Krooninen sairaus

tiivistelmä

Epigeneettiset prosessit – kuten DNA: n metylaatio – pidetään yhä jolla on keskeinen rooli kroonisia sairauksia, kuten syöpää. On hyvin tunnettua, että metylaatio tasoja erityisesti geenejä tai loci eroa normaalien ja sairaan kudoksen. Tässä me tutkimme, onko sisäiseen geenin metylaatio arkkitehtuuri on vioittunut syövän ja onko vaihtelun tasot metylaation yksittäisten CpG: t tietyllä geeni pystyy erottamaan syöpä- normaalista kudoksesta, ja se liittyy heterogeenisten kasvaimen fenotyypin, kuten on määritelty geeni ilmaisu. Analysoimme 270985 CpG: t annotoituna 18272 geenejä, vuonna 3284 syöpä- ja 681 normaalia näytteitä, jotka vastaavat 14 eri syöpätyyppejä. Näin löysimme uusia monia sisäisiä geenissä metylaatiokuvion poikki fenotyyppejä, erityisesti niissä geenit, jotka ovat ratkaisevia kantasolujen biologiassa; Meidän toimenpiteet sisäisen geenin metylaatio arkkitehtuuri on parempi tekijä fenotyypin kuin toimenpiteiden perustuu keskimääräisen metylaatio tasolla yksin (K-S testin kaikissa 14 sairaudet testattu). Nämä per-geenin metylaatio toimenpiteet muodostavat myös huomattavan vähentämisen monimutkaisuus, verrattuna perinteisiin per-CpG beeta-arvot. Meidän havainnot tukevat vahvasti sitä mieltä, että sisäinen geeni metylaatio arkkitehtuuri on suuri kliininen mahdollisuudet kehittämiseen DNA-pohjainen syövän biomarkkerit.

Citation: Bartlett TE, Zaikin A, Olhede SC, West J, Teschendorff AE, Widschwendter M (2013) Korruptio on sisäinen Gene DNA metylointi Architecture Onko Hallmark of Cancer. PLoS ONE 8 (7): e68285. doi: 10,1371 /journal.pone.0068285

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 11 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 26 toukokuu 2013; Julkaistu: 16 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Bartlett et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Engineering ja fysikaalisten tieteiden tutkimusneuvosto (Complex /ESPRC), Euroopan komissio (FP7, EpiFemCare, projektin numero 305428) ja avustusta UCLH /UCL Kattava Biomedical Research Centre (hanke nro 152). Epigeneettisenä analyysit tehtiin klo UCLH /UCL, joka sai osan rahoituksestaan ​​Department of Health NIHR Biomedical Research Centres (BRC) rahoitusjärjestelmästä. AZ myöntää taloudellista tukea CR-UK hanke Promise-2016. AET tukee Heller Research Fellowship. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Epigeneettiset tiedot on tallennettu genomissa muodossa periytyviä muutoksia kemiallista rakennetta DNA, kuten metylaatio erityisesti emäkset, sekä erilaisia ​​kemiallisia muunnoksia histoniproteiineista mikä paketti DNA. Epigeneettiset tiedot voidaan mukauttaa elinaikana organismiin ympäristön ärsykkeille [1] – [3] ja nämä muutokset jatkuvat myöhemmissä mitooseja, mikä hankittu muutoksen fenotyyppiin.

DNA: n metylaatio on epigeneettisestä jonka osat lähes kokonaan metylaation CpG-dinukleotidien [4], ja se on mahdollista, että yksi, molemmat tai kumpikaan alleeleissa erityisesti genomisen lokuksen metyloitavaa [5]. Hypermetylaatiota CpG: t geenin promoottori (alue lähellä transkription aloituskohdan, TSS) on kiistatta liittyy hiljentäminen vastaavan geenin, ja tämä vaikutus on erityisen tärkeää syövän, joissa poikkeavien geenien liittyy toiminnallisia muutoksia tärkeitä jokaisessa vaihe syövän etenemisen [6].

on havaittu aiemmin, että vaihtelu metylaatio tietyn genomisen paikoissa on tärkeää syövän kehittymiseen [7]. On huomattu erityisesti että kasvu stokastisia metylaatio vaihtelua alueilla, jotka ovat jo tiedetään muuttaneen tasoja metylaation syövissä, mikä johtaa poikkeavaan ja vaihtelevia geeniekspressiota, ja tarjoaa epigeneettiset mekanismi kasvainten heterogeenisyys [8]. On myös osoitettu äskettäin, että tilastot perustuvat ero vaihtelu metylaatio voi johtaa parempaan havaitsemiseen riskin markkereita ennalta syöpäkasvaimia [9], [10].

Polycomb- ryhmä proteiineja (PcG) olla olennainen osa kehitysprosesseissa ylläpitäminen geeniluokassa tunnetaan Polycomb ryhmän tavoitteet (PCGTs) on tukahdutettu tilassa ES (alkion kantasoluja) soluja, ylläpitää pluripotenssia, ja ”valmis aktivointiin” erilaistumisen aikana [11]. Välinen yhteys PCGTs ja syöpä on käsitelty monet kirjoittajat [12] – [14]; se oli hiljattain osoitettu, että DNA hypermetylaation syövät etupäässä suunnattu PCGTs jotka ovat kehitys- sääntelyviranomaiset [15], ne kirjoittajat väitä näin, että tämä saattaa edistää varren kaltainen ominaisuudet syöpä; edelleen tukemaan näitä ajatuksia on huomattu, että kasvaimia, jotka ovat erityisen huonosti eriytetty taipumus näyttää ilmaisun kuvioita, jotka ovat samankaltaisia ​​kuin ES-soluja, kuten tukahduttaminen PCGTs [16].

Polycomb- ryhmä proteiineja säilyttää tukahdutettu valtio geenien kautta kromatiinin (DNA pakkaus); DNA kompakti tila kiedottu histoniproteiineista (pääkomponentti kromatiinin), ja PRC2 (Polycomb tukahduttavaa kompleksi 2) vastaa trimethylation lysiiniä 27 histoni 3 (johtava epigeneettiset merkin H3K27me3), joka liittyy tämä kompakti tila [17]. Geenit käytössä PRC2 ES-soluissa enimmäkseen kuljettaa kaksivalenssinen chromatin markkaa [15]; bivalency sisältää histonimodifikaation H3K4me3 (trimethylation lysiiniä 4 histoni 3), tavaramerkki, joka liittyy aktivaatio vastaavan geenin lisäksi tukahduttava H3K27me3 merkki. Uskotaan, että se on tämä bivalenttinen tila, joka pitää stemness pitäen geeni tukahdutettu, mutta valmis aktivointia upon erilaistumista. Koska DNA: n metylaatio liittyy myös repression ja aktivaation geenien, on kiinnostava, onko metylaation geenien, joihin liittyy kromatiinin merkinnät H3K27me3 ja /tai H3K4me3 kantasoluja muutetaan syövän, kuten esimerkiksi poikkeava muutos geenin asetuksen kautta DNA- metylaatio saattaa liittyä tuotto tai korostuu kantasolujen kaltaisia ​​solujen ominaisuudet.

rooli varhaisen epigeneettiset muutokset syövän syntyyn, mukaan lukien häiriöitä terveen epigenotype esisolujen, luominen epigeneettiseltä sallitun ympäristö jossa geneettinen poikkeamia voivat olla tuumorigeenisemmiksi vaikutuksia, ja fenotyyppinen plastisuus johtavat kasvaimeen sopeutumista ja liittyy sisäisiin kasvain heterogeenisuus, alun perin ehdottamat Feinberg ja työtovereiden [1]. On oletettu, että yksi tapa, jolla stokastisia dysregulation kantasolujen geenejä ja niihin liittyviä fenotyyppisiä heterogeenisuus saattaa ilmetä, on suhteen solusta soluun vaihtelu metylaation; tämä puolestaan ​​odotetaan korreloivan sisäisiin geenin vaihtelu metylaation, mitattuna käyttämällä yhteenlaskettu seoksia heterogeenisia solujen microarray kokeilu.

sisäiset geenin metylaatio vaihtelua pidetään häiriöitä normaalin metylaation profiili tai arkkitehtuuri, tietyn geenin, ja tällainen muutos voi olla yleisemmin liittyy luominen epigeneettiseltä sallitun ympäristön onkogeeniset transformaatio, ja tuumorigeneesiä. Tällaiset muutokset voidaan olettaa mukana alkuvaiheessa tai jopa edeltää sairauden puhkeamista, ja siten tunnistaa luotettavat indikaattorit muutoksista, saattaa arvokas johtoa kehittämiseksi DNA-pohjainen syövän biologisten merkkiaineiden kehon nesteiden, varsinkin kun se on ollut osoittaneet äskettäin, että DNA: n metylaatio biomarkkerit liittyvät kantasolujen geenejä liittyvät kliinistä tulosta naisten syövistä [18].

Aikaisemmat tutkimukset [7], [9], [10] ovat keskittyneet vaikutuksista näytteen näyte vaihtelevuus metylaation; täällä ensimmäistä kertaa, analysoimme yhdistys fenotyypin sisäisiin geenin vaihtelevuus metylaation. Hyödyntämällä saatujen tietojen Illumina Infinium HumanMethylation450 alustan, joka tekee kyselyn CpG: t genominlaajuisten lukien, joiden tiedetään geenin merkintöjä (joka vastaa keskimäärin 17 CpG: t per geeni), olemme tutkineet toimenpiteet sisäisen geenin metylaatio arkkitehtuuria, ja niiden kyky erilaistua terveiden ja sairauksien fenotyypit. Tästä olemme kehittäneet uusia toimenpiteitä, ja mukautetaan standardin niistä.

Tulokset

tutkimiseksi sisäisen geenin metylaatio arkkitehtuuri, neljä geeniä-keskeinen toimenpiteitä pidetään seuraavasti:

keskimääräinen poikkeama näytteen metylaation profiilin keskiarvosta metylaatio profiilia terve fenotyypin kontrollinäytteistä kunkin geenin. Tämä tarkoittaa metylaatio profiili voi vaihdella paljon kunkin geenin, ja niin se ei ole sama kuin keskimääräinen metylaation tason geenin. Koska tämä tarkoittaa poikkeama normalisoidaan jokaisen koetin jakamalla koetin keskihajonta poikki terve fenotyyppi vertailunäytteet, sitä kutsutaan ”tarkoittaa -score” toimenpide; tämä on esitetty kuviossa 1 (a). Eräs esimerkki geenien havaittiin olevan merkittävin mukaisesti tämä toimenpide on esitetty kuviossa 1 (b) ja (c).

keskimääräinen johdannainen metylaation mittausten kunkin geenin. Derivaatta metylaation profiilin tietyn geenin ja näytteen approksimoidaan väliset erot metylaatio mitatuista arvoista peräkkäisen koettimet kartoitus, että geeni. Keskimääräinen itseisarvojen näiden erojen jälkeen lasketaan ”tarkoittaa johdannainen” toimenpide; Tämä on sama kuin summa kaikista kasvaa ja pienenee metylaation tason yhdestä koetin seuraavaan poikki geenin; tämä on esitetty kuviossa 1 (d). Tämä on itsekalibroivasta mitta sisäisen geenin metylaatio vaihtelua, koska se lasketaan tietyn näytteen eroja että näyte, ja viittaamatta muihin näytteessä.

keskiarvoa metylaation mittaukset erityisesti genomisen alueen kullekin geenille; tämä on esitetty kuviossa 1 (e). Tyypillinen keskiarvo metylaatiotasoilla vaihtelevat suuresti genomin alueella toiseen; joten keskimääräinen metylointi taso tietyllä genomista aluetta käytettiin ”tarkoittaa metylaation toimenpide” jonkin geenin, ja samalla alueella käytettiin kutakin geeniä.

varianssi kunkin geenin metylaatio mittausten varten erityisesti genomin alueella; tämä on esitetty kuviossa 1 (f). Koska varianssi lasketaan suhteessa keskiarvoon, tämä toimenpide on vastaavasti laskettu kullekin geenille käyttämällä ainoastaan ​​koettimet kartoitus tiettyyn genomisen alueen uudelleen samalla genomin alueella kullekin geenille. Tätä kutsutaan ”metylaatio varianssi” toimenpide; se on toinen itsekalibroivasta toimenpide.

(a) Keskimääräinen -score toimenpide lasketaan kasvaimen näytteen (näkyy punaisena) geenin (johon koettimet kartta), keskiarvosta, ja keskihajonta,, terveiden kontrollinäytteistä kullakin koetin (b) metylointi profiilit 586 syöpä (punainen) ja 98 tervettä (sininen) näytteet poikki geeni löydetty merkittävää mukaan keskimääräinen -score toimenpide, koettimilla välein (epätasaisesti ) mukaan niiden genomista loci. Genomiset alueet on merkitty alla geenin värikoodi näytön alareunassa kuvion. (C) heatmap havainnollistaa samaa geeniä, jossa koettimet tasaisin välein; arvot jokaisesta näytteestä ja kukin koetin on merkitty värikoodi näytetään kuvion yläosassa. Näytteet on piirretty järjestyksessä keskimääräisen -score siten, että kasvaimen näytteen pienimmän keskiarvon -score ja terveen näytteen pienimmän keskimääräisen -score ovat vierekkäin. Genomiset alueet on merkitty alla geenin värikoodi näytön alareunassa kuvion. N. B., tämä geeni on kaksi transkription aloituspaikat (TSSs) eri paikoissa. (D) keskimääräinen johdannainen toimenpide lasketaan, näytteen, kuten keskiarvo absoluuttisen erot vastaavat arvot peräkkäisten koettimia, koko geenin. (E) keskimääräinen metylaatio toimenpide lasketaan, näytteen, kuten keskiarvo vastaavat arvot koettimien huomautusta, erityisesti genomisen alueen. (F) metylaatio varianssimittaus lasketaan, näytteen, kuten varianssi vastaavat arvot koettimien huomautusta, erityisesti genomisen alueen. NB, (d) – (f) lasketaan ilman viittausta terve näytteitä, kun taas (a) lasketaan viittaamalla terveitä näytteitä.

Näiden neljän toimenpiteen jokaisen pyritään tutkimaan eri ominaisuus sisäisten -geenin metylaatio arkkitehtuuri, ja kaikki voivat luokitella näytteet yksi kerrallaan, toisin sanoen, ne ovat sisäisiä geenin tai intra-otoksen toimenpiteitä, pikemminkin kuin näytteissä toimenpiteitä on tutkittu aiemmin yhteydessä metylaation vaihtelua.

koska keskimääräinen -score lasketaan keskimääräinen mitta metylaation eroa terveen metylaatio profiilin, tarkkaan ottaen se on mitta metylaation epävakautta. Keskimääräinen johdannainen ja metyloinnin varianssi toimet ovat sekä toimenpiteistä sisäisen geenin metylaatio vaihtelu; kuitenkin, keskimääräinen johdannainen laskettuna tilaamista koettimien (eli tämä toimenpide palauttaa toinen numero, jos järjestystä koettimien satunnaistettiin), kun taas metylointi varianssi ei olisi; keskimääräinen johdannainen lisäksi pitää kaikkia koettimia kartoitus geeniin, kun taas metylointi varianssimittaus vain katsoo koettimet kartoitus tiettyyn genomin alueella. Keskimääräinen metylaatio toimenpide on ainutlaatuinen täällä, koska se ei mittaa eroa metylaation tason ja sen sijaan mittaa absoluuttisen metylointi tasolla; se sisältyy tähän lähinnä vertailussa.

ominaisuudet Näiden neljän toimenpiteet alun perin tutkittu yhteydessä neljätoista Illumina Infinium Human Metylointi 450 aineistoja, jotka ladata Cancer Genome Atlas (TCGA) [19] . Käytimme nämä neljä toimenpidettä neljästätoista TCGA käyttökelpoisuus; kaikkiaan analysoitiin 450 K DNAm tietoja 3284 kasvain ja 681 tervettä näytteitä; yksityiskohdat näytteiden määrä kunkin fenotyypin ja kussakin datajoukko on esitetty taulukossa 1 (datajoukon lyhenteitä, katso ”Menetelmät ja mallit). Teimme myös meta-analyysi Näiden tietojen on tietojemme suurin meta-analyysi suorittaa missä tahansa DNA: n metylaatio tutkimusta.

vertailu sisäiset geenin metylointi Toimenpiteet

Aluksi arviointiin suhteellisista ansioista näiden neljän toimenpiteen tarkastelimme niiden kykyä erottaa kasvaimen ja terveen kudoksen. Korrelaatio kudosnäytteen fenotyyppi neljään metylaatio toimenpiteet katsottiin mitattuna jakaumista per-geenin AUC (pinta-ala käyrän, joka on mitta ennusteen tarkkuus, katso ”Menetelmät ja mallit” lisätietoja). Nämä jakaumat on esitetty laatikossa-tontteja kuviossa 2. Jokaista datajoukon keskimääräinen -score toimenpide on huomattavasti paremmin erotteleva kasvaimen tervettä kudosta näiden metylaatio tietoja, kuin keskiarvo johdannainen toimenpiteenä metylaatio varianssi toimenpide, ja keskimääräinen metylaatio toimenpide (visuaalinen vertailu kuvion 2 vahvistettiin Kolmogorov-Smirnov kokeista, tuloksia ei ole esitetty); tämä johtuu siitä, että keskimääräinen -score toimenpide on määritelty suhteessa terveen keskimääräinen metylointi profiili. Ilman keskimääräinen -score toimenpidettä, keskimääräinen metylointi toimenpide on huomattavasti paremmin erotteleva kasvaimen tervettä kudosta kuin loput kaksi toimenpiteitä kymmenen Jäljellä olevat tiedot, joissa keskimääräinen johdannaisen erotteleva huomattavasti paremmin kaksi tiedostoa (LUE ja THCA), ja tuloksettomia tulokset jäljellä olevat tiedot (KIRC ja Paad, joka on epävakaa tuloksia johtuen pienen näytteen koko). Kuva S3 esittää, hajontakaavioiden, pairwise vertailuja kunkin neljän metylaation toimenpiteet geeni, joka oli joukossa 1000 geenien korkeimman AUC mukaan kukin näistä toimenpiteistä.

Jokaisessa kentässä näkyvät arvot AUC varten 1000 merkittävin geenit tietylle kasvaimen tyyppi ja sisäisten geenin metylaatio toimenpide. Keskimääräinen -score ennustaa fenotyyppi paremmin kuin muut kolme toimenpiteitä kaikilla 14 kasvaintyypeissä. Kasvaintyyppi lyhenteet ovat seuraavat: Virtsarakon urothelial karsinooma (BLCA), Rintojen Invasive karsinooma (BRCA), Colon adenokarsinooma (COAD), pään ja kaulan alueen Okasolusyöpä (HNSC), Munuainen Munuaisten Clear cell carcinoma (KIRC), Munuainen munuaispapillan Cell karsinooma (KIRP), Maksa (LIHC), keuhkoadenokarsinooma (LUAD), Lung Okasolusyöpä (LUSC), Haiman adenokarsinooma (Paad), Prostate adenokarsinooma (PRAD), peräsuoli adenokarsinooma (LUE), kilpirauhaskarsinoomaa (THCA), ja kohdun Corpus endomet- karsinooma (UCEC).

suoraan verrata tehokkuutta keskiarvon -score toimenpide ennustamaan fenotyyppi (syöpä /terve) riippumaton keskimääräisen metylaation tason, logistinen regressiomalli sovitettiin kunkin geenin käyttämällä keskimääräistä -score ja tarkoittaa Metylointia covariates, mikä -arvot kullekin geenin kunkin keskiarvon -score ja tarkoittaa metylaation. Joka data asettaa kahta lukuun ottamatta, että suuri enemmistö (80-100%) näiden geenien ainakin yksi kahdesta kovariaattien merkittävää, keskimääräinen -score kovariaattina-arvo oli merkittävämpi kuin vastaavan keskimääräisen metylointi kovariaatin -arvo. Muissa kaksi tiedostoa, keskimääräinen -score kovariaattina -arvo oli merkittävämpi useimpien (50-80%) geenien ainakin yksi merkittävä kovariaattina (yksityiskohtaiset tuloksia ei esitetä). Siten keskimääräinen -score on parempi ennustaja fenotyypin kuin keskiarvo metylaatio, jopa oikaistu keskimääräinen metylaation tasolla.

Meta-analyysi ja Gene-set rikastus Analysis

Meta-analyysi neljästätoista tietokokonaisuuksien tehtiin. Geenit jaettiin merkitys niiden AUC (perustuen keskimääräinen -score toimenpide) kaikilla tiedot sarjoista permutaatio menetelmällä (katso ”Menetelmät ja mallit” lisätietoja); Tämän tunnistettu yli 4000 merkittäviä geenejä, jotka liittyvät johdonmukaisesti ero syövän ja terveen fenotyyppien poikki kudostyypeistä (FDR). Nämä geenit osoittavat johdonmukaisesti suurimmat erot terveen ja syövän fenotyypit (keskiarvona -score toimenpide määritellään suhteessa terveisiin näytettä), ja kun keskimääräinen -score on mitta metylaation epävakautta, niitä kutsutaan eniten epävakaa meta-analyysi geenejä. Keskimääräinen -scores yksittäisten kasvainten ja terve näytteitä 50 Näistä merkittävimmät epävakaimmat meta-analyysi geenien näkyvät kuvassa 3, ja tietoja 100 merkittävin näiden geenien on esitetty taulukossa S1. Erityisesti, kuvio 3 esittää sitä, missä määrin epävakaus on yhdenmukainen (korkea tarkoittaa -score, punainen) yli syöpäpotilailla verrattuna potilaisiin (alhainen keskimääräinen -score, sininen). Geenit, joiden keskimääräinen AUC lähellä 0,5 useimmissa kasvaintyypeille Lisäksi todettiin; nämä ovat geenejä, jotka ovat yleensä pienimmät erot terveen ja syövän fenotyyppien poikki kudostyyppien ja siten on merkitty vähiten epävakaa meta-analyysi geenien. Yli 2800 vähiten epävakaa meta-analyysi geenien havaittiin olevan merkittävä tällä permutaatio menetelmällä (FDR) ja 100 Näistä merkittävimmät on esitetty taulukossa S2. On kuitenkin vähemmän johdonmukaisuus vähiten epävakaa meta-analyysi geenien poikki kasvaintyypit, esimerkiksi 100. sijoitettu merkittävä ainakin epävakaa meta-analyysi geeni on AUC alle 0,6 vain 10 pois 14 kasvaintyypeille.

Mean -scores kasvaimen (T) ja terveet (H) näytteet näkyvät lämpökarttana mukaan värikoodeja top 50 meta-analyysi geenien (top 50 johdonmukaisimmin epävakaa geenejä). Heatmap osoittaa, missä määrin epävakaus on johdonmukainen (korkea keskiarvo -score, punainen) poikki syöpäpotilailla verrattuna potilaisiin (alhainen keskimääräinen -score, sininen). Jokaisen kudostyypin terve näytteitä näyttävät oikealle kasvaimen näytteitä; jossa ei ole tilaa on käytettävissä (H) tarra on jätetty pois. Lyhenteet: R (LUE), B (BLCA), K (KIRP), P (Paad).

Vahvista biologisen tulosten merkityksen tämän meta-analyysin viitaten geenejä, jotka ovat hyvin tiedetään olevan tärkeitä syövän biologian, kaikkein epävakaa ja vähiten epävakaa meta-analyysi geenien testattiin väkevöimisen geenejä, jotka ES-solut kantavat repressoiviin /aktivoimalla chromatin merkitsee H3K27me3 (H3K27 ES geenit), H3K4me3 (H3K4 ES geenejä) ja kahdenarvoista (eli sekä H3K27me3 ja H3K4me3 merkkejä, BIV ES geenit) ja väkevöimisen PCGTs (ES-solujen Polycomb ryhmä tavoitteet). Kaikkein epävakaa meta-analyysi geenit erittäin rikastuttavat BIV ja H3K27 ES geenejä ja PCGTs, ja vähiten epävakaa meta-analyysi geenit erittäin rikastunut H3K4 ES geenejä (taulukko 2).

Lisää yleinen geeni-set rikastus analyysi (GSEA) suoritettiin myös, testaus rikastuminen kaikkein epävakaa ja vähiten epävakaa meta-analyysi geenien jäsenten yli 6000 geenin sarjaa (katso ”menetelmät ja mallit ’yksityiskohdat osasta). 100 parhaan merkittävästi rikastettu näistä geenin sarjaa kaikkein epävakaa ja vähiten epävakaa meta-analyysi geenien näkyvät taulukoissa S3 ja S4 vastaavasti. Erityisesti Taulukko S3 (geenin sarjaa rikastuttavat epästabiilein meta-analyysi geenien) näyttää paljon kehitys- ja soluviestitykseen geenin sarjaa.

eniten epävakaa meta-analyysi geenit liittyvät yleensä korkeampi metylaatiotasoilla kuin geenit, jotka eivät ole merkittävä mukainen meta-analyysi (eli geenit, jotka eivät ole kaikkein epävakaa tai ainakin epävakaa meta-analyysi geenien) sekä kasvaimen ja terveen näytteitä, nämä genomiset alueet sijaitsevat lähempänä promoottorin kaikissa kudostyypeissä, mutta kaikkein epävakaa meta -analyysi geenit liittyy myös suuri vaihtelu metylaatiotasoilla (kuva S4). Vähiten epävakaa meta-analyysi geenien päinvastoin liittyy jatkuvasti hyvin alhainen metylaation sekä kasvaimen ja terveen näytteet näiden genomialuetta, ja erityisesti TSS200, 5’UTR- ja 1stExon, mikä viittaa siihen, että alhainen metylaatio epävakauden näistä geeneistä liittyy joiden puute metylaation kaikkein toiminnallisesti tärkeä genomialuetta sekä sairaiden ja normaaleista kudoksista, ja siksi tätä asetusta näiden geenien on mekanismeilla, joihin ei liity DNA: n metylaatio, erityisesti saatavuuden transkriptiotekijöiden.

korrelaatio kasvainten Gene Expression kanssa sisäiset geenin metylointi Architecture

tutkiakseen vaikutuksen sisäiseen geenin metylaatio arkkitehtuuri geenien ilmentymisen, 217 BRCA kasvain näytteet Hyväksytty geenien ilmentyminen ja metylaation käytettävissä tietoja TCGA katsottiin tarkemmin. Kunkin geenin ei-lineaarista monimuuttuja regressioanalyysi suoritettiin (katso ”Menetelmät ja mallit) geeniekspression sisäisen geenin metylaatio arkkitehtuuri, näiden sovitettu kasvainnäytteet, kun geenin ilmentymisen vasteena, ja ottamalla yksi keskiarvo -score merkitse johdannainen ja metylaation varianssi yhtenä kovariaattina ennustajan yhdessä keskiarvo Metylointia toisena kovariaattina ennustaja. Suhteelliset osuudet geenien havaittu olevan merkittävä tai ei, ja merkittävää erään kovariaattina tai muita, tai molemmat, on esitetty kuviossa 4; erityisesti monia geenejä ilme ei merkittävästi ennustaa keskimääräistä metylaation mutta merkittävästi ennustama keskimääräinen -score, tarkoittaa johdannaista, tai metylointi varianssi.

Expression otettiin vastemuuttuja, yksi keskiarvon -score, tarkoittaa johdannainen ja metylaation varianssi yhtenä kovariaattina ennustajan yhdessä keskiarvo Metylointia toisena kovariaattina ennustaja. (A) osuus geenejä ainakin yhdellä kovariaattina merkitsevä (FDR), ja osuus geenit eivät kovariaatin merkittävä. (B) osuus merkittävä geenien (eli osuus geenien edustaa vasenta kunkin parin tankojen), jotka ovat merkittäviä, koska yksi tai toinen tai molemmat covariates. Sillä geenit, jotka ovat merkittäviä johtuu vain yksi kovariaattina ennustaja, osuudet näiden geenien joille merkitys johtuu positiivinen tai negatiivinen korrelaatio on merkitty baareja /ja \\ vastaavasti. On monia geenejä ilme ei merkittävästi ennustaa keskimääräistä metylaation mutta merkittävästi ennustama keskimääräinen -score, tarkoittaa johdannaista, tai metylointi varianssi.

Rikastaminen kantasolujen geenien geenien ilmentymistä merkittävästi ennustivat vain yksi kovariaattina jälleen testattiin vahvistaa biologista merkitystä havaintojen viitaten geenejä, jotka ovat hyvin tiedetään olevan tärkeitä syövän biologian. Todettiin, että geenien ilmentymistä ennusti vain keskimääräinen -score kovariaattina merkittävästi rikastettiin BIV ES geenejä ja PCGTs (ja vastaavasti, Fisherin testiä), tulos, joka on sopusoinnussa havaintojen tässä, että VP ES geenit rikastetaan kesken epästabiilein meta-analyysi geenien, eli ne geenit, jotka ovat hyvin johdonmukaisesti liittyy suurin ero metylaatiokuvion syövän ja terve fenotyyppejä. Todettiin myös, että vastaavasti geenien ilmentymistä ennusti vain keskimääräinen metylaation kovariaattina monimuuttujakalibrointiin regressio kanssa keskimääräisen -score kovariaattina merkittävästi rikastettu (Fisherin tarkka testi) mukaan H3K4 ES geenejä, tulos, joka on johdonmukainen havaintojen että H3K4 ES geenit rikastetaan joukossa vähiten epävakaa meta-analyysi geenien, eli ne geenit, jotka ovat johdonmukaisesti vähiten ero metylaatiokuvion syövän ja terve fenotyyppejä. Samoin todettiin, että geenien ilmentymistä ennustaa vain keskimääräinen johdannainen kovariaattina merkittävästi rikastettiin BIV ES geenejä ja PCGTs (ja vastaavasti, Fisherin eksakti testi), ja että geenien ilmentymistä ennustaa vain keskimääräinen metylaation kovariaattina samalla monimuuttuja regressio merkittävästi rikastaa H3K4 ES geenejä (Fisherin tarkka testi).

Nämä havainnot ulottuvat heterogeeninen kasvaimen fenotyypin määrittelemän geenien ilmentyminen, ajatus siitä, että erot metylaatiovyöhykkeiden kantasolujen geenit tunnusmerkki syöpä , ja osoittaa, että tämä voidaan mitata sisäisen geenin metylaatio arkkitehtuurin muodossa sisäisen geenin metylaatio vaihtelua (mukaan keskimääräinen johdannainen ja metylaation varianssi toimenpiteet) ja epävakaus (mukaan keskimääräinen -score toimenpide) tarkemmin kuin keskiarvolla metylaatio tasolla yksin.

Association genominlaajuisten Mean -score joilla on rintasyöpä luonnostaan ​​alatyypit

erot sisäisessä geenin metylaatio arkkitehtuurin välillä heterogeeninen kasvaimen fenotyypit (kuten määritelty geenien ilmentyminen) tutkittiin edelleen yhteydessä rintasyövän luontainen alatyyppejä. Sama 217 BRCA näytteitä Hyväksytty geenien ilmentyminen ja metylaation tietoja olivat kukin yksilöllisesti osoitettu yksi näistä tauti alatyyppien, vakiintuneiden molekyylien määritelmiä käyttäen PAM50 luokittelija [20]. Tämä tehtiin korreloimalla geeniekspressioprofiili (Spearman korrelaatio) kunkin näytteen PAM50 luokitin kanoninen geeniekspressioprofiilit 5 eri luontaisten alatyyppiä, ja kunkin näytteen valita alatyypin kanssa suurin korrelaatiokerroin, mikä johtaa 42 näytteet luokitellaan Basal , 24 kuten Her2, 81 Luminal A, 54 Luminal B, ja 16 on luokiteltu Normaali. Kunkin näistä näytteistä genomin laajuinen tarkoittaa -score laskettiin myös, kuten per-näyte genominlaajuisten mitta sisäisen geenin metylaatio arkkitehtuuria. Jakaumia Näiden genomin laajuinen keskiarvo -scores kunkin luontaisen alatyypin esitetään kuviossa 5; on selviä eroja keinot ja jakaumien välillä kunkin alatyyppejä. Kruskal-Wallisin testi suoritettiin tarkistamiseksi merkitystä näiden erojen, joilla on merkittävä tulos,. Irrottaminen näytteet luokitellaan Luminal B ja Normal (kuten jakaumat genominlaajuisten keskiarvo z tulokset ovat suurempia ja pienempiä vaihtelut vastaavasti näitä alatyyppejä kuin muut), vielä johti merkittävään tulokseen Kruskal-Wallisin testiä, . Tämä kyky erottaa heterogeenisen kasvaimen fenotyyppejä, yhteydessä perustettiin molekyyli määritelmät taudin alatyyppejä, osoittaa, että se voi olla mahdollista käyttää sisäistä geenin metylaatio arkkitehtuuri kehittää uusia molekyyli luokittelijoiden syövän, tai tehdä perustettuja vankempi. Tämä on erityisen kiinnostavaa, koska metylaatiotasoilla ovat tyypillisesti stabiileja kuin geeni-ilmentymisen tasot.

keskiarvo kaikissa geenit keskiarvo -scores laskettiin 217 BRCA näytteitä sovitetun ilmaisun ja metylaation tietoja. Nämä näytteet itsenäisesti luokiteltu korrelaatio niiden geeniekspressioprofiilien (Spearman korrelaatio), jotka on otettu PAM50 rintasyövän luontainen alatyypin luokittelija [20]. Jakaumia Näiden genomin laajuinen keskiarvo -scores, kunkin sisäinen alatyypin, on esitetty boxplots. Ilmoitettu merkitys laskettiin käyttäen Kruskal-Wallisin testiä.

Keskustelu

Olemme osoittaneet, että uudelleenjärjestely sisäisten geenin metylaatio arkkitehtuuri on olennainen ominaisuus syöpäsoluja, ja että monia tapoja arvioida nämä erot, jotka voivat tarjota ilmainen tietoa. Olemme kehittäneet toimenpiteitä havaitsemiseksi osa näistä eroista, kuten ensimmäisen tutkimuksen sisäisen geenin vaihtelu metylaation (vastakohtana näytteestä toiseen vaihtelua metylaation). Olemme osoittaneet, että meidän keskimääräinen -score toimenpide on jatkuvasti tehokkaampaa ennustamaan syöpään verrattuna terveisiin fenotyyppiin kuin tarkoittaa metylaation, jopa oikaistu keskimääräinen metylaation tasolla.

Olemme tehneet mitä on, että tietomme, suurin meta-analyysi suorittaa missä tahansa DNA: n metylaatio tutkimusta. Erityisesti yli 4000 geenejä havaittiin merkittävästi liittyvän johdonmukainen ero syövän ja terveiden fenotyyppejä, mikä osoittaa, että menetelmä erottaa syövän tervettä kudosta, meidän keskimääräinen -score toimenpide on vankka eroista kasvaintyypeissä. 100 merkittävimmät geenit mukaan tämä meta-analyysi (taulukko S1) voidaan pitää erityisen ominaista yleinen ja ei kudosspesifisiä syövän fenotyypin. Nämä vähiten epävakaa meta-analyysi geenit myös merkittävästi rikastettu (taulukko 2) geenien kuljettavat H3K27 ja kaksiarvoinen chromatin merkkien ES-soluissa ja PCGTs, sopusoinnussa ajatus, että kasvain fenotyyppi liittyy hankintaan kantasolujen kaltaisia ​​solujen ominaisuudet [ ,,,0],15].