Krooninen sairaus

tiivistelmä

Useimmat potilaat hoidettiin EGFR-tyrosiinikinaasin estäjät (EGFR-TKI) lopulta kehittää hankittu resistenssi. Menetys ilmentymisen insuliinin kaltaisen kasvutekijän (IGF) sitoutuvilla proteiini-3 (IGFBP-3) on ehdotettu mahdolliseksi resistenssimekanismi EGFR-TKI: in A431 ja HN11 solulinjat. Täällä tutkimme IGFBP-3 ilmentymistä kahdessa EGFR mutantti keuhkosyövän solulinjat resistenssi EGFR-TKI ja tutkittiin arvon seerumin IGFBP-3 tason markkerina vastarintaa. Vaikutus induktion tai vaimennuksen IGFBP-3: n ekspressio on vastus arvioitiin myös. HCC827 alalinjoja resistenssi gefitinibin (HCC827 /GR) ja erlotinibin (HCC827 /ER) perustettiin. Loss of IGFBP-3: n ekspressio havaittiin Western-blottauksella molemmissa solulinjoissa ilman muutoksia transkriptionaalisen aktiivisuuden, ja ELISA osoitti huomattavasti pienempiä määriä erittyy IGFBP-3 elatusaineet mutantti solulinjojen kuin että vanhempien linjan. Huolimatta menetys IGFBP-3 lauseke, IGFR signalointi pysyi ennallaan. Pakko ilmentymisen IGFBP-3 adenoviruksen välittämä transfektio tai yhdistelmä IGFBP-3 hieman lisäsi kasvua estävää ja apoptoottisia vaikutuksia EGFR-TKI, kun taas tukahduttaminen IGFBP-3 ei vaikuttanut herkkyyttä EGFR-TKI. Seerumin IGFBP-3-taso mitattiin ELISA: lla ennen ja jälkeen kehitys EGFR-TKI vastus 20 potilaalla ei havaittu merkittäviä muutoksia (1815,3 ± 94,6 ng /ml ennen hoidon vs. 1778,9 ± 87,8 ng /ml, kun EGFR-TKI resistenssi). Yhteenvetona vaikka IGFBP-3 downregulation liittyy hankintaan vastustuskykyä EGFR-TKI riippumatta mekanismin, sen vaikutus vastus ei ollut merkittävä, mikä osoittaa, että IGFBP-3 ei saa olla tärkeä rooli vastustuskyvyn EGFR-TKI ja seerumin IGFBP-3 taso ei ole luotettava indikaattori vastarinnan.

Citation: Choi YJ, Park GM, Rho JK, Kim SY, niin GS, Kim HR, et al. (2013) Role of IGF-sitova proteiini 3, Resistance EGFR Mutant Lung Cancer Cells EGFR-tyrosiinikinaasi-inhibiittorit. PLoS ONE 8 (12): e81393. doi: 10,1371 /journal.pone.0081393

Editor: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italia

vastaanotettu: toukokuu 13, 2013; Hyväksytty: 14 lokakuu 2013; Julkaistu: 05 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Choi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustus (2011-467) alkaen Asan Institute for Life Science, Seoul, Korea. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

EGFR on transmembraaninen reseptori, joka kuuluu perheeseen neljän siihen liittyvän proteiineja, EGFR (ErbB-1), HER2 /neu (ErbB-2), HER3 (ErbB-3) ja HER4 (ErbB-4) [1]. Ligandin sitoutuessa, EGFR muodot homo- tai heterodimeerejä muiden ErbB-reseptorien johtaa aktivaatioon solunsisäisen signaloinnin porrastetusti. Kaksi suurta solunsisäisiä reittejä aktivoituu EGFR ovat RAS-RAF-MEK-MAPK-reitin, joka ohjaa geenin transkriptiota, solusyklin etenemisen ja solujen proliferaation, ja PI3K-Akt-reitin, joka aktivoi kaskadin anti-apoptoottisten ja prosurvival signaalit [2].

Ei-pienisoluinen keuhkosyövässä (NSCLCs) että satama aktivoivia mutaatioita ja /tai vahvistusta EGFR lokuksen ovat erityisen herkkiä EGFR-tyrosiinikinaasin estäjät (TKI), kuten gefitinibin (Iressaa; AstraZeneca International) ja erlotinibi (Tarceva; OSI Pharmaceuticals) [3] – [9]. Noin 70-80% NSCLCs kätkeminen somaattisen mutaation tyrosiinikinaasidomeeniin EGFR-geenin vastata gefitinibille /erlotinibin [3], [4], [10]. Kuitenkin kehittynyt resistenssi EGFR-TKI-terapialle lähes aina kehittyy jälkeen mediaani oli noin 10 kuukautta hoidon aloittamisesta, vaikka potilaat ilmaisevat alussa olevaa dramaattinen vaste näille aineille. Hankittu resistenssi on liittynyt toissijainen mutaatio EGFR geenin T790M [11], [12], joka on havaittu noin 50% syövistä, joilla on hankittu vastustuskyky EGFR-TKI: [13], [14]. Lisäksi, monistus MET onkogeenin tunnistettiin toinen mekanismi hankitun resistenssin välittämän fosforylaation ErbB-3, ja sen seurauksena aktivointi PI3K [15], [16]. Samoin, yliekspressio AXL kinaasin on yhdistetty vastus EGFR-TKI: [17].

Eräässä tuoreessa tutkimuksessa, menetys ilmentymisen insuliinin kaltaisen kasvutekijän (IGF) sitoutuvilla proteiini 3 (IGFBP- 3) oli ehdotettu mahdolliseksi mekanismi resistenssin A431 ja HN11 solulinjat [18]. Tässä tutkimuksessa kehittynyt resistenssi EGFR-TKI mallinnettiin A431 levy- syöpäsolun linja, joka satamat villityypin EGFR geenimonistuman. Gefitinibin kestävä A431 A431 GR ylläpidetään PI3K signaloinnin läsnäollessa gefitinibin aktivoimalla IGF1- reseptori (IGF1 R) kautta. Esto IGF1 R signaloinnin palautti kyky gefitinibin ja säätelevät vaimentaen PI3K /Akt signalointi ja estävät A431 GR solujen kasvua. Geenien ilmentyminen analyysit osoittivat merkittävää downregulation IGFBP-3 ilmentymisen A431 GR soluissa, ja lisäksi yhdistelmä-IGFBP-3 palautti kyky gefitinibin ja säätelevät vaimentaen PI3K /Akt signalointi ja estävät solujen kasvua. Eri mallia Hankitun gefitinibin resistenssi sijoittautunut gefitinibin herkkä villityyppisen EGFR ilmentävien HN11 pään ja kaulan alueen syöpä solulinja, Akt fosfory- pidettiin läsnäollessa gefitinibin, ja vastus oli voittaa yhdistettiin EGFR ja IGF1 R esto. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että menetys ilmentyminen IGFBP kasvainsoluissa käsiteltiin EGFR-TKI johtaa aktivoinnin IGF1 R signalointia, joka puolestaan ​​välittää resistenssiä EGFR antagonisteja. Siksi yhdistetty terapeuttinen EGFR ja IGF1 R voi kumota tämän hankittu mekanismia lääkeresistenssin. Kuitenkin malli hankittu resistenssi gefitinibille ei ole kehitetty EGFR mutantti keuhkosyövän soluja, jotka on kliinistä merkitystä.

Useimmat verenkierron IGF-1 sitoutuu pääasiallinen IGF-sitova proteiini, IGFBP- 3 [19]. Seerumin IGF-1 ja IGFBP-3 pitoisuuksia voidaan mitata helposti ja voivat olla arvokkaita indikaattoreina syöpäriskiä. Epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että korkea IGF-1 ja alhainen IGFBP-3 tasot ovat itsenäisesti liittyy suuri riski yleisten syöpien, kuten keuhkosyövän [20]. IGFBP-3 on ehdotettu potentiaalinen kohde keuhkosyövän hoitoon, kuten adenovirus-välitteisen yliekspressio IGFBP-3 inhiboi kasvua NSCLC-solujen in vitro ja in vivo apoptoosin indusoimisessa inhibition kautta PI3K /Akt /PKB ja MAPK signalointipolkujen [21].

Tässä tutkimuksessa, IGFBP-3 ilmentymistä tutkittiin EGFR mutantti keuhkosyövän soluja kehittynyt resistenssi EGFR-TKI, ja arvo seerumin IGFBP-3 tason arviointi suoritettiin merkkiaine vastarintaa. Vaikutus aiheuttama IGFBP-3 voittamiseen vastus arvioitiin myös.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

HCC827 solulinja hankittiin American Type Culture Collection (ATCC: Rockville, MD, USA). Soluja viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 2 mM L-glutamiinia ja 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja streptomysiiniä, ja ylläpidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa kammiossa, joka sisälsi 5% CO

2. Gefitinibi ja erlotinibi oli ostoksen Selleck Chemicals (Houston, TX, USA). Rekombinantti ihmisen IGFBP-3 (rh IGFBP-3) hankittiin Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Adenovirusvektori ilmentävät ihmisen IGFBP-3 (Ad /IGFBP3) luovutti ystävällisesti Dr. Ho-Young Lee (University of Texas MD Anderson Cancer Center) [21].

perustaminen Gefitinib- ja Erlotinibi kestävä Solulinjat

gefitinibi ja erlotinibin vastustuskykyisten variantteja HCC827 eristettiin portaittaista altistuminen kasvavia annoksia gefitinibin ja erlotinibin. HCC827 soluja käsiteltiin 10 nM gefitinibin ja erlotinibin 72 tuntia. Solut altistuvat jatkuvasti kasvava lääkeaineen pitoisuuksia jopa 1 uM yli 8 kuukautta. EGFR-TKI-resistentit pesäkkeet valittiin altistuksilla pitoisuuksina 5 uM ja kaksi eristettyä kloonia nimettiin HCC827 /GR ja HCC827 /ER, vastaavasti. Sukupolven HCC827 /ER-solulinja on kuvattu aiemmin [17]. Resistentit solut pidettiin lääkeaineen väliaineessa vähintään 2 viikkoa ennen kokeiden eliminoimaan lääkkeiden.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus mitattiin käyttäen MTT- määritys ja trypaanisininen solulaskennan. Solut maljattiin 96-kuoppaisille steriilit muovilevyt ja altistettiin vaihtelevia pitoisuuksia lääkkeiden, joka sisälsi 1% FBS: ää. 72 tunnin jälkeen, 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidin (MTT) liuosta lisättiin ja kiteinen formatsaanin solubilisoitiin natriumdodekyylisulfaattia (SDS) liuos.

yhdistelmä vaikutuksia arvioitiin kanssa trypaanisinisellä solulaskennan. HCC827 /GR ja HCC827 /ER-soluja maljattiin 60 mm: n annoksia ja käsiteltiin EGFR-TKI ja Ad /IGFBP-3-infektion tai rh IGFBP-3: ssa 72 tuntia väliaineessa, joka sisälsi 1% FBS: ää. Solumäärät määritettiin ADAM-MC automaattinen solu laskuri (NanoEnTek, Seoul, Korea), mukaan valmistajan ohjeiden. Tulokset edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen ja virhepylväät merkitsevät keskihajonnat (SDS).

Western Blot

Proteiinit erotettiin SDS-polyakryyliamidigeeleillä, ja sähköllä Immobilon-P -kalvoille (Millipore, Bedford, MA, USA). Vasta-aineet ovat spesifisiä p-EGFR, EGFR, MET, Her2, Her3, IGF1 R, p-Akt, Akt, p-ERK, ERK, Axl, IGFBP-3 ja aktiinin saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), ja ne, p-HER2, p-ErbB3, p-MET ja p-IGF1 R (Tyr1131 ja Tyr1135 /1136) Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Proteiinit detektoitiin tehostetun kemiluminesenssin Western blotting (Amersham Biosciences, NJ, USA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Semi-käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) B

Yhteensä RNA: n eristys ja cDNA-synteesi suoritettiin käyttäen RNA mini-kit-protokollan (Qiagen Inc., Valencia, CA) ja Accupower RT sekoitus reagenssi, mukaan valmistajan ohjeiden (Bioneer Corp., Seoul, Korea). Oligonukleotidisekvenssit monistamiseen oli seuraava: eteenpäin-aluke, 5′-ATATGGTCCCTGCCGTAGA-3 ’, ja reverse-aluke, 5′-AAATCGAGGCTGTAGCCAG-3′, IGFBP-3, forward-aluke, 5’-GCGAGAAGATGACCCAGATC-3 ’, ja käänteinen aluke, 5′-CCAGTGGTACGGCCAGAGG-3’, sillä β-aktiini.

transfektio Sirna

Sirna (siRNA ) oligonukleotidit spesifinen IGFBP-3 saatiin Thermo (Thermo Electron Corp., Waltham, MA, IGFBP-3 siRNA-1) ja Qiagen (IGFBP-3 siRNA-2). Transfektio siRNA suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kohdegeenin ilmentyminen mitattiin 24 tuntia myöhemmin käyttäen western blot -analyysiä. Sillä MTT-määritystä,-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille jälkeen siRNA transfektion, käsitellään sitten ilmoitettu lääkkeiden 72 tuntia.

ELISA Seerumin IGFBP-3-ELISA

Jäljellä seerumin jälkeen rutiini kemia testi kerättiin 20 potilaan ennen EGFR-TKI-terapialle ja hankinnan jälkeen EGFR-TKI vastuksen kirjallinen lupa. Se varastoitiin -80 ° C: ssa määritykseen asti. IGFBP-3-pitoisuudet soluviljelyalustaan ​​ja seerumissa mitattiin käyttäen ihmisen IGFBP-3-ELISA-kittiä (R alavirran Akt signalointi jatkuvasti aktivoidaan resistenttejä alalinjoja HCC827 /GR ja HCC827 /ER.

HCC827, HCC827 /GR ja HCC827 /ER2 soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla gefitinibin ja erlotinibin 72 h elatusaineessa, joka sisälsi 1% FBS: ää. Solujen elinkelpoisuus ja IC

50-arvot määritettiin käyttäen MTT-määritystä.

(A) Basal ilmentyminen EGFR ja EGFR-liittyvä signalointi molekyylien HCC827, HCC827 /GR ja HCC827 /ER-soluja arvioitiin Western-blottauksella. Vaikutukset gefitinibin (B) ja erlotinibin (C) EGFR-liittyvä signalointi tutkittiin. HCC827, HCC827 /GR ja HCC827 /ER-soluja käsiteltiin 0,1 ja 1 uM gefitinibin ja erlotinibin 72 h elatusaineessa, joka sisälsi 1% FBS: ää. Proteiini (30 ug) solulysaateista tehtiin Western blot analyysi osoitti proteiineja.

Menetys IGFBP-3 in HCC827 /GR ja HCC827 /ER Cells

Arvio IGFBP-3: n ekspressio ja IGF1 R signalointia vanhempien ja kestävät solulinjat osoittivat IGFBP-3 ilmentyminen oli merkittävästi vaimentua vuonna HCC827 /GR ja HCC827 /ER-solut; kuitenkaan ole merkittäviä eroja koko ja aktivoitu IGF1 R välillä havaittiin resistenttejä ja vanhempien soluja (kuvio 2). IGFBP-3: n eritystä oli merkittävästi vähentynyt HCC827 /GR ja HCC827 /ER-soluja samanaikaisesti sen vähentynyt ilmentyminen tasolla (kuvio 3B). Ei kuitenkaan ole korrelaatiota IGFBP-3-proteiinin ja mRNA-tasojen havaittiin (kuvio 3A), mikä viittaa siihen, että downregulation IGFBP-3 tapahtuu transkription jälkeisellä tasolla.

IGFBP-3-mRNA: n (A) ja erittävät IGFBP-3 (B) määritettiin RT-PCR: llä ja ELISA: lla HCC827, HCC827 /GR ja HCC827 /ER. ELISA toistettiin kolme kertaa ja virhepalkit edustavat keskihajonta (SD). *

P

0,001 verrattuna HCC827 soluihin.

Herkkyys EGFR-TKI: in kestävä soluissa ei palaudu induktio IGFBP-3

tutkimiseksi osallistumista IGFBP-3 vastuksessa EGFR-TKI, HCC827 /GR-solut valeinfektoitiin tai infektoitiin Ad /IGFBP-3, ja induktio IGFBP-3: n ekspressio arvioitiin Western-blottauksella. Kuten on esitetty kuviossa 4A, IGFBP-3-tasot olivat merkittävästi korkeampia HCC827 /GR-solut infektoitiin eri tiitterit ad /IGFBP-3 kuin valeinfektoitujen solujen, joka vahvistettiin Western-blottauksella anti-flag-vasta-ainetta. Lisäksi IGFBP-3 erityksen elatusaineeseen tartunnan HCC827 /GR ja HCC827 /ER lisättiin mitattuna ELISA: lla (kuvio 4B). Vaikutuksen tutkimiseksi EGFR-TKI: IGFBP-3 yli-ilmentävät solut, solut infektoitiin Ad /IGFBP-3 100 MOI ja käsiteltiin EGFR-TKI. Kuitenkin yhtäaikainen käsittely Ad /IGFBP-3 ja EGFR-TKI eivät tehokkaasti estävät solujen lisääntymistä (kuvio 4C). Jotta voidaan tutkia roolia IGFBP-3 vastus edelleen, HCC827 /GR ja HCC827 /ER-soluja käsiteltiin 1 ug /ml ihmisen rekombinantti (rh) IGFBP-3 ja 1 uM EGFR-TKI: ssa 72 tuntia. Yhdistetty hoito johti pieneen kasvuun eston HCC827 /GR ja HCC827 /ER (37,0% ja 32,8%, tässä järjestyksessä) huolimatta runsaasti rh IGFBP-3 (kuvio 4D). Vaikka palauttaminen IGFBP-3 inhiboi IGF1 R toimintaa, se ei voinut vähentää Akt-aktiivisuutta (kuvio 4E ja F). Vastaavasti, tukahduttaminen IGFBP-3 hieman tehosti IGF1 R aktiivisuutta (dataa ei ole esitetty), mutta herkkyys EGFR-TKI: ei vaikuttanut (kuvio 4G ja H). Nämä tulokset osoittivat, että vaikka induktio IGFBP-3 hieman lisääntynyt vaikutus EGFR-TKI, se oli riittämätön voittamaan EGFR-TKI-hankittu resistenssi, mikä osoittaa, että menetys IGFP-3 voi olla tärkein vastus mekanismi HCC827 soluissa.

Kestää solut infektoitiin Ad /IGFBP-3: mÕIS on 0-100 PFU /solu 48 h: n ja IGFBP-3: n ekspressio määritettiin Western-blottauksella (A) ja ELISA: lla (B). (C) HCC827 /GR ja HCC827 /ER-soluja käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden EGFR-TKI: 72 h infektion jälkeen 100 MOI Ad /IGFBP-3. (D) HCC827 /GR ja HCC827 /ER-soluja käsiteltiin 1 uM EGFR-TKI ja 1 ug /ml rh IGFBP-3: ssa 72 tuntia. Tulokset edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen, ja virhepalkkien edustavat keskihajonta (SD). (E ja F) Soluja käsiteltiin lääkkeillä, rh IGFBP-3 tai Ad /IGFBP-3, kuten paneeli C ja D. 24 h kuluttua solut kerättiin talteen ja modulaatio EGFR ja IGF1 R signalointi osoitettuun solulinjoissa havaittiin Western blottauksella. (G) Ohjaus ja IGFBP-3 siRNA (100 nM) tuotiin HCC827 soluihin, ja IGFBP-3 tukahduttaminen vahvistettiin Western-blottauksella. (H) Solujen elävyys mitattiin käyttäen MTT-määritystä 72 tuntia myöhemmin.

Serum IGFBP3 Tasot eivät korreloi kestävyys EGFR-TKI

Serum IGFBP-3 tasoa mitattiin ELISA 20 pienisoluista keuhkosyöpää, joka osoitti osittaista vastetta EGFR-TKI hoitoa. Näistä 20 potilasta, 16 oli EGFR mutaatioita ja neljä ei arvioitu. Seerumin IGFBP-3-tasot eivät muuttuneet vasteena resistenssin kehittyminen EGFR-TKI: (1815,3 ± 94,6 ng /ml ennen hoidon vs. 1778,9 ± 87,8 ng /ml, kun EGFR-TKI vastus, p = 0,678, kuvio 5).

IGFBP-3-tasot määritettiin ELISA: lla seerumissa potilailla, joilla on NSCLC. Hankitun resistenssin kehitetään kaikilla potilailla, jotka aiemmin vastanneet EGFR-TKI.

Keskustelu

IGF polku on rooli säätelyssä sikiön kehitykseen, kudosten kasvua ja aineenvaihduntaa. Kaksi erillistä ligandeja (IGF-1 ja IGF-2) plus insuliini, ja kahden reseptorin (IGF-1 R ja insuliinin reseptorin) pystyy sekä homo- ja heteropolymerisation välittävät toimia tämän reitin [22]. IGF-1 R on 15- ja 20-kertaa suurempi affiniteetti IGF-1 kuin IGF-2, ja kaikki IGFBP on suurempi affiniteetti IGF-ligandin kuin vastaava IGF-reseptoreihin. Siksi toiminta IGF säädellään tiukasti perheen IGFBP, ja vähintään kuusi IGFBP (IGFBP-1 IGFBP-6) on tunnistettu. Niistä IGFBP-3 on hallitseva kiertävä sitomiskumppanin IGF, osuus 70-80% IGF-1 sitova [23]. IGFBP-3 on jo pitkään ollut vakiintunut voimakas negatiivinen säätelijä IGF-1 R aktivointia ja uskotaan estää ligandin sitoutumista, vaikka se voi olla myös IGF-riippumaton antiproliferatiiviset [24].

vapauttaminen IGF signalointi on on kuvattu useissa syöpätyypeissä, mukaan lukien keuhkosyöpä. Äskettäin inhibitio IGFR on osoitettu lisäävän kasvua estävää ja apoptoottisia vaikutuksia geftinib in H1650-soluissa, jotka näyttävät ensisijaisen vastustuskyky EGFR-TKI huolimatta, jossa on deleetio mutaatio eksonin 19 EGFR-geenin. Tämä tulos viittaa siihen, että yhdistettyä esto IGFR voisi olla hyödyllistä vastustusta EGFR-TKI: in keuhkosyövän [25]. Useat IGF-reseptorin estäjiä, kuten monoklonaalisia vasta-aineita ja pienmolekyylisalpaajien hetkellä kliinisissä kokeissa.

IGFBP-3: n ekspressio on merkittävästi vaimentua in A431 gefitinibin-resistentit solut, jotka on kehitetty olosuhteissa kroonisen EGFR esto [ ,,,0],18], ja hoito näiden solujen AG1478, EGFR-TKI, downregulates IGFBP-3 [26]. Nämä tulokset saattavat selittää mukauttamista soluja kasvatetaan olosuhteissa EGFR esto, joka aktivoi IGFIR johtavalla reitillä PI3K /AKT signalointi. Uudelleen altistuminen A431 GR solujen IGFBP-3 resensitised sekä PI3K koulutusjakso ja solujen eloonjäämistä vaikutuksille gefitinibin [18]. Kuitenkin malli kehittynyt resistenssi gefitinibin EGFR mutantti keuhkosyövän soluja ei ole kehitetty tähän mennessä, vaikka hankinta EGFR-TKI resistenssin pienisoluista keuhkosyöpää EGFR mutaatioita korostaa sen kliinistä merkitystä. Siksi tässä tutkimuksessa, me perustettiin kaksi EGFR-TKI-resistenttejä alalinjoja (HCC827 /GR ja HCC827 /ER) vanhempien HCC827 soluista, jotka ovat herkkiä EGFR-TKI koska poiston eksonissa 19, jatkuva altistuminen gefitinibin ja erlotinibin.

Molemmat solulinjat osoittivat downregulation IGFBP-3 ilmentymisen Western-blottauksella ilman muutoksia transkriptionaalisen aktiivisuuden ja riippumatta resistenssin mekanismi. Lisäksi taso eritetyn IGFBP-3 elatusaineessa resistenttien solujen väheni merkittävästi, kuten on esitetty ELISA-menetelmällä. Kuitenkaan mitään muutoksia IGFR signalointi havaittiin huolimatta menetys IGFBP-3. Tämä tulos on ristiriidassa tämän aiemman tutkimuksen osoittaa, että menetys ilmentyminen IGFBP kasvainsoluissa käsitelty EGFR-TKI aktivoi IGFIR signalointi [18]. Tämä ero olisi voinut aiheuttamia samanaikaisia ​​muutoksia ligandeja kuten IGF-1 tai IGF-2, taso IGFBP-3, vaikka tätä käsitettä olisi tutkittava tarkemmin.

Lee et al. tutki vaikutusta IGFBP-3: NSCLC-solujen infektion jälkeen adenovirus ilmentävät konstitutiivisesti IGFBP-3 valvonnassa sytomegaloviruksen promoottorin (Ad5CMV-BP3). IGFBP-3: n yliekspressio inhiboi fosforylaatiota Akt ja glykogeenisyntaasikinaasi-3β ja toiminnan MAPK. Lisäksi IGF-1 pelasti NSCLC-solujen seerumin ehtymisestä indusoiman apoptoosin, ja tämä pelastus estettiin Ad5CMVBP-3-tartunnan H1299 NSCLC-solujen [21]. Kuitenkin, esillä olevassa tutkimuksessa, pakko ilmentyminen IGFBP-3-infektion adenovirusvektori tai lisäksi yhdistelmä-DNA-IGFBP-3 lisäsi vain hieman kasvua estävää ja apoptoottisia vaikutuksia EGFR-TKI. Tutkimus Chang et al. osoittivat, että vähentynyt IGFBP-3-ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä lyhyempi tautikohtaista selviytymisen vaiheessa I pienisoluista keuhkosyöpää ja osoitti, että hypermetylaatiota IGFBP-3 promoottori saattaa liittyä downregulation IGFBP-3 [27], [28]. Tärkeys IGFBP-3 säätelyssä NSCLC soluproliferaation, kyky muodostaa klooneja, ja kasvaimen kasvu osoitettiin in vitro tutkimuksessa sama ryhmä. Kuitenkin uudempi tutkimus, IGFBP-3: n ekspressio ei korreloi mitään kliinisiä muuttujia ja ei merkittävästi liittynyt vastaus kemoterapiaa ja selviytymisen [29], [30].

Kaiken yhdistyksen välillä EGFR -TKI hoito ja muutokset IGFBP-3 tasoa ei tukenut nykyisten tietojen. Esillä olevassa tutkimuksessa seerumin IGFBP-3-taso mitattiin ennen EGFR-TKI hoitoa ja sen jälkeen kehitys EGFR-TKI vastus 20 pienisoluista keuhkosyöpää ei havaittu merkittäviä muutoksia (1815,3 ± 94,6 ng /ml ennen hoidon vs. 1778,9 ± 87,8 ng /ml jälkeen EGFR-TKI vastus). IGFBP-3 valmistetaan pääasiassa ja vapautuu maksan Kupfferin ja endoteelisolujen verenkiertoon vaikuttaa auxological kasvuun kautta hormonitoimintaa asetus [31]. Siksi osuus verenkierrossa IGFBP-3 erittyy keuhkosyöpä solut voivat olla liian pieni havaitsemiseksi merkittäviä muutoksia, jotka liittyvät resistenssin kehittymistä, vaikka menetys IGFBP-3 keuhkojen syöpäsoluja.

Lopuksi meidän toistuvat samat kokeet PC-9-solujen poisto mutaatio eksonissa 19 EGFR vahvistamaan havaintomme. Aiemmin loimme gefitinibi-resistenttien solujen (PC-9 /GR) PC-9 solua [32]. Vaikka PC-9 /GR-solut hankittiin T790M-välitteisen vastus, vähentynyt ilmentyminen IGFBP-3 havaittiin myös niitä (Täydentävä kuvio S1). Näin ollen uudelleen IGFBP-3 PC-9 /GR soluja tai vaiennettu IGFBP-3 PC-9-solut eivät vaikuta herkkyyttä EGFR-TKI.

Yhteenvetona vaikka IGFBP-3 downregulation liittyy n hankinnan EGFR-TKI vastus riippumatta taustalla mekanismi, sen vähäinen vaikutus vastus havaitaan esillä tutkimus osoittaa, että IGFBP-3 ei olla merkittävä rooli vastus NSCLC solujen EGFR-TKI-terapialle. Lisäksi tulokset viittaavat siihen, että seerumin IGFBP-3 ei ole käyttökelpoinen markkeri resistenssin kehittyneiden NSCLC.

tukeminen Information

Kuva S1.

IGFBP-3 ilmaisua ei vaikuttanut herkkyyttä EGFR-TKI: in PC-9 solua. Perusilmentymisen ja mRNA: n IGFBP-3 PC-9, PC-9 /GR ja PC-9 /ER-soluja arvioitiin Western-blottauksella (A) ja RT-PCR: llä (B). (C) PC-9 /GR-solut infektoitiin Ad /IGFBP-3: MÕIS on 0-100 PFU /soluja 24 h: n ja IGFBP-3: n ekspressio määritettiin Western-blottauksella. (D) PC-9 /GR-soluja käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden gefitinibin ja 1 ug /ml rh IGFBP-3: ssa 72 tuntia infektion jälkeen 100 MOI Ad /IGFBP-3. Solujen elinkelpoisuus mitattiin käyttäen ADAM-MC automaattinen solulaskijalla. Tulokset edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen, ja virhepalkkien edustavat keskihajonta (SD). (E) Ohjaus ja IGFBP-3 siRNA (100 nM) tuotiin PC-9 solua, ja IGFBP-3 tukahduttaminen vahvistettiin Western-blottauksella. (F) Solujen elävyys mitattiin käyttäen MTT-määritystä 72 tuntia myöhemmin.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0081393.s001

(TIF)