Krooninen sairaus

tiivistelmä

Diffuusi suurten B-solujen lymfooma (DLBCL) on ominaista suuri geneettinen ja kliininen heterogeenisyys mikä vaikeuttaa ennustetekijöiden ennustaminen ja vaikutteita hoidon tehokkuutta. Yleisin hoito, R-CHOP, koostuu yhdistelmästä antrasykliiniä ja immuno-pohjainen huumeiden, kuten rituksimabi. Se on edelleen heikko, miten ja missä määrin geneettinen vaihtelu vaikuttaa vaste ja mahdolliset sietokykyä R-CHOP. Siten parannettu ymmärrystä johtavien mekanismien huumeiden suvaitsevaisuutta B-soluissa on ratkaiseva, ja mallinnus geneettinen interventio suoraan B-soluissa on olennainen tällaisia ​​tutkimuksia. Lentivirus-pohjainen geenin vektoreita käytetään laajalti geenin ajoneuvoja, jotka B-solut ovat houkutteleva vaihtoehto mahdollisesti myrkyllisiä transfektion perustuvia menetelmiä. Täällä me tutkimme käyttöä VSV-G-pseudotyypeiksi lentivirusvektoreita B-solujen tutkitaan vaikutuksia MikroRNA on toleranssin Rituksimabi. Erityisesti havaitaan, että vahva lentiviruksen transduktion syöpä- B-solulinjojen merkittävästi ja erityisesti parantaa vastustuskykyä transdusoitujen itukeskuksen B-solujen (GCBs) ja rituksimabi. Vaikka rituksimabi toimii osittain läpi komplementin välittämiä solun tuhoutumisen, sietokykyä ei saavuteta vaikutuksia lentiviruksen transduktion solukuolemaan välittyy komplementin. Pikemminkin alenemisesta PARP1 ja jatkuvasti korkeita CD43 in Rituksimabi saaneilla GCBs osoittavat antiapoptoottisia vaikutuksia lentiviruksen transduktion, jotka voivat häiritä tuloksen ja tulkinnan rituksimabia sietokykyä koskevilla tutkimuksilla. Meidän havainnot korostavat, että on oltava varovainen hyödyntämällä lentivirusvektoreita tutkimuksissa toleranssi terapeuttisia DLBCL. On kuitenkin tärkeää, osoitamme mahdollisuutta käyttää lentiviruksen geeniä jakelukanavasta tutkimuksissa käsitellään vaikutuksia erityisten MikroRNA on Rituksimabi reagointikykyä.

Citation: Ranjbar B, Krogh LB, Laursen MB, Primo MN, Marques SC, Dybkær K, et ai. (2016) Anti-apoptoottinen Effects lentivirusvektorikirjastojen TRANSDUKTIO edistämään suurempaa Rituksimabi sietokyky syöpä B-solut. PLoS ONE 11 (4): e0153069. doi: 10,1371 /journal.pone.0153069

Editor: Kristy L. Richards, Cornell University, Yhdysvallat |

vastaanotettu 24. marraskuuta 2015 Hyväksytty: 23 maaliskuu 2016; Julkaistu: 05 huhtikuu 2016

Copyright: © 2016 Ranjbar et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Agnes og Poul Friis Fond; Aase og Ejnar Danielsens Fond; Frits, Georg og Marie Cecilie Gluds Legat; Else og Mogens Wedell-Wedellsborgs Fond; Civilingeniør Frode V. Nyegaard og hustrus Fond; Arvid Nilssons Fond; Fabrikant Ejnar Willumsenin Legat. Kaikki saamat J.G. Mikkelsen. PhD liikkuvuus toveruuden välillä Aarhus University saamien B. Ranjbar.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Diffuusi suurten B-solujen lymfooma (DLBCL) on yleisin non-Hodgkin lymfooma aikuisilla, joilla on 5-vuoden yleinen eloonjäämisaste 60%, mikä osoittaa, että jotkut potilaat ovat joko välinpitämättömiä nykyiseen hoitoon tai kehittää lääkeresistenssi hoidon aikana. DLBCL on sekä kliinisesti ja molekyylirakennetta heterogeeninen sairaus. Suurin alatyyppi on määritelty DLBCL, ei ole mainittu muualla (DLBCL, NOS), joka geenitekniikan ilmentymisen profilointi voidaan jakaa seuraaviin molekyyli alaluokkien: (i) germinaalikeskuksen B-solu (GCB) DLBCL ja (ii) aktivoitujen B -solujen (ABC) DLBCL, [1-3]. Kaksi molekyyli alaluokkaa GCB ja ABC eroavat signalointireitistä vikoja, geneettisiä poikkeavuuksia, ja patogeneesi [1,4-6]. Survival tulokset eroavat myös, kuten GCB potilailla on suurempi 5 vuoden pysyvyys on 69-79% verrattuna 52-53% niille ABC DLBCL kun käsitellään standardin immuno- ja antrasykliinipohjaista monilääke solunsalpaajahoito, joka tunnetaan nimellä R -CHOP, joka koostuu rituksimabia (R), syklofosfamidi (C), doksorubisiini (H), vinkristiini (O), ja prednisonin (P) [7]. Lisäksi noin kolmasosa DLBCL potilaalla ilmenee uusiutunutta /refraktorista tautia. Siten löytö uusien biologisten merkkiaineiden ja terapeuttisten aineiden sekä strategiat voittamiseksi lääkeresistenssin edelleen keskeisiä haasteita tarjoamalla parannetun hoidon DLBCL potilaille.

Rituksimabi on ensimmäinen FDA-hyväksytty vasta-ainetta voidaan käyttää hoidettaessa DLBCL . Rituksimabi on kohdistettu CD20-molekyylien pinnalla esi-B-solujen ja eriytetty B-solujen vaiheissa [8]. CD20 on erilaistumisspesifistä solun pinta-antigeeni, joka on läsnä B-solun pinnan alkuvaiheessa B-solujen kehittymisen jälkeiseen siemennestettä kypsymisen vaiheista, mutta ei pinnalla kypsän plasman soluja [8]. Molekyyli on mukana aktivoitumista ja lisääntymistä B-soluissa ja on ajateltu olevan osa solun pinnalla kompleksin mukana kalsiumin kuljetusta, vaikka ligandi CD20 on tuntematon [8]. Eri toimintamekanismeja on kuvattu Rituksimabi, kuten komplementista riippuva solu- sytotoksisuus (CDC), vasta-aine-Dependent soluvälitteinen sytotoksisuus (ADCC), ja suora induktio solukuolema [8,9]. Huolimatta eduista Rituksimabi, lääkeresistenssin edelleen haaste tehokas ja pitkäaikainen hoito. Useat johtavien mekanismien Rituksimabi toleranssi on kuvattu; Näitä ovat alas-säätely CD20 ilmaisun [10-12], säätely alaspäin apoptoosin-mukana proteiineja, kuten Bak ja Bax [13], ja p38 MAPK toimintaa [14], kuten äskettäin tarkistaa Pérez-Callejo ja työtovereiden [15]. Lisäksi MikroRNA (miRNA) uskotaan edistää lääkkeen vaste ja mahdolliset resistanssin kautta niiden kyky moduloida proteiinien ekspression keskeisten signaalitransduktioreaktioteiden [16-18].

miRNA ovat pieniä (noin 20 nukleotidia ) ei-koodaavat RNA: t, jotka transkription jälkeen säädellä geeniekspressiota kautta RNA-interferenssi-reitin [19]. Nämä RNA-molekyylit, ilmennetään RNApolII- tai RNApolIII-transkriptoidaan geenejä genomissa, käsitellään sekä tumassa ja sen jälkeen, kun tumasta, sytoplasmassa. Osana RNA aiheuttama hiljentäminen kompleksi (RISC), kypsä miRNA kiinnittyvät tunnustamista sivustoja kohde mRNA: iden ja välittää mRNA: n hajoamisen tai translaation tukahduttaminen [20,21]. Vuorovaikutus miRNA ja mRNA perustuu emäspariutumisen, mutta täydellinen ottelu näiden kahden molekyylin välillä ei tarvita miRNA toimintoa. Siksi yksi miRNA on potentiaalia tavoite ja säädellä monin eri mRNA: t, kun taas tietyn mRNA voidaan kohdistaa joukko eri miRNA. Tämä luo verkoston geenin sääntelyn vuorovaikutusta ja ehdottaa, että miRNA olla puskurointi rooli geenisäätelyn joitakin mahdollisia välinen redundanssi miRNA. Ottaen huomioon nämä toimet, miRNA ovat kriittisiä toimijoita monissa solun ja kehittävän reittejä ja auttaa säätelemään perustiedot solujen ominaisuuksia kuten erilaistuminen, proliferaatio, apoptoosin, ja homeostaasiin. On hyvin tiedossa, että miRNA asetus vaikuttaa syövän kehittymisen ja etenemisen [22], ja miRNA voi toimia joko tuumorisuppressoreilla tai onkogeenien perustuu niiden kohde- geeni (t) avustaminen tukahduttaminen ja edistäminen, tässä järjestyksessä, syövän kasvua ja etenemistä [23 -26].

Global miRNA ilmaisun profilointi tutkimukset ovat osoittaneet selvästi miRNA allekirjoituksia eri DLBCL alaryhmiä, mikä viittaa siihen, että B-solujen syöpiä voidaan luokitella perustuu miRNA ekspressioprofiileja [27]. Koska tällaiset erot miRNA allekirjoituksia, tiettyjä osia miRNA voidaan tunnistaa mahdollisia prognostisia ja ennakoivan biomarkkereita taudin etenemistä ja hoito, vastaavasti. Esimerkiksi korkea ilmentyminen miR-155 löydettiin kliinisessä aineisto liittyvän epäonnistumisen R-CHOP-hoito [27]. Tuore systemaattinen tutkimus, joissa keskitytään miRNA ilmaisun DLBCL havaintojen mukaan yhteensä 30 miRNA liittyy potilaiden hoitotuloksiin [28]. Erityisesti vain suhteellisen pieni määrä miRNA on havaittu useissa riippumattomissa tutkimuksissa tukee käsitystä, että erot voivat olla johtuen äärimmäisen sääntelyn monimutkaisuutta ja olemassaolon pitkälti tunnistamattomien verkostojen yhteistyötä miRNA. Lisäksi on osoitettu, että miR-224 voi vaikuttaa Rituksimabi tehokkuutta säätelemällä kohdegeenin koodaavan CD59, joka osoittaa uskottava roolit miRNA on resistenssin kehittyminen Rituksimabi [29]. Tuoreessa tutkimuksessa todettiin, että miR-199 ja miR-497 aiheuttaa lisääntynyt herkkyys Rituksimabi ja muita kemoterapeuttisia, joilla parannetaan yleistä selviytymistä DLBCL [30].

Global analyysit kliinisiä näytteitä array perustuvat tekniikat tai ensi sukupolven sekvensointi ovat voimakkaita lähestymistapoja, jotka ovat johtaneet tunnistamiseen molekyyli ennustavia, kuten miRNA, sekä DLBCL selviytymisen ja ennusteen [31,32]. On kuitenkin olennaisen tärkeää, mallintamaan miRNA toiminto B-solujen ja luoda foorumin opiskeluun miRNA verkkojen ja niiden merkitystä lääkkeen vaste ja kehittäminen mahdollisten lääkkeiden sietokykyyn. Molekyylimanipulaatiolla B-solujen vaikeuttaa se, että nämä solut ovat vaikea transfektoida kanssa plasmidi-DNA ja syntetisoitu tai

in vitro

-transcribed RNA ja että transfektio kemiallisella käsittelyllä tai elektroporaatiota voidaan liittää huomattavaa toksisuutta ja solukuolemaa. Virus-pohjainen geeninsiirto kuitenkin edustaa vaihtoehtoista tapaa mallintaa miRNA toiminnon B-soluissa. Tässä tutkimuksessa selvitimme käyttö rakkulasuutulehdusvirusta glykoproteiini G (VSV-G) -pseudotyped lentivirusvektoreita B-solujen vaikutuksia käsittelevien tutkimusten miRNA herkkyydestä syöpä- B-solujen Rituksimabi. Erityisesti, me osoittavat, että transduktion GCB-tyypin B-solujen standardin lentivirusvektoreita johtaa lisääntynyt sietokyky Rituksimabi ja että anti-apoptoottiset tekijöiden aiheuttama käsittelemällä soluja lentivirusvektoreita. Huolimatta näistä vaikutuksista lentivirusvektorikirjastojen transduktion B-solujen, me osoittaa toteutettavuus tämän geenin jakelualustan tutkimuksissa käsitellään merkitys erityisten miRNA suhteessa Rituksimabi reagointikykyä.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjoja

Kuusi DLBCL solulinjoja käytettiin annos-vaste-määrityksiä. NU-DHL-1 ja SU-DHL-5 ostettiin DSMZ (German Collection of mikro-organismien ja Cell Cultures). FARAGE [33], OCI-Ly-7 [34], RIVA [35], ja SU-DHL-8 [36] saatiin ystävällisesti Dr. Jose A. Martinez-Climent (Molecular Oncology Laboratory, University of Navarra, Pamplona , Espanja). Kaikki solut viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2. DLBCL linjat ympättiin RPMI1640 (Lonza, Basel, Sveitsi), johon oli lisätty 10% FBS: ää, 1% glutamiinia ja 1% penisilliini /streptomysiiniä. HEK-293T-solut ympättiin DMEM (Lonza, Basel, Sveitsi), joka sisälsi 5% FBS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiiniä. Identiteetti solulinjojen varmistettiin DNA viivakoodaus, kuten aiemmin on kuvattu [37].

Vector rakentaminen

standardia lentiviraalinen miRNA ekspressiovektori (pLV /miRCS-PE), kuljettaa miRNA kloonauskohta (miRCS) asetettavaksi PCR-monistettujen miRNA-sekvenssit, luotiin kloonaamalla U1 ekspressiokasetti, joka sisältää sisäisen kloonauskohdan (U1-MCS-U1terminator) osaksi lentivirusvektori plasmidi pLV /PGK-eGFP [38], joka sisältää PGK-eGFP (PE) ekspressiokasetin. Insertion mahdollistamiseksi Notl-pilkotut fragmentit alavirtaan U1 promoottorin, Bsp120I restriktiokohta lisättiin välillä U1 promoottorin ja U1 terminaattori. Genomi-DNA-sekvenssit, jotka koodaavat eri tutkittu miRNA PCR-monistettiin ihmisen genomisesta DNA: sta eristettiin HeLa-soluista ja kloonattiin Bsp120I-digestoituun pLV /miRCS-PE. Tutkittu miRNA ja käytetyt alukkeet PCR-amplifikaatiota varten annetaan S1 taulukossa.

Analyysi miRNA-toiminto

funktionaalisia tutkimuksia kloonatun miRNA variantteja, yksittäiset kohde-sekvenssit fuusioidaan Rluc reportterigeenin insertoimalla oligonukleotidit, jotka sisältävät kohdesekvenssin Notl /Xhol-digestoituun psiCHECK-2-vektoriin (Promega, Madison, WI, USA), kuten aiemmin on kuvattu [39]. Toimivuus kloonattu miRNA tarkistettiin HEK-293T-soluissa yhdessä transfektoitu psiCHECK-2-peräinen plasmidi ja pLV /miRCS-PE-peräinen plasmidi, joka koodaa kyseisen miRNA käyttäen Dual Luciferase Assay (Promega, Madison, WI, USA) valmistajan protokollan.

lentivirustartunnat tuotanto ja transduktio

tuottaa lentivirusvektoreita, HEK-293T-solut maljattiin 10 ml DMEM tiheydellä 4 x 10

6 per 10-cm lautasen. Seuraavana päivänä solut transfektoitiin lentiviraalinen pakkaus plasmideilla (13,0 ug pIntg, 3,75 mikrog pMD2G, 3.0 ug pRSV-Rev, ja 13,0 ug pLV /miR [numero] -PE). Medium vaihdettiin 24 tunnin kuluttua. 48 tuntia transfektion jälkeen, supernatantti otettiin talteen ja ultrasentrifugoitiin kautta sakkaroosikerroksen. Virussaanto määritettiin käyttäen p24-ELISA-kittiä (XpressBio, Frederick, MD, USA), ja virusten määrää eri vektori valmisteiden normalisoitui tason perusteella p24-proteiinin. Syövän B-soluja ympättiin tiheydellä 3 x 10

4 /ml 2 ml: ssa RPMI 1640. Solut transdusoitiin seuraavana päivänä käyttäen yhtä suuria määriä virusta, joka perustuu p24 mittauksiin. Transduktio teho mitattiin käyttäen virtaussytometriaa (LSRFortessa, BD Bioscience, San Diego, CA, USA).

Rituksimabi sytotoksisuusmääritys

vaikutusten tutkiminen eri miRNA herkkyydestä hoitoon rituksimabilla, transdusoidut solut kerättiin, pestiin ja ympättiin 3 x 10

5 /ml 0,8 ml RPMI1640, 72 tuntia transduktion jälkeen. Soluja käsiteltiin seuraavana päivänä rituksimabilla annoksena, joka vastaa GI50 rituksimabia tai sama tilavuus natriumkloridia puskuria. Tilavuus 200 ui yhdistettyä ihmisen AB-seerumia (HS) (Innovative Research, Novy, MI, USA) lisättiin levyille. Neljäkymmentä kahdeksan tunnin kuluttua lääkehoidon solut laskettiin suoraan trypaanisinivärin (kuten elinkelpoisuus markkeri) syrjäytymistä menetelmällä käyttäen Neubauer kammio (0,0025 mm

2) ja värjättiin rinnalla BrdU (BD Bioscience, San Diego, CA , USA) mittaamiseksi proliferaationopeus. Joitakin kokeita, komplementin proteiinien inaktivoitiin ihmisen seerumissa (inHS) kuumentamalla 56 ° C: ssa 30 minuutin ajan.

Virtaussytometria

Solut kerättiin, pestiin ja värjättiin 30 minuutin ajan jossa korjattavissa lähellä IR-kuolleiden solujen elinkelpoisuuden markkeri (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) valmistajan protokollan. Sitten solut pestiin ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 minuutin ajan ja analysoitiin elinkelpoisuuden ja GFP: n ilmentymisen. For CD43 ja CD20-analyysi, solut kerättiin, pestiin ja värjättiin APC-konjugoidun anti-CD43 (BD ​​Bioscience, San Diego, CA, USA) ja APC-konjugoitu anti-CD20 (BD Bioscience, San Diego, CA, USA) erikseen 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa pimeässä ja kiinnitetään sitten 15 minuuttia 4% paraformaldehydillä. Mitata apoptoosin, solut kerättiin, pestiin, permeabilisoitiin ja värjättiin PE-konjugoidulla anti-katkotun PARP1 (BD Bioscience, San Diego, CA, USA) valmistajan protokollan. Mitata proliferaationopeus, soluja inkuboitiin BrdU 55 minuuttia ja sitten kerättiin, pestiin kahdesti ja läpäiseviksi ja värjättiin APC-konjugoidun anti-BrdU (BD Bioscience, San Diego, CA, USA) valmistajan protokollan. Kvantifiointi GFP, elinkelpoisuutta, CD43 ja CD20 ilmentymisen, pilkottiin PARP1, ja BrdU-positiivisten solujen arvioitiin virtaussytometrillä (LSRFortessa, BD Bioscience, San Diego, CA, USA), ja tiedot analysoidaan käyttäen FlowJo_V10 ohjelmistoa.

kvantitointi-mRNA-tasojen qPCR

Solut kerättiin, pestiin, ja hajotettiin 48 tuntia rituksimabi-hoidon jälkeen. Kokonais-RNA puhdistettiin käyttämällä Mirvana miRNA Isolation Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) valmistajan protokollan. Ilmaisu on CD43 mitattiin alukkeita ja koetin (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) valmistajan protokollan Light Cycler 480 (Roche, Basel, Sveitsi). Ilmentymisen taso normalisoitiin ilmaus RPLP0.

Tilastollinen

Studentin t-testit (kaksisuuntaisia) parilliset ja parittomat tehtiin. Kaikki kokeet, mukaan lukien lääkeaineen määritykset ja geenin ja proteiinin ilmentyminen analyysi suoritettiin kolme kertaa biologisen kolmena rinnakkaisena.

Tulokset

tehokas lentiviruksen transduktion B-solujen GCB- ja ABC-kaltaista alkuperää

vaikutusten tutkiminen miRNA ilmaisua Rituksimabi vaste vaikeasti transfektoimaan DLBCL solulinjoissa, ensin luotu lentivirusvektoria konstruktio, pLV /miRCS-PE, jossa on kaksi ekspressiokasettia mahdollistaa samanaikaisen ilmentymisen (i) miRNA kiinnostavia ilmennetään ihmisen U1 pienet ydin-RNA (snRNA) promoottorin ja (ii) eGFP reportterigeenin, jota käyttää fosfoglyseraattikinaasi (PGK) promoottori (kuvio 1a). Käyttämällä ilmaus eGFP markkerina onnistuneelle geenikuljettimia, määritimme transduktio nopeudella upconcentrated LV /miRCS-PE yhteensä kuusi syövän B-solulinjojen DLBCL alkuperää. Kaksi näistä solulinjoista olivat refraktorisia transduktio VSV-G-pseudo- lentivirusvektoreita, mutta jäljellä olevat solulinjat osoittivat vahvaa tasoa lentiviruksesta transduktion (S1a kuvio). Lisäksi elinkelpoisuuden solujen transduktion jälkeen oli lähes 100% kaikkien solulinjojen (S1B kuvio). Tämän perusteella seulonta solulinjoja, jotka olivat herkkiä lentivirus transduktio, olemme keskittyneet kahteen GCB kaltainen solulinjoissa OCI-Ly-7 ja SU-DHL-5 ja kaksi ABC kaltainen solulinjoissa RIVA ja NU-DHL- 1. Määritettynä virtaussytometrialla analysointia, nämä neljä B-solulinjat olivat kaikki positiivisia CD20 ilmentymisen solun pinnalla (S2 kuvio). Näistä solulinjoista, suoritimme lisää transduktion kokeiluja ja vahvistettiin tehokasta geenikuljettimia fluoresenssimikroskopialla (kuvio 1 b). Näin ollen tasojen transduktio määritettiin virtaussytometrialla vaihtelivat 57 ± 3% RIVA soluissa 78 ± 2,5% SU-DHL-5-soluja (tyypillinen ilmentymisen profiilit esitetään kuviossa 1c). Olisi myös huomattava, että morfologia näistä neljästä solulinjojen erosivat tavalla, joka on riippumaton lentiviruksen hoitoon. Siten molemmat OCI-Ly-7 ja SU-DHL-5-solut muodostivat soluryppäitä suurempien solujen aggregaatteja, erityisen ilmeistä OCI-Ly-7 kulttuureissa, kun taas kumpikaan RIVA eikä NU-DHL-1-solut osoittivat taipumusta klusterin.

(a) lentivirusvektori, pLV /miR-PE rakennettiin samanaikaisesti ilmaista tietyn miRNA (peräisin U1 promoottori) ja eGFP (peräisin PGK-promoottori). Violetin laatikon (merkitty ”T”) osoittaa U1 terminaatioalue, joka päättyy transkription miRNA työnnetään BSp120I sivustoon. Vaaleanharmaa laatikot kuvaavat elementit (R, U5, ja ΔU3) pitkän terminaalin toistoa lentivirusvektori. CMV (vaaleanharmaa nuoli) osoittaa käytetyn promoottorin ilmentymisen ohjaamiseksi vektorin RNA vektori tuottavissa soluissa. Transduktioteho vektorin analysoitiin (b) fluoresenssi mikroskopia ja (c) virtaussytometria-analyysi eri syövän B-solulinjoissa. Mittakaava mikroskooppi kuvien osoitetaan punaisella palkki edustaa pituus 0,1 mm kaikissa kuvissa.

Lisääntynyt toleranssi rituksimabista GCB kaltaisia ​​soluja käsiteltiin lentivirusvektoreita

Kun tavoitteena hyödyntää lentiviruksen toimituksen tutkimuksissa rituksimabin suvaitsevaisuuden B-soluissa, ryhdyimme ensimmäisenä tunnistaa soluvaikutuksensa lentivirusvektorikirjastojen transduktion. Tavallisessa Drug Response Assay (DRA) (koejärjestely kuvattu S3 kuviossa), altistimme transdusoitujen solujen Rituksimabi läsnä ihmisen seerumia (HS), 72 tuntia transduktion jälkeen LV /miRCS-PE ja mitataan vaikutus Rituksimabi hoidon sen jälkeen vielä 48 tunnin laskemalla solujen lukumäärä tai analysoimiseksi leimaamisen BrdU kuten soluproliferaation mittana. Aluksi, OCI-Ly-7 ja RIVA soluja käsiteltiin lisäämällä rituksimabiannoksilla, joka vastaa GI50 (lääkeaineen pitoisuus, joka estää 50% solujen kasvun), TGI (lääkeaineen pitoisuus, joka aiheuttaa yhteensä kasvun esto), ja 2 x TGI.

OCI-Ly-7-soluissa havaitsimme, että solut transdusoitu standardin ekspressiovektorilla, LV /miRCS-PE, kohonneen vastustuskyvyn kaikki rituksimabiannoksilla (määritettynä solujen laskenta ja BrdU proliferaatiomäärityksissä) suhteessa soluihin, joita ei ole käsitelty lentivirusvektori (kuvio 2a ja 2b, vasen paneeli). Tällaiset suurempaa suvaitsevaisuutta ei voitu tunnistaa transdusoiduissa RIVA soluissa (kuvio 2a ja 2b, oikea paneeli). Hoito kahden solutyyppien kanssa Doksorubisiini ei ilmennyt vaikutuksia huumeiden toleranssi jälkeen lentiviraalinen transduktion (kuvio 2c ja S4a kuvassa), mikä viittaa siihen, että indusoi toleranssin OCI-Ly-7-soluissa oli spesifinen Rituksimabi. Käyttämällä Rituksimabi konsentraatio vastaa GI50, suoritimme Rituksimabi siedettävyystutkimukset kaikissa neljässä solulinjoissa (OCL-Ly-7, SU-DHL-5, RIVA, ja NU-DHL-1-solut) ja löysi sama vaikutukset transduktion LV /miRCS-PE kahden GCB kaltainen solulinjoissa, kun taas toleranssi Rituksimabi ei muuttunut kahden ABC kaltainen solulinjoissa (kuvio 2d ja S4b kuvassa), mikä viittaa siihen, että indusoitu toleranssi oli spesifinen GCB kaltainen DLBCL cell linjat. Samanaikaisesti, suora solun laskenta transdusoitujen OCL-Ly-7 ja SU-DHL-5-solut osoittivat väheneminen lisääntymisnopeus (kuvio 2e), joka on tuettu analyysi BrdU (S4c kuvio), mikä osoittaa, että rituksimabi siedettävyys oli ei lisääntyneen soluproliferaation lentivirally transdusoidut solut.

soluja käsiteltiin Rituksimabi (RTX) 72 tuntia sen jälkeen, kun lentivirusvekto- transduktion. Solujen proliferaatio mitattiin 48 tunnin kuluttua Rituksimabi hoidon avulla (a) Trypan Blue-värjäys ja suora solujen laskenta ja (b) BrdU määrityksessä ja virtaussytometria-analyysi. (C) ei ole vaikutusta doksorubisiinin, kuten on esitetty mittaamalla solujen lisääntymistä 48 tunnin käsittelyn jälkeen lääkeaineen kanssa. (D) lentivirustartunnat välittämää lisäystä toleranssin rituksimabista GCB-Like DLBCL solulinjoissa (OCI-Ly-7, SU-DHL-5), mutta ei ABC-Like soluissa. (E) Vähennys soluproliferaation OCI-Ly-7 ja SU-DHL-5-solut käsiteltiin lentivirusvektoreita. Määrä soluja määritettiin sen jälkeen, kun 96 tunnin inkubaation jälkeen. NTC, nontranduced solut; LVTC, lentivirusvektori-transdusoidut solut. Tähdet osoittavat merkitsevyystaso seuraavasti: *:

p

value≤0.05, **:

p

value≤0.01, ***:

p

value≤0.001.

Lentivirusvektori aiheuttama Rituksimabi toleranssi ei liity komplementtivälitteisen solun hajoamista

roolin tutkimiseksi komplementin välittämiä solun tuhoutumisen lisääntyneestä Rituksimabi toleranssin lentivirally transdusoiduissa GCB kaltaisia solut, olemme analysoineet vaste GI50 rituksimabiannoksilla läsnä ollessa HS ja täydentää inaktivoidun ihmisen seerumia (inHS). Ensin viljellään OCI-Ly-7 ja RIVA soluja, transdusoitu LV /miRCS-PE: n läsnä ollessa inHS ja HS. Sillä OCI-Ly-7-soluissa, olemme huomanneet, alentunut toleranssi rituksimabista komplementin läsnä ollessa (soluja kasvatettu HS) suhteessa soluihin, joita kasvatetaan in komplementin puuttuessa (solut kasvanut inHS), mitattuna laskemalla solut (kuvio 3a, vasen paneeli). Sen sijaan vastaus Rituksimabi eivät vaikuttaneet täydentäjinä RIVA soluissa (kuvio 3a, oikea paneeli). Näitä havaintoja tukevat mittaamalla sisällyttämällä BrdU (S5a kuvio). Täten solukuoleman aiheuttama Rituksimabi hoitoon OCI-Ly-7 tapahtui osittain mekanismien kautta, joissa komplementin riippuva sytotoksisuus (CDC).

(a) Lisääntynyt toleranssi Rituksimabi (RTX) in GCB kaltaisia ​​soluja läsnä ja täydentävät suhteessa kasvatettujen solujen komplementin puuttuessa. Solujen käsittely lämmöllä inaktivoitua ihmisen seerumia (inHS) osoitti, että apoptoottinen vaikutus Rituksimabi oli riippumaton komplementin järjestelmän RIVA (ABC-like) soluissa, mutta ei OCI-Ly-7 (GCB kaltaiset solut). (B) Suhteellinen eloonjäämisaste rituksimabia käsiteltyjä soluja kasvatettiin ihmisen seerumin (HS) ja inHS eivät eronneet nontransduced ja lentivirally transdusoidut solut. Määrä OCI-Ly-7 ja SU-DHL-5-soluissa määritettiin ja ilman lentiviraalinen transduktio puuttuessa tai läsnä aktiivisen täydennys. Sekä GCB kaltainen solulinjoissa (OCI-Ly-7, SU-DHL-5) suhteellinen kasvu Rituksimabi toleranssi oli samanlainen NTC ja LVTC ryhmiä, jotka osoittavat, että suojaavia vaikutuksia lentiviruksen transduktion ei liittynyt vaikutuksia CDC. Vaaleanharmaa ja kuoriutui pylväät edustavat solujen määrä mitattuna läsnäollessa HS ja läsnäollessa inHS, vastaavasti. Absoluuttinen määrä solujen kvantifioitiin trypaanisinivärin syrjäytymisen menetelmä hoidon jälkeen Rituksimabi ja normalisoitiin määrän käsittelemättömien solujen. Suhteellinen määrä soluja käytettiin kasvun inhibitiota indeksi osoittaa suhde käsiteltyjen solujen suhteen käsittelemätön kontrolli.

vieressä esitetyt testata onko suojaava vaikutus lentiviruksen transduktion GCB-like osallistuvien solujen vaikutuksia CDC. Tätä varten määrä OCI-Ly-7 ja SU-DHL-5-soluissa määritettiin kanssa ja ilman lentiviruksen transduktion puuttuessa tai läsnä ollessa aktiivisen komplementin. Sekä solulinjat, havaitsimme lisääntynyt sietokyky Rituksimabi käsiteltyjen solujen lentivirusvektoreita riippumaton komplementin läsnä ollessa. Näin ollen, suhteellinen eloonjäämisprosentti Rituksimabi-käsiteltyjen solujen kasvatettu HS ja inHS eivät eronneet nontransduced ja lentivirally transdusoidut solut (kuvio 3b), joka vahvistettiin BrdU mittaukset (S5b kuvio). Tämä tukee käsitystä, että suojaavia vaikutuksia lentiviruksen transduktion ei liity komplementin välittämiä solun tuhoutumisen.

Lentivirusvektori transduktion indusoi antiapoptooppinen vaikutuksia GCB kaltaisia ​​soluja

Seuraavaksi osoitetaan, onko suojaavia vaikutuksia lentiviruksen transduktion liittyi muuttuneen apoptoottisen vasteen. Käyttäen lohkaista PARP1 mittana apoptoosin korko, huomasimme, että määrä pilkkoa PARP1-positiivisten apoptoottisten solujen puuttuessa Rituksimabi ja HS laski 1,4 ± 0,15% vuonna nontransduced soluista 0,7 ± 0,1%: in OCI-Ly-7 solut, jotka oli transdusoitu lentivirusvektori (kuvio 4a). Tämä anti-apoptoottisen vaikutuksen lentiviruksesta transduktion oli merkittävä myös OCI-Ly-7 ja SU-DHL-5-soluja käsiteltiin Rituksimabi (kuvio 4b), mikä osoittaa, että solukuolemareittejä vaikutti aikana lentivirusvekto- toimitus. Erityisesti kuitenkin, testasimme anti-apoptoottisen valmiuksia lentiviruksen transduktion vastauksena sarjan apoptoosin indusoiva ärsyke (aktinomysiini D, Kamptotesiini, syklohek-, deksametasoni, ja etoposidi) ja sen on todettu lisääntynyt solujen määrä vain transdusoiduissa OCI-Ly-7 altistuvat Rituksimabi (kuvio 4c), mikä viittaa siihen, että havaittu anti-apoptoottiset vaikutukset olivat spesifisiä Rituksimabi. Yhteenvetona lentivirus- transduktio häiritsee mekanismeja apoptoosin, jotka ovat erityisesti laukaisi Rituksimabi.

(a) Alennettu apoptoosin korko lentivirally transdusoiduissa versus transdusoimattomien OCI-Ly-7 cell. (B) alennetulla tasolla apoptoosin transdusoidut solut suhteessa nontransduced solut altistetaan Rituksimabi 48 tuntia. (C) analyysi mahdollisten anti-apoptoottisen valmiuksia lentiviruksen transduktion vastauksena sarjan apoptoosin indusoiva ärsykkeisiin, mukaan lukien rituksimabi (RTX) OCI-Ly-7-soluissa. Suhteellinen määrä soluja käytettiin kasvun inhibitiota indeksi osoittaa suhde käsiteltyjen solujen suhteen käsittelemätön kontrolli.

Jatkuva ilmentyminen CD43 in lentivirally transdusoiduissa GCB kaltaisia ​​soluja käsiteltiin Rituksimabi

ilmaisun puuttumista pinnan proteiinin CD43, ilmentyy pääasiallisesti lymfosyyttien, liittyy alkuvaiheessa apoptoosin polymorfonukleaaristen soluihin [40]. Vähentäminen taso CD43 voi siis toimia markkerina solujen läpi aikaisen vaiheet apoptoosin. Mukaisesti, populaation OCI-Ly-7-soluissa suoritettiin Rituksimabi, osoitti kohonneita katkaistun PARP1 soluissa alemmilla CD43, kun taas solut, joilla on korkeampi CD43 ekspressio oli alhaisempi pilkkoa PARP1 (kuvio 5a). Siten solut alemman CD43 ilmaus profiili osoitti korkeampaa apoptoosin. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että apoptoosin (halkaistut PARP1) korko alhainen ilmentävien CD43 solujen (määritelty suhde Q3 ja Q4 kuvassa 5a) oli identtinen molemmissa ryhmissä (0,18 sekä NTC ja LVTC), mikä osoittaa tasaisena apoptoosin soluissa on alhainen ilmaus CD43. Solut transdusoitu lentivirusvektoreita olivat pääasiassa positiivisia CD43 ja korko apoptoosin, mitattuna solut menetti ilmaus CD43 tai kohonneeseen pilkkoa PARP1, väheni merkittävästi (kuvio 5a ja 5b). Sitten seurasi ilmentymistä CD43 in OCI-Ly-7-soluissa ajan rituksimabi-hoidon jälkeen ja osoitti vähitellen menettää CD43 ilmentymisen transdusoimattomien soluissa. Kuitenkin solut, jotka oli transdusoitiin lentivirusvektoreita pystyivät vastustamaan menetys CD43 ilmaisun, kuten virtaussytometrialla (kuvio 5c) ja vahvistettiin RNA tasolla qPCR 48 tunnin kuluttua Rituksimabi hoidon (kuvio 5d). Johtopäätöksenä nämä havainnot viittaavat siihen, että anti-apoptoottiset vaikutukset osaltaan lisääntynyt sietokyky Rituksimabi on lentivirally transdusoidut solut.

(a) Alennettu apoptoosin transdusoiduissa OCI-Ly-7-soluissa 8 tunnin kuluttua Rituksimabi hoidon, mitattuna analyysi CD43 ilmaisun ja halkaistut PARP1 vuonna NTC ja LVTC. (B) vähentäminen CD43 ilmentymisen OCI-Ly-7-soluissa 48 tunnin kuluttua Rituksimabi hoidon. Histogrammi käyrä kuvaa useita CD43-positiivisten solujen nontransduced soluissa (NTC) ja lentivirally transdusoidut solut (LVTC) ja negatiivinen kontrolli solulinjassa. (C) menetys CD43 vastauksena Rituksimabi hoitoon on estänyt lentiviraalinen transduktion OCI-Ly-7-soluissa. (D) vahvistus säilyy CD43 ekspressiotasot soluissa transdusoitu lentivirusvektoreita ja seuraavaksi altistaa Rituksimabi. Analyysi CD43-geenin ilmentyminen suoritettiin käyttäen qPCR päälle eristetyn kokonais-RNA NTC ja LVTC.

hyödyntäminen lentiviraalinen transduktio analysointiin vaikutusten miRNA on Rituksimabi toleranssi

lentivirusvektorien ainutlaatuiset työkalut tuottaa geenien tehokkaasti osaksi B-soluihin ja siten myös houkutteleva, tutkimuksissa miRNA toiminto. Ottaen kuitenkin huomioon vaikutus lentiviruksen transduktion solukuolemaan ja toleranssi GCB kaltaisten solujen Rituksimabia oli epäselvää, onko vaikutus toimituksen työkalun itse häiritsisi tutkimuksia geenien, mukaan lukien miRNA-koodaavat geenit, jotka vaikuttavat toleranssi huumetta.