Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

farmakologinen interventio redox tasapainon syöpäsoluissa usein johtaa oksidatiivista stressiä välittämän apoptoosin houkuttelee paljon huomiota kehittämiseen uuden sukupolven täsmähoitoihin syövässä. Kuitenkin tiedetään vähän mekanismeista muuntaminen oksidatiivisen signaloinnin loppupään toimintaa johtavat solujen kuolemaan.

Menetelmät /Principal Havainnot

Me täällä raportoida järjestelmällisesti havaitseminen transcriptome muutoksia vastauksena oksidatiivisen tuotettujen signaalien leukemiasolujen upon fenretinidi hoitoa, syyllistämättä esiintyminen lukuisia stressiin reagoiva tapahtumia fenretinidi aiheuttaman apoptoosin, kuten redox vastauksen, Endoplasmakalvosto stressi /laskostumattoman proteiinivaste, translaation sorron ja proteasomin aktivointi. Lisäksi kokoonpano näistä olennaisista tapahtumista pääasiassa johtamasta stressi reagoiva transkriptiotekijät, kuten tyypillisesti korostettu NF-E2 liittyvä tekijä-2 (Nrf2) ja lämmön sokki tekijä 1 (HSF1). Useat tekijät osoittavat, että koordinoitua sääntelyä näiden transkriptiotekijöiden ja siten niiden loppupään geenejä ovat mukana muuntaa oksidatiivisen signalointi alavirtaan stressiin reagoivia tapahtumien säätelevä proapoptoottisten ja apoptoottisten toimintaa ajallinen ja paikallinen tasolla, luonnehtivat oksidatiivisen stressin välittämän ohjelmoitu kuoleman sijaan eloonjäämisen syöpäsoluissa.

Johtopäätökset /merkitys

tutkimus tarjoaa suunnitelma ymmärtämään oksidatiivisen stressin välittämää apoptoosia syöpäsoluissa, jota voidaan edelleen kehitettävä kehittyneempiä terapeuttista protokollia, kuten epäillyn synergistisen induktion apoptoosin avulla proteasomiestäjät kanssa fenretinidi.

Citation: Wang K, Fang H, Xiao D, Zhu X, hän M, Pan X, et al. (2009) muuntaminen Redox Signaling on apoptoottinen toiminta Stress-Responsive Regulators HSF1 ja Nrf2 in fenretinidi Käsitellyt syöpäsoluja. PLoS ONE 4 (10): e7538. doi: 10,1371 /journal.pone.0007538

Editor: Maurizio C. Capogrossi, Istituto Dermopatico dell’Immacolata, Italia

vastaanotettu: toukokuu 31, 2009; Hyväksytty: 30 syyskuu 2009; Julkaistu: 21 lokakuu 2009

Copyright: © 2009 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Tieto Innovation Program Kiinan Academy of Sciences (KSCX2-YW-R-19, KSCX1-YW-22-01), Ministry of Science and Technology of China Grants (2006CB910405, 2006CB910700, 2007AA02Z335 ja 2009CB825607), National Natural Science Foundation Apurahat (30730033, 30670436 ja 30600260), Shanghai Postdoctoral Scientific Program (09R21414900). LTR on osa TB-VIR verkon (Euroopan yhteisön Avustukset PO7, 200973). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kehitys syöpähoitojen voivat hyötyä kertyneen tiedon syövän biologian, erityisesti mitä tulee syövän tunnusmerkkejä kuten omavaraisuutta kasvun signaaleja, kiertäminen ohjelmoidun solukuoleman ja etäpesäkkeiden [1]. Viimeaikaiset kokeelliset ja kliiniset tiedot tarjoavat vakuuttavia todisteita siitä, että vähennys /hapetus (redox) signalointipolkujen voi olla keskeinen rooli syövän synnyssä ja pahanlaatuisten etenemisen [2]. Yleensä pahanlaatuiset solut ovat luonnostaan ​​alle pro-hapetin microenvironment, lisääntynyt vakaan tilan tasot reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) [3], joka edustaa toista lupaava komponentti biologisten erojen syövän ja normaalit solut. Viime aikoina uusia terapeuttisia interventiostrategioita tuottaa tilan selektiivisen oksidatiivista stressiä syöpäsolut ovat saaneet merkitys [4].

Redox asetus on osoitettu olevan tärkeä mekanismi pahanlaatuisten solujen eloonjäämistä. Siirtämällä solu redox tasapainoon farmakologinen manipulointi hyväksi lisäten solujen ROS voi aiheuttaa oksidatiivista stressiä ja myöhemmin induktion apoptoosin sisällä syöpäsoluja. Kytkennän apoptoosin syöpäsoluissa aiheuttama ROS tuottavan aineet on todennäköisesti mukana aktivoituminen endoplasmakalvoston (ER) stressiä. Apoptoosi voidaan aloittaa kuolemareseptorien stimuloimalla ulkoinen tie tai häiriön solunsisäisen homeostaasin liittyy mitokondrioiden liittyvien sisäisen reaktiotien ja ER stressin välittämän reitin. Nämä aloittamista proapoptootti- signaaleja lopulta lähentymässä keskeinen pyöveli apoptoosin häiriöitä mitokondrion transmembraanisen potentiaali (MMP) mitokondrioita sekä kaspaasi porrastetusti. Tavoittaminen tasoa siinä määrin ylittää endurable redox kynnys, ROS voi toimia merkinannoista stimuloiva ER stressiin välittämää apoptoosia nimenomaan syöpäsoluissa. Vastauksena erilaisiin ärsykkeisiin kuten oksidatiivisen stressitekijöitä [5], [6], ER on kehittynyt laskostumattoman proteiinivaste (UPR) moduloiva useita transkriptiotekijöitä (esim ATF6, XBP1 ja CHOP) yritetään sopeuttaa selviytymisen tai muuten apoptoosin päin pitkittynyt UPR. On kuitenkin rajallinen tietoa mekanismit muuntaminen oksidatiivisen signalointi loppupään stressiä johtavat tapahtumat solujen kuolemaan. Kun saatavilla on asianmukaiset terapeuttisia ROS tuottavien aineiden järjestelmällinen luonnehdinta geenin ilmentymisen ja taustalla transkription sääntely on avain selventämiseen muuntamista.

Kehittämisen ROS tuottavien aineiden, kuten arseenitrioksidi (ATO) ja akuutin promyelosyyttisen leukemian (APL) [7], mahdollisuus hyödyntää valikoivaa oksidatiivisen stressin kuin apoptoosin indusoiva syövän hoito on tulossa lupaava terapeuttinen vaihtoehto. Tutkimukset ovat osoittavat, että terapeuttinen tehokkuus ATO välittyy ROS intrasellulaarisen tuotannon ja sitä seuraavan apoptoosin [8]. Vaikka ROS aiheuttavien aineiden kuten ATO ovat osoittaneet suurta potentiaalia hoidettaessa pahanlaatuisia soluja, sivuvaikutuksia on vielä täysin arvioitu [9]. On huomattavaa kiinnostusta suunnittelussa kaikkein perustelut redox-aktiivisia strategioita minimaalisella

in vivo

sivuvaikutuksia. Tässä suhteessa N- (4-hydroksifenyyli) retinamidi (fenretinidi), synteettinen retinoidi useita pitkän aikavälin kliinisissä tutkimuksissa, ansaitsee lisätutkimuksia [10]. Toisin kuten luonnon retinoidit kuten

kaikki-trans

retinoiinihappo (ATRA), fenretinidi kiinnostavuus erillisiä biologisia vaikutuksia, ensisijaisesti harjoittaa apoptoottisen reitin monissa kasvainsoluissa kohdistaminen ROS säilyttäen sen minimaalinen

in vivo

sytotoksisuuteen normaaleihin soluihin [11], [12]. Mekanismeja fenretinidi indusoiman apoptoosin on tutkittu intensiivisesti [13] – [15]. Viimeaikaiset tulokset viittaavat siihen, että tämä ROS-muodostava aine voi häiritä solun homeostaasin ja moduloivat erilaisia ​​stressiin liittyvät geenit, syytetään, että niiden ROS-riippuvaisten ER stressi voi tehdä herkkyyttä syöpäsolujen fenretinidi indusoiman apoptoosin [16]. Kuitenkin mekanismit, jotka ROS muodostuminen johtaa ER stressiä ja syöpäsolujen apoptoosia ovat kaikkea muuta kuin selvä. Yksityiskohtainen selvittäminen Näiden mekanistinen linkit saattavat sallia käsityksen oksidatiivista stressiä-välitteistä apoptoosia syöpäsoluissa ja sallivat optimoinnin syövän kohdespespesifisinä hoitoja.

spekuloida, että syöpäsolut on taipumus redox signalointi todennäköisimmin herkkiä hapettava ärsykkeitä ROS tuottavasta aineet kuten fenretinidi, joille oksidatiivisen stressin välittämän apoptoosin. Tarkasti paljastaa sääntelyn mekanismit muuntaminen oksidatiivisen signaloinnin loppupään stressiä tapahtumia kohdistuvan ER ja lopulta kuolemaan sijasta tulokset selviytymisen etuja, käytimme integroiva menetelmät kehittyneitä data mining kanssa sirutekniikalla profiloida transcriptome muutokset jossakin fenretinidi herkkä solulinja ja löytänyt lukuisia ajalliset-tilasuhteiden stressin vasteen tapahtumia. Lisäksi stressi-reagoiva transkriptiotekijöiden, kuten korostettiin NF-E2 liittyvä tekijä-2 (Nrf2) ja lämmön sokki tekijä 1 (HSF1), pelata näkyvä roolit kokoonpano näistä olennaisista tapahtumista. Vahvistukset kautta immunofluorescene ja chromatin immunopresipitaatiomäärityksiä ja stressiin liittyvien transcriptome vertailujen lisäksi osoittanut, että nämä stressiin reagoivia sääntelyviranomaisten ja siten niiden kohdegeenien osallistuvat muuntaa oksidatiivisen signalointi loppupään stressiä aktiviteetteja, kuten redox vastaus, ER stressiä /UPR ja proteasomin aktivointi, jotka edustavat tyypillinen tapahtumia oksidatiivisen stressin välitteistä apoptoosia in fenretinidi-käsiteltyjen pahanlaatuisten solujen.

tulokset

fenretinidi indusoi solunsisäistä tuotantoa ROS ja näin ollen apoptoosin erilaisissa maligniteetteja, mukaan lukien leukemia [10]. Analysoimme antiproliferatiivisia ja apoptoottinen vaikutus fenretinidi on leukemia solulinjat NB4, U937, ja HL60, ja totesi, että nämä solulinjat koki kasvun esto ja apoptoosin vasteena 1-2 uM fenretinidi, ja että niiden alttius näytti olevan korreloivat tasot ROS (Täydennyskuvio S1). Perustuu sen suhteellisen suuri herkkyys lääkkeen aiheuttamalle ROS ja apoptoosin, NB4 valittiin prototyyppi solulinja solu- ja molekyylitason arvioinnit ennen yksityiskohtaista transcriptome analyysiin. Kuten kuviossa 1A on esitetty, NB4 solujen kasvu inhiboituu fenretinidi hoito annoksesta riippuvalla tavalla. Hoito pienellä annoksella (1 uM) fenretinidi näytti olevan riittävä indusoimaan apoptoosin NB4-soluissa 72 tunnin kuluessa, kuten on esitetty mitokondrion kalvon potentiaalia ja anneksiini V määritykset (kuviot 1B ja 1C). Olemme edelleen tutki solunsisäistä ROS muuttuu tänä aikana kurssin. Yllättäen huomasimme, että ROS muutokset olivat monimutkaisempia kuin aikaisemmin kirjattu, näytetään vasemmalla vinossa Bell-muotoinen käyrä (kuvio 1 D). Kuten odotettua, ROS kertynyt jyrkästi saavuttaen nelinkertainen lisäys verrattuna pohjapinta tasoille 6 tunnin kuluessa hoidon, kun se yllättäen laski sen jälkeen vähitellen tasolle, joka vastaa suunnilleen kaksinkertaista pohjapinta tasot käsittelemättömien solujen. Nämä tiedot viittaavat siihen osallistumista redox signalointi NB4- soluissa upon fenretinidi hoitoa. Fenretinidi stimulaatio aiheuttaa nopean kertyminen solunsisäisen ROS, jotka puolestaan ​​voivat aktivoida solumekanismeja vähentämiseksi ROS tasolle. Myös kohtuullisella tasolla solunsisäisten ROS todennäköisesti tarvitaan fenretinidi: n indusoiman apoptoosin.

(A) Solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttäen MTT-määritystä, kun erilaisten annosten fenretinidi 48 tuntia. (B) mitokondrion kalvon potentiaalia Δ

Ψm 1 uM fenretinidi hoitoa, kuten määritetään rodamiini 123 ja propidiumjodidilla (PI) kaksinkertainen värjäys, ja sen jälkeen virtaussytometrialla analyysi. (C) Apoptosis jälkeen 1 uM fenretinidi hoitoa arvioitiin anneksiini V-spesifistä vasta-ainetta ja PI kaksinkertainen värjäys ja virtaussytometria analyysi. (D) Dynaaminen muutoksia ROS, arvioitujen värjättyjä soluja DCFH-DA ja seurasi virtaussytometria analyysi. Keskiarvot ± SD piirretään kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Tukeva transcriptome profilointi fenretinidi aiheuttaman apoptoosin

Aika-sarja microarray hybridisaatio, geenin valinta ja tunnistaminen transcriptome ominaisuuksia.

analysoimiseksi yksityiskohtainen mekanismeista fenretinidi indusoiman apoptoosin, suoritimme transcriptome profiloinnin näytteitä fenretinidi käsiteltyjen NB4 soluja, jotka kerättiin 19 ajankohtina ja käsittelemättömien solujen näytteet 4 ajankohtina. Sen jälkeen microarray hybridisaatio- ja tiedonkeruu, geenien ilmentyminen tietoja ensin alistettiin topologian säilyttävän geenin valintamenettelyn kautta self-organizing map (SOM) integroitu yksikkö muodostaminen (SVD). Noudattamalla perustunut virheellisiin löytö määrä (FDR) tilastollinen päättely, yhteensä 3345 geenien ominaisella kuviot valittiin (katso menetelmät) ja analysoidaan edelleen komponenttia lentokoneella esitys (CPP) integroitu SOM [17] – [19]. Kuten kuviossa 2A on esitetty, kukin esitys havainnollistaa aikapisteessä-spesifinen transcriptome kartta, joka mahdollistaa suoraan verrata transcriptome muutoksia /välinen ohjaus sarjan ja fenretinidi käsitellyn sarjassa. Vertaamalla ohjaus ja hoito-sarja, havaitut transcriptome muutoksia ennen 6 tunnin hoito (kutsutaan varhaisessa vaiheessa) ovat lähinnä kulttuurin kestoa, mikä tarkoittaa, että alkuvaiheen aiheuttamia vaikutuksia fenretinidi ovat pääasiassa biokemiallisia, rajallisesti vaikuttavilla transkription säätelyyn. Kuitenkin merkittävä transcriptome muutokset käyvät ilmi 8 tunnin jälkeen hoidon, mikä käy ilmi geenit kartoitettiin neuronien oikeassa alakulmassa kulmat (kutsutaan myös ryhmän 6 oikealla paneeli kuvio 2A). Nämä geenit ovat näkyvästi sääteli jälkeen alkuvaiheessa, jotka edustavat suurinta transcriptome ominaisuus aikana fenretinidi indusoiman apoptoosin. Koska ROS kertymistä on merkittävä vaikutus fenretinidi hoito, on loogista spekuloida, että modulaatio näiden geenien johtuu ROS kertymistä.

(A) Kuva transcriptome muutoksista CPP-SOM. Jokainen esitys kuvaa aika-pisteen erityisiä transcriptome kartta, jossa kaikki sääteli (edustaja neuronien punaisella), alassäädetty (edustaja neuronien sinisenä) ja kohtalaisen säännelty (edustaja neuronien keltainen ja vihreä) geenit hyvin rajattuja. Color bar edustaa ilmaisun arvojen (log suhde kanssa base 2), jossa on kirkkaampi tarkoittamaan korkeamman arvon. Esityksiä kontrollisarjassa on merkitty valkoinen palkki alla, kun taas in fenretinidi saaneista sarjat jaetaan kolmeen vaiheeseen: varhainen, keski- ja myöhäinen, kuten on osoitettu harmaalla luokiteltava bar alla. Kaikki esitykset yhdistävät asemat, ts sama kanta edustaa samaa hermosolu, jonka indeksi on esitetty laajentuneessa ruudukon ideogrammi oikealla paneelissa. Kuusi tunnistettavissa alueet saadaan hierarkkisia klustereiden perustuu kuvio yhtäläisyyksiä värillinen koodataan ilmoitettu. Geenien Ryhmä 6 ovat näkyvimmin sääteli aikana apoptoosin, mikä vastaa oksidatiivisen stressin vastetta transcriptome allekirjoitus taajuuksia. (B) Kuva ilmentymismalleja geenien edustavissa neuronien ryhmän 6 kautta värikoodatut linja kaavioita ja baari kaavioita, esimerkkinä neuronien 46, 47, 40 ja 49. Niitä vastaavan PWM ja /tai GO rikastusta on myös osoitettu. (C) Major toiminnallisia piirteitä liittyy oksidatiivista stressiä välittämän apoptoosin, visualisoituina hierarkkinen klusterointi edustavien geenien.

Transkription ja toiminnalliset ominaisuudet ryhmittyneet geenien tyypillisesti korostamalla oksidatiivista stressiä-välitteistä apoptoosia.

vankka transcriptome lähestymistapa mahdollistaa klusterointi geenien erittäin samankaltaisia ​​ekspressiokuvioiden samaan tai lähellä naapurimaiden neuronien, kuten kuvassa 2B. Tämä voi helpottaa monia näkökohtia syvällinen kaivostoiminnan biologisen kannalta merkityksellisiä tietoja fenretinidi indusoiman apoptoosin. Suoritimme transkriptiotekijän sitoutumiskohta (TFBS) rikastamiseen analyysi seuraavat hypergeometrisen jakelu-pohjainen useita hypoteesitestejä päätellä yhteisiä transkription piirteitä ryhmittyneet geenien (katso menetelmät). Kuten on esitetty tyypillinen neuronien Ryhmä 6 (kuvio 2B), transkriptiotekijöille Nrf2, HSF1, ATF6 ja ELK1 ovat merkittävästi yliedustettuna vastaavasti neuroni 40, 46, 47 ja 49 Nrf2 tiedetään aktivoivan geenien transkriptiota, jotka koodaavat antioksidatiivisen proteiineja alle oksidatiivisen stressin [20], [21], HSF1 on transkriptiotekijä, joka vastaa ilmentymisen lämpöshokkigeenit [22], ATF6 on keskeinen transkriptionaalinen aktivaattori laskostumattoman proteiinin vaste (UPR) [23], ja ELK1 on mukana transkription selviytymisen geenejä [24]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että geenit Ryhmä 6 pitkälti säätelee stressi-reagoiva transkriptiotekijöitä, korostaen vaikutus alkupään oksidatiivisen signaloinnin loppupään vaikutuksia.

edelleen puuttua toiminnallinen merkitys ryhmittyneet geenien, käytimme Gene ontologia ( GO) toiminnallinen rikastamiseen analyysiä. Toiminnalliset ominaisuuksia tilastollista merkittävyyttä paljastui, joka kuvaa suhteellisen kattavan kuvan oksidatiivisen stressin-välitteisen apoptoosin. Näistä ominaisuuksista olivat osallistuvia geenejä transkription säätelyyn, ribosomien koneet, oksidatiivisen stressin, ER stressin /UPR, ubikitiinistä proteasomin järjestelmä, ja apoptoosin (kuvio 2C). Muutokset liittyvien geenien transkription säätelyyn näyttävät olevan looginen ottamisen pahanlaatuisten solujen ohjelmoitua solukuolemaa, kuten jopa säädelty

DDIT3 Twitter /

CHOP

,

CEBPB: lle

,

CEBPG

,

NFE2L1

ja

PHF1

ja alassäädetty

MYC

ja

IKZF1

. Alennettu ribosomi toiminta voi edustaa suora vastaus stressiä tukahdutettu yleinen proteiini käännös. Sääntely redox liittyvien geenien osuus voi ROS vähentämisen aikana myöhemmässä vaiheessa fenretinidi indusoiman apoptoosin. Up-regulation useita ER stressi-ja UPR geenien havaittiin aikana 6-24 tuntia hoidon jälkeen (kutsutaan välivaiheessa), syyllistämättä esiintyminen ER stressi-ja UPR liittyviä puolustustoimintaan. Erityisesti, me havaittu geenien aktivaation mukana ubikitiini-proteasomin järjestelmä. Useimmat koodaavat geenit proteasomi laitteen indusoitiin jälkeen varhaisessa vaiheessa, edistää hajoaminen ylikuormitettu laskostumattoman /väärin laskostuneet proteiinit, jotka johtuvat ER stressiä /UPR. Ylössäätöä koodaavien geenien sääntelyviranomaisten /osallistujia apoptoottisten kaskadeja (esim

CASP7

,

BCLAF1

,

DEDD2

,

DAP3

,

STK17A

,

LAPTM5

ja

MAGEH1

) ja alas-säätely negatiivisten apoptoosisäätelijät kuten

BCL2

ja

MPO

olivat ilmeisiä aikana väli- ja loppuvaiheissa.

Muita molekyyli- ja solutason näyttöä oksidatiivisen stressin välittämää apoptoosia fenretinidi käsiteltyjen leukemiasolujen

peräkkäinen osallistuminen ER stressin /UPR ja mitokondriot liittyvät apoptoottisten toimintaa.

validoida ominaisuudet paljasti transcriptome analyysi ja tunnistaa lisäosia oksidatiivisen stressin-välitteisen apoptoosin, me edelleen toteutettiin useita solu- ja molekyylitason määrityksissä. Kuten esitetään vasemmassa paneelissa kuvion 3A, muutokset proteiinin tasot ER stressin /UPR merkki GRP78 /HSPA5 ja stressi-indusoituva proapoptoottisten transkriptiotekijä CHOP /GADD153 korreloivat mRNA (kuvio 2C). Nämä geenit ja proteiinit olivat nimenomaan säädelty aikana välivaiheessa, tarjoaa lisätodiste siitä, että ER stressi /UPR tapahtunut tämän ajanjakson aikana. Lisäksi pro-apoptoottisen muoto CASP4, joka on ER stressiä erityinen kaspaasi [25], väheni dramaattisesti klo myöhäisessä vaiheessa, syyllistämättä osallistuminen fenretinidi aiheuttaman apoptoosin. Kuten esitetään oikeassa paneelissa kuvion 3A, mitokondriot liittyy apoptoottisen kaspaasi kaskadeista aktivoitiin klo myöhäisessä vaiheessa. Proapoptootti- CASP9 väheni, kun taas CASP3 nostettiin sen aktiivisessa muodossa ennen myöhäisessä vaiheessa. Lisäksi lohkaista PARP havaittiin seuraavat kaspaasi Cascade aktivointia. Kaiken proteiini biokemialliset tiedot tukevat myös ajatusta, että ER stressi /UPR tapahtuu välivaiheessa, kun taas mitokondrio-mukana apoptoosin esiintyy lähinnä loppuvaiheessa.

(A) Western blot-analyysi ER stressin /UPR liittyviä markkereita ja apoptoottisten caspases kun 1 uM fenretinidi hoito NB4- soluissa. (B) kumoaminen fenretinidi aiheuttaman apoptoosin vitamiinia (C) Synergistinen induktion solun apoptoosin proteasomin estäjä MG132 ja fenretinidi. Apoptoosi arvioitiin anneksiini V-spesifistä vasta-ainetta ja PI kaksinkertainen värjäys ja virtaussytometria analyysi. Tulokset edustavat keskiarvoa kolmesta riippumattomien arviointien ± SD.

Synergistinen induktion solun apoptoosin fenretinidi ja proteasomin estäjä.

fenretinidi käsiteltyjä soluja, ROS signalointi voi edustaa oleellinen ärsyke alkuvaiheessa ohjelmoidun solukuoleman. Lisänäyttöä ROS signalointia apoptoosin, teimme antagonisti määritystä, jossa käytetään C-vitamiinia antioksidanttina. Kuten kuviossa 3B on esitetty, C-vitamiini hoito kumosi kokonaan fenretinidi indusoiman apoptoosin NB4-soluissa. Geenit koodaavat proteasomin komponentit olivat merkitsevästi sääteli aikana väli- ja loppuvaiheissa. Niinpä arveltu, että proteasomin aktiivisuus voisi toimia puolustusmekanismi kytketty UPR varten unfolded /väärin laskostuneen proteiinin hajoamisen vähentämiseksi ER stressiä taakkaa [26]. Vastaavasti proteasomin aktivointi voi antagonisoida proapoptoottisten /apoptoottisten Cascade. Tutustua hypoteesin, käytimme proteasomin estäjä MG132 estää proteasomiaktiivisuus aikana fenretinidi indusoiman apoptoosin. Kuten kuviossa 3C on esitetty, osa-sytotoksinen konsentraatio (0,2 uM) MG132 yhdessä matalan annoksen fenretinidi (0,5 uM) indusoi merkittävän apoptoosin 48 tunnin kuluessa, mikä osoittaa synergistisen sijaan antagonistiset vaikutukset kahden yhdisteen.

muuntaminen oksidatiivisen signalointi loppupään vaikutukset stressin reagoivaa transkriptiotekijöiden kuten korostetaan Nrf2 ja HSF1

koordinointi ajallisten-paikkatietojen muutokset Nrf2 ja HSF1, ja ilmaisun malleja niiden mahdollisten kohdegeenien.

vankka transcriptome profilointi lähestymistapa helpotti syvällinen kaivostoiminnan biologisen tiedon merkitystä oksidatiivisen stressin välittämää apoptoosia, mukaan lukien ennustaminen ylävirtaan transkription tekijöitä geenisäätelyn. Transkription sääntelyviranomaisten ennusti, stressi-reagoiva transkriptiotekijöiden Nrf2 ja HSF1 ovat erityisen kiinnostavia ymmärtämiseksi oksidatiivisen signalointi on käännetty alavirtaan vaikutuksia. Siksi edelleen tutkineet ajallista runsaus ja paikkatietojen lokalisointi näiden kahden stressiin reagoivia transkriptiotekijöiden apoptoosin aikana. Kuten on osoitettu kuviossa 4A, proteiini tasot sekä Nrf2 ja HSF1 olivat merkittävästi koholla tumaekstrakteilla 6 tunnin kuluessa altistumisesta fenretinidi, ja niiden ajallinen runsaus oli eriytetty sen jälkeen. Nrf2 induktio oli jatkettu 24 tuntia kun taas HSF1 induktion lopetettiin tänä ajankohtana. Vastaavasti, immunofluoresenssimikroskopialla analyysit paljastivat selvästi kertymistä sekä tekijät tumien käsiteltyjen solujen fenretinidi 6 tuntia, verrattuna hajanainen jakelu Nrf2 ja HSF1 käsittelemättömissä soluissa (kuvio 4B). Myös ydinvoiman kokoontuminen Nrf2 säilyi yli 24 tunnin hoitojakson aikana kun taas on HSF1 lopetettiin. Ottaen huomioon suhteellisen alhaisia ​​ROS 24 tunnin käsittely (kuvio 1D), inaktivaatio HSF1 johtuu luultavasti pelkistävän mikroympäristön [22]. Lisäksi ajallinen paikkatiedot muutokset Nrf2 ja HSF1 korreloivat hyvin sääntelyn malleja niiden mahdollisista kohdegeenien (kuvio 4C). Sääteli ilmentymä Nrf2 mahdollisten kohdegeenien laajennettiin myöhäisessä vaiheessa, kun taas geenin ilmentymisen HSF1 mahdollisia kohteita yksimielisesti lopetettiin loppuun mennessä välivaiheen.

(A) Western blot-analyysi Nrf2 ja HSF1 tumauutteista of NB4 solujen käsittelemättömän tai käsitelty 1 uM fenretinidi tällä ilmoitettuina ajankohtina. ”*” Tarkoittaa ei-spesifisen sitoutumisen band. (B) Nuclear Nrf2 ja HSF1 seuraavaa 1 uM fenretinidi hoidon NB4-soluissa, kuten visualisoitiin immunofluoresenssimikroskopialla (asteikko baaria, 5 um). (C) Kuva ilmentymismalleja geenien potentiaalisesti kohdistettu Nrf2 ja HSF1, havainnollistettu vasen ja oikea paneeli, vastaavasti. (D) pelimerkin yhdistettynä PCR-määrityksissä vahvistaa fyysistä vuorovaikutusta transkriptiotekijöitä (so Nrf2 ja HSF1) sekä niiden kohdegeenien. Yhteensä: kokonaispanos; IgG: ChIP reaktio IgG-vasta kontrollina; DNAJB6

#: alukkeet on suunniteltu ei-TFBS geenin alue

DNAJB6

.

fysikaalinen vuorovaikutus Nrf2 ja HSF1, ja niiden kohdegeenien aktivaation jälkeen.

tutkia, onko Nrf2 ja HSF1 fyysisesti sidottu tavoitteensa, teimme kromatiinin immunosaostuksella (chip), joissa käytetään vasta-aineita Nrf2 tai HSF1. Ennustearvon perusteella TFBS edustavan luetelluista geeneistä kuviossa 4C, erityisten PCR-alukkeet suunniteltiin käyttämällä ChIP tuotteet joko Nrf2 tai HSF1 DNA malleja. Kuten esitetty vasemmassa paneelissa kuvio 4D, geenien ennustetun TFBS of Nrf2 (eli

FTL

,

NQO1

,

TXNRD1

,

GCLM

ja

GCLC

) ovat positiivisia Nrf2 ChIP tuotteita, kun taas etuyhteydettömille geenit (eli

LRRC

,

AFIM

ja

PAX7

) ovat negatiivisia samoja tuotteita. Vaikka pohjapinta taso Nrf2 sitoutumista todettiin käsittelemättömän ChIP tuotteita, suurin osa ennustetun geenien paljasti merkittävästi vahvempi signaaleja käsiteltyjen näytteiden. Samoin, siru-PCR määritykset HSF1 paljasti samanlaisia ​​tuloksia (kuvio 4D, oikea paneeli). Erityisesti suunniteltuja alukkeita TFBS alueelta paljastui merkittävä bändejä HSF1 ChIP tuotteita, kun taas ei-TFBS alueilla samat geenit paljasti poissa signaaleja (esim

DNAJB6 vs. DNAJB6

#

). Kaikkiaan meidän todisteet osoittavat, että Nrf2 ja HSF1 aktivoituvat kun ROS kertymistä loppuun mennessä alkuvaiheessa, muuntaa oksidatiivisen signalointi osaksi loppupäässä vaikutuksia suoraan toimivat niiden kohdegeenien. Nrf2 aktivointi ulottuu myöhäisessä vaiheessa, kun HSF1 toiminta lopetetaan loppuun välivaiheen.

toiminnallinen merkitys Nrf2 ja HSF1 aktivointi oksidatiivisen stressin-välitteisen apoptoosin syöpäsoluissa.

Mahdolliset tavoitteet Nrf2 useimmiten edustaa geenejä, jotka koodaavat antioksidantti proteiineja tai entsyymejä (kuvio 4C) puskuroimaan solunsisäisen redox toimintoja, kuten

FTL

,

NQO

,

TXNRD

GCLM

ja

GCL

. Aktivointi Nrf2 kun muodostumista oksidatiivisen signalointi alkuvaiheessa parantaa ilmentymistä antioksidantti geenejä, jotka voivat siten johtaa asteittaiseen ROS vähentäminen välivaiheessa, ja kohtalainen ROS tasoilta myöhäisessä vaiheessa (kuvio 1 D). Mahdolliset tavoitteet HSF1 pitkälti edustaa geenejä, jotka koodaavat UPR liittyvien chaperones (kuvio 4C), kuten

HSPA8

,

HSPH1

,

HSPA1A

,

HSPA9B

,

DNAJA1

,

DNAJB1

,

DNAJB6

ja

SERIPINH1

. HSF1 aktivointi ja niiden kohdegeenien näyttävät olevan ohimenevää, tarjoaa lisää näyttöä siitä, että UPR havaittu fenretinidi käsiteltyjä soluja tapahtuu välivaihetta. Ohimenevä modulaatio UPR on todennäköisesti tärkeä oksidatiivisen stressin-välitteistä apoptoosia syöpäsoluissa, perustuu siihen, että monet näistä UPR liittyvien chaperones ovat toiminnallisesti estävää esiapoptoottisille /apoptoottiset laskeutuu [27]. Siksi irtisanominen sijaan säilyttäminen UPR ennen myöhäisessä vaiheessa, jossa useimmat apoptoottinen toiminta tapahtuu todennäköisesti olennaista tehokkaan etenemisen apoptoosin. Lisäksi esiliina geenejä, useita proapoptoottisten /apoptoottiset geenit säännellään myös HSF1, kuten

DEDD

[28] ja

BAG3

[29]. Koska ylössäätöä näiden geenien myös päättyy lopussa välivaiheen, on houkuttelevaa ajatella, että ne ovat mukana vastavirtaan toimintaan proapoptootti- /apoptoottisten porrastetusti.

Merkittävä vaikutus Nrf2 ja HSF1 stressiin reagoivia transcriptome allekirjoitusten merkitystä oksidatiivisen stressin välittämää apoptoosia

fenretinidi aiheuttaman apoptoosin syöpäsoluissa esiintyy vastauksena oksidatiivisen stressin, ja on takana ovat stressi-reagoiva transkriptiotekijöiden, kuten korostetaan modulaatio suuri määrä stressiä reagoivien geenien. Tyypillisesti nämä stressiin reagoivia geenit edustavat ne ryhmittyneet Ryhmä 6 (kuvio 2A). Niinpä me arveltu, että geenit Ryhmä 6 voi edustaa allekirjoitus spektrin ominaispiirre syöpäsolujen meneillään oksidatiivista stressiä välittämä ohjelmoidun solukuoleman sijaan selviytymisen kun stressi ärsyke. Validoida tätä oletusta, ja arvioida mahdollisia vaikutuksia Nrf2 ja HSF1 oletetun allekirjoituksen spektrin, olemme verrattain päällekkäin geenien ryhmän 6 kanssa useita eri ilmaisun tärkeitä tietoja eri stressistä aiheutuvat ei-apoptoottisia olosuhteita [30] ja meidän aiemmin julkaistu ilmaus tärkeitä tietoja ATO /RA aiheuttama erilaistuminen /apoptoosi NB4 solujen [18]. Hierarkkisen klusterointi seuraa integrointi genomista TFBS tietoa, stressi-reagoiva transcriptome piirteiden apoptoottisen tai ei-apoptoottisia olosuhteita näkyy (kuvio 5). Vertaamalla näitä ominaisuuksia kaikissa olosuhteissa allekirjoitus spektri voidaan edelleen osittaa neljään ryhmään (I-IV). Modulaatio geenien luokan I johtuu suurelta osin HSF1 aktivointi, kuten myös merkitty näkyvästi ylössäätöä lämmön shock. HSF1 aktivointi ei-apoptoottisia lämmön shokkitilat näyttää jatkuvan sijaan ohimeneviä. Modulaatio geenien luokan II näyttää olevan monimutkaisempi, luultavasti koska ne johtamasta useita stressi reagoiva transkriptiotekijöiden kuten CHOP ja XBP1, kuten epäillyn havaitut monipuolinen TFBS koostumus. Tuloksemme viittaavat siihen, että tämä geeni luokka on mukana myös ER jännitys /UPR esiintyvät välivaiheessa oksidatiivisen stressin-välitteisen apoptoosin, joka perustuu ekspressiomalleja sekä toiminnallisia merkinnät. Geenit luokkaan III ovat ne suoraan mukana redox signalointia väli- ja loppuvaiheen, mikä käy ilmi huomattava rikastuminen Nrf2 ja sen kofaktorin MAF. Koodaavien geenien aktivoituminen alayksiköiden Proteasomin laitteisto on yksi merkittävimpiä ominaisuuksia tässä tutkimuksessa. Nämä geenit ovat yksinomaan ryhmitelty luokkaan IV. TFBS analyysi syytöksiä että geenit tähän luokkaan moduloidaan ELK1.

stressiin liittyvät ekspressiotietojen koottiin ja näytetään kautta hierarkkinen klusterointi. TFBS tiedot jokaisesta transkriptiotekijä on integroitu vasemmalla näytön, jossa on mahdollinen osumia merkitty punaisella. Erilaiset olosuhteet ilmoitetaan yläosassa näytön. Kolme stressistä aiheutuvat olivat kaikki aiheuttama kynnyksen alapuolella, jossa merkittävä kuolleisuutta esiintyi. Lämpöshokki aiheutettiin HeLa, fibroblasti ja K562-solut; Endoplasmakalvosto stressin aiheutettiin HeLa solujen glykosylaatio estäjän tunikamysiinillä tai pelkistävää ainetta tiolia DTT ja fibroblastien kanssa DTT; Oksidatiivisen stressin aiheutettiin HeLa-soluissa H

2O

2 tai menadionia ja fibroblastien kanssa menadioni.