Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aktivoidut AHR /ARNT kompleksi (AHRC) säätelee ilmentymistä kohdegeenien altistettaessa ympäristön epäpuhtauksien, kuten 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-

p

– dioksiinin (TCDD). Tärkeää on, näyttö on osoittanut, että TCDD tukahduttaa estrogeenireseptori (ER) kohdegeenin aktivointi kautta AHRC. Tuloksemme osoittavat, että AHR ja ARNT toimivat toisistaan ​​riippumatta ei-dioksiinin elementin sivustoja. Siksi pyrimme määrittämään tiettyjä toimintoja AHR ja ARNT in estrogeenista riippuvien signalointi ihmisen MCF7 rintasyövän ja ihmisen ECC-1 kohtukarsinooma soluja. Knockdown AHR siRNA kumoaa dioksiinin indusoituvaa tukahduttaminen estrogeeniriippuvainen geenin transkription. Kiehtovan, knockdovvn ARNT ei vaikuta TCDD-välitteisen tukahduttaminen estrogeenisäädeltyjen transkription, mikä viittaa siihen, että AHR tukahduttaa ER toiminta riippumatta ARNT. Tätä teoriaa tukee kykyä selektiivisen AHR modulaattorin 3 ’, 4’-dimetoksi-α-naphthoflavone (DiMNF) tukahduttaa estrogeenia indusoituvan transkription. Lisäksi pohjapinta ja estrogeeni-aktivoitua transkriptiota koodaavat geenit

katepsiini-D

ja

pS2

ovat alassäädetty MCF7-soluissa mutta säädellään ylöspäin ECC-1-solujen vastauksena menetykseen ARNT. Nämä vasteet kuvastuvat proteiinitasolla katepsiini-D. Lisäksi knock-alas ARNT johtanut vastakkaiseen mutta vastaavat muutokset estrogeenin stimuloimaa proliferaatiota sekä MCF7 ja ECC-1-soluissa. Olemme saaneet kokeellista näyttöä osoittavat dioksiini riippuva repressorin toiminto AHR ja dioksiinin riippumaton koaktivaattoria /co-repressorin toiminto ARNT estrogeenin signalointi. Nämä tulokset antavat meille lisää tietoa mekanismeihin transkriptiotekijän ylikuulumisen ja otaksuttu terapeuttisia kohteita estrogeeni-positiivisia syöpiä.

Citation: Labrecque MP, Takharin MK, Hollingshead BD, Prefontaine GG, Perdew GH, Beischlag TV ( 2012) Erilliset teht aryylihiilivetyreseptori Nuclear Translocator ja Ah-reseptorin Estrogeeni-välitteistä signalointia Human Cancer Cell Lines. PLoS ONE 7 (1): e29545. doi: 10,1371 /journal.pone.0029545

Editor: Bernhard Ryffel, Ranskan kansallisen tieteellisen tutkimuksen, Ranska

vastaanotettu: 24 lokakuu 2011; Hyväksytty: 30 marraskuu 2011; Julkaistu: 03 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Labrecque et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Kanadan Breast Cancer Foundation – BC /Yukon, luonnontieteiden ja tekniikan tutkimuksen toimikunta Dr. Beischlag, ja National Institutes of Health myöntää ES04869 tohtori Perdew. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

selvittämiseen mekanismeista transkriptio on ratkaisevaa tietämystämme solujen ja organismien reagoida fysiologisten signaalien ja ympäristön ärsykkeisiin. Aryylihiilivetyreseptori (AHR) ja aryylihiilivetyreseptori ydin- translocator (ARNT) ovat jäseniä perus helix-loop-helix /PER-ARNT-SIM (bHLH-PAS) perheen proteiinien ja muodostavat heterodimeerisen transkriptiotekijän upon sitomaan erilaisia ​​ympäristömyrkyt, kuten 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-

p

dioksin (TCDD) [1]. Aktivoidut AHR /ARNT kompleksi (AHRC) soittaa keskeinen rooli syövän synnyn ja säätelee ilmentymistä

Sytokromi P4501A1

(

CYP1A1

) ja muut xenobiotic kohdegeenien vaikutusten torjumiseksi ympäristösaasteiden [1 ]. Lisäksi, AHR on osoitettu olevan tärkeitä normaalin kehityksen ja fysiologiset homeostaasiin [2], [3], [4], ja on välttämätöntä tiettyjen toimintojen immuunivasteen, kuten sääntely interleukiini-17 tuottavat auttaja-T-solujen [5] ja induktion sytokiinin interleukiini-6 MCF7 rintasyöpäsoluissa [6].

Unliganded AHR olemassa sytoplasmassa osana multimeerisen kompleksin, joka sisältää kaksi molekyyliä HSP90, HSP90-co-kaperonin p23 ja hepatiitti B -virus X liittyvä proteiini 2 (XAP2) [7], [8], [9], [10]. Ligandin sitoutuessa, AHR siirtyy tumaan, jossa se on yhteydessä ARNT muodostaa toiminnallisen transkriptiotekijän monimutkainen, AHRC. Koska aktivoitu kompleksi, AHRC kykenee rekrytoimaan säätelevien proteiinien, kuten steroidireseptoriperheen koaktivaattorikompleksien-1 (SRC-1), CREB sitova proteiini (CBP /p300), NCoA2 /GRIP1 [11], [12],-reseptorin kanssa vuorovaikutuksessa -proteiinitiivisteet 140 (RIP140) [13], kaakao [14], GAC63 [15], NcoA4 [16] ja TRIP230 [17], mikä merkittävää osuutta aktiivisuuden määrittämiseksi TCDD aiheuttama geenin transkription. Nämä co-aktivaattorit ja yhteistyön repressoreja sisällyttää itsensä multimeerisiä komplekseja, jotka muuttavat kromatiinirakenteeseen, vakauttaa ydin transkription koneita, ja välittävät RNA-ketjun pidentymisen [18]. Näiden lisäksi klassinen transkription co-aktivaattoreita ja co-repressoreihin, AHR värvää muut transkriptiotekijät transkription aikana, kuten estrogeenireseptori-α (ERa) [11], [19], [20] ja NF-KB [21] muuttaa niiden luontaisen toiminnan.

ERa /β ovat ligandi transkriptiotekijöitä, jotka kuuluvat superperheen nukleaarihormonireseptorit (ET) [22] ja sitovat 17β-estradioli (E2) säädellä geenien lisääntymiseen ja solujen kasvun ja lisääntymisen [23]. Ligandin sitoutuessa ER muodostaa toiminnallisen homodimeerin ja sitoo sen sukulais-elementteihin. Mielenkiintoista on, on ligandista riippuvan vastavuoroisia häiriöitä välillä ER ja AHR signalointia. Esimerkiksi aktivoitua ERa estää AHRC aktiivisuutta

CYP1A1

suoran proteiini-proteiini vuorovaikutusten, kutsutaan

transrepression

[11]. Kääntäen, TCDD: n anti-estrogeenisiä ominaisuuksia ovat hyvin dokumentoitu se tukahduttaa E2-indusoituva geenien

pS2

ja

katepsiini-D (CAT-D) B [24], [25], [26 ]. Kuitenkin mekanismit sorron esiintyvät E2-reagoiva geenit ovat epäselviä. Ehdotettu teorioita tämän tukahduttamisen kuuluvat: (i) kilpailu yhteinen uima yhteistyön aktivaattorien [27]; (Ii) suora säätely alaspäin

CAT-D

transkription läpi ylävirran estävä dioksiinin elementteihin [28]; (Iii) aktivointi TCDD-indusoituva estävä tekijä [28]; (Iv) AHR-riippuvaisen E3-ligaasi, joka heikentää proteiinien ratkaiseva ER-signaloinnin [29], tai; (V) suora transrepression vuorovaikutusta AHR ja ER [11], [19].

Tässä tutkimuksessa selvitimme roolia AHR ja ARNT on ERa-riippuvaista kohdegeenin transkriptiota ihmisen MCF7 rintasyöpä ja ihmisen ECC-1 kohdun limakalvon-kohdunkaulan syövän solulinjoissa. Tuloksemme viittaavat siihen, että AHR ja ARNT toimivat toisistaan ​​riippumatta klo off-kohde sivustoja ja me paljasti, että ARNT ei ole olennainen TCDD-riippuvainen tukahduttaminen ER-signaloinnin. Lisäksi olemme osoittaneet, että ARNT toimii soluspesifisen koaktivaattorikompleksien MCF7-soluissa, ja sen corepressor ECC-1-soluissa. Lopuksi osoitamme, että ARNT Knockdown ei vaikuta pelkästään kertymistä mRNA ja proteiini ERa-kohdegeenien, mutta myös fenotyyppisiä vaikutuksia vaikuttamalla ERa välittämä solujen lisääntymistä.

Tulokset

AHR riippuva tukahduttaminen estrogeenin signaloinnin ECC-1-soluissa

läsnäolo AHR, ARNT ja ERa on dioksiinin indusoituva

CYP1A1

tehostajana ja E2-indusoituva

pS2

promoottori on jo dokumentoitu MCF7-soluissa ja muissa rintasyövän solulinjat [11], [19], [20], [30]. Vaikka alustavat tutkimukset ovat tunnistaneet ECC-1 ihmisen kohdun limakalvon solujen ihanteellinen järjestelmä tutkia dioksiinin häiriöitä estrogeenin signaloinnin [31], [32] erittäin vähän tiedetään koskevat roolit AHR, ARNT ja ER ja niiden vuorovaikutukset tässä solulinjassa . Käytimme Siru määritys varmistua tilan näiden proteiinien on

pS2

promoottori ja

CYP1A1

tehostajana sekä läsnäollessa ja ilman E2 ja TCDD. ECC-1-soluja käsiteltiin DMSO: ssa, 10 nM E2, 2 nM TCDD tai yhdistelmä E2 ja TCDD 45 min. Sen jälkeen, kun kemiallisesti silloittamalla proteiini DNA formaldehydin kanssa, solut otettiin talteen ja sonikoitiin. Leikatut DNA-proteiini-kompleksit saostettiin spesifisiä vasta-aineita AHR, ARNT tai ERa ja eristettiin sitten kompleksit olivat reverse-silloitettu ja DNA alistettiin PCR-monistuksen. Johdonmukaista muiden tutkijoiden havaintoja rintasyöpäsoluissa, havaitsimme rekrytointi AHR ja ARNT ihmisen

CYP1A1

tehostajana on TCDD-riippuvaisella tavalla ja ERa oli suuresti rikastunut vasta hoidon yhdistelmällä 2 nM TCDD ja 10 nM E2 (kuvio 1A). Lisäksi rekrytointi ERa että

pS2

promoottori tapahtuu E2 riippuvalla tavalla, kun taas AHR ja ARNT ovat läsnä käsittelyn jälkeen joko ligandin vaan rikastetaan samanaikaisen hoidon (kuvio 1 B).

Kromatiini immunopresipitaatiomäärityksiä että

CYP1A1

tehostajana (A) ja

pS2

promoottori (B) alueet ECC-1-soluissa käyttäen vasta-aineita kohdistamista AHR, ARNT tai ERa. Soluja käsiteltiin 45 minuutin ajan joko DMSO, E2 (10 nM), TCDD (2 nM) tai yhdistelmä E2 ja TCDD. (C ja D) toiminnallista roolia AHR TCDD-välitteisen transkription. ECC-1-solut transfektoitiin siRNA: t joko GFP (siGFP) negatiivisena kontrollina tai AHR (siAHR # 3 tai siAHR # 4) 24 h ennen ligandin hoidon jälkeen soluja käsiteltiin DMSO, E2 (10 nM), TCDD (2 nM) tai yhdistelmä E2 ja TCDD. MRNA-tasot

pS2

(C) ja

CYP1A1

(D) määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR ja normalisoidaan konstitutiivisesti aktiivista GAPDH ilme. (E) ECC-1-solut transfektoitiin siRNA: n AHR ja korjattu kokosolulysaattien Western Blot-analyysi AHR, ERa ja XAP2 proteiinin tasoja.

Olemme aiemmin osoittaneet, että ERa assosioituu AHRC välittäjänä estradioli-riippuvainen transrepression dioksiinin geenin, transkription [11]. Siksi ryhdyimme määrittää toiminnallinen merkitys AHR estrogeenin-geenin, transkription. Transfektoimme ECC-1-solujen pieni estävä RNA suuntautuu joko AHR (siAHR) tai GFP negatiivinen kontrolli (siGFP). Transfektion jälkeen soluja seerumia 24 tuntia, jonka jälkeen 24 h ligandin hoidon ja sitten korjattu kokonais-mRNA, joka on määrällisesti läpi kvantitatiivista PCR: ää. Kuten odotettua, ablaatio AHR ja yhtäaikainen käsittely 2 nM TCDD ja 10 nM E2 johtaa menetykseen TCDD aiheuttaman tukahduttamisesta

pS2

transkriptio (kuvio 1 C). Kuitenkin menetys AHR ei ollut mitattavissa olevaa vaikutusta perustason tai estrogeeni aktivoitu

pS2

mRNA kertymistä. Kontrollina siRNA spesifisyys, Western-blotit AHR proteiinin osoittavat suuresti vähentynyt ilmentyminen AHR-proteiinin transfektion jälkeen ja muuttumaton proteiinin tasot ERa: n ja XAP2 joka toimi latauskontrollina (kuvio 1E). Nämä osoittavat spesifisyyden siRNA: n AHR, ja että menetys AHR ei vaikuta kertymistä tai liikevaihdon perus ERa-proteiinin tasoja. Lisäksi induktio

CYP1A1

transkription TCDD jälkeen AHR pudotus on heikennetty verrattuna siGFP negatiiviseen kontrolliin (kuvio 1 D). Siten AHR on edellytys TCDD aiheuttama tukahduttaminen E2-reagoiva geenin transkription ja lisääntyneen transkription vaste kombinatorisista hoito johtuu yksinomaan menetys AHR ja muiden otaksuttu transkription määritteet liittyy sen läsnäoloa. Lopuksi saatu oleellisesti identtiset tulokset sekä MCF7 ja ECC-1 solulinjojen seerumin puutteessa tai hiilellä erotettua seerumia olosuhteissa viittaa siihen, että erot solulinjoissa kykyä käydä läpi solusyklin ei vaikuta tätä ilmiötä. Yhdessä nämä tulokset tukevat käsitystä, että ECC-1 solulinja on erinomainen vaihtoehto solumallin tutkia dioksiinin aiheuttama häiriö estrogeenireseptorin signalointi.

ARNT on solun erityinen koaktivaattoria /co-repressori toiminnot

tunnistaminen ARNT kuin koaktivaattoria estrogeenin signalointi [27], [30], rinnakkain tunnettujen transrepressor vaikutuksia TCDD, johti meidät tutkimaan roolia ARNT in TCDD-välitteisen transrepression ER toiminto erilaisissa ihmisen syöpäsolulinjoissa, eli MCF7 ja ECC-1-soluissa. Kautta siRNA suunnattu ARNT ja salatun negatiivinen kontrolli (siSCX), ja myöhemmät qPCR analyysi endogeenisen

pS2

ja

CAT-D

geenin transkriptio, teimme useita mielenkiintoisia havaintoja. Ensinnäkin ARNT näyttää co-repressori ominaisuuksia ECC-1-soluissa. Kertyminen

pS2

(kuvio 2A) ja

CAT-D

(kuvio 2B) mRNA-tasot pahentaa aikana E2 hoitojen jälkeen menetyksen ARNT viittaa solun erityinen toiminto ARNT riippumaton AHR. Lisäksi havaitsimme ilmiötä, jossa on kolme erillistä siRNA suunnattu ARNT (siRNA: n 1 ja 3 on esitetty kuviossa 2A, B ja C). Käytimme ainakin kaksi siRNA: n kaikille muille koeparametreihin olennaisesti identtiset tulokset, mutta tilan säästämiseksi, jäljempänä me vain esittävät tietoja kuvaa käytöstä yhden siRNA. Toiseksi sopusoinnussa havaintojen useiden muiden tutkijoiden, ARNT näkyy koaktivaattoria ominaisuuksien MCF7-soluissa [27], [30]. Todellakin, knockdovvn ARNT proteiinin vaimentaa E2 aiheuttama transkriptio

pS2

(kuvio 2C) ja

CAT-D

(kuvio 2D). Lopuksi, annos-vaste-koe, havaitsimme samanaikainen väheneminen CAT-D-proteiinin tasot kasvavilla pitoisuuksilla TCDD sekä ECC-1 ja MCF7-soluissa (kuvio 2E). Nämä tiedot osoittavat, että ARNT toiminto, koska se liittyy ER signalointi on todennäköisesti määräävät muut tekijät spesifisiä solun ympäristöön.

ECC-1-solujen (A ja B) ja MCF7-solujen (C ja D) transfektoitiin joko salattu siRNA (siSCX) tai siRNA suunnattu ARNT (siARNT # 1 tai siARNT # 3). Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin vehikkelillä (DMSO), E2 (10 nM), TCDD (2 nM) tai yhdistelmä E2 ja TCDD. Geenin ilmentyminen määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä eristyksen jälkeen ja käänteistranskriptio kokonais-RNA.

CAT-D

ja

pS2

ilmaus normalisoitiin konstitutiivisesti aktiivinen 36B4 geeniekspressiota. (E) Western blot-analyysi CAT-D-proteiinin tasot MCF7 ja ECC-1-soluissa. Soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai E2 (10 nM) ja vaihtelevia pitoisuuksia TCDD (kaksikymmentäkaksi, 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM tai 5 nM). 24 tunnin kuluttua hoidon kokosolulysaateista otettiin talteen, ja Western blot analyysit suoritettiin käyttäen vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja CAT-D ja α-tubuliinin. Virhe pylväät edustavat ± S.D. * P 0,05.

Voit selvittää modulaatioon transkriptionaalisen aktiivisuuden käännetty samanlainen proteiinin ilmentymisen profiilit, käytimme Western blot-analyysi visualisoida tasolle CAT-D proteiini jälkeen ARNT knockdown. Solut transfektoitiin ja ligandin käsiteltiin samanlaisissa olosuhteissa kuin qPCR parametrit. Verrattuna sekoitetun negatiivinen kontrolli, CAT-D-proteiinin ilmentymisen jälkeen E2 hoidon pahenee ECC-1-solujen ARNT pudotus (kuvio 3A). Kääntäen, MCF7-solut transfektoitu ARNT siRNA johti pyöristetty ilmaus CAT-D proteiini aikana E2 hoidon (kuvio 3C). Lisäksi ERa pysyivät johdonmukaisesti riippumatta ARNT tilan (kuvio 3A ja C). Tärkeintä on, dioksiinin aiheuttama tukahduttamisesta ER signalointi pidettiin proteiini tason jälkeen ARNT taintumisen (kuvio 3A ja C). Edustaja blotit normalisoitiin a-tubuliinia ja luminesenssi mitattiin GeneTools 4.01.2 ohjelmistoa (Syngene-). Nämä normalisoidut arvot osoittivat kaksinkertainen induktioon CAT-D ECC-1-solujen ARNT Knockdown jälkeen E2 hoidon (kuvio 3B, sarakkeet 2 ja 6), kun taas MCF7-soluissa, knock-down of ARNT johti 40%: n lasku E2-riippuvainen CAT-D ilmentymistä (kuvio 3D, colunms 2 ja 6). Nämä tulokset tarjoavat konkreettisia todisteita siitä, että taso proteiinin ilmentymisen peilaa transkriptionaalista vastetta molemmissa solulinjoissa ja että fysiologiset seuraukset on seurata menetys ARNT.

ECC-1 (A ja B) ja MCF7 (C ja D ) soluja transfektoitiin joko siSCX tai siARNT ja ligandin käsiteltiin, kuten on kuvattu kuviossa 2. (A ja C) edustaja Western-blotit ARNT, CAT-D, ERa ja α-tubuliinin proteiinin tasoja. Pylväsdiagrammeja CAT-D-proteiinin tasot ECC-1 (B) ja MCF7 (D) solujen normalisoinnin jälkeen luminesenssi arvot a-tubuliinia. Avoimet pylväät edustavat ligandi hoitojen jälkeen siRNA on salattu negatiivinen kontrolli (siSCX) ja suljettu (mustat) palkit edustavat ligandin hoitojen jälkeen siRNA kohteeseen ARNT (siARNT). Kokeet suoritettiin kolmesti olennaisesti sama kohtalo.

Nämä yllättävät tulokset yhdistettynä havainto, että TCDD aiheuttama tukahduttaminen ER-signaloinnin säilyy molemmissa solulinjoissa jälkeen ARNT taintumisen (kuvio 2 ja 3 ) mikä tarjoaa todisteita siitä, että ARNT ei tarvita TCDD /AHR-riippuvainen tukahduttaminen ERa signalointi. Tätä hypoteesia tukee kyky selektiivisen aryylihiilivetyreseptori modulaattori (SAHRM) tukahduttaa estrogeenia signalointi. Olemme tutkineet kykyä tunnettujen SAHRM, DiMNF [33], [34] tukahduttamiseksi E2-välitteisen transkription RT-PCR: MCF7 ja ECC-1-soluissa (kuvio 4). DiMNF oli yhtä tehokas tukahduttaa CAT-D mRNA kerääntymisen TCDD. DiMNF on voimakas antagonisti AHR ja tehokkaasti siirtää TCDD reseptorista 1 uM [34]. Lisäksi, DiMNF ei indusoimaan AHR-ARNT dioksiinin vaste-elementti muodostumista elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä, viittaa siihen, että AHR-ARNT dimerisaatio ei voi esiintyä, [34], joten on todennäköistä, että AHR: n transrepression toiminto on täysin ARNT riippumaton.

vaikutus 1 uM DiMNF E2-indusoituva CAT-D ilmentymistä MCF7 ja ECC-1-soluissa. Soluja käsiteltiin osoitetuilla ligandien 24 tuntia ennen RNA: n eristämistä. Geenin ilmentyminen määritettiin edellä kuvatulla tavalla. Virhe pylväät edustavat ± S.D. * P 0,05.

ARNT pudotus aiheuttaa kasvavia lisääntymistä ECC-1-soluissa ja vähentynyt proliferaatio MCF7-soluissa

Herkkyys estrogeenin on linkitetty leviämisen ja solutransformaatiota ER- karsinooman solut [35]. Sen selvittämiseksi, ARNT voi vaikuttaa E2-riippuvaisen soluproliferaation, suoritimme proliferaatiomäärityksillä ECC-1 ja MCF7-soluissa jälkeen ARNT siRNA hoidon. Vastaa meidän kvantitatiivinen PCR ja Western blot tietoja, ECC1 ja MCF7-solut näytetään muuttunut hinnat leviämisen jälkeen ARNT pudotus verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu sekoitetun negatiivisen kontrollin siRNA (kuvio 5A ja B). Knockdovvn ARNT tarkkailtiin 72 tuntia ja merkittävät knock-down havaittu pysyi ennallaan lähinnä kunakin ajankohtana (kuvio 5C). Kumpikaan solulinjan näkyy muuttunutta kasvutavat kunnes 48 tunnin kohdalla. 48 tuntia, ECC-1-soluja sekä siSCX ja siARNT olosuhteissa osoittivat vaatimatonta proliferaatiota vasteena E2 hoitoja. Tällä 96 tunnin kohdalla, oli erittäin merkitsevä lisäys E2-indusoituva leviämisen ECC-1-soluja käsiteltiin siARNT verrattuna salattu ohjaus käsiteltyjen solujen. Kiehtovan, ARNT knockdown lisääntynyt tyvi kasvu ja aiheutti pahentunut vastauksen E2 kanssa solujen määrä lähes kaksinkertaistunut siARNT E2 hoitoja verrattuna siSCX E2 hoitoja. Kääntäen, MCF7-solut osoittivat alentunutta proliferaationopeus jälkeen ARNT taintumisen (kuvio 5B). Kasvuvauhdin eivät olleet merkittävästi erilaiset, kunnes 48 h ajankohtana, jolloin E2-indusoituva proliferatiivista vastetta salattu negatiivinen kontrolli oli ilmeinen. SiARNT transfektoidut solut oli pyöristetty kasvureaktio aikana sekä ohjaus ja E2 olosuhteissa. 96 tunnin kuluttua solut alkoivat menettää herkkyyttä E2 ja solminut senescent tilaan. Onko tämä johtui kasvuolosuhteet on epäselvä. Nämä tiedot tukevat edelleen hypoteesia, että ARNT on co-repressori ominaisuuksia ECC-1-soluissa ja koaktivaattoria ominaisuuksia MCF7-soluissa. Lisäksi herkkyys E2 ja vastavuoroinen kasvua vasteet osoittivat kahden solulinjoja ovat bona fide fenotyyppisiä vaikutuksia ARNT ablaation.

ECC-1 (A) ja MCF7 (B) transfektoitiin joko siSCX tai siARNT 6 tuntia, sitten trypsinoitiin ja siirrostettiin 10000 solua /kuoppa 12-kuoppaisilla levyillä. Kaksikymmentäneljä tuntia ymppäyksen jälkeen solut käsiteltiin joko DMSO tai E2 (10 nM) ja solumäärät tehtiin 0, 48 ja 96 tunnin kuluttua hoitojen kanssa Fuchs-Rosenthal Counting jaosto. Tällä 48 h aikapisteessä soluja käsiteltiin toisen kerran 10 nM E2. Kokeet tehtiin kolmena kappaleena ja kussakin kokeessa laskettiin kolme kertaa. (C) Western blot-analyysi ARNT jälkeen siRNA knock-down paljastaa, että merkittäviä seurannaisvaikutuksia alas saavutettiin ja jatkuu yli 72 tuntia ajan. Virhe pylväät edustavat ± S.D. * P 0,05.

Keskustelu

Monet ympäristömyrkyt, jotka toimivat aktivaattorit aryylihiilivetyreseptori tunnetaan otaksuttu hormonitoimintaa häiritseviä yhdisteitä. Altistuminen monet näistä yhdisteistä esiintyvät päivittäin ja se edustaa merkittävää riskiä ihmisten terveydelle. Erityisesti tukahduttava vaikutus aikaansaama ligandit AHR on ER signalointi on hyvin dokumentoitu [11], [19], [36], [37], [38]. Muut raportit ovat kuvanneet koaktivaattoria potentiaali ARNT ER-välitteisen transkription [27]. Huolimatta yhä enemmän todisteita tukemaan rooleja AHR ja ARNT ER-toiminto, tiedetään vähän normaalia fysiologinen rooli näiden proteiinien kuin ne liittyvät estrogeenin signalointia tai molekyyli- determinantit myrkyllisen aineen aiheuttaman transrepression ER toiminnon AHR. Lopuksi, tässä tutkimuksessa kävi ilmi, että ARNT ei ole olennainen AHR välittämää off-tavoite transrepression. Jotta rajata molekyylitason mekanismit AHR välittämää transrepression yritimme irrottaa AHR ja ARNT toimintoa ER-positiivisia ihmisen syöpäsolujen linjat. Näin olemme havainneet, että ARNT vaimentaa aktivoitu ER-kohdegeenin transkription ECC-1-soluissa, on suorassa ristiriidassa sen koaktivaattori kuvattu toiminto MCF7-soluissa [27].

ARNT alun perin tunnistettiin bona fide transkriptiotekijä [39] ja dimerisaation kumppani AHR [40]. Beyond sen kanoninen transkriptiotekijän toiminto, ARNT voi olla vuorovaikutuksessa useiden muiden transkriptiotekijöiden, kuten ERa [11] ja sen koaktivaattoria toiminto ER signalointia on kuvattu hyvin [27], [30]. Siksi, odotimme, että knockdovvn ARNT ECC-1 kohdun limakalvon-kohdunkaulan syöpäsolut johtaisi heikkenemiseen ER kohdegeenin ilmentymisen. Lisääntyneet mRNA kertymistä, proteiinin ilmentymisen ja E2-indusoituva leviämisen viittaa vahvasti siihen, että ARNT toimii transkription co-repressori tässä solulinjassa. Molekyylimekanismin (t) taustalla havaitut erot MCF7 ja ECC-1-soluissa todennäköisesti liittyy eroihin laatu ja koostumus liitännäinen transkriptiokoneiston palvelukseen ARNT kussakin solulinjassa. ARNT esittelee useita eri proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen verkkotunnuksia rekrytointi koaktivaattoria proteiineja, kuten karboksipään transaktivaatiodomeenin [18], sen PAS-B-alue [41] ja sen perus-helix-loop-helix domain [12] . Lisäksi, assosiaation ARNT ja transkription co-repressoriproteiinia, SMRT on osoitettu [42]. Uskomme kuitenkin, että tämä on ensimmäinen osoitus siitä, että ARNT on kaksi koaktivaattoria /co-repressori toimii soluspesifisen tavalla (kuvio 6). Lisäksi vaikutukset näiden transkription vaikutuksia voidaan havaita luennan ja fenotyyppiset tasolla.

Läsnäolo E2 helpottaa kokoonpanoa transkription määritteet, jotka aiheuttavat transkriptio E2-reagoivien geenien. Ligandi aktivoitu AHR tukahduttaa ER-signaloinnin riippumaton ARNT. Menetys ARNT ECC-1-soluissa, joissa se toimii yhteistyössä repressori, johtaa lisääntynyt herkkyys E2 ja lisääntynyt transkription aktiivisuus ER säännelty geenejä. Menetys ARNT MCF7-soluissa, joissa se toimii koaktivaattoria, johtaa laski herkkyys E2 ja vähentää transkription aktiivisuutta ER säännelty geenejä.

Useita malleja on esitetty hypoteesi selittää molekyylitasolla mekanismit transkriptiotekijä välittämän cross-talk, erityisesti kyky yhden transkriptiotekijän tukahduttamiseksi toisen tehtävänä [18]. Reugg ja työtovereiden, muiden muassa, ovat ehdottaneet, että transkriptiotekijä välittämä transrepression saattaa johtua kilpailun rajoitetun altaan koaktivaattoria proteiinit [27]. Kuitenkin tunnistaminen ARNT toisena repressori ECC-1-soluissa unmasks monimutkaisempi mekanismi transrepression at E2-indusoituva geenit sitten koaktivaattoria kilpailu malli esittää. Vaikka nämä tiedot eivät lopullisesti vääräksi tätä mallia, uskomme, että tiedot viittaavat siihen, että on epätodennäköistä, koska koaktivaattoria kilpailu ei voi selittää TCDD-indusoituvaa sorto ECC-1 soluja aktivoituu AHR pitäisi litinä ARNT n co-repressori toiminto. Lisäksi, ARNT, proteiini, joka on osoittanut, että kyky rekrytoida lukuisia co-aktivaattorit [12], [15], [17], [41], [43], [44] olisi laitonta samanlainen vaikutus kuin ligandi-aktivoitujen AHR jos koaktivaattoria altaat olivat niin rajallinen, että kilpailu haittaavat yksittäisten transkriptiotekijän toiminto. Tämä ei selvästikään ole asianlaita ECC-1-solulinjassa.

Kokeellinen Edellä esitetty osoittaa, että AHR ei vaadi ARNT välittäjänä sen tavoitteen ulkopuolella transrepressor vaikutuksia. Menetys ARNT sekä MCF7 ja ECC-1-soluissa ei kumota tukahduttava vaikutus TCDD on E2-indusoituvan transkription ja proteiinin ilmentyminen (kuviot 2 ja 3). Vaikutukset DiMNF sidottu AHR ovat riippumattomia dioksiinin elementin sitova tumauutteesta soluista käsitelty DiMNF ei hidastaa liikkumista leimatun dioksiinin elementin anturi geeli shift määrityksissä [34]. Lisäksi AHR-ARNT dimerisaatio on edellytys DNA: ta sitovaa, mikä viittaa siihen, että tämä ei voi tapahtua, kun läsnä on DiMNF. Tämä merkitsee paradigman muutosta ymmärrystämme AHR funktion ja on vaikutuksia käyttöä ja tehokkuutta selektiivisiä AHR modulaattorit. Itse asiassa uusi AHR antagonisti on osoittautunut olevan voimakas stimulaattori AHR-riippuvaisen kantasolujen laajentamiseen [45]. Siten antagonistit, jotka eivät saada AHR-ARNT dimerisaatio voisi olla tehokkaampaa repressors ER toiminto kuin puhdas agonistit kuten AHR ei olisi squelched Arnt sitova. SARHM DiMNF on voimakas AHR-riippuvainen repressori sytokiinisignaloinnin [33], [34]. Lisäksi DiMNF tehosi tukahduta ER-säännelty kohdegeenin ilmentyminen (kuva 4). Molekyylimallinnus tutkimukset osoittavat, että DiMNF muodostaa ylimääräinen vetysidos kanssa AHR at Thr289 [34], ominaisuus ei jaeta agonistivaikutusta α-naphthoflavone viittaa siihen, että DiMNF-AHR antaa ainutlaatuisen vahvistus. Siten flavonoidit ovat luokka yhdisteitä, jotka voivat olla houkuttelevia kohteita lisäkokeita ja kehitys määrittää niiden vaikutuksista ER kohdegeenin ilmentymisen.

kokeellista näyttöä osoittaa TCDD riippuva repressorin toiminto AHR ja TCDD /AHR riippumaton koaktivaattoria /co-repressorin toiminto ARNT estrogeenin signalointi. Nämä tulokset antavat meille lisää tietoa mekanismeihin transkriptiotekijän ylikuulumisen ja otaksuttu terapeuttisia kohteita estrogeeni-positiivisia syöpiä. Yhdessä meidän tiedot viittaavat monimutkaisempi mekanismi ARNT toiminta ja AHR välittämä transrepression ER-signaloinnin kuin aiemmin ehdottanut. Kliininen hyöty Näiden havaintojen vielä testataan ja tehdään tulevaisuuden tutkimuksissa.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit ja Soluviljely

3 ’, 4’ dimetoksi-α-naphthoflavone (DiMNF) saatiin kaupallisesti (Indofine Chemical Co., Hillsborough, NJ). ECC-1 ja MCF7-solut (ATCC) ylläpidettiin Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM, BioWhittaker, Lonza,), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS, HyClone, Perbio, Thermo Fisher Scientific Inc.) ja jota oli täydennetty 100 yksiköllä /ml kalium penisilliini-100 ug /ml streptomysiiniä sulfaattia (BioWhittaker, Lonza) 37 ° C: ssa, 20% O

2, ja 5% CO

2. Kaksikymmentäneljä tuntia ennen kokeellista häiriön, solut pestiin 2 x PBS: llä, ja ylläpidetään fenoli-Red-vapaa media ilman FBS [46].

Kromatiini immunosaostusmäärityksissä.

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) määritykset suoritettiin, kuten on kuvattu aiemmin [17]. Lyhyesti, solut maljattiin 150 cm

2 ruokia ja seerumin puutteessa 24 tuntia ennen käsittelyä. Solujen käsittely tehtiin seerumittomassa elatusaineessa, jota oli täydennetty 3 mg /ml naudan seerumin albumiinia 45 minuuttia. Kromatiinin kompleksit olivat kemiallisesti silloitettu käyttäen 1% formaldehydiä /0,7 mol /l HEPES-liuosta (lopullinen pitoisuus), pH 7,8, ja kompleksit sonikoitiin, jolloin saatiin DNA-fragmentit, 200-900 bp koon. Komplekseja esikirkastettiin proteiini A agaroosihartsi (Calbiochem) ja inkuboitiin yön yli spesifisten vasta-aineiden [ERa kanin polyklonaalisia tai ARNT vuohen polyklonaalinen (Santa Cruz) tai AHR kaniinin polyklonaalista kuvattu aiemmin [47]. Immunoadsorboitiin kompleksit vangittiin proteiini A-agaroosi-hartsi ja pestiin kahdesti 0,5 × RIPA, jota seurasi kolme pesua 10 mmol /L Tris-HCI (pH 8,0) ja 1 mmol /l EDTA: a. Näytteet eluoitiin hartsista käyttäen 100 mmol /l NaHCO3 ja 1% SDS, ja ristisidosten purettiin 65 ° C: ssa yön yli. Näytteet olivat fenoli-kloroformilla ja saostettiin 70% EtOH ja Pellet Paint (Novagen). Immuno-adsorboitu DNA analysoitiin PCR: llä. Alukkeet

CYP1A1

edistäjä ja pS2-promoottori on kuvattu aikaisemmin [20], [48].

Transient transfektiot

MCF7 ja ECC-1-soluja viljeltiin edellä kuvatuissa olosuhteissa, kunnes noin 70% konfluentteja ennen siRNA transfektiota. Solut transfektoitiin joko vihreä fluoresoiva proteiini (GFP) siRNA (Dharmacon), salattu (SCX) siRNA (DS Salatut negatiivinen kontrolli siRNA, Integrated DNA Technologies Inc.), AHR siRNA (Dharmacon) tai ARNT siRNA (Integrated DNA Technologies Inc., Cat. No. HSC.RNAI.N187426.11.1, HSC.RNAI.N178426.11.2, HSC.RNAI.N178426.11.3, siARNT 1, siARNT 2 ja siARNT 3 vastaavasti). Solut transfektoitiin 10-15 nM siRNA käyttäen 0,3% (v /v) Trifectin (Integrated DNA Technologies) valmistajan protokollan. Solujen annettiin inkuboitua transfektioseos 6 h ajan 37 ° C: ssa ja 5% CO

2, jonka jälkeen transfektioseos poistettiin ja korvattiin seerumittomalla väliaineella.

Käänteinen transkriptio ja Real- PCR

Käänteinen transkriptio ja real-time PCR suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [11]. Lyhyesti, soluja käsiteltiin joko DMSO: lla (Me

2SO), TCDD (2 nM), E2 (10 nM), tai yhdistelmä TCDD ja E2, 24 tuntia.