroviruksen transduktion tehokkuutta (kuvio. 5B). Olemme myös vahvisti onnistunut ydin- kohdentaminen hiiren DLC1 immunofluoresenssilla värjäystä NLS3-DLC1 fuusioproteiinin. Olemme havainneet, että yli 90% NLS3-DLC1 transdusoidut solut osoittivat tuman värjäytymisen verrattuna sytoplasman värjäytyminen DLC1 transdusoidut solut. Tausta värjäys anti-Myc-vasta-aine oli tuskin havaittavissa vektori-soluissa (kuvio. 5B). Olemme edelleen vahvistaneet ilmentymistason DLC1 proteiinien immunoblottaus (Fig. 5C). Edelleen vahvistaa, että omaisuutta nucleocytoplasmic shuttling säilytettiin meidän DLC1 yliekspressoivat hepatoblast malli, käsittelimme DLC1 ilmentävien solujen kanssa LMB, jonka jälkeen immunofluoresenssilla. Huomasimme, että hoito LMB voisi johdonmukaisesti säilyttää DLC1 tumassa (kuvio. 5D). Tämä havainto tukee lisäksi, että nucleocytoplasmic shuttling omaisuus säilytettiin ihmisen ja hiiren DLC1 ortologeihin.

in vivo

kasvainten muodostumiseen näitä stabiileja klooneja tutkittiin ihon alle nude-hiirissä. Johdonmukaisesti, DLC1 näytteillä tukahduttaminen vaikutusta kasvaimen muodostumiseen, kun taas ydinvoiman DLC1 osoittivat merkittävää vähenemistä tukahduttamaan kasvainten muodostumiseen

in vivo

(Fig. 5E ja 5F).

(A) kaaviokuva retroviruksen vektoreita käytetään ajaa stabiilin ilmentymisen Myc-merkityn hiiren DLC1 ja ydinvoima kohdistetun hiiri DLC1 (NLS3-DLC1). (B) hepatoblasteja tartunnan vektori, DLC1 tai NLS3-DLC1 retroviruksia kiinnitettiin ja ilmentymistä Myc-merkityn proteiini visualisoitiin anti-Myc-vasta sen jälkeen Texas Red-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineella. (C) lysaatit sairastuneiden hepatoblasteja vektori, DLC1 tai NLS3-DLC1 retroviruksia tehtiin immunoblottauksella käyttäen vasta-aineita Myc, DLC1 ja GFP. β-aktiini toimi latauskontrollina. (D) hepatoblasteja tartunnan DLC1 retrovirus alistettiin LMB hoitoon. Solut kiinnitettiin sitten ja lokalisoinnin Myc-merkityn DLC1 visualisoitiin anti-Myc-vasta-ainetta ja sen jälkeen Texas Red-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineella. Pylväsgrafiikka ilmaisee prosenttiosuuden soluista ydin- DLC1 värjäystä. Tulokset edustavat kaksoiskappale kahdessa riippumattomassa kokeessa. (E) tuumorigeenisyyden osoitetun retroviruksen transdusoidut hepatoblasteja arvioitiin ihon alle paljaisiin hiiriin injektio. 1 x 10

5 hepatoblasteja injektoitiin subkutaanisti päivinä 0 ja tilavuus kasvaimen koon tarkkailtiin päivittäin päivästä 4. Kaikki hiiret lopetettiin päivänä 14. Päivänä 14 hiiret lopetettiin ja tuumorit leikattiin irti. (F) leikellään kasvaimet punnittiin ja niiden massat kirjattiin. Mitta-asteikko: 10 um.

On raportoitu, että ektooppinen ekspressio DLC1 in DLC1 negatiiviset solut voivat aiheuttaa apoptoosin [19]. Sen testaamiseksi, NLS3-DLC1 esillä ero biologinen aktiivisuus apoptoosin indusoimisessa, loimme ja analysoitiin HEK293T-soluissa, jotka ekspressoivat stabiilisti ydin- DLC1 virtaussytometrialla varten subG1 solupopulaation (Fig. S3B). Jotta vältetään mahdolliset klonaalinen vaikutusta, kaksi kloonia kustakin ryhmästä poimittiin analyysiä varten. Olemme havainneet, että DLC1 ilmentävät solut osoittivat lisääntynyttä subG1 huippu verrattuna vektori ja NLS3-DLC1 ilmentäviä soluja. DLC1 ilmentävät solut osoittivat myös alennettua G1 mutta kasvoi S väestöstä (Fig. S3B). Uskottavaa selitystä tähän voisi olla, että DLC1 ilmentävät solut voivat viettää pidemmän aikaa S-vaiheessa, kun ne tulevat solusyklin. Nämä havainnot osoitti jälleen, että NLS3-DLC1 oli vähemmän kiinteää apoptoosin ja lieventävät solusyklin etenemisen verrattuna villityyppiin DLC1.

Keskustelu

In silico

sekvenssianalyysi on paljasti useita mahdollisia emäksisen aminohapon runsaasti kaksiosaisia ​​NLSs in DLC1 [16]. Läsnäolo nämä motiivit sai meidät kysyä DLC1 olemassa tumaproteiini. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että DLC1 oli proteiini jatkuvasti edestakaisin välillä sytoplasmassa ja tumassa eri solulinjoissa. Tämä havainto tarjoaa tasapainoisen selityksen läsnäolon ydin- DLC1 ja tukee sen luontainen sytoplasman lokalisointi osoituksena eri tutkimuksissa [10], [18], [20], [21], [22]. On huomionarvoista, että kun hoito LMB, fokaalisen adheesion lokalisoitu DLC1 oli vielä havaittavissa. Tämä havainto viittasi siihen, että ainoastaan ​​ei-spesifinen, sytoplasman DLC1 säilyi tumassa käsittelyn jälkeen. Focal tarttuvuus lokalisoitu DLC1 oli suhteellisen staattinen luonteeltaan. Tämä havainto on yhteensopiva osittainen tumavärjäystä havaittiin DLC1 fokaalisen adheesion lokalisointi viallisen mutantin, Y442F vuonna keuhkojen solu malli [10]. Vaikka positiivinen tumavärjäystä voisi löytyä normaalien ei-neoplastisia maksan immunohistokemiallisella värjäyksellä, olisi mielenkiintoista havaita, onko erotettavissa ero ydin- DLC1 värjäytymisen välillä normaalin maksakudosta ja DLC1-positiivisia HCCs (tai muu syöpätyyppeihin).

Vaikka läsnäolo ydin- DLC1 on aiemmin käsitelty, sen tuumoria tukahduttavan aktiivisuuden ydin ei ole selvästi osoitettu. Suoraan tutkimiseksi tuumoria tukahduttavan aktiivisuuden ydin- DLC1, me ohimenevästi tai pysyvästi ilmensivät NLS-DLC1 HCC solulinjoissa seuraa sarja toiminnallinen luonnehdinta. Käytimme tätä lähestymistapaa sijaan tutkimalla DLC1 mutantti, josta puuttuu kartoitettu ydin- kohdesignaalipeptidiin (600-700 jäännökset päällekkäin kanssa RhoGAP domain) kuten ennustimme, että poistamalla tämä signaali häiritsee sen luontainen RhoGAP toimintaa ja tehdä vertailu villityyppisen DLC1 mahdotonta . Myös pitkäaikainen LMB hoito tuottaa ydinvoiman DLC1 on epäsuotuisa ja se estää maailmanlaajuinen tumaproteiinin vienti ja aiheuttaa stressiä soluille [23]. Vaikka uusia toimia ydinaseiden DLC1 vielä tutkittava, olemme vahvistaneet, että NLS-DLC1 oli vähemmän tehokas tukahduttamaan solujen kasvua, hajottavia RhoA välittämä aktiini stressisäikeiden muodostumista, ja indusoimalla solukuolemaa

in vitro

. NLS-DLC1 oli myös vähemmän tehokas tukahduttamaan kasvaimen kasvua hiiren ksenograftimallissa. Me spekuloida ydinaseiden mislocalization voi olla mahdollinen mekanismi, jolla kumotaan DLC1 vaikutus ihmisen syövän ja ehjät DLC1 ilme.

Toiminnallisesti meidän havainnot ovat ristiriidassa sen päätelmän kanssa, jotka aikaisemmat raportit. Yuan et al. osoittivat tumaansiirtymiseen of DLC1 voivat aiheuttaa apoptoosin ja helpottaa sen tuumoria tukahduttavan funktion ekspressoida ohimenevästi DLC1 negatiivinen ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjassa malli [16]. Kuitenkin meidän vakaa ydin- DLC1 ilmaisun malli hiirellä hepatoblasteja ja ihmisen HEK293T solut eivät ole parantamisessa eikä asiakkuutta apoptoottista osapopulaation kuten virtaussytometrialla analyysi. Todennäköinen selitys sisältää lyhytaikaisen ilmentymisen tuottaa erittäin korkean DLC1, joka voi aiheuttaa toksisuutta soluille; kun taas meidän vakaa solujärjestelmällä voitu käsitellä jonkinlainen sopeutumisen aikana vakaa solun valinta, jonka avulla solut voidaan lisätä ilmentymisen kanssa ydinvoiman DLC1. Myös solutyypin ja solulinjan riippuvia vaikutuksia myötävaikuttaa ero DLC1 apoptoosin indusoiva aktiivisuus ja kasvun pysähtymisen on pidettävä [11], [16], [24]. Toisaalta, Scholz et ai on osoittanut, että DLC1 S327AS431A mutantti ei pysty monimutkainen 14-3-3-sytoplasmassa ja on biologisesti aktiivisempi kuin villityypin DLC1. Valitettavasti havaitsivat, että käyttöönotto negatiivisesti varautuneita tähteitä edellä mainitussa sivustoja ei voi jäljitellä konstitutiivisesti aktiivinen 14-3-3 sitoutumiskonformaation. Puute suotuisa mutantti estää arvion siitä, kuinka nämä 14-3-3 sitovia tähteitä vaikuttavat LMB herkkyyteen DLC1 [17]. Olettamalla DLC1 S327AS431A on vähemmän todennäköisesti olla eristetty sytoplasmassa, voidaan ennustaa, että tämä mutantti voidaan edestakaisin tumaan useammin. On kuitenkin tällä hetkellä tiedetä, onko hyperaktiivisuutta tämä mutantti on seurausta lisääntyneestä ydinvoiman merkinnän lyhyellä tai johtuu konformaation muutoksen, joka suosii DLC1 RhoGAP toiminto. On mahdollista, että lisääntynyt ydinvoiman tulo biologisen hyperaktiivinen DLC1 voi toimia negatiivisena sääntelymekanismin downregulate hyperaktiivinen DLC1 pitkällä aikavälillä.

Kaksi riippumattomissa tutkimuksissa on yritetty kartoittaa Maanmittauslaitoksen in DLC1 [16] , [17]. Yuan et al ehdottivat DLC1 415-431 on otaksuttu Maanmittauslaitoksen, kun taas Scholz et ai ehdotti, että DLC1 ydinvoiman kuljetus vaatii vain jälkipuoliskolla samassa paikassa johon jäännökset 428 ja 429. Kuitenkin olemme huomanneet, että DLC1 mutantti, josta puuttuu koko ehdotettu Maanmittauslaitoksen voitaisiin vielä saada tehokkaasti pysymään tumassa, mikä osoittaa, ylimääräinen rakenteellisia sekvenssi DLC1 voi olla mukana tässä ydinvoiman liikenteen. Ongelman teimme yksityiskohtainen solunosasijaintia tutkiminen GFP-DLC1 deleetiomutantteja. Huomasimme, että DLC1 Δ292-646 mutantti oli vähemmän LMB herkkä. Johdonmukaisesti, huomasimme, että ilmaus fragmentteja, jotka edustavat vain keskustan alueella DLC1 osoitti tumaanohjaussignaali. Havainto merkitsee sitä, että muutos molemmissa päissä DLC1 voi altistaa osia, jotka ajavat ydinvoiman lokalisoinnin DLC1. Näiden tietojen me edelleen ehdottaa ja osoittaa, että alueella 600-700 on RhoGAP verkkotunnus on tärkeää ohjata ydinvoiman lokalisoinnin DLC1.