Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Leukosyyttien maailmanlaajuinen DNA metylaatiotasoilla parhaillaan pidetään biomarkkerit syöpäalttiutta ja on liitetty vaaraa useiden syöpien. Tässä tutkimuksessa pyrittiin tutkimaan yhdistyksen välillä pitkä siroteltu ydinaseiden osia (LINE-1) metylaatiotasoilla, biomarkkerina globaalin DNA: n metylaation verisolujen DNA, ja munuaissyövän syöpäriskiä.

Experimental Suunnittelu

LINE-1 metylointi bisulfiitin-muunnetaan genomi-DNA eristettiin leukosyyteistä kvantitoitiin pyrosekvensointi mitataan kolmena kappaleena, ja keskimäärin yli 4 CpG sivustoja. Kaikkiaan 328 RCC tapauksissa ja 654 valvonta taajuus-Hyväksytty (02:01) iän (± 5 vuotta), sukupuoli ja tutkimus keskus, suuresta tapaus-control tutkimus Keski- ja Itä-Euroopassa arvioitiin.

tulokset

LINE-1 metylaatiotasoilla olivat merkitsevästi korkeammat RCC tapauksissa mediaani 81,97% (kvartiiliväli [IQR]: 80,84-83,47) verrattuna 81,67% (IQR: 80,35-83,03) kontrollien joukossa ( p = 0,003, Wilcoxonin). Verrattuna alimpaan LINE-1 metylointi kvartiili (Q1), oikaistu syrjäisimpien alueiden lisäämiseksi metylaation kvartiileja olivat seuraavat: OR (Q2) = 1,84 (1,20-2,81), OR (Q3) = 1,72 (1,11-2,65) ja OR ( Q4) = 2,06 (1,34-3,17), jossa on p-suuntaus = 0,004. Yhdistys oli vahvempi keskuudessa tupakoivat (p-suuntaus 0,001) kuin entiset tai tupakoimattomia (p-vuorovaikutus = 0,03). Mahdollisuuden poistamiseksi valinta bias kontrollien joukossa, suhde LINE-1 metylaation ja tupakointi arvioitiin ja vahvistettiin tapauskohtaisesti ainoastaan ​​analyysin, samoin.

Johtopäätökset

Korkeammalla LINE -1 metylaatio näyttävät liittää positiivisesti RCC riski, erityisesti keskuudessa tupakoijilla. Lisätutkimukset käyttäen sekä ennakko- ja jälkihyväksyntää diagnostinen genominen DNA on perusteltua vahvistaa havainnot ja on tarpeen selvittää, onko havaittu eroja esiintyy ennen, tai seurauksena syövän synnyn.

Citation: Liao LM, Brennan P, van Bemmel DM, Zaridze D, Matveev V, Janout V, et al. (2011) LINE-1 metylaatiotasoilla leukosyyttien DNA ja riski munuaissyöpä. PLoS ONE 6 (11): e27361. doi: 10,1371 /journal.pone.0027361

Editor: Bernard W. Futscher, University of Arizona, Yhdysvallat

vastaanotettu: Kesäkuu 27, 2011; Hyväksytty: 14 lokakuu 2011; Julkaistu: 04 marraskuu 2011

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Intramural tutkimusohjelma National Institutes of Health, National Cancer Institute, Division of Cancer Epidemiology and Genetics (Bethesda , MD, USA). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

aluekohtaisia ​​hypermetylaation ja maailmanlaajuinen hypometylaatio DNA liittyy syövän synnyn [1]. Poikkeava DNA hypermetylaation taipumus esiintyä CpG-rikkaiden promoottorialueilla ja liittyy transkription hiljentämisen geenien, kuten tuumorisuppressorigeeneille [2]. Sen sijaan, genomin laajuinen DNA hypometylaatio esiintyy pääasiassa toistuvia DNA-sekvenssien, kuten heterochromatic alueiden ja retrotransposonit [3]. Useissa tutkimuksissa on havaittu yhdistyksen välillä metylaatiotasoilla valkosolujen DNA ja riski virtsarakon, rinnan, paksusuolen ja peräsuolen syöpä [4], [5], [6], [7]. Kuitenkin yhdistyksen välinen globaali metylaatiotasoilla ja munuaissyövän syöpä (RCC) ei ole vielä arvioitu.

Long lomassa ydinaseiden osia (LINE-1) ovat ei-long-terminaali-repeat (ei-LTR) retrotransposoneja jotka muodostavat noin 17% ihmisen genomin, jossa ~500,000 elementtejä yleensä hajallaan ihmisen genomin [3], [8]. LINE-1 elementit on tyypillisesti voimakkaasti metyloitu normaaleissa kudoksissa, kun taas LINE-1 hypometylaatio on raportoitu syövän kudoksissa [9]. Kvantifiointi CpG metylaation LINE-1 elementit on edullinen korkean suoritustehon määritys, joka on laajasti käytetty proxy maailmanlaajuisen sytosiinin metylaatio (5meC) tasot [10], [11]. Useita tapausverrokkitutkimukset ovat ehdottaneet, että LINE-1 metylaatiotasoja valkosolujen DNA voisi olla potentiaalinen biomarkkereiden syövän alttiuden ja perimän epävakaisuuden; kuitenkin, suhde LINE1 ja muiden biomarkkerit maailmanlaajuisten metylaatiostatuksen kuten Alu [12] on vasta löytäjäänsä suurissa hyvin suunniteltu tutkimuksia syöpäriskin [13], [14], [15], [16]. Lisäksi väliset suhteet metylaatiotasoilla kohdekudoksissa ja ei-invasiivisesti kerätään proxy kudosten DNA-näytteet eivät myöskään ymmärretä hyvin.

ilmaantuvuus RCC, yleisin maligniteetti munuaisten syöpä, vaihtelee maailmanlaajuisesti [17], jossa on joitakin korkeimmat esiintyviä Keski- ja Itä-Euroopassa [18], [19]. Tupakointi, lihavuus ja kohonnut verenpaine ovat vakiintuneita riskitekijöitä RCC, mutta nämä muodostavat vain noin 50% tapauksista [19]. Tutkia mahdollisuuksia vaikuttaa globaalin Metylointia riskitekijä RCC vertasimme LINE-1 metylaatiotasoilla leukosyyttien DNA osajoukko RCC tapausten ja kontrollien kirjoilla Monikeskustutkimusta tapauskontrollitutkimuksessa. Tutkimme mahdollinen vaikutus muutokseen yhteisellä ituradan polymorfismien ja tunnettujen RCC riskitekijöitä. Lopuksi

VHL

geenin toiminnan lopettamisesta RCC kasvainkudoksessa on usein (jopa 91%) havaittiin.

VHL

muutos, joko promoottoria hypermetylaation tai jaksojen muutoksia, pidetään varhainen ja usein tapahtuma munuaisten syövän synnyn ja sitä on käytetty biomarkkerina munuaisten kasvain heterogeenisyys. Siksi LINE-1 metylaatiotasoilla arvioitiin keskenään erilaisten tapauksessa alaryhmiä tutkimaan, onko riski saada tietyntyyppistä

VHL

muutos kasvainten DNA voidaan modifioida maailmanlaajuinen metylaatiotasoilla genomisessa DNA: ssa.

tulokset

suurin osa tutkimukseen osallistuneista olivat Tsekistä, on hieman suurempi osuus joukossa tapauksia. Tapaukset olivat todennäköisemmin kuin valvonta on korkeampi painoindeksi (p = 0,07) ja on pienempi vihannesten nauttiminen (p = 0,01; taulukko 1). Jakaumat iästä, tupakoinnista ja itse ilmoitettu verenpainetauti olivat vertailukelpoisia tapausten ja kontrollien välillä.

käyttäminen lineaarinen regressio malleja, arvioimme osuus valitun osallistujan ominaisuudet arveltu liittyvän LINE-1 metylaatiotasoilla kontrollien joukossa (n = 654; taulukko 1). Kontrollien joukossa, miehillä oli tilastollisesti merkitsevästi suurempi LINE-1 metylaatiotasoilla (mediaani = 81,89%) kuin naisilla (mediaani = 81,29%; p = 0,0003). Yksilöt, jotka raportoitiin ottaa verenpainetauti liittyy myös tilastollisesti merkitsevä korkeampi LINE-1 metylaatiotasoilla (mediaani = 82,03%) kuin ne, jotka eivät (mediaani = 81,46%; p = 0,04). Merkittävä ero keskuudessa keskusten havaittiin myös kesken (p = 0,01), joka sopeutamme varten meidän malleissa. Ei erillistä suuntaukset LINE-1 metylaatiotasoilla iän, tupakoinnista, BMI tai vihannesten nauttiminen havaittu kontrollien joukossa. Jakauma LINE-1% 5meC joukossa tapauksia on myös esitetty taulukossa 1. Vertailun.

Kaiken mediaani LINE-1 metylaatiotasoilla olivat merkitsevästi korkeammat RCC tapauksissa 81,97% (kvartiiliväli: 80,84-83,47) verrattuna on 81,67% (kvartiiliväli: 80,35-83,03) kesken (p = 0,003, Wilcoxonin, taulukko 1). Verrattuna yksilöiden alin LINE-1 metylointi neljännekseen, yksilöiden korkein neljänneksessä olivat yhteydessä 2-kertainen kohonnut RCC (p muutossuunnat = 0,004; taulukko 2). Oikaistu OR RCC yhdessä 1%: n nousu yleisen LINE-1 metylaatio oli 1,10 (95% CI: 1,03-1,19; p = 0,008). Metylointi vaihteli hieman yli kunkin neljän CpG sivustoja sekvensoitiin, jossa alin mediaani% 5meC havaittu neljännessä lokuksessa (mediaani tapauksista: 78,4%, valvonta: 78,2%) ja korkeimman tason ensimmäisellä locus (mediaani tapauksista: 85.4 %, hallitsee: 84,8%). Verrokkeihin verrattuna, tapauksia oli tilastollisesti merkitsevästi suurempi% 5meC kussakin lokuksessa (p-arvot vaihtelevat välillä 0,0001-0,05, Wilcoxonin). Korkeampi% 5meC Locus 1 osoittivat vahvimman yhdessä riski RCC (OR = 1,24, 95% CI: 1,14-1,35); kuitenkin samanlaiset noususuuntien havaittiin kolmen muun loci (locus 2: OR = 1,07, 95% CI: 0,99-1,14; locus 3: OR = 1,06, 95% CI: 1,00-1,13; locus 4: OR = 1,05, 95% CI: 0,99-1,11).

analyysit ositettiin tupakoinnin tila, lisääntynyt riski on suurin LINE-1% 5meC kvartiili (Q4) oli selvempi keskuudessa tupakoivat (OR

Q4 = 6,48, 95% CI: 2,68-15,67; p-suuntaus 0,0001) kuin entisten tai tupakoimattomia (p-vuorovaikutus = 0,03; kuvio 1). Positiivinen yhdessä RCC riski oli niinikään rajoitettu tupakoijilla poikki yksittäisten loci (taulukko S1). Tutkimaan edelleen vuorovaikutusta tupakoinnin ja korkean LINE-1% 5meC (Q2-Q4), teimme tapauskohtaisesti ainoastaan ​​analyysi sen varmistamiseksi, että yhdistys ei johtunut ohjaus sarja, joka ei ollut edustava tutkimusväestöstä osalta tupakoinnista. Verrattuna RCC tapauksia, jotka eivät ole koskaan tupakoitsijoita, positiivinen lähdöt multiplicativity havaittiin RCC tapauksissa, jotka olivat joko entinen (IOR = 1,83, 95% CI: 0,69-4,83) tai tupakoijilla (IOR = 2,47, 95% CI: +0,91-+6,70 ; p-trendi = 0,06). Tämä osoittaisi, että suhde voimistuvan maailmanlaajuisen metylaation ja RCC on vahvempi joukossa tupakoijilla kuin tupakoimattomia. Molemmissa analyyseissä, tupakoinnista ja LINE-1 metylaatiotasoilla ilmestyi muuttaa panoksen muiden riskitekijä. Muita kerrostunut analyysit sukupuolen, BMI, vihannesten nauttiminen, ja itse ilmoitettu verenpainetauti ei aiheuttanut mitään merkittäviä eroja (tietoja ei esitetty).

Kerroin suhde ja 95%: n luottamusväli yhdistyksen välillä LINE-1 metylointi tasot ja RCC, oikaistu sukupuolen, iän, keskusta, BMI, korkea verenpaine ja vihannesten nauttiminen.

Sen arvioimiseksi, yleinen vaihtelu valittujen geenien yhden hiili ja tupakka aineenvaihdunta muutettu havaitun yhdistys teimme kerrostunut analyysit seitsemän toiminnalliset variantit viidessä geeneistä (

MTHFR, MTR, TYMS, GSTM1,

ja

GSTTI

). Kaksi geneettisiä variantteja,

MTHFR

c.1298A C ja

MTR c.2756A G,

näytti vaikuttaa yhdistyksen välillä LINE-1 metylaatiotasoilla ja RCC riski (taulukko 3). Havaitsimme voimakas positiivinen suuntaus välillä LINE-1 metylointi kvartiileihin ja RCC riski joukossa, jotka toteutetaan vähintään yhden kopion C vähäinen alleelin

MTHFR

c.1298A C (p-kehitys = 0,0009; p- vuorovaikutus = 0,15). Suurentunut korkeasti LINE-1 metylointi ainoastaan ​​sellaiset kanssa AA genotyyppi

MTR c.2756A G

(p-kehitys = 0,004; p-vuorovaikutus = 0,19) ja ei ollut merkittävä joukossa joissa on vähintään yksi kopio vähäinen alleelin. Kumpikaan näistä variantteja oli tilastollisesti merkitsevästi pääasialliset vaikutukset, joka on aiemmin julkaistu [20].

Koska

VHL

geenin inaktivoimiseksi on usein varhainen tapahtuma RCC, että on käytetty määrittelemään molekyyli alaryhmiä munuaisten syövistä [21], tutkimme, globaali metylaatio liittyy tiettyyn osajoukko RCC tapauksissa määritelty mekanismi, jonka avulla

VHL

geenin toiminnan lopettamisesta kasvaimen DNA tapahtuu. Määrittelimme RCC alaryhmien olevan

VHL

geenin toiminnan kautta epigeneettisellä mekanismien (promoottori hypermetylaation), geneettisiä mekanismeja (koodaava sekvenssi, joka johtaisi muuttuneeseen proteiinia (eli missensemutaatioita, deleetiot, insertiot, silmukointikohtamutaatio) tai villityypin kasvaimia (niitä ei ole havaittavia

VHL

inaktivointi). Niistä alijoukon RCC tapauksista, joista tietoja oli saatavilla

VHL

promoottori metylaatio tai geneettinen muutos tila somaattisten kudosten (n = 144 ), riski, jonka muutoksen

VHL

kasvoivat, kvartiileja metylaation (OR

Q2 = 1,26, 95% CI: 0,34-4,64; OR

Q3 = 1,62, 95% CI : 0,42-6,18; ja OR

Q4 = 2,57, 95% CI: 0,68-9,72, p-trendi = 0,12). Vaikka viittaavia, enemmän tapauksia tarvitaan täysin arvioida tätä -alueella.

keskustelu

Tässä tutkimuksessa arvioitiin roolia LINE-1 metylointi perifeerisen veren DNA proxy maailmanlaajuisen metylaation munuaisten kasvainkudoksessa. tutkimuksessamme korkeampi LINE-1% 5meC liittyi suurentunut RCC. Korkeampi LINE-1% 5meC tasoja näytti olevan vahvempi riskitekijä kehittämisen RCC tupakoijilla kuin entiset tai tupakoimattomia. Lisäksi tulokset Tutkimuksemme viittaavat mahdollista vuorovaikutusta LINE-1 metylointi ja

MTHFR

c.1298A Cand

MTR c.2756A G

RCC.

yhdistyksen havaitsimme ristiriidassa sen kanssa, mitä on havaittu muilla syöpää epidemiologisissa tutkimuksissa. Global DNA hypometylaatio kasvainkudoksessa on pitkään havaittu, mutta vaihtelee suuresti sisällä ja välillä syöpien [7], [22]. Global DNA hypometylaatio valkosolujen DNA, mitattuna% 5meC sisältöä, on liittynyt lisääntynyt syöpäriskiä useissa viimeaikaisissa tapausverrokkitutkimukset, kuten suuri tapauskontrollitutkimuksessa virtsarakon syöpään [4], [6], [7]. Useissa tapausverrokkitutkimukset, alhaisempi LINE-1 on liitetty suurentunut riski kiveskasvaimia [14], ja mahalaukun [13], pään ja kaulan [16], ja virtsarakon syöpä [15]. Kuitenkin pieni tutkimus rintasyöpään todettu eroa% 5meC LINE-1 tasot tapausten ja kontrollien välillä, mutta huomattavasti vähemmän% 5meC tasot tapauksissa [5]. Samassa tutkimuksessa myös, että tasot% 5meC ja% 5meC LINE-1 (molemmat mitattuna valkosolujen DNA) eivät korreloineet hyvin [5].

rajallisesti tietoa vaikutuksista maailmanlaajuisen DNA: n metylaation tasot munuaisten kasvaimet ja on vaikea vertailla johtuen eri tavoista metylaation. Parhaan tietomme mukaan tietoja ei ole saatavilla korrelaatio globaali metylaatiostatuksen seerumin ja munuaisten kudosta. Niistä promoottori metylaatio tutkimukset, yksi tutkimus raportoi, että promoottori metylaatiotilaa

Wnt

geenien mitattuna seerumista yleisesti Hyväksytty että vastaavien munuaisten kasvain näytteet [23], kun taas osuus tapauksista, joissa promoottori metylaation erityinen syöpään liittyvien geenejä seerumissa sovitettu metyloinnin saman markkerin kasvaimissa vaihtelivat 0: sta 60% [24]. Muutama tutkimukset ovat havainneet lisääntynyt maailmanlaajuinen metylaatio RCC kudoksessa. Arai et ai. raportoitu, että genomin laajuinen DNA: n metylaatio profiileja, kuten globaali hypermetylaatio, määritetään vierekkäisten normaali munuaisten kudos olivat erittäin liittyy aggressiivisuus vastaavan RCC [25]. Pieni tutkimus Minardi et al. huomattava merkittävä kasvu globaalin metylaatio kasvainkudoksissa yhä arvosanalla RCC [26]. Kaksi kokeelliset tutkimukset ovat kuvattu

LINE

-1 metylaatiostatuksen RCC kudosnäytteistä. Chalitchagorn et ai. osoittivat, että LINE-1 metylointi vaihtelivat merkittävästi eri kudosten tyyppejä, mutta havaittu eroa

LINE

-1 hypometylaatio tasojen RCC ja munuaisten kudosten [9]. Toisessa tutkimuksessa havaittiin poissaolo hypometylaatio LINE-1-sekvenssit eri vaiheissa ja laatuja RCC, joka oli toisin kuin muut urothelial karsinoomat [27]. Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että RCC ehkä ole tyypillinen yhdessä DNA: n metylaation havaittu muiden syöpien; kuitenkin, kun otetaan huomioon erilaiset arviointimenetelmät käytetään, tarvitaan lisätutkimuksia.

Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimus löytää yhdessä suurempi kuin pienentäisivät LINE-1 metylaatiotasoilla (mitattuna valkosolujen DNA) ja syöpäriskiä. Phokaew et ai. havaittua satunnaista tapauksia hypermetylaation in LINE-1 lokusten joukossa syöpäsolulinjoissa [28]. Erityisiä hypermetylaatiota LINE-1 on myös raportoitu epänormaali umpeenkasvun ja erilaistumista istukkakudokset [29]. Vaikka LINE-1 metylaatiotasoilla odotetaan tarjota nopea ja helppo arvioida globaalin metylaation, vain kolmannes genomista DNA: n metylaatio on arvioitu esiintyvän toistuvia elementtejä [11]. On myös mahdollista, että RCC on epätavallinen suhde metylaation toistuvia elementtejä verrattuna muihin syöpätyyppeihin. Lopuksi kunnes meidän havainnot monistaa siellä on myös edelleen mahdollisuus, että yhdistys havaitsimme voi johtua sattumasta. Havaittu yhdistys vaikuttaa hieman vankka ja yhdenmukainen analyysimme viittaa siihen, että nämä löydökset eivät johdu sattumasta; kuitenkin, tämä toteamus ei tarvitse uusia toisessa tutkimuksessa populaatio.

Meidän arvioinnissa ennustavat LINE-1 metylaatiotasoilla leukosyyttien DNA, sukupuoli oli ainoa ominaisuus, joka oli voimakkaasti yhteydessä Vaihtelut. Miehillä oli merkittävästi korkeampi LINE-1 metylaatiotasoilla kuin naisilla, mikä on yhtäpitävä muissa tutkimuksissa [14], [15], [16], [30], [31], [32], [33]. Itse ilmoitettu verenpainetauti liittyi myös suuremmat LINE-1 metylaatiotasoilla, mutta ei ole aiemmin arvioitu julkaistuissa tutkimuksissa. Ikä pidetään yleisesti käänteisesti liittyy lisääntynyt maailmanlaajuinen metylaatio [34]; kuitenkin iän ei korreloi LINE-1 metylaatiotasoilla tutkimuksessamme tai useissa aikaisemmissa tutkimuksissa [9], [16], [31], [32], [35], [36]. Tupakointi on liittynyt sekä promoottorin hypermetylaation ja genomista hypometylaatio kasvaimen DNA [16], [37]. Emme kuitenkaan ole noudattanut yhdistyksen välillä tupakointi ja LINE-1 metylaatiotasoilla leukosyyttien DNA, joka on sopusoinnussa muista tutkimuksista saatuja tuloksia [15], [16], [31], [32]. Puute yhdistyksen välillä LINE-1 metylaatiotasoilla veren eri ominaisuudet tutkimuksessamme oli yleisesti ottaen samanlainen kuin mitä on havaittu muissa tutkimuksissa; kuitenkin syytä huomata, että meidän komponentteja ei välttämättä ole edustava, koska ne olivat sairaalassa perustuvia tarkastuksia.

Tupakointi on aiemmin sidoksissa globaaliin metylaatiotasoilla kasvainkudoksessa [16], [37]. Saatujen tietojen perusteella Tutkimuksemme ym kuitenkaan ei näytä olevan hyvin määritelty suhde suhteen eristetyn genomisen DNA verestä [15], [16], [31], [32]. Koska ristiriitaisia ​​tietoja yhdistyksen välillä tupakoinnin ja metylaatiotasoilla, on mahdollista, että vaikutus tupakoinnin karsinogeenien on metylaatiostatuksen voi olla erilainen eri kudosten tyyppejä. Meidän data, riskejä suurempi% 5meC LINE-1 näyttää tehostettava tupakoivat, mikä viittaa vuorovaikutusta tupakoinnin ja LINE-1 hypermetylaation. On huomattava, että aiemmissa raporteissa Tämän tutkimuksen väestön ei havaita tupakoinnin tärkein vaikutus, mikä johtuu oletettavasti joitakin lähde ohjauksen valinta bias [38]. Emme kuitenkaan huomaa, että yksi kolmesta eniten kvartiileihin LINE-1, tupakointi liittyi kasvu RCC riski verrattuna ei tupakoitsijoita. Käsitellä bias teimme tapauskohtaisesti ainoastaan ​​analyysin, joka minimoi mahdolliset valikoitumisharhalle käytöstä sairaalan perustuvia tarkastuksia. Nämä tulokset joukossa tapauksia olivat samankaltaisia ​​ja vahvisti, että tupakoijilla, jotka ovat raskaasti metyloituja sisällä LINE-1 on suurempi riski RCC kuin koskaan tupakoitsijoita, jotka ovat voimakkaasti metyloitu. Useita mahdollisia mekanismeja miten tupakointi vaikuttaa DNA: n metylaatio tila olemassa, kuten epäsuorasti lisääntynyt systeeminen tulehdus tai kaksijuosteisen-break vahinko, tai suoraan muuttuneen ilmentymisen DNA metyylitransferaasit, mutta tarkka mekanismi on huonosti [39].

Kuten geenien yksihiilisten aineenvaihdunta on liittynyt maailmanlaajuinen metylaatiotasoilla ja RCC, teimme valmisteleva analyysien avulla saatavissa genotyyppitietoja arvioida, polymorfismien muutettu yhdistyksen välillä LINE-1 metylaatiotasoilla ja RCC riskejä. Esillä olevassa tutkimuksessa tulokset kahdesta geneettisiä variantteja

MTHFR

c.1298A Cand

MTR c.2756A G

olivat vihjailevia. Muut tutkimukset globaalin metylaation ja syöpä ei ole havaittu mitään havaittavia eroja syöpäriski näiden variantteja [4], [13], [15].

Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus, jossa arvioidaan LINE- 1 metylaatiotasoilla leukosyyttien DNA ja riski RCC. Vaikka osajoukko koko tapauskontrollitutkimuksessa valittiin, tämä tutkimus on riittävä tilastollinen voima havaita yhdistyksille ja ne eivät olleet eri ryhmään kokonaisuutena. Rajoituksena on, että tämä tapauskontrollitutkimuksessa sisälly sairaalan perustuvat tarkastukset ja DNA tapauksista kerättiin ennen käsittelyä vielä post-diagnoosi. Emme havainneet huomattavia eroja LINE-1 metylaatiotasoilla sairauden ryhmien keskuudessa valvontaa tai vaiheessa ja luokan tapauksissa. Tämä viittaa siihen, että taudin eteneminen on vähemmän todennäköisesti on vaikuttanut tuloksiin. Tapaus vain analyysiä, eliminoidaan mahdollinen valinta harhaa, joka tapahtuu käyttämällä sairaalan perustuvat tarkastukset, ja tukenut yhdistyksen havaittu kerrostunut analyysiin. Vaikka LINE-1 metylaatiotasoilla pidetään välityspalvelinta maailmanlaajuinen DNA: n metylaatio yleistä, molemmat toimenpiteet eivät ole täysin vaihdettavissa ja voidaan mitata eri osa maailmanlaajuista metylaation. Riippumatta, monet tutkimukset ovat osoittaneet, että käyttö LINE-1 metylaatiotasoilla veressä voi tarjota käyttökelpoinen markkeri taudin ja tarjoaisi yksinkertaisen, noninvasive menetelmä käyttää henkilöiden riski RCC.

Yhteenvetona havaintomme viittaavat siihen, että LINE-1 metylaatiotasoilla leukosyyttien DNA positiivisesti liittyy riski RCC ja voi toimia biomarkkeri RCC alttius. Tutkimukset onko maailmanlaajuinen metylaation genomista DNA heijastaa epigeneettiset muutokset munuaisten kudosta tarvitaan edelleen esiin roolia epigenetiikka ja RCC. Vastatakseen näihin kysymyksiin tulevien tutkimusten takautuvasti kerättyjen DNA-näytteitä on tarpeen, samoin kuin tutkimuksia suunniteltu vastaamaan näennäisen vuorovaikutuksen metylaatiostatuksen ja tupakoinnin liittyviä RCC riskiä.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

tutkimusprotokolla hyväksyi asiaan eettisten komiteoiden ja institutionaalisten tarkastuslautakunta kaikkien osallistuvien keskukset, International Agency for Research Cancer (IARC), ja US National Cancer Institute (NCI) on Yhdysvaltain National Institutes of Health. Kaikki oppiaineista ja niiden lääkärit edellyttäen kirjallinen lupa.

Tutkimus Väestö

Keski- ja Itä-Euroopan Munuaisten Cancer Study (CEERCC) on sairaala-pohjainen tapauskontrollitutkimuksessa munuaisten syöpä (1097 tapaukset ja 1555 kontrollit) joka toteutettiin seitsemän asemaa Itä- ja Keski-Euroopassa (Moskova, Venäjä, Bukarest, Lodz, Puola, ja Praha, Olomouc, Ceske Budejovice ja Brno, Tsekin tasavalta). Tutkimusaineisto on kuvattu aiemmin [40]. Lyhyesti, vasta diagnosoitu ja histologisesti varmistettua munuaissyövän muttei munuaisaltaan (ICD-0-2-koodi C64) ikävälillä 20 ja 79 vuotta rekrytoitiin 1999 kautta 2003. Koulutettu hoitohenkilökunta tarkistetaan potilastiedot ja uuttaa tietoa mennessä ja Diagnoosimenetelmä histologinen luokitus, kasvaimen vaiheessa ja arvosana. Hyväksyttävät tarkastukset valittiin tuotujen potilaiden samassa sairaalassa kuin tapausten olosuhteet eivät liity tupakoinnin tai urogenitaalinen häiriöt (lukuunottamatta eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun) ja olivat taajuus-sovitettu tapauksissa iän, sukupuolen, ja tutkimus keskus. Mikään yksittäinen tauti oli yli 20% kontrolliryhmään. Kaikki palvelukseen tapausten ja kontrollien oli valkoihoisia. Hoitovasteet jokaisessa keskustan vaihteli 90,0-98,6% tapauksista ja 90,3-96,1% valvontaa. Standardoitu elämäntapa ja ruoan taajuus kyselyihin annettiin henkilökohtaisesti koulutettu henkilöstö [38], [41].

verinäytteitä kerättiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa ja sen jälkeen kuljetetaan National Cancer Institute (NCI). Genomi-DNA uutettiin buffy coat standardin fenoli kloroformi menetelmän NCI laboratoriossa. Arvioida globaalin metylaatio, valitsimme osajoukko RCC tapausten ja kontrollien kanssa paljon saatavilla DNA (≥10 ug) ja tiedot

VHL

tila käyttäen seuraavia vastaavia kriteereitä. Kontrollit valittiin satunnaisesti ja taajuus-Hyväksytty (02:01) iän (± 5 vuotta), sukupuoli ja opintokeskus (jos mahdollista) saada riittävästi virtaa (90% havaita vähäinen 1,80). Kaikki aiheet tässä tutkimuksessa ei esittänyt kirjallisia lupaa. Tutkimus hyväksyi Institutional Review laudat NCI, International Agency for Research Cancer (IARC), ja kunkin osallistuvan keskus.

genotyypin

genotyypin määritykset suoritettiin NCI: n Core Genotyping Facility . Seuraavat toiminnalliset yhden emäksen monimuotoisuus (SNP) kolmen geenit pidettiin tässä tutkimuksessa, koska niiden tehtävä tarjota esiasteita tarvitaan DNA-synteesiin ja korjaus sekä DNA: n metylaatio: 5,10 metyleenitetrahydrofolaattia reduktaasin (

MTHFR

; c.1298A C,

c.677C T) B, 5-methyltetrahydrofolate-homokysteiinin metyylitransferaasin (

MTR; c.2756A G

), ja tymidylaattisyntetaasin (

TYMS ; EX8 + 157C T, EX8 + 227A G

). Glutationi-S-transferaasin mu 1 (

GSTM1

) ja glutationi S-transferaasi theta 1 (

GSTT1

) deleetioita valittiin myös siksi aiempien yhdistysten riski RCC ja niiden merkitys vaiheen II aineenvaihduntaan . Erityiset kokeelliset menetelmät on kuvattu aikaisemmin (https://snp500cancer.nci.nih.gov) [20], [42].

kvantifiointi LINE-1 metylaatiotasoilla

LINE-1 metylaatio kvantitoitiin käyttäen pyrosekvensointi kokeessa EpigenDx (Worcester, MA) [43], [44], [45]. Meidän määritys on suunniteltu tutkimaan metylaatiostatuksen neljässä CpG sivustoja edistäjä LINE-1 alue (GenBank #: M80343, -605, -593, -590 ja -583 bp ATG ORF1) [16], [46]. Lyhyesti, 500 ng leukosyyttien DNA: isella käsiteltiin ja puhdistettiin käyttämällä Zymo DNA Metylointi Kit (Zymo tutkimus, Orange, CA). Bisulfaatti käsitelty DNA puhdistettiin ja eluoitiin 20 ui eluutiopuskuria. Kukin 50 ui PCR sisälsi 10X PCR-puskuria, 3,0 mM MgCI

2, 200 uM dNTP, 0,2 uM alukkeita, 1,25 U DNA-polymeraasia (Hotstar, Qiagen Inc., Alameda, CA) 1,25 U, ja ~ 10 ng bisulfiitti muunnetun DNA . Polymeraasi aktivoitiin inkuboimalla 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 34 sykliä 95 ° C 15 s, 45 ° C 30 sekuntia ja 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Reaktion annettiin sitten jatkaa 5 minuuttia 72 ° C: ssa. Universaali biotinyloitua aluketta käytettiin alkuperäisen PCR-reaktiossa mahdollistaa eristämiseksi amplikonin, jonka jälkeen denaturointi- ja vapauttamaan yhden lohkon tuote pyrosekvensointi [47]. PCR-tuotteet (10 ui) sekvensoitiin käyttämällä pyrosekvensointi PSQ96 HS System (pyrosekvensointi Qiagen) seuraten valmistajan ohjeita (pyrosekvensointi Qiagen). Metylaatiostatuksen kussakin 4 loci analysoitiin erikseen T /C SNP käyttäen QCpG ohjelmistoa (pyrosekvensointi Qiagen). Metylaatiostatuksen kaikissa neljässä loci ovat keskimäärin yhdessä tarjota yleistä prosenttia 5meC tila. Näyte pyrogram on sisällytetty täydentäviä tietoja (kuva S1). Prosenttia DNA metylaation LINE-1 mitattiin kolmena kappaleena.

TILASTOANALYYSI

kolmin kappalein LINE-1 5meC mittausten keskiarvo yhteen. Yksittäiset juoksee 7,5% bisulfiitti konvertoitumatonta sytosiini arvoja ja näytteet variaatiokerroin (CV) 10% jätettiin analyysien (n = 19). Teimme Herkkyysanalyysien ilman yksilöiden CV 5%. Tämä rajoitus ei johtanut merkittävää eroa riskiestimaattien vähintään 10% ja siten näitä aiheita jäi analyyseissä. Kun nämä rajoitukset, tiedot olivat saatavilla 982 näytettä (328 RCC tapausta ja 654 valvontaa). Erot tapausten ja kontrollien välillä testattiin merkitystä käyttäen Wilcoxonin testejä. Tunnistaa mahdolliset tekijöitä LINE-1 metylaatiotasoilla ja /tai tekijöitä, jotka voivat muuttaa assosiaatio LINE-1 metylaatiotasoilla ja munuaissyövän riskiä, ​​lineaarinen regressiomalleja käytettiin arvioimaan eroja valvonnan suhteen valitut ominaisuudet. Jakauma LINE-1 keskimääräinen% 5meC kontrollien joukossa käytettiin määrittämään leikata pistettä kvartiiliin. Arvioimaan yhdistyksen välillä LINE-1 metylaatiotasoilla ja RCC, logistinen regressio malleja oikaistu matching tekijät, tupakka tila, BMI, vihannesten nauttiminen ja itse ilmoitettu verenpainetauti, käytettiin arvioimaan kertoimet suhde (OR) ja 95%: n luottamusväli (95% CI). Testit suuntaus laskettiin mallintamalla muuttuja koodattu 0, 1, 2 ja 3 jokaiselle neljännekseen. Olemme myös mallinnettu LINE-1 jatkuvana arvo. Arvioida mahdollisia vaikutuksia muutos LINE-1 metylointi, kerrostunut analyysit tupakoinnin asema, sukupuoli, painoindeksi, vihannesten vähäinen, itse ilmoitettu verenpainetauti ja valittujen SNP tehtiin. Yhteinen toiminnallisia variantteja sisällä

MTHFR, MTR, TYMS, GSTM1,

ja

GSTT1

arvioitiin yhdessä LINE-1 metylointi. Homotsygoottinen pääalleelille oli koodattu kuin vertaisverkko ryhmä, ja heterotsygoottinen ja homotsygoottinen pieniä alleeli genotyypit yhdistetään johtuen pieniä määriä, jotka olivat homotsygoottisia alaikäisen alleelien. Tapaus vain analyysin välisen vuorovaikutuksen arvioimiseksi tupakoinnin ja LINE-1 metylaatiotasoilla suoritettiin myös tarjota arvio vaikutuksen muutos (vuorovaikutus OR: IOR), joka ei saa vaikuttaa valintaan harhat keskuudessa valvontaa. IORS edustavat lähdön yhteisvaikutus tupakoinnin ja LINE-1 metylointi kyseisestä odoteta kertovan mallin RCC riskiä. Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen SAS versiota 9.1. (SAS Institute, Cary, NC).

tukeminen Information

Kuva S1.

Näyte pyrogram osoittamalla LINE-1 metylaatiotasoilla.

doi: 10,1371 /journal.pone.0027361.s001

(DOC) B Taulukko S1.

Ositettu analyysit mukaan tupakoinnista ja Individual LINE-1 asemassa. Kerroin suhde ja 95%: n luottamusväli yhdistyksen välillä LINE-1 metylaatiotasoilla ja RCC, oikaistu sukupuolen, iän, keskusta, BMI, korkea verenpaine ja vihannesten nauttiminen.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0027361.s002

(DOC) B