Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kantasolujen kaltaisia ​​soluja (CSCS) /syöpä-initiaiting soluja (CIC) on määritelty pieni väestö syöpäsolut ovat kyky uusiutua, erilaistumista ja korkeasta kasvaimen aloittamista kyky. CSCS /CIC munasarjasyövän on eristetty puolella väestöstä (SP) analyysi, ALDEFLUOR määritys ja käyttämällä solunpintamarkkereiden. Nämä lähestymistavat eivät ole lopullisia markkereita CSCS /CIC, ja se on tarpeen tarkentaa viime menetelmät niiden puhdistetaan korkeammin CSCS /CIC. Tässä tutkimuksessa kartoitettiin SP-soluissa ja aldehydi dehydrogenese kirkkaita (ALDH

Br) soluja munasarjasyöpäsoluja. Sekä SP-soluissa ja ALDH

Br-solut oli korkeampi kasvaimeen aloittamista kyky ja korkea ilmentymistaso kantasolun markkeri,

sukupuolen määrittävän alueen Y-box 2 (Sox2) B, kuin valtaväestön (MP ) soluihin ja ALDH

Low soluja, tässä järjestyksessä. Analysoimme AH ja ALDH

Br päällekkäisiä väestöstä (SP /ALDH

Br), ja SP /ALDH

Br väestöstä oli korkeampi kasvaimen aloittamista kyky kuin SP solut tai ALDH

Br-solut , joka mahdollistaa aloittamisen kasvaimen liittyi vain 10

2-soluissa. Lisäksi SP /ADLH

Br väestö osoitti korkeamman palloja muodostavan kyky, sisplatiini vastus, adiposyyttien erilaistumiseen kyky ja ilmaus

Sox2

kuin SP /ALDH

Low, MP /ALDH

Br ja MP /ALDH

Low soluja. Gene knockdovvn Sox2 tukahdutti kasvaimeen aloittamista munasarjasyöpäsoluja. SP /ALDH

Br väestö havaittiin useita gynekologinen syöpäsoluissa suhteissa 0,1% HEC-1 endomet- adenokarsinoomasolujen 1% MCAS munasarja mucinous adenokarsinoomasolua. Yhdessä käyttö SP ja ALDH

Br päällekkäisiä väestö on lupaava lähestymistapa eristää hyvin puhdistettua CSCS /CIC ja Sox2 saattaa olla uusi toiminnallinen merkkiaine munasarjojen CSCS /CIC.

Citation: Yasuda K , Torigoe T, Morita R, Kuroda T, Takahashi A, Matsuzaki J, et al. (2013) munasarjasyöpä kantasoluja Rikastettu Side väestö- ja aldehydidehydrogenaasi Kirkas Päällekkäiset Population. PLoS ONE 8 (8): e68187. doi: 10,1371 /journal.pone.0068187

Toimittaja: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 joulukuu 2012; Hyväksytty: 28 toukokuu 2013; Julkaistu: 13 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Yasuda et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Apurahat-in-tuki Scientific Research opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan (myöntää nro. 16209013, 17016061 ja 15659097) Harjoittelun Application Research Japan Science and Technology Agency, ja Cancer Research (15-17 ja 19-14) alkaen terveysministeriön, Labour and Welfare of Japan, Onon Cancer Research Fund (NS) ja Takeda Science Foundation (YH). Tätä työtä tukee osittain National Cancer Center tutkimus- ja kehitysrahasto (23-A-44). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syöpä kantasolujen kaltaisia ​​soluja (CSCS) /syöpää aloittamista solujen (CIC) on määritelty pieni populaatio syöpäsolujen, joilla on ominaisuuksia korkean kasvain aloittamista kyky, itseuudistumiseen kyky ja erilaistumista kyky [1] – [3]. Lisäksi CSCS /CIC on osoitettu olevan vastustuskykyisiä standardi syövän hoitomuotoja kuten kemoterapiaa ja sädehoitoa; siksi, CSCS /CIC ovat vastuussa syövän uusiutumisen hoidon jälkeen [4], [5]. Useita lähestymistapoja on kuvattu tunnistamiseksi CSCS /CIC, mukaan lukien eristäminen CSC /CIC-erityisiä solunpintamarkkeria ilmaisu (esim CD44, CD133, CD166), havaitseminen puolella väestöstä (SP) solun fenotyyppi Hoechst 33342 syrjäytyminen ja havaitseminen aldehydidehydrogenaasin 1 (ALDH1) aktiivisuus ALDEFLUOR määrityksessä [6]. Kuitenkin, ekspressio solun pinnalla, SP-solut ja ilmentyminen ALDH1 eivät liity kasvaimeen aloittamista kyky joissakin raporteissa [7] – [9]. Nämä havainnot viittaavat siten siihen, että nämä kantasolujen merkkiaineita (solupinnan, SP solut ja ALDH1) eivät toimi ja ei tarvita ylläpitoa CSCS /CIC. Näitä markkereita ei ehkä määritellä korkea tuumorigeenisia CSCS /CIC, ja nämä merkit ovat siis pelkästään sijaismarkkereita CSCS /CIC. Siksi toiminnallinen ei-korvikemarkkerina joka on välttämätön ylläpito CSCS /CIC odotetaan.

Munasarjasyöpä on yksi tärkeimmistä syöpäsairauksia ja aiheuttaa kuoleman yli miljoona ihmistä maailmassa vuosittain [10 ]. Lisäksi, useimmilla potilailla on kurja jaksot askites, erityisesti myöhemmissä vaiheissa. Parantaa kliinistä munasarjasyövän, munasarjasyövän kantasolututkimuksen on noussut hiljattain aihe. CD44 solunpintamarkkeria, SP solut ja ALDH

Br soluissa on raportoitu kantasolujen merkkiaineita gynekologinen maligniteettien käyttämällä solulinjoja OVCAR3, HEC-1 ja muut linjat ja ensisijaisuuden näytteitä [11] – [14], ja CSC /CIC tutkimus voi parantaa tulos kehittynyt munasarjasyöpä potilaille.

parantamiseksi menetelmiä eristämiseksi hyvin puhdistettua munasarjojen CSCS /CIC, olemme analysoineet yhdistelmä tunnettujen munasarjojen CSC /CIC markkereita. Analysoimme munasarjasyövän solulinjoissa SP analyysi ja ALDEFLUOR määritys ja totesi, että SP-soluissa ja ALDH

Br-solut olivat korkeammat tuumorigeenisia kuin valtaväestön (MP) solut ja ALDH

Low soluja, tässä järjestyksessä. Huomasimme, että päällekkäiset populaatio SP solujen ja ALDH

Br solua (SP /ALDH

Br) olivat erittäin tuumorigeenisiä. Ja huomasimme, että

Sox2

ilmaistiin SP /ALDH

Br väestö korkeammalla tasolla, ja geeni knockdovvn

Sox2

kumottu kasvaimeen aloittamista munasarjasyöpäsoluja. Siksi Sox2 saattaa olla uusi toiminnallinen merkkiaine munasarjojen CSCS /CIC ja SP /ALDH

Br väestö sopii paremmin populaation analysointia varten munasarjojen CSCS /CIC kuin SP soluja tai ALDH

Br soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Hiiriä seurattiin ja kokeita mukaisesti ohjeiden ja hyväksynnän jälkeen komitean Sapporo Medical University School of Medicine, Animal koe keskus alla luvan numero 08-006. Jos jonkin eläimen huomataan epäterveellistä tai sairaat nopeasti lopetettiin. Immunohistokemiallinen värjäys hyväksyi tutkimuksen Institutional Review Boards (IRB) Sapporo Medical University Hospital. Saimme kirjallinen suostumus kaikilta potilailta ohjeiden mukaan ja Helsingin julistuksen.

Solulinjat ja kulttuuri

Ihmisen munasarjojen solulinjoissa (MCAS, HTBoA, OVCAR3, OVSAHO) ja ihmisen kohdun limakalvon karsinooma (HEC-1) -solut saatiin ATCC: stä (Manassas, VA, USA). MCAS ja HEC-1-soluja ylläpidettiin Minimi Essential Medium (MEM) (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). HTBoA ja OVCAR3 soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). OVSAHO soluja pidettiin RPMI1640-alustassa (Sigma-Aldrich). Kukin solulinja, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja viljeltiin kostutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa.

Side väestöstä (SP) määritys

Side väestöstä (SP) analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu joitakin muutoksia [15], [16]. Hoechst 33342 (Lonza, Walkersville, MD, USA) väriainetta käytettiin konsentraatiossa 2,5 tai 5,0 ug /ml läsnä tai poissa ollessa verapamiilin (50 mM, Sigma-Aldrich) estäjänä ABC transporter. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 60 min tai 90 min jatkuvasti ravistellen. Miljoona värjätyt solut analysoitiin FACS Aria II (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Hoechst 33342 väriaine viritettiin 357 nm: ssä ja sen fluoresenssi analysoitiin dual aallonpituuksilla (sininen, 402-446 nm; punainen, 650-670 nm).

ALDEFLUOR määritys

Aldehydi (ALDH) aktiivisuus havaittiin käyttäen ALDEFLUOR iinianalyysikitissä (StemCell Technologies) mukaisesti valmistajan protokollan [17]. Solut värjättiin bodipy-aminoasetaldehydi (BAAA) 1,5 mM, ja inkuboitiin 30 min 37 ° C: ssa. Estäjä ALDH1, dietyyliamino- bentsaldehydiä (DEAB), on a10-kertainen mooliylimäärä käytettiin negatiivisena kontrollina. Yksi miljoonaa värjätyt solut analysoitiin FACS: lla Aria II. Kirkkaasti fluoresoiva ALDH1 ilmentävien solujen (ALDH1

Br) havaittiin vihreän fluoresenssin kanava (520-540 nm).

SP ja ALDEFLUOR dual värjäys

Solut värjättiin Hoechst 33342 väriaine ja värjätään BAAA. Miljoona SP ja ALDEFLUOR-dual-värjätyt solut analysoitiin FACS Aria II. Solut jaettiin kolmeen ryhmään sen mukaan ALDH intensiteetin (ALDH

Br (ALDH kirkas), ALDH

Mid (ALDH keskellä), ALDH

Low (ALDH matala)), sitten analysoitiin SP määrityksessä.

immunohistokemiallinen värjäys

immunohistokemiallinen värjäys käyttäen formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut leikkeet kirurgisesti resektoitiin munasarjasyövän kudosta suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [18]. Anti-ALDH1 hiiren vasta-ainetta käytettiin 250-kertainen laimennus. Anti-ABCG2 kanin polyklonaalista vasta-ainetta (Sigma-Aldrich) käytettiin 5 ug /ml. Peroksidaasilla leimattua vuohen anti-kanin polyklonaalista vasta-ainetta (Nichirei, Tokio, Japani) käytettiin valmistajan protokollan ja visualisoitiin DAB. Alkalisella fosfataasilla leimattua vuohen anti-hiiri-polyklonaalista vasta-ainetta (Nichirei) käytettiin valmistajan protokollan ja visualisoitiin New Fuchsin (Nichirei). Kalvo ruskea värjäytyminen arvioitiin positiiviseksi värjäytymistä ABCG2, ja solulimassa punainen värjäytyminen arvioitiin positiiviseksi värjäytymistä ALDH1.

Vieraslajisiirteen elinsiirron

Lajittelu solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen konsentraatioissa 10

2-10

4 solua per 50 ui PBS: ää, ja sekoitetaan sitten 50 ui Matrigel (BD Biosciences). Solu-matrigeeliä seos injektoitiin ihon alle tilaa 6-viikon ikäisiä Ei-lihava diabeettinen /severe combined immuuni-puutos (NOD /SCID) hiiriä (NOD.CB17-Prdkcscid /J, Charles River Laboratory, Yokohama, Japani) nukutuksessa. Kasvaimen kasvua seurattiin viikoittain, ja tuumorin tilavuus laskettiin XY

2/2 (X = pitkä akseli, Y = lyhyt akseli).

Sphere muodostumista määrityksessä

Pyöreät pesäkemuodostusta suoritettiin käyttäen CSC Complete Recombinan Medium (Cell Systems Corporation, Kirkland, WA, USA). SP /ALDH

Br, SP /ALDH

Low, MP /ALDH

Br ja MP /ALDH

Low solut maljattiin 10

3 solua per kuoppa 6-kuoppaisille ultra-low kiinnityslevyt (Corning Inc., Corning, NY, 14831) ja viljeltiin 10 päivää. Morfologia solujen arvioitiin ja kuvat on otettu valomikroskoopilla joka päivä. Pyöreä soluklusterien suurempia kuin 100 um tuomitaan aloilla.

solunelinkykyisyysmääritys

solunelinkykyisyysmääritys, SP /ALDH

Br, SP /ALDH

Low, MP /ALDH

Br ja MP /ALDH

Low soluja eristettiin. Sitten solut maljattiin 1000 solua per 96-kuoppaiselle levylle 1 päivä ja sitten käsiteltiin sisplatiinin kanssa 3 päivää useita pitoisuuksia. Tämän jälkeen solujen elinkelpoisuus tutkittiin käyttäen Esisekoita WST-1 Cell Proliferation Assay System (Takara Bio Inc., Otsu, Japani) mukaan valmistajan protokollan.

adiposyyttien erilaistumisen määritys

adiposyyttien erilaistuminen määritys, SP /ALDH

Br, SP /ALDH

Low, MP /ALDH

Br ja MP /ALDH

Low soluja eristettiin. Solut maljattiin 10000 solua per 24-kuoppalevylle, ja niitä kasvatettiin seerumivapaassa vähennetty RPMI:DMEM (01:01), alustaa, joka sisälsi 0,5 mM trans-retinoiinihappo (Sigma-Aldrich) ja 50 nM insuliinia (Sigma-Aldrich) ja 2 päivää, jonka jälkeen lisättiin rasvakudoksen erilaistumisen alustaa, joka sisälsi 170 nM insuliinia, 2 nM trijodityroniini ja 0,5 mM rosiglitatsoni [19]. Soluja ylläpidetään väliaineessa 5 päivää ja neutraali lipidi kertymistä havaittiin 4% formaldehydiä kiinnitettyjä soluja käyttäen Oil red O (Sigma-Aldrich) värjäys. Lipid värjäytyminen havaittiin käyttäen mikroskooppia, ja rasva-värjätään solut laskettiin.

Sox2

mRNA pudotus siRNA

Sox2

geeni pudotus koe suoritettiin käyttämällä sirna (siRNA). Sox2 siRNA (NM003106) ja negatiivinen kontrolli siRNA hankittiin Life Technologies. MCAS solut ympättiin 24-kuoppalevylle, ja transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine RNAi max (Life Technologies) Opti-MEM mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin solut analysoitiin ilmentymisen

Sox2

,

ALDH1A1

ja

ABCG2

RT-PCR: llä.

Käänteinen transkriptio-polymeraasi ketjureaktio (RT-PCR) analyysi

Gene knockdovvn Sox2 varmistettiin RT-PCR: llä. Eristäminen RNA ja RT-PCR-analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Lämpötilasyklit olosuhteet olivat 94 ° C 2 min, jota seurasi 35 sykliä 15 s ajan 94 ° C: ssa, 30 s 60 ° C: ssa, ja 30 s 72 ° C: ssa. Käytetyt alukeparit RT-PCR-analyysi oli 5′-TGTTAGCTGATGCCGACTTG-3 ’ja 5′-TTCTTAGCCCGCTCAACACT-3’ varten

ALDH1A1

, jonka odotettu PCR-tuotteen koko 154 emäsparia (bps), 5′-CACCTTATTGGCCTCAGGAA -3 ’ja 5’CCTGCTTGGAAGGCTCTATG-3’ varten

ABCG2

, jonka odotettu PCR-tuotteen koko 206 bps, 5′-CATGATGGAGACGGAGCTGA-3 ’ja 5′-ACCCCGCTCGCCATGCTATT-3’ varten

Sox2

, jonka odotettu PCR-tuotteen koko 410 bps, 5′-GCAGTCAACAGTCGAAGAAGG-3 ’, ja 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′ ja 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 ’ja

glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH)

, jonka odotettu tuote koko 452 bps.

GAPDH

käytettiin sisäisenä kontrollina.

Quantitative reaaliaikainen PCR-analyysi (qPCR) B

Quantitative real-time PCR suoritettiin käyttäen ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) valmistajan protokollan.

Sox2

(Hs01053049_s1),

ABCG2

(Hs00184979_m1),

CD44

(Hs01075861_m1),

PROM1

(Hs01009250_m1) ja

ABCB1

(Hs00184500_m1) alukkeet ja koettimet suunniteltiin valmistaja (TaqMan Gene ilmentämismääritykset; Applied Biosystems). Lämpökäsittelyyn suoritettiin käyttäen 40 sykliä 95 ° C 15 sekunnin ajan ja sen jälkeen 60 ° C: ssa 1 min. Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena, ja normalisoitiin

GAPDH

geeni sisäisenä kontrollina.

Tulokset

CSCS /CIC rikastuneet SP-soluissa

munasarjojen CSCS /CIC on eristetty kuin SP soluja ihmisen ja hiirten munasarjasyövän linjan soluihin [11], [21]. Analysoimme useita gynekologisia caner solulinjojen ihmisen munasarjan solulinjat (MCAS, HTBoA, OVCAR3, OVSAHO) ja ihmisen kohtukarsinooma (HEC-1) solulinjassa (kuvio 1A ja kuvio S1). SP-soluissa voitiin havaita kaikissa linjan soluissa ja SP solujen suhde oli vaihtelivat 1,2%: sta 2,6%. Koska ei ole raportin, jossa kuvataan ihmisen mucinous adenokarsinooman linja solun MCAS, me täten analysoidaan edelleen SP peräisin olevat solut MCAS. CSCS /CIC on korkea kasvaimeen aloittamista kyky [22], me siis pistetään sarjalaimennetun lukumäärät SP solujen ja MP solujen selkään kolmen NOD /SCID-hiiriin ihon alle tutkia kasvaimeen aloittamista kyky. Kaikissa kolmessa hiiret, kasvaimet aloitettiin 10

4 SP soluja, ja kasvaimet aloitettiin 10

4 MP soluja 2 3 hiirtä. Yhdessä hiiri, kasvain aloitettiin 10

3 SP-soluissa, kun taas 10

3 MP soluja ei tehnyt kasvain (taulukko 1). Kasvainten koon peräisin SP-soluissa oli merkittävästi suurempi kuin kasvaimia, jotka ovat peräisin MT-soluja (kuvio 1 B). Ilmentymistasojen kantasolujen merkkiaineita tutkittiin qPCR, ja SP-soluja, jotka ovat peräisin MCAS solut ilmensivät korkeampia tasoja kantasolujen merkkiaineita

Sox2

,

CD44

ja

PROM1

ja ABC transporter geeni

ABCG2

, kun taas

ABCB1

ollut (kuvio 1 C). Nämä tulokset osoittavat, että CSCS /CIC rikastuneet SP-soluissa, jotka ovat peräisin MCAS soluja. Tulokset toistettu ainakin kolmen erillisen kokeen.

. Havaitseminen SP solujen MCAS soluja. MCAS munasarjojen mucinous adenokarsinooma solut värjättiin Hoechst 33342 väriainetta ja analysoitiin. Prosenttiosuus edustaa suhde SP-soluissa. B. Kasvain aloittamisen SP peräisin olevien solujen MCAS soluista. 10

3 ja 10

4 SP ja MP peräisin olevien solujen MCAS inokuloitiin subkutaanisesti selkään NOD /SCID-hiiriin, ja kasvaimen kasvua mitattiin viikoittain. Tiedot edustavat keskiarvoja ± SD. Erot SP ja MP soluja tutkittiin tilastollista merkittävyyttä käyttämällä Studentin t-testiä. * P-arvot. C. qPCR CSC /CIC merkkiaineiden MCAS SP ja MP soluja. Tiedot edustavat keskiarvoja ± SD. Tähdet osoittavat merkittävää eroa. * P 0,05. t-testi.

CSCS /CIC rikastuneet ALDH

Br solujen

CSCS /CIC voitiin eristää ALDH

Br soluihin ALDEFLUOR määritys [23]. Siksi tutkittiin, CSCS /CIC voidaan menestyksellisesti eristää ALDEFLUOR määrityksessä. MCAS, HTBoA, OVCAR3, OVSAHO ja HEC-1-solut analysoitiin ALDEFLUOR määrityksessä ja havaittiin, että suhde ALDH

Br-solut oli 8,1% ja 11,3% (kuvio 2A ja kuvio S1). ALDH

Br-solut ja ALDH

matala-solut, jotka ovat peräisin MCAS lajiteltiin ja injektoitiin selkään viiden NOD /SCID-hiiriin tutkia kasvaimen aloittamista kyky. Kaikissa viidessä hiiret, kasvaimet aloitettiin 10

4 ALDH

Br soluja, kun taas kasvaimissa aloitettiin 10

4 ALDH

Low solujen vain 2 5 hiirtä (taulukko 1). Kasvainten koon peräisin ALDH

Br-solut oli merkittävästi suurempi kuin kasvaimia, jotka ovat peräisin ALDH

matala-soluja (kuvio 2B). Ilmentymistasojen kantasolujen merkkiaineita tutkittiin qPCR. ALDH

Br peräisin olevien solujen MCAS solut ilmensivät korkeampia tasoja kantasolujen merkkiaineita

Sox2

,

CD44

ja

PROM1

, ALDH1A1, ja ABC transporter geeni

ABCG2

ja

ABCB1

(kuvio 1 C). Nämä tulokset osoittavat, että CSCS /CIC myös rikastuneet ALDH

br solu peräisin MCAS soluista. Tulokset toistettu ainakin kolmen erillisen kokeen.

. Detection ALDH

Br soluja MCAS soluista. MCAS munasarjojen mucinous adenokarsinooma solut värjättiin BAAA ja analysoitiin. Prosenttiosuus edustaa suhdetta ALDH

Br soluja. Estäjä osoittaa ALDH1 estäjä (dietyyliamino- bentsaldehydiä (DEAB)). B. Kasvain aloittamisen ALDH

Br peräisin olevien solujen MCAS soluista. 10

4 ALDH

Br ja ALDH

Low peräisin olevien solujen MCAS inokuloitiin subkutaanisesti selkään NOD /SCID-hiiriin, ja kasvaimen kasvua mitattiin viikoittain. Tiedot edustavat keskiarvoja ± SD. Erot ALDH

Br ja ALDH

Low soluja tutkittiin tilastollista merkittävyyttä käyttämällä Studentin t-testiä. * P-arvot. C. qPCR CSC /CIC merkkiaineiden MCAS SP ja MP soluja. Tiedot edustavat keskiarvoja ± SD. Tähdet osoittavat merkittävää eroa. * P 0,05. t-testi.

SP ja ALDEFLUOR dual analyysi

SP-soluissa ja ALDH

Br-solut osoittavat suurempaa ulosvirtaus Hoechst 33342 väriaineen ja korkeampi ekspressiotaso aldehydiä dehydrogenese, jotka ovat erilaisia ​​fenotyyppejä, ja hematopoieettiset kantasolut eristettiin SP ja ALDH

Br väestö aiemmassa tutkimuksessa [24]. Siksi tutkittiin päällekkäisiä populaatio SP solujen ja ALDH

Br soluja. Värjäämisen jälkeen MCAS solujen Hoechst 33342 väriainetta, solut pestiin ja värjättiin sitten ALDEFLUOR reagenssin ja analysoitiin. Tässä kokeessa suhde SP-soluissa oli 5,3%, ja suhde ALDH

Br-soluissa oli 14,4%. 7,1% ALDH

Br-solut osoittivat SP väestöstä, ja 6,9% ALDH

Mid-solut osoittivat SP väestöstä, ja vain 3,7% ALDH

Low solut osoittivat SP väestöstä (kuvio 3A). ALDH

Br-solut osoittivat osittain päällekkäisiä, ja vain 1,0% kaikista soluista (7,1% 14,4% väestöstä) ilmaistaan ​​sekä SP solujen fenotyyppi ja ALDH

Br fenotyypin (kuvio 3A).

. Yhteenveto SP ja ALDEFLUOR dual määritys. MCAS solut värjättiin Hoechst 33342 väriaine ja värjätään BAAA ja analysoidaan. Solut jaettiin kolmeen ryhmään sen mukaan ALDH intensiteetin (ALDH

Br (ALDH kirkas), ALDH

Mid (ALDH keskellä), ALDH

Low (ALDH matala)), sitten analysoitiin SP määrityksessä. Suhde ALDH

Br-soluissa oli 14,4%, ja suhde SP-soluissa oli 5,3%. Suhteet SP solujen ALDH

Br soluja, ALDH

Mid soluja ja ALDH

Low solut olivat 7,1%, 6,9% ja 3,7%, tässä järjestyksessä. Suhde SP /ALDH

Br solujen yhteensä soluissa oli 1,0%. B. Kasvain aloittamisen SP /ALDH

Br, SP ja ALDH

Br soluja. 10

2 ja 10

3 SP /ALDH

Br, SP ja ALDH

Br peräisin olevien solujen MCAS inokuloitiin subkutaanisesti selkään NOD /SCID-hiiriin, ja kasvaimen kasvua mitattiin viikoittain. Tiedot edustavat keskiarvoja ± SD. Erot SP /ALDH

Br ja SP soluja tai ALDH

Br soluja tutkittiin tilastollista merkittävyyttä käyttämällä Studentin t-testiä. * P-arvot. Tikarit osoittavat hiiret aiheuttama kuolema kasvain. C. immunohistokemiallinen värjäys ABCG2 ja ALDH1. Munasarjasyöpä kudos värjättiin anti-ABCG2 vasta-aine ja anti-ALDH1 vasta-aine. Brown solukalvojen värjäytyminen osoittaa ABCG2 ja solulimassa vaaleanpunainen värjäys osoittaa ALDH1. Tähti osoittaa aluksen, ja nuolet osoittavat ABCG2 ja ALDH1 kaksinkertainen positiivisia munasarjakarsinoomasolut. Suurennos, × 400.

SP ja ALDH

br soluissa on korkea kasvaimeen aloittamista kyky

kasvainta aloittamista kyky SP ja ALDH

Br (SP /ALDH

Br) solut tutkittiin ruiskuttamalla 10

3 ja 10

2-soluissa, vastaavasti osaksi NOD /SCID-hiiriin. Yllättäen kasvaimet aloitettiin 10

3 SP /ALDH

Br soluja ja liittyi vain 10

2 SP /ALDH

Br solujen kaikkien hiirten (taulukko 1). Lisäksi kasvaimia peräisin SP /ALDH

Br-solut osoittivat merkitsevästi nopeammin kuin kasvaimista peräisin SP soluista ja ALDH

Br-solut (kuvio 3B). Nämä tulokset osoittavat, että SP /ALDH

Br-solut ovat erittäin rikastettu CIC /CSCS.

Suoritimme immunohistokemiallisella värjäyksellä havaitsemiseksi SP /ALDH

Br väestön ensisijainen ihmisen munasarjasyöpäpotilailla kudosta. Käytimme anti-ABCG2-vasta-aineen havaitsemiseksi SP-soluja, koska SP solujen tiedetään ilmaista korkeampi ABCG2. Kuten kuviossa 3C, kaksi positiivista (ABCG2-positiivisia ja ALDH1-positiivinen) munasarjasyöpä soluja havaittavissa munasarjasyövän kudoksessa. Mielenkiintoista, jotkut dual-positiivisten solujen olemassa vieressä aluksiin, voidaan osoittaa munasarjojen CSCS /CIC olemassa verisuonten kapealla. SP /ALDH

Br soluja havaittiin myös muita munasarjojen serous adenokarsinooma linjan solujen (OVSAHO, OVCAR3 ja HTBoA) ja kohdun limakalvon solulinja (HEC-1), ja suhteet SP /ALDH

Br soluja 0,1 % 0,8% (Kuva S1).

SP /ALDH

Br solut ovat kantasolujen fenotyyppiä

SP /ALDH

Br väestö verrattiin muihin populaatioihin alalla muodostaen määrityksessä. SP /ALDH

Br, SP /ALDH

Low, MP /ALDH

Br ja MP /ALDH

Low soluja eristettiin MCAS soluista ja viljellään ultramatalaa kiinnityksen edellytys alalla muodostavan määritys. SP /ALDH

Br-solut oli korkeampi pallo muodostumista tehokkaammin kuin MP /ALDH

Br solua ja MP /ALDH

Low soluja (kuvio 4A). Ero SP /ALDH

Br solua ja SP /ALDH

Low solujen ollut merkittävä; kuitenkin, SP /ALDH

Br-solut yleensä korkeampia alalla muodostumista tehokkaammin kuin SP /ALDH

Low soluja.

. Sphere muodostumista määrityksessä. Pesäkkeiden lukumäärät neljästä jakeet (SP /ALDH

Br, SP /ALDH

Low, MP /ALDH

Br ja MP /ALDH

Low) arvioitiin 7. päivänä Data edustaa tarkoittaa ± SD. Erot tutkittiin tilastollisen merkitsevyyden käyttämällä Studentin t-testiä. * P-arvot. Edustavia kuvia pallojen esitetään (x 100). B. adiposyyttien erilaistumisen määritys. Soluja viljeltiin olemassa trans-retinoiinihappo ja sen jälkeen adiposyyttien erilaistumisen elatusaineessa. Oli Red O-positiivisia adiposyyttien laskettiin. Tiedot edustavat keskiarvoja ± SD. Erot tutkittiin tilastollisen merkitsevyyden käyttämällä Studentin t-testiä. * P-arvot. Edustavat kuvat Oil Red O-värjäyksen esitetään (x 200). Red-värjäys osoittaa adiposyyttien erilaistumiseen.

CSCS /CIC on kuvattu olevan pluripotenssia [25], me siten tutkinut adiposyyttien erilaistumiseen kyky SP /ALDH

Br-solut (kuva 4B). Eristetty SP /ALDH

Br, SP /ALDH

Low, MPALDH

Br ja MP /ALDH

Low väestöstä oli viljellään adypocyte erilaistumista kunnossa. SP /ALDH

Br peräisin olevien solujen MCAS soluista paljasti korkein adiposyyttien erilaistumiseen kyky verrattuna SP /ALDH

Low, MP /ALDH

Br ja MP /ALDH

Low peräisin olevien solujen MCAS soluista.

CSCS /CIC ovat resistenttejä kemoterapiaa [4], me täten analysoitiin lääkeresistenssin SP /ALDH

Br soluja. Koska sisplatiini on keskeinen lääke munasarjasyövän kemoterapian, käytimme sisplatiinin. Eristetty SP /ALDH

Br, SP /ALDH

Low, MPALDH

Br ja MP /ALDH

harvaan viljeltiin olemassaolon sisplatiinin. SP /ALDH

Br soluissa merkittävästi suurempi sisplatiinin vastus verrattuna SP /ALDH

Low solua, MP /ALDH

Br solua ja MP /ALDH

Low soluja. Ja MP /ALDH

Low solujen osoittivat korkeinta herkkyyttä sisplatiinin (kuvio 5A).

. Solunelinkykyisyysmääritys. Soluja viljeltiin olemassa sarjalaimennettua sisplatiinia. Elinkelpoiset solut analysoitiin WST-1 Kit. Y-akseli osoittaa Solujen elinkelpoisuus. Tiedot edustavat keskiarvoja ± SD. Erot tutkittiin tilastollisen merkitsevyyden käyttämällä Studentin t-testiä. * P-arvot. B. qPCR analyysi. Ilmaisu kantasolujen merkkiaineiden tutkittiin käyttämällä SP /ALDH

Br, SP /ALDH

Low, MP /ALDH

Br ja MP /ALDH

Low soluja. Tiedot edustavat keskiarvoja ± SD. Tähdet osoittavat merkittävää eroa. * P 0,05. t-testi. C.

Sox2

Knockdown tukahduttaa ilmentymiä

ALDH1A1

ja

ABCG2

.

Sox2

mRNA tippuu alas siRNA. Kaksi päivää transfektion jälkeen Sox2 siRNA, ilmaukset

ALDH1A1

ja

ABCG2

tutkittiin RT-PCR: llä.

GAPDH

käytettiin sisäisenä kontrollina. Ohjaus siRNA (si-Cont) transfektoituja soluja käytettiin negatiivisena kontrollina. D. Sox2 kaataa tukahduttaa kasvaimen aloittamista.

Sox2

mRNA tippuu alas siRNA. Kymmenentuhatta si-Sox2 ja hallita siRNA (si-Cont) transfektoidut solut istutettiin ihonalaisesti selkään NOD /SCID-hiiriin, ja kasvaimen kasvua mitattiin viikoittain. Tiedot edustavat keskiarvoja ± SD. Erot tutkittiin tilastollisen merkitsevyyden käyttämällä Studentin t-testiä. * P-arvot.

analysoimiseksi molekyylitason ominaisuudet SP /ALDH

Br väestö, suoritimme qPCR (kuvio 5B).

ABCG2

mRNA ilmentyy edullisesti SP /ALDH

Br solua ja SP /ALDH

Low soluja.

ALDH1A1

ilmaistiin SP /ALDH

Br solua ja MP /ALDH

Br soluja. Nämä ilmentymisen profiilit ovat yhdenmukaisia ​​sen kanssa, että SP-solun fenotyypin riippuu ekspressioon

ABCG2

ja ALDH

Br solun fenotyypin riippuu ekspressioon

ALDH1A1

.

Sox2

mRNA ilmentyi korkeimmalla tasolla SP /ALDH

Br soluissa, mutta ei SP /ALDH

Low solua, MP /ALDH

Br soluja tai MP /ALDH

Low -solut (kuvio 5B), mikä osoittaa, että SP /ALDH

Br väestön edullisesti ovat kantasolujen populaation. Koska Sox2 on rooli ylläpitoon keuhkojen CSCS /CIC [26], tutkimme suhde

Sox2

ja ilmaisujen

ABCG2

ja

ALDH1A1

. Ilmaukset

ABCG2

ja

ALDH1A1

vähenivät

Sox2

mRNA pudotti soluja (kuvio 5C). Lisäksi Sox2 pudotti solut osoittivat alempi kasvaimen aloittamista kuin ohjaus siRNA transfektoitujen MCAS soluja (kuvio 5D). Siksi nämä tulokset viittaavat siihen, että SP /ALDH

Br väestö ilmaista korkea kantasolujen geenin

Sox2

, joilla voi olla rooli ylläpito CSCS /CIC ja ilmaisujen

ABCG2

ja

ALDH1A1

.

ekspressiotasot CD44 edustaja markkeri munasarjojen CSCS /CIC [27], [28], oli samankaltainen kaikissa ryhmissä (kuvio 5B). Siksi tutkittiin suhde SP soluja, ALDH

Br-solut ja CD44-positiivisten (CD44

+) soluja. Suhde CD44

+ soluja oli 8,0%. Suhde SP /CD44

+ päällekkäisiä väestöstä oli 0,9%, ja suhde ALDH

Br /CD44

+ päällekkäisiä väestöstä oli 3,3%. Lisäksi suhde SP /ALDH

Br /CD44

+ päällekkäisiä väestöstä 0,4% (kuvio 6).

MCAS solut värjättiin Hoechst 33342 väriainetta, BAAA ja anti-CD44-vasta-ainetta, ja analysoidaan. Suhteet SP, ALDH

Br, CD44

+, SP /ALDH

Br, SP /CD44

+, ALDH

Br /CD44

+ ja SP /ALDH

Br /CD44

+ solut olivat 5,3%, 14,4%, 8,0%, 1,0%, 0,9%, 3,3% ja 0,4%, vastaavasti.

keskustelu

käsite CSCS /CIC ehdotettiin kauan sitten [29]. Leukemia kantasoluja on eristetty akuutin leukemiasolujen [30], [31], ja ensimmäinen CSC /CIC väestön eristettiin rintasyöpä yhdistelmällä CD44 ja CD24 ilmentymisen [32]. Seuraavassa toimii, CSCS /CIC onnistuneesti eristettiin useissa syöpäsairauksia. Kuitenkin, koska molekyylitason mekanismeja CSCS /CIC: t ovat edelleen vaikeasti, tarkka markkereita CSCS /CIC: t ovat vielä tuntemattomia. Siksi parannuksia menetelmät eristämiseen CSCS /CIC tarvitaan yhä.

Yhdistelmä menetelmiä kahden tai kolmen hengen markkereita ja merkkejä ja ALDEFLUOR määritys on raportoitu. Populaatiot ALDH

Br ja CD44

+ /CD24

– soluja esillä osittainen päällekkäisyys, ja ALDH

Br /CD44

+ /CD24

– väestö osoitti korkeampi kasvaimen aloittamista kyky kuin ALDH

Br väestön tai CD44

+ /CD24

– väestö [17]. ALDH

Br /CD44

+ väestön ja ALDH

Br /CD133

+ väestöstä on peräisin ihmisen ensisijainen paksusuolen syöpä oli korkeampi kasvaimen aloittamista kyky kuin ALDH

Br, CD44

+ ja CD133

+ populaatiot [33]. Nämä havainnot osoittavat, että ilmaukset CSC /CIC markkereita ovat osittain limittäin ja että päällekkäinen väestö on erittäin rikastettu CSCS /CIC. Todellakin, tuloksemme osoittivat myös samanlainen päällekkäisyyden ALDH

Br-solut ja SP-soluissa, ja päällekkäiset väestöstä oli korkeampi kasvaimen aloittamista kyky. Eräässä munasarjasyöpä tutkimuksessa ALDH

Br-solut olivat rikastuneet CD44

+ soluissa kuin käyttö CD133

+ solujen [23], mutta ALDH

Br ja CD44

+ päällekkäisiä oli osittainen. Havaitsimme SP /ALDH

Br /CD44

+ päällekkäisiä väestön MCAS soluista (kuvio 6). Siksi käyttö päällekkäisten väestöstä SP /ALDH

Br /CD44

+ solut voivat olla parempi lähestymistapa tunnistaa CSC /CIC populaatiot.

Gliooma kantasoluja on kuvattu erilaistumaan endoteelin soluihin [34]. Pahanlaatuiset methotelioma kantasoluja on kuvattu erilaistua endoteelisoluihin, hermosoluja ja adiposyyttien [25]. Tässä tutkimuksessa olemme vahvistaneet, että SP /ALDH

Br solut ovat korkeammat adiposyyttien erilaistumiseen kyky.