Krooninen sairaus

tiivistelmä

On hyvin tunnettua, että B-1 B-solut ovat tärkeimmät solutyyppi, joka on vastuussa tuottamaan luonnollisia immunoglobuliini M (IgM ) ja voivat vastata infektio lisäämällä IgM eritystä. Olemme kuitenkin yllättäen havainneet, että jotkut epiteelisolujen voi myös ilmaista uudelleen järjestetyssä IgM transkriptio että on luonnollista IgM ominaisuuksia, kuten ituradan-koodattuja ja rajoitettu uudelleenjärjestelyn kuvioita. Tässä olemme tutkineet IgM ilmentymistä ihmisen ei-B-solujen ja totesi, että IgM ilmaistaan ​​usein monien ihmisen epiteelisyöpäsolujen sekä ei-syöpä epiteelisolujen. Lisäksi, CD79A ja CD79B, kaksi molekyyliä, jotka ovat fyysisesti yhdistetty kalvo-IgM pinnalla B-solujen muodostamiseksi B-soluantigeenireseptorin monimutkainen, myös ilmennetään solun pinnalla epiteelisyöpäsolujen ja joka sijaitsee yhdessä IgM. Kuten luonnollinen IgM, epiteelin syöpäsolujen johdettu IgM tunnustettu useita mikrobi-antigeenit, kuten yksijuosteisen DNA, kaksijuosteinen DNA, lipopolysakkaridi, ja HEp-2-solujen antigeenin. Tärkeämpää, stimulaatio tiemaksun kaltainen reseptori 9 (TLR9), joka jäljittelee bakteeri-infektio, lisäsi huomattavasti eritystä IgM ihmisen epiteelisyöpäsolujen. Nämä havainnot osoittavat, että ihmisen epiteelisyöpäsolujen sekä ei-syöpä epiteelisolujen voi spontaanisti tuottaa IgM luonnon aineaktiivi-.

Citation: Hu F, Zhang L, Zheng J, Zhao L, Huang J, Shao W , et ai. (2012) spontaani tuotanto immunoglobuliini m Human epiteelisyöpäsolujen. PLoS ONE 7 (12): e51423. doi: 10,1371 /journal.pone.0051423

Editor: Jonas Fuxe, Karolinska Institute, Ruotsi

vastaanotettu: 27 elokuu 2011; Hyväksytty: 07 marraskuu 2012; Julkaistu: 12 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Hu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia 30973389 ja 30772470 National Natural Science Foundation of China. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

on hyvin tunnettua, että klassinen koskemattomuus molekyyli, immunoglobuliini (Ig) on ​​keskeinen rooli immuunijärjestelmän [1]. Se voi liittää vieraisiin aineisiin kuten bakteerien ja auttaa niiden tuhoaminen [2]. Ig luultu on tuotettu vain B-lymfosyytit ja plasman soluja. Viime vuosikymmenen aikana, mutta tämä käsite on kyseenalaistettu joukko tutkimuksia [3], [4], [5], [6],. Vuonna 2003 raportoitiin ensimmäisen IgG ilmentymistä ihmisen epiteelisyöpäsolujen [3]. Sittemmin ryhmämme ja muut ovat vahvistaneet, että monet ihmisen ei-B-syöpäsoluja ja jotkut normaalit solut voivat tuottaa Ig, erityisesti IgG- tai IgA [4], [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Lisäksi nämä ei-B syöpäsolujen johdettu IgG tai IgA on mukana selviytymisen ja syöpäsolujen lisääntymistä [3], [4], [18]. Ilmaisulla IgM ihmisen ei-B-solujen harvoin tutkittu [8]. Viime aikoina olemme havainneet, että IgM- raskaan ketjun (Ig μ) geeni, jolla on erityistä ohjelmistoon litteroitiin ihmisen epiteelisyöpäsolujen [8], mikä viittaa siihen, että IgM voidaan myös ilmaista näissä epiteelisolujen linjaa soluja.

On kaksi luokkiin IgM, luonnon ja immuuni. Natural IgM on ajateltu valmistaa vain luontaisen kaltaisten B-1 B-solujen puuttuessa taudinaiheuttajan kohtaamisen, ja immuunijärjestelmän IgM tuotetaan sekä luontaisen kaltaisten B-1 B-solujen ja mukautuva B-2 B-soluissa antigeenin tai taudinaiheuttaja kohtaavat. Natural IgM- muodostaa suurimman osan koko kiertävän IgM. Suurin osa luonnon IgM on ituradan koodataan ja polyreactive, ja se sitoutuu heikolla affiniteetilla useisiin eri antigeenejä, kuten mikrobipatogeenejä, edistää varhainen immuniteetti ennen puhkeamista adaptiivisen humoraalisen vasteen ja pelaa keskeinen rooli varhaisessa mikrobilääkkeiden immuniteetti [19]. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset Zhou et al. osoittivat, että kaikki polyreactive luonnollisia IgM tuottavat antigeeniä sitovia B-solut ilmentävät B-1 B solupinnan (esim IgM

hi, IgD

lo, B220

lo, Mac-1

hi , CD23

lo ja CD5

hi) [20], mikä viittaa siihen, että sen lisäksi B-1 B-solujen, muut solutyypit voivat myös olla mukana tuottamaan luonnollisia IgM.

Toll-like reseptorit (TLR) ovat luokka proteiineja, jotka on perustavaa laatua oleva merkitys luonnollinen immuniteetti. He tunnistavat ”taudinaiheuttajista liittyvien molekyylitason kuvioita”, jotka ovat rakenteellisesti konservoituneita molekyylejä johdettu mikrobeista ja ovat erotettavissa isäntä molekyyleistä, ja aktivoi synnynnäisen immuunivasteen [21]. Yli 13 jäsentä TLR perheen on tunnistettu nisäkkäillä. TLR9 tunnustaa erityisesti metyloimattoman CpG-sekvenssit mikrobi-DNA [21], [22]. Synteettinen oligodeoksinukleotideja (ODN) metyloitumattomilla CpG-motiiveja, jotka voivat jäljitellä vaikutuksia mikrobien DNA, hyväksytään myös TLR9 [23], [24], [25], [26]. Aktivoinnin jälkeen TLR9 ja siihen liitettyjen sovittimien, kuten myelooinen erilaistumisen antigeeni 88 (MyD88) [27], [28], rekrytoida solunsisäinen signalointi välittäjäaineiden ja aiheuttaa aktivoitumista Nukleaaritekijä-KB (NF-KB) ja mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi reittejä, mikä johtaa sytokiinien ja Ig, pääasiassa IgM [29].

ihmisillä TLR9 ilmaistaan ​​edullisesti B-soluissa, plasmasolumaisten dendriittisolut, monosyytit, ja luonnollisten tappajasolujen [22]. Toiminnallinen TLR9 on myös monissa ihmisen epiteelisyöpäsolujen, kuten keuhkosyöpä, rintasyöpä ja eturauhassyöpä [30], [31], [32], [33], [34]. Vielä tärkeämpää, CpG ODN: ää, ja jopa ei-CpG-ODN, voi aktivoida TLR9 ilmaistuna rintasyövän solulinjoissa ja eturauhassyövän solulinjoissa, mikä lisää soluinvaasion [32], [33], [34]. Kun aktivoitu metyloimattoman CpG, TLR9 indusoi eritystä monien sytokiinien, kuten interleukiini (IL) -1α, IL-6 ja IL-8 [31], [35]. On vielä epäselvää, onko TLR9 on epiteelisyöpäsolujen voi välittää IgM ja erityksen.

Tässä tutkimuksessa arvioimme IgM ilmentymistä ihmisen ei-B-solujen, ja osoitti, että ihmisen epiteelisyöpäsolujen sekä ei- syöpä epiteelisolujen voi spontaanisti tuottaa luonnollista IgM. TLR9 agonistit stimuloi eritystä IgM ihmisen epiteelisyöpäsolujen. Kuten B-1 B soluperäisissä luonnollinen IgM, epiteelin syöpäsolujen johdettu IgM tunnustettu sarjan mikrobiantigeenien ja joitakin autoantigeenille. Nämä havainnot osoittavat, että ihmisen epiteelisyöpäsolujen sekä ei-syöpä epiteelisolujen voi spontaanisti tuottaa IgM luonnon aineaktiivi-.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kulttuurin

ihmisen kohdunkaulan syöpäsolu HeLa MR, joka on

O

6-metyyliguaniini-DNA metyylitransferaasi-puutosta johdannainen HeLa S3 [36], [37], [38], [39], [40 ], [41], oli lahja tri Shouping Ji (Academy of Military Medical Science, Peking, Kiina). Kaikki muut solulinjat, mukaan lukien ihmisen kohdunkaulan syövän solulinja HeLa, koolonsyöpäsolulinjoissa HT-29 ja SW480, maksasyöpä HepG2, luusarkoomasolulinjassa U-2 OS, sikiön munuaisen solulinjat 293 ja 293T, ja B-lymfosyyttinen leukemia cell Raji saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). HeLa MR, HT-29, SW480, HepG2, U-2 OS, 293 ja 293T-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% antibiootteja, kun taas HeLa ja Raji-soluja viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää ja 1% antibiootteja 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. Solut logaritmisessa kasvuvaiheessa käytettiin kokeissa.

Kudosnäytteiden

kudossiruina ostettiin patologian osaston, Beijing Friendship sairaala. Tutkimme kaikkiaan 202 näytettä, joka sisälsi 26 erilaista kasvaintyypit, 19 vastine näytteitä hyvänlaatuinen sairaus, ja normaaleissa kudoksissa. Leikataan 4-um: n leikkeiksi tuloksena multitumor kudosten microarray lohkot ja kiinnitetty kukin osio liima-päällystetty luisti (Instrumedics Inc., Hackensack, NJ, USA). Jäädytetyt syöpä kudoksiin, mukaan lukien rintasyöpä (2 tapausta), paksusuolen syöpä (2 tapausta), keuhkosyöpä (2 tapausta), ja munasarjasyöpä (1 tapaus) olivat kasvain kudosnäyte pankki Pekingin yliopiston Cancer sairaala. 4 um: n jää- leikkeitä valmistettiin ja kiinnitettiin asetonilla.

immunohistokemia

Tissue microarray osat poistettiin parafiini, vedettömät kautta etanolia pesee porrastettuja pitoisuuksia, sijoitetaan 10 mM sitraattipuskurilla (pH 6,0), ja sitten lämmitetään kahdesti mikroaaltouunissa 5 minuutin kukin. Levyjä inkuboitiin sitten 3% vetyperoksidia 5 minuuttia, pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja blokattiin PBS: ssä plus 10% normaalia vuohen seerumia 10 minuuttia. Jälkeen poistamalla ylimääräinen salpauspuskurilla, teimme epäsuora immunohistokemiallisella värjäyksellä monoklonaalisella hiiren anti-ihmis-Ig: μ (1:100, Dako, Carpinteria, CA, USA). Laseja inkuboitiin kosteutetussa kammiossa 37 ° C: ssa 45 minuutin ajan, pestiin perusteellisesti, ja sitten inkuboitiin vuohen anti-hiiri-IgG-piparjuuriperoksidaasi (HRP) (1:100, Dako) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Objektilasit pestiin jälleen, ja sitoutuneet vasta-aineet havaittiin käyttämällä 3,3′-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla (DAB, Dako). Ohjaus leikkeet värjättiin vuohen anti-hiiri-IgG-HRP yksin.

Immunofluoresenssivärjäys

Vahvista ilmentymisen IgM ihmisen epiteelisoluissa, kaksivärinen immunofluoresenssivärjäyksen suoritettiin jäädytetyn kudoksen diat . Lyhyesti, jäätynyt kudos levyt blokattiin 10% normaalia vuohen seerumia, ja sitten levyt inkuboitiin hiiren anti-ihmis-Ig: μ (Mabworks Biotech Co., Peking, Kiina) sekä kanin anti-ihmis-pan-sytokeratiini tai kanin anti-ihmisen CD19 (Santa Cruz, CA, USA) 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan, jonka jälkeen inkuboitiin TRITC-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG ja Alexa Fluor® 488-konjugoitua vuohen anti-kani-IgG: tä (Santa Cruz) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Sen jälkeen counterstaining kanssa Hoechst 33342, diat havaittiin suoraan käänteinen fluoresenssimikroskopiaan (Olympus IX71-141, Tokio, Japani).

Virtaussytometrianalyysi

Me tehdään virtaussytometria-analyysi arvioida ilmaus IgM ja TLR9 ihmisen epiteelisyöpäsolujen. Sillä IgM ja TLR9 solun pinnalla, solut kerättiin, pestiin kahdesti PBS: llä, blokattiin 2% FBS PBS: ssä 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan, värjättiin hiiren monoklonaalisia vasta-aineita (mAb) ihmisen Ig μ (Mabworks) tai TLR9 (IMG-305A, IMGENEX, San Diego, CA, USA) 4 ° C: ssa 40 minuutin ajan. Kahden pesun jälkeen PBS: llä, soluja inkuboitiin 100 ul: ssa PBS: ää, joka sisälsi fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) -konjugoitu vuohen anti-hiiri-IgG: tä (Santa Cruz) 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Solut pestiin kahdesti PBS: llä, ja 10000 Solut analysoitiin FACSCalibur-virtaussytometrillä käyttäen CellQuest-ohjelmaa (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA). Tausta-fluoresenssi määritettiin käyttäen soluja inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen, mutta ilman primaarista vasta-ainetta.

arvioida solunsisäisen IgM ja TLR9, korjatun solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä huoneen lämpötilassa 30 minuuttia, pestään PBS: llä ja läpäiseviksi kahdesti 1 x permeabilisointipuskuriin (eBioscience, San Diego, CA, USA). Sen jälkeen solut sentrifugoitiin 1500 rpm 4 ° C: ssa 5 minuutin ajan. Supernatantti heitettiin pois, ja solut leimattiin sopivilla ensimmäisen ja toisen vasta-aineita, kuten edellä on kuvattu.

Sen mahdollisuuden poissulkemiseksi, saastumisen syöpäsolulinjojen B-lymfosyyttien, solut kerättiin, pestiin kahdesti PBS: llä, blokattiin 2% FBS PBS: ssä 30 minuutin ajan, ja värjättiin monoklonaalisella anti-ihmisen CD19-fykoerytriini (PE) (Becton Dickinson) 4 ° C: ssa 40 minuutin ajan. Kahden pesun jälkeen solut arvioitiin CD19 ekspression FACSCalibur-virtaussytometrillä. CD19

+ Raji käytettiin positiivisena kontrollina. Tausta-fluoresenssi määritettiin käyttäen soluja inkuboitiin PE-konjugoidulla hiiren IgG: tä (Becton Dickinson).

käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) ja Reaaliaikainen PCR-analyysit

Kokonais-RNA uutettiin soluja tai kudosnäytteitä käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja käsiteltiin TURBO DNaasia (Ambion, Austin, TX, USA) poistamaan saastumista genomisen DNA: ta. Käänteistranskriptio suoritettiin RevertAid First Strand cDNA-synteesi kit (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Saatu cDNA altistettiin PCR: llä ja reaaliaikaisen PCR-analyysit.

PCR suoritettiin ekspression analysoimiseksi Ig μ, Ig κ, CD79A, CD79B, TLR9 ja MyD88 ihmisen epithelical syöpäsolulinjoissa (alukkeet esitetään Taulukko S1). PCR-tuotteet erotettiin geelielektroforeesilla 1% agaroosia. Identiteetin PCR-tuotteiden edelleen varmistettiin DNA-sekvensoinnilla.

Kaksivaiheinen reaaliaikainen PCR suoritettiin määrittää ilmaus IgM: n ja CD19 ihmisen epiteelin syövän kudoksissa käyttämällä SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti (alukkeet esitetään taulukossa S2). Reaktio ajetaan 7300 Fast Realtime PCR System (Applied Biosystems). Geenien ilmentyminen kvantifioitiin suhteellisen ilmaisemiseen housekeeping-geeni GAPDH, ja normalisoitu positiiviseen kontrolli (ihmisen perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa) tavanomaisilla 2

– △△ CT laskenta.

Protein Extraction ja Western Blot analyysi

uuttamiseksi soluliman proteiinien, korjatun solupelletit hajotettiin radioimmunosaostuskokeella (RIPA) lyysipuskuria (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA), ja inkuboitiin jäillä 30 minuutin ajan. Lysaatteja sentrifugoitiin 16000 rpm: ssä 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Supernatantit kerättiin Western blot-analyysi.

saamiseksi eritettyjen proteiinien, soluviljelmän supernatantti solujäte otettiin talteen, saostettiin yön yli 100% kylläistä ammoniumsulfaattia (01:01), ja sentrifugoitiin 16000 rpm: 20 minuuttia 4 ° C: ssa. Supernatantti heitettiin pois. Pelletti suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan PBS: ää, dialysoitiin kahdesti 0,05 M PBS: llä 24 tuntia, ja sitten käytetään Western blot -analyysi.

Western blot -analyysi suoritettiin käyttäen alennettua (ja β-merkaptoetanoli) ja ei-vähennetty ( ilman β-merkaptoetanoli) proteiini näytteitä, jotka erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (PAGE) ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Amersham Pharmacia, Little Chalfont, UK). Membraanit blokattiin Tris-puskuroidulla suolaliuoksella, joka sisälsi 0,1% Tween-20 ja 5% rasvatonta maitoa tai 5% naudan seerumin albumiinia (ilmaisemiseksi fosfopro-) huoneenlämpötilassa 2 tunnin ajan, ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla, kuten hiiren anti- ihmisen Ig μ mAb (Mabworks), vuohen anti-ihmis-Ig-p polyklonaalista vasta-ainetta (Sigma, St. Louis, MO, USA), hiiren anti-humaani CD79A ja CD79B mAb: t (Abcam, Cambridge, MA, USA), hiiren anti-humaani TLR9 mAb (IMGENEX), anti-fosfo-PKC-mAb, anti-fosfo-Akt-mAb, anti-fosfo-ERK mAb, anti-fosfo-IKB-mAb ja anti-IKB-mAb (kaikki Cell Signaling, Danvers, MA, USA ), kanin anti-ERK polyklonaalista vasta-ainetta (Kangcheng Biotech Co., Shanghai, Kiina), ja anti-aktiini mAb (Sigma), 4 ° C: ssa yön yli. Membraanit pestiin kolme kertaa Tris-puskuroidulla suolaliuoksella, joka sisälsi 0,1% Tween-20: ssa 10 minuutin ajan kutakin, ja inkuboitiin IRDye 800- tai 700-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (LI-COR Bioscience Inc., Lincoln, NE, USA) huoneen lämpötilassa pimeässä 1 tunnin ajan. Signaali havaittiin käyttäen Odyssey Imaging System (LI-COR Bioscience).

solunsisäisen kalsiumin Flux Measurement

mittaus solunsisäisen kalsiumin vuon suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [42]. Lyhyesti, HeLa MR soluja kasvatettiin erikoistunut lasipohjaisella mikrokaivo astiat (MatTek Corp., Ashland, MA, USA) ja ladattiin 5 uM Fluo-3 /AM HEPES-puskuroitua suolaliuosta 37 ° C: ssa pimeässä 30 minuutin ajan . Solut pestiin HEPES-puskuroitua suolaliuosta, ja niitä stimuloitiin 20 ng /ml vuohen anti-humaani-IgM: ää tai vuohen lgG: llä. Fluoresenssia seurattiin 488 nm: ssä (eksitaatio) ja 530 nm (emissio) käyttämällä Leica TCS-NT konfokaali- fluoresenssimikroskooppia (Leica MicroImaging, Mannheim, Saksa), jossa on 40 x öljyssä linssi (Wetzler, Heidelberg, Saksa). Kuvat otettiin 5 sekunnin viisi kertaa ennen stimulaatiota, ja 1,5 sekunnin välein 60 sekunnin ajan, sitten 5 sekunnin välein vielä 120 sekuntia. Mittaus toteutettiin huoneenlämmössä, ja kunkin kentän solujen valittiin satunnaisesti. Kuvat analysoitiin suhteellinen fluoresenssi käyttämällä Leican konfokaalista ohjelmistoa (Wetzler). Kaikki kalsiumvuomäärityksiä määritykset suoritettiin, kun läsnä oli ekstrasellulaarisen kalsiumin ja ilman EDTA tai EGTA määrityksessä puskureita. Näin ollen sekä solunsisäisen kalsiumin vapautuminen ja solun kalsiumin analysoitiin.

Cell hoito ODN Stimulation

HeLa MR-soluja viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, ennen kuin ODN stimulaatiota. Sitten väliaine vaihdettiin DMEM, jota oli täydennetty 2% FBS: ää, ja 10 ug /ml ärsyke, kuten fosforotioaatti-modifioidut ihmisen erityisiä CpG 2006 [5′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3 ’], ei-CpG-ODN ohjaa CpG 2078 [5’-TGCTGCTTCCCCCCCCCCCC-3 ’] ja GpC [5′-TGCTGCTTTTG TGCTTTTGTGC TT-3′], tai neutraloimalla CpG-N ODN208 [5’-TGCCGCGGCAGA-3 ’]) lisättiin kanssa tai ilman sitä 10 umol /l klorokiinia ( Sigma) 1 tunnin esi-inkuboinnin ennen ODN lisättiin. Jälkeen 3 päivää, solut kerättiin ja RT-PCR, virtaussytometrialla, ja Western blot-analyysi. Soluviljelysupernatantti myös kerättiin Western blot kuten edellä on kuvattu.

MyD88 pudotus määritys suoritettiin käyttäen syntetisoitiin MyD88 siRNA: t, kuten on kuvattu aiemmin [43]. SiRNA transfektoitiin HeLa MR solulinjaan elektroporaatiolla. Edellä mainittujen ärsyke (CpG 2006, CpG 2078, tai GpC) lisättiin soluviljelmään 24 tunnin kuluttua elecroporation, ja solut otettiin talteen sen jälkeen, kun toinen 3 päivää RT-PCR, virtaussytometrialla, ja Western blot -analyysit.

konfokaalimikroskopialla Analyysi

HeLa MR-soluja stimuloitiin tai ilman vuohen anti-ihmis-Ig-p polyklonaalista vasta-ainetta (20 ug /ml) 5 minuutin ajan, ja kahden värjättiin PerCP /Cy5.5-konjugoitua hiiren anti-humaani Ig μ (Biolegend, San Diego, CA, USA) ja FITC-konjugoitua hiiren anti-ihmis-CD79A (ABD SEROTEC, Kidlington, UK) tai FITC-konjugoitua hiiren anti-ihmis-Ig μ ja PE-konjugoidulla hiiren anti- ihmisen CD79B (eBioscience). Sitten solut tehtiin konfokaalimikroskopia analyysi, ja kuvat koottiin kanssa Axioskop-2 mikroskooppi (Olympus, Tokio, Japani), joka on 63 x NA 0,75 Plan Apochromat immersioöljyobjektiivilinssillä ja vakiosuodatinkierre sarjaa (Leica MicroImaging), joka on 1300 x 1030 pixel-jäähdytetty CCD-kenno kamera (CCD-1300-Y, Princeton Instruments, Trenton, NJ, USA), ja Metavue ohjelmistot (Visitron Systems, Puchheim, Saksa).

Analyysi Natural vasta-aktiivisuus epiteelisolujen Cancer Cell johdettu IgM

Sen analysoimiseksi, onko epiteelin syöpäsolujen johdettu IgM on luonnollinen vasta-aine tehoaa mikrobien antigeenejä, kuten yksijuosteisen DNA (ssDNA), kaksijuosteisen DNA: n (dsDNA) tai lipopolysakkaridin (LPS ), suoritimme antigeenispesifisen entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) käyttäen HeLa MR soluviljelmän supernatantti, joka sisältää IgM. Mikrotiitterilevyt päällystettiin 10 ug /ml ssDNA: ta, dsDNA, tai LPS: ää (kaikki Sigmalta). Hiiren anti-ihmis-Ig μ mAb ja HRP-leimattua vuohen anti-hiiri-IgG käytettiin havaitsemaan IgM, ja tetrametyylibentsidiiniä substraattina. OD450 mitattiin käyttäen mikrolevylukijaa (Bio-Tek, Winooski, VT, USA).

suoritettiin myös epäsuoralla immunofluoresenssilla värjäys analysoida autovasta-aktiivisuuden epiteelisolujen syöpä-soluista peräisin IgM. Inkuboimme Hep-2 cell dioja (EUROIMMUN, Lyypekki, Saksa), jossa HeLa MR soluviljelysupernatantilla sisältävien IgM. PBS-pesun jälkeen, hiiren anti-humaani Ig μ mAb ja FITC-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG käytettiin havaitsemaan positiivisen signaalin.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin tilastollinen ohjelmistot SAS versiossa 8,1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Erot eri ryhmien laskettiin Studentin

t

testillä tai chi-neliö testi. Erot katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, kun

P

oli 0,05.

Tulokset

IgM ilmentyy pääasiassa ihmisen epiteelisolujen

Analysoimme kudos microarray of 202 kudosnäytteiden IgM ilmaisun immunohistokemiallisesti, kuten syövän tai normaali kudoksissa epiteelin, mesenkymaalisten ja neuroglial alkuperä sekä sukusoluissa (taulukko S3). Olemme havainneet, että IgM ilmaistiin useammin epiteelisolujen, kuten 17 34 (50%) epiteelisyöpäsolujen, erityisesti keuhko-, rinta-, maksa-, ja haiman (kuvio 1A-D), ja 23 66 (34,8% ) ei-syöpä epiteelisolujen (kuvio 1 E, F). Sitä vastoin ei tai matalataajuista IgM löydettiin neoplastisten mesenkyymisolujen (1 47, [2,1%], kuten lipoma, fibroma, ja leiomyooma soluja [kuvio 1I]) ja normaaleissa mesenkyymisolujen (1 34, [2,9 %], kuten rasvasolujen, fibroblastit, ja sileän lihaksen soluissa). Mikään neuroglial solujen arvioidaan ilmaistaan ​​IgM (0 13, [0%]). On mielenkiintoista, että IgM: n ekspressio havaittiin korkeilla tasoilla seminooma soluissa ja joissakin normaaleissa sukusolujen kiveksissä (kuvio 1K, L). Kaksi tapausta T-solujen lymfooma ei ollut havaittavaa IgM ilme, odotetusti (kuva 1J). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ei-B-soluista peräisin IgM esiintyy pääasiassa epiteelisoluissa.

A, keuhkosyöpä solut; B, rintasyöpä solut; C, maksasyövän solut; D, haimasyövän soluja; E, munuaistiehyiden epiteelisolujen; F, endometrium epiteelisolujen; G, munuaistiehyiden epiteelisolujen, värjättiin vuohen anti-hiiri-IgG-HRP vain, negatiivisena kontrollina; H, kohdun limakalvon epiteelisolujen, värjättiin vuohen anti-hiiri-IgG-HRP vain, negatiivisena kontrollina; I, sileälihaskasvain solut; J, T-lymfoomasolut; K, seminooma solut; L, spermatosyyttejä.

edelleen vahvistaa, että IgM ilmaistaan ​​epiteelisyöpäsolujen mutta ei tunkeutunut B-solujen, kaksivärinen immunofluoresenssivärjäyksen suoritettiin jäällä epiteelin syövän kudoksen dioja, mukaan lukien paksusuolen syöpä , rintasyöpä, keuhkosyöpä ja munasarjasyövän, anti-IgM: n ja anti-pan-sytokeratiini-vasta-aineita. Kuten kuviossa 2A on esitetty, merkittävä co-localization paljastui bewteen IgM ja sytokeratiini; Vain harvat B-solujen tunkeutuminen havaittiin näissä kudoksissa osoituksena IgM- ja CD19 kaksinkertainen värjäys (Kuva S1). Lisäksi reaaliaikainen PCR-analyysi osoitti, että ei ollut mitään korrelaatiota IgM transkriptien ja B-solujen spesifisten kopioiden CD19 näissä kudoksissa, kun ne ilmaistaan ​​korkeammat IgM kuin ihmisen perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC: t), mutta ilmaistuna aika alemmilla tasoilla CD19 kuin PBMC: (kuvio 2B). Kaikki nämä tulokset viittaavat siihen, että IgM positiivinen signaali oli peräisin epiteelisyöpäsolujen.

, kolokalisaation ihmisen epiteelisyövissä IgM ja sytokeratiinia. Ihmisen epiteelin syövät, mukaan lukien paksusuolen syöpä, rintasyöpä, keuhkosyöpä ja munasarjasyövän, oli kaksinkertainen värjättiin anti-ihmis-IgM (punainen), anti-ihmis-pan-sytokeratiini (vihreä), ja Hoechest 33342 (sininen). Rinnakkaispaikantumisen IgM ja sytokeratiinia joutui (keltainen). Paksusuolen syöpä värjättiin TRITC-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG ja Alexa Fluor® 488-konjugoitua vuohen anti-kani-IgG: tä vain käytettiin negatiivisena kontrollina. B ei ollut korrelaatiota IgM transkriptien ja B-solujen erityisiä CD19-transkriptien ihmisen epiteelisyöpien. Ihmisen epiteelin syövät, mukaan lukien paksusuolen syöpä, rintasyöpä, keuhkosyöpä ja munasarjasyövän tehtiin qRT-PCR-analyysi IgM: n ja CD19 ilmentymisen. Ihmisen perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC) käytettiin positiivisena kontrollina IgM ja CD19 ilme.

IgM ilmentyy laajalti useissa ihmisen epiteelisyöpäsolujen Solulinjat

aiemmin löytäneet ilmentyminen monoklonaalisen, järjestää uudelleen Ig μ HeLa S3 ja HT-29-soluihin [8]. Sen määrittämiseksi, onko IgM laajasti ilmaistuna ei-B-solujen, erityisesti epiteelin syövän solulinjat, arvioimme ilmaus Ig μ ja Ig κ geenien ihmisen neljän epiteelin syöpäsolulinjoissa (kohdunkaulan syövän solulinjoissa HeLa ja HeLa MR, paksusuolen syöpäsolu linja SW480, ja maksan syöpä HepG2), yksi luusarkoomasolulinjassa (U-2 OS), ja kaksi ihmisalkion munuaissolulinjoissa (293 ja 293T) RT-PCR. Raji-soluja käytettiin positiivisena kontrollina. Tulokset paljastivat, että Ig μ ja Ig κ transkriptit havaittiin kaikissa näissä solulinjoissa (GenBank nro FJ197674, kuvio 3A). Sekvenssin analyysi paljasti, että Ig κ oli hallitseva Vκ4-1 /Jκ3 rekombinaatio kuvio (tuloksia ei ole esitetty).

, havaitseminen Ig μ ja Ig κ transkriptien useita syöpäsolulinjoissa semi-sisäkkäisiä RT PCR. HeLa ja HeLa MR, kohdunkaulan syövän solulinjoissa; SW480, koolonisyöpäsolulinja; U-2 OS, luusarkoomasolulinjassa; HepG2, maksasyöpä solulinja; 293 ja 293T, ihmisalkion munuaissolulinjoissa. Raji, ihmisen B lymfosyyttisen leukemian solulinjassa, positiivisena kontrollina; GAPDH, sisäistä valvontaa. B, virtaussytometria käyttäen hiiren anti-ihmis-Ig-μ-mAb osoittivat, että IgM paikallistettiin paitsi solukalvon mutta myös sytoplasmassa epiteelin syöpäsolujen, erityisesti HeLa MR-solut. Punainen viiva, isotyyppikontrollilla IgG1; Sininen linja, anti-ihminen IgM. C, Konfokaalimikroskopia analyysi HeLa MR soluihin käyttämällä hiiren anti-ihmis-Ig-μ-mAb osoittivat, että IgM oli läsnä sekä solukalvon ja sytoplasmassa. Hiiren IgG, isotyyppikontrollina. D, koko IgM havaittiin HeLa-MR-soluissa ei-pelkistävällä SDS-PAGE: lla (ilman β-merkaptoetanoli) ja Western blot vuohen anti-ihmis-Ig-p polyklonaalista vasta-ainetta. Human IgM, positiivisena kontrollina. E, IgM ekspressiota havaittiin HeLa MR-soluissa pelkistävällä SDS-PAGE: lla (jossa β-merkaptoetanoli) ja Western blot, jossa hiiren anti-ihmis-Ig-μ-mAb. Human IgM, positiivisena kontrollina; p-aktiini, sisäistä valvontaa. F, IgM havaittiin myös kulttuurin supernatantissa HeLa MR solujen vähentämällä SDS-PAGE ja Western blot käyttämällä hiiren anti-humaani Ig μ mAb. Human IgM, positiivisena kontrollina; Medium, negatiivisena kontrollina.

Virtaussytometria-analyysi osoitti, kalvomainen ja sytoplasmista ekspressiota IgM HeLa MR-soluissa, ja vähän tai ei lainkaan ekspressiota kalvo IgM alhainen ilmentyminen sytoplasman IgM HeLa ja HepG2-soluissa ( kuvio 3B). Sitten HeLa MR valittiin solun mallin lisäanalyysiä varten. Konfokaalimikroskopia vahvisti lokalisoinnin IgM olevan kalvon ja sytoplasmassa (kuvio 3C). Pelkistävissä ja ei-pelkistävissä Western blot analyysi paljasti ekspressiota IgM soluissa sekä soluviljelmän supernatantti (kuvio 3D-F).

Yhtenä tärkeimmistä valvontaa, olemme havainneet, että mitään syöpäsolulinjoissa arvioidaan ilmaistuna pinta-CD19 paitsi Raji solu, jota käytettiin positiivisena kontrollina (kuvio S2). Nämä havainnot sulje pois mahdollisuutta saastuminen syöpäsolun riviä B-lymfosyyttien.

Expression of BCR-kaltainen Complex in Human epiteelisyöpäsolujen

CD79A ja CD79B, kaksi B-solujen molekyylejä, ovat fyysisesti liittyy kalvomainen IgM pinnalla B-solujen, jotka muodostavat B-soluantigeenireseptorin (BCR) kompleksi. Puuttumaan onko CD79A ja CD79B myös liittyvät epiteelin syöpäsolujen johdettu IgM muodostaen BCR kaltainen monimutkainen, ensin analysoidaan jos nämä molekyylit voidaan ilmaista näiden solujen. RT-PCR: llä ja Western blot -analyysit, olemme osoittaneet, että ilmentyminen CD79A ja CD79B epiteelin syöpäsolujen (kuvio 4A, B). Käyttäen HeLa MR soluna malli, olemme edelleen vahvisti, että nämä molekyylit olivat yhteistyössä paikallistaa kalvomainen IgM (kuvio 4C). Vielä tärkeämpää, todettiin, että ennen stimulaatiota, BCR-like kompleksi jakautuu tasaisesti epiteelisyöpäsolujen. Stimulaation jälkeen, anti-IgM silloitettuja BCR kaltainen monimutkainen suurten ja pienten laikkuja (kuvio 4C) ja indusoi kasvu kalsiumin virtausta (kuvio 4D). Lisäksi BCR loppupään signalointireittien, fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) -Akt ja fosfolipaasi C (PLC) -γ2-PKC, aktivoitiin stimulaation jälkeen anti-ihmisen IgM (kuvio 4E). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että CD79A ja CD79B liittyvät kalvo IgM pinnalla epiteelisyöpäsolujen, muodostaen BCR-, kuten kompleksin, joka voi välittää signaaleja, jotka johtavat kasvuun ja eloonjääminen epiteelisyöpäsolujen.

A, RT-PCR osoitti, että CD79A ja CD79B havaittiin ihmisen syöpäsolulinjoissa, U-2 OS, HT-29, HeLa MR ja HeLa, ja että oli kaksi isoformia sekä CD79A ja CD79B. Raji, positiivisena kontrollina; GAPDH, sisäistä valvontaa. PCR-tuotteet erotettiin geelielektroforeesilla 1% agaroosia ja lisättiin edelleen varmistettiin DNA-sekvensoinnilla. B, Western blot-analyysi osoitti, että läsnä on suurempi isomuodon CD79A ja CD79B. p-aktiini, sisäistä valvontaa. C, konfokaalimikroskopia analyysi osoitti kolokalisaation (keltainen) CD79A (FITC, vihreä) ja Ig M (PerCP /Cy5.5, punainen) (ylempi kaksi paneelia), tai CD79B (PE, punainen) ja Ig M (FITC, vihreä) (alempi kaksi paneelia) HeLa MR-soluissa tai ilman stimulaatio anti-IgM. D, kalsiumvuomäärityksiä analyysi konfokaalimikroskopialla HeLa-MR-solut ladattiin Fluo-3 /AM ja stimuloitiin vuohen anti-humaani-IgM (a) tai vuohen IgG isotyyppiä controle (b). Kuvat otettiin stimulaation jälkeen 0, 1, 15, 30, 60, ja 150 sekuntia. Vastaava aika aikana kalsiumvuomäärityksiä on esitetty. Suhteellinen fluoresenssi kuvista arvioitiin Leica konfokaali ohjelmisto. Jokainen viiva edustaa signaalia, joka on peräisin yksittäisestä solusta. E, fosforylaatio PKC ja Akt alavirtaan PLC-γ2 ja PI3K signalointireitteihin, vastaavasti, havaittiin HeLa-MR-soluissa sen jälkeen, kun on stimuloitu 20 ug /ml vuohen anti-humaani-IgM: ää ja 5 ja 15 minuuttia, vastaavasti.

Analyysi Natural vasta-aktiivisuus ihmisen epiteelisolujen syöpäsolu-erittyy IgM

spontaani ilmaus IgM ihmisen epiteelisyöpäsolujen ilman todisteita infektio tai muita stimulaation kehotti meitä havaitsemaan, onko niillä aktiivisuus luonnon IgM. Tätä tarkoitusta varten, testasimme kykyä HeLa MR-soluista peräisin IgM tunnistaa ssDNA, dsDNA, ja LPS. ELISA, huomasimme, että HeLa MR solu-erittämä IgM tunnustettu kaikki nämä kolme antigeenejä (kuvio 5A-C). Lisäksi tämä IgM oli autovasta-aktiivisuutta ja tunnustettu hyvin määritelty autoantigeenien tumassa, sytoplasmassa, ja solun tukirangan HEp-2-soluissa (kuvio 5D).

A-C, ELISA osoitti, että eritetty IgM viljelmässä