Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on johtava kuolinsyy pahanlaatuisia tauteja maailmanlaajuisesti, ei-pienisoluinen (NSCLC) alatyyppi osuus useimmissa tapauksissa. NSCLC on ominaista usein genomista epätasapaino ja kopioluvun vaihtelut (CNVs), mutta epigeneettiset poikkeavuuksia, jotka liittyvät kliinisiin ennustetta ja hoidon epäonnistumisen pysyvät ole täysin tunnistaa. Esillä olevassa tutkimuksessa, yhteensä 55 keuhkosyöpäpotilaita otettiin mukaan ja teimme genomista ja geneettistä ilmentymää analyysit immunohistokemiallinen proteiinia tunnistus, DNA: n metylaation ja kromatiinin immunopresipitaatiomäärityksiä saada geneettiset ja epigeneettiset profiilit liittyvät ennusteeseen ja chemoresponse NSCLC potilaiden. Lopuksi, siRNA transfektio välittämä geneettinen hiljentäminen ja sisplatiini solujen -sytotoksisuusmäärityksiä NSCLC solulinjoissa A-427 ja Iner-37 arvioitiin kuvaamaan chemoresistance mekanismeja. Tuloksemme tunnistettu korkeita taajuuksia CNVs (66-51% tapauksista) että 7p22.3-p21.1 ja 7p15.3-p15.2 sytogeneettisen alueilla. Kuitenkin yli-ilmentyminen geenien, kuten

MEOX2

,

HDAC9

,

TWIST1

ja

AhR

kello 7p21.2-p21.1 lokukseen tapahtui puuttumisesta huolimatta CNVs ja vähän muutoksia DNA: n metylaatio. Sen sijaan promoottorisekvenssit on

MEOX2

ja

TWIST1

näkyy huomattavasti pienempi /lasku tukahduttava Histonimerkki H3K27me3 ja lisäsi aktiivisen Histonimerkki H3K4me3 tasoilla. Lopuksi nämä tulokset korreloivat huono eloonjäämiseen pienisoluista keuhkosyöpää ja solujen chemoresistance että syöpäpotilailla huumeiden NSCLC solulinjoissa on

MEOX2

ja

TWIST1

yli-ilmentymisen riippuvainen-tavalla. Lopuksi raportoimme ensimmäistä kertaa, että

MEOX2

osallistuu chemoresistance riippumatta korkea CNV, mutta se on huomattavasti riippuu H3K27me3 rikastamiseen liittyy luultavasti aggressiivisuus ja kemoterapian epäonnistumisen pienisoluista keuhkosyöpää, mutta lisää kliinisiä tutkimuksia on suoritetusta vahvistaa havaintomme uusina todennäköinen kliininen merkkiaineiden pienisoluista keuhkosyöpää.

Citation: Ávila-Moreno F, Armas-López L, Álvarez-Moran AM, López-Bujanda Z, Ortiz-Quintero B, Hidalgo-Miranda A, et al. (2014) yli-ilmentyminen

MEOX2

ja

TWIST1

liittyy H3K27me3 tasot ja määrittää, Lung Cancer Chemoresistance ja Ennuste. PLoS ONE 9 (12): e114104. doi: 10,1371 /journal.pone.0114104

Editor: Santosh Patnaik, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 elokuu 2014; Hyväksytty: 29 lokakuu 2014; Julkaistu: 02 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Ávila-Moreno et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information lukuja ja tiedostoja. Array tiedot on toimitettu GEO tietokantaan (GSE62407).

Rahoittajat: FAM kirjailija tukivat National Council of Science and Technology (CONACyT), rahastojen Research in Basic Science Project 0053643; Tutkimus suunta National Institute of Respiratory Diseases (iner); ja National Autonomous University of Mexico, UNAM, Projects IACOD-PAPIIT IA201611, PAPIIT IB202512 ja PAPIIT RR282512. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä edelleen johtava syy syövän liittyvät kuolemat sekä Yhdysvalloissa [1] ja maailmanlaajuisesti, ei-pienisoluinen (NSCLC) alatyyppi osuus useimmissa tapauksissa tupakoitsijoilla ja ei-tupakan liittyvä potilaat [2]. Late diagnoosit ja tehotonta terapeuttisten edistää köyhien ennusteiden ja keskimäärin 5 vuoden eloonjäämisluvut alle 15% [1], [3], [4], [5].

NSCLC on ominaista genomista poikkeavuuksia, joka sisältää yhteiset somaattisen DNA kopioluvun vaihtelut (CNVs). Vertaileva genominen hybridisaatio (CGH) spektrin karyotyping [6] tai matalan resoluution genomista DNA-siru määritykset [7], [8], [9] ovat korostaneet tappiot /deleetioita 2q36-37, 3p21, 8p22, 9p21-22, 9q22 , 13q22 ja 17p12-13, ja voitot /monistumiset klo 1q23, 1q31, 3q25-27, 5p13-14, 6p, 7q ja 8q23-24; Kuitenkin vain harvat näistä muutosten on osoitettu olevan osallisena kasvaimen aggressiivisuus [9] tai kliiniseen etenemiseen NSCLC.

Viime aikoina kansainvälinen yhteenliittymiä tutkimiseen keuhkosyöpä ovat käyttäneet high-density SNP paneelit (250 K) kuvaamaan CNVs, kuten 5p15.33, 7p11.2, 14q13.3 ja 17q12, sekä microdeletions at 5q11.2, 7q11.22 ja 9p23 [10]. Jotkut näistä CNVs, kuten vahvistukset 14q13.3, joka sisältää

NKX2-8

[11] ja

NKX2-1

geenejä [10], on osoitettu olevan toiminnallisesti mukana kasvun , selviytyminen ja tuumorigeenisia aktiivisuus NSCLC [10], [11]. Kohonneita CNV on 5p13.2 lokuksessa on ehdotettu uudeksi molekulaarinen merkkiaine varhaisen pre-invasiivisuus [12]. Lisäksi geneettinen allekirjoitus mRNA yli-ilmentymisen peräisin 7q11.23, 14q23.2 ja 17q21.2 (

STX1A

,

HF1A

ja

CCR7-

, vastaavasti) on ollut tunnistettu ennakoiva etenemistä-ennusteen allekirjoitus aikaisissa kliinisissä vaiheissa NSCLC potilaiden [13].

Huono ennusteet ovat liittyy 7p lokuksen, joka voi johtua osittain lisääntyneestä CNV ja yli-ilmentyminen mahdollisten onkogeenien on 7p15.3-11.2, jotka on kuvattu 56% NSCLC solulinjojen [14]. Myös voitot klo 7p12-21 on havaittu lähes 50% NSCLC metastasoivaa tautia sairastavaa potilasta [15], joka voi edustaa yksi karyotyyppitutkiraus evoluution malleja NSCLC perustuu voitot 7. kromosomissa [16]. Lisäksi epigeneettiset poikkeamia, kuten DNA hypermetylaation at 7p15.2 [17], voivat edustaa asiaan sääntelymekanismeja ja /tai markkereita, paitsi keuhkosyövän biology [16], mutta myös NSCLC etenemisen, koska niiden läsnäolo alkupuolella [ ,,,0],17] ja pitkällä kliinisessä vaiheessa [10], [11], [15]. Tähän mennessä, molekyylien välisiä suhteita korkean taajuuden CNVs, epigeneettiset aberraatioita, potilas ennusteet ja onkologisiin epäonnistuminen NSCLC ei ole vielä täysin tutkittu.

Tässä tutkimuksessa olemme yrittäneet korreloivan mahdollisia epigeneettiset muutokset kanssa rakenteessa DNA kopioluvun muutoksia NSCLC käyttämällä korkean resoluution laatoitus SNP paneelit (500 K). Havaitsimme monistuksissa klo 7p22.3-p22.1, 7p21.3-p21.1 ja 7p15.3-p15.2 sytogeneettinen alueiden välillä 66-51% meidän tapauksista. Nämä monistukset johtivat

MEOX2

,

HDAC9

,

TWIST1

ja

AhR

yliekspressio huolimatta pieni kohonneeseen DNA: n metylaatio. Kuitenkin huomattavasti pienempi rikastuminen sortavasta histoni merkki H3K27me3 ja huomattavasti aktivointia H3K4me3 sekä

MEOX2

ja

TWIST1

promoottorialueille korreloivat huono kliinisiä ennusteet. Siksi, kuten olemme osoittaneet NSCLC solulinjassa malleja, sisplatiinia chemoresistance korreloi yli-ilmentyminen

MEOX2

ja

TWIST1

geenejä, lähinnä menetys histoni tukahduttavia merkkien H3K27me3. Tuloksemme viittaavat siihen, että epigeneettisellä mekanismit ylittää geneettinen (CNV) poikkeavuuksien 7p21 ja täydentää niitä, edistää näin aggressiivisuus ja epäonnistuminen syöpäsairaus hoidon pienisoluista keuhkosyöpää.

Materiaalit ja menetelmät

Sample valinta

yhteensä 55 keuhkotuumoreiden (LT), 15 viereisen ei-mukana keuhkojen sovitettu kudoksia (LNAT) ja 20 keuhkon esiasteleesioita (LP) Fresh Frozen (FF) ja Formaliinifiksoidusta ja parafiiniin (FFPE) kudokset menetelmiä käyttäen, koottiin rintakehä Surgical palvelu ja patologian Service National Institute of Respiratory Diseases (iner). Lisäksi ei-pienisoluisen keuhkosyövän solulinjat SK-MES-1, A-549, A-427, saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) ja iner-37, Iner-51 saatiin Mexican Mestizo potilaat, kuten aiemmin raportoitu [18], [19].

Ethics lausunto

Institutional Review Board (IRB) National Institute of Respiratory Diseases (iner) hyväksyi protokollat ​​rekisteritietoihin B17 -07 ja B09-08 ja Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), FES-Iztacala, Biolääketieteen tutkimusyksikkö tarkasti ja hyväksyi protokollia nämä geneettiset ja molekyylibiologian tutkimukset. Tietoinen suostumus saatiin potilailta, joilla on diagnoosi LT ja käynnissä kirurgisia toimenpiteitä. Kaikki koehenkilöt allekirjoitti tietoisen suostumuksen kirjeen näihin tutkimuksissa at thoraxkirurgian palvelu, iner, ja ne luvan varastointi heidän biologisten näytteiden klo Iner ja UNAM arkistot tälle ja tuleville tutkimuksille. Tässä tutkimuksessa ei kerätty näytteitä alaikäisten /lapsia, vain nuoria aikuisia Yli 18-vuotiaat olivat mukana.

SNP Mapping Array 500 K Hybridisaatio ja bioinformatiikan analyysit

Yhteensä 30 LNAT, LT, LP ja NSCLC solulinjan DNA-näytteet otettiin mukaan array hybridisaatio alustan (SNP 500 K) ja joissakin tapauksissa SNP 6,0 paneelit, mukaan valmistajan käyttöohjeiden (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA), ja analysoitiin käyttäen edellä kuvattu menetelmä [20] vertaamalla 300 ihmisen terveistä luovuttajista Meksikon Mestizo väestöstä Haplotyyppifrekvenssianalyysi Karttatietokanta aiemmin kuvattu [21]. Affymetrix SNP taulukot data (Affymetrix Console Version 4.1.3), tuotiin, normalisoitu ja korotukset CNV tunnistettiin käyttämällä Partek Genomics Suite Program oletukset ja Partek Genome View Tools (Partek, Saint Louis, MI, USA), kun keskimäärin 20 SNP ylitti kopiomäärä suhde on 2,5 tai vähemmän kuin 1,5 (

FDR

≤0.02). Pathway ennustus analyysejä geenien kopioluku muutoksia meidän NSCLC näytteistä (File S1) suoritettiin käyttäen ohjelmistoa Ingenuity Varusohjelmisto (versio 7.0). Luettelo poikkeavien geenien mukana meidän solun koulutusjakson ennustus analyysit, valittiin perustuen saatavuuteen ekspressioprofiileja ihmisen keuhkojen kudoksiin ja keuhkosyöpä kudoksia käyttäen tietoja EntrezGene selaaminen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov /geeni) ja verkkoselaimen GeneCards Human Gene Database (https://www.genecards.org/). SNP array tiedot sisältyvät esillä tutkimuksessa esitettiin ja hyväksyttiin Gene Expression Omnibus (GEO) tietokannan GEO virallinen numero: GSE62407.

immunohistokemialliset vuonna Histologinen Näytteitä

immunohistokemiallinen analyysit tehtiin on LNAT, LT ja LP kudosnäytteiden kiinnitetty formaldehydillä, 10% tai Hope I /II reaktiivinen menetelmä (Innovative Diagnostik-System, Saksa), ja sen jälkeen käyttämällä 1-2 mikrogrammaa spesifisten vasta-aineiden anti-MEOX2, anti-TWIST1, anti-HDAC9 ja anti-EVX1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA), inkuboimalla kosteuskammiossa, ja lisäksi, että antigeenispesifisen reaktio avidiini-biotiini-peroksidaasi /diamino-bentsidiiniä järjestelmä (Dako, Carpinteria, CA, USA ). Ventana System laite (Roche, Tucson, Arizona, USA) ja lähetetyn valomikroskoopilla tutkimus (Leica, Bannockburn, IL, USA), käytettiin saamiseksi mikrovalokuvia 40X ja 80X suurennus.

Real-Time PCR mRNA Expression ja DNA: n kvantifiointiin analyysit

mRNA ilmaisun analyysien, cDNA syntetisoitiin 2 ug kokonais-RNA käyttäen High Capacity Kit (Life Technologies Corporation, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). cDNA ja genomi-DNA: ta monistettiin myös käyttämällä SYBR Green qPCR määrityksissä ja oligonukleotidiyhdistelmät suunnittelema Primer suunnittelu ja /tai Vector NT ohjelmat ja syntetisoi Sigma-Genosys (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), on kuvattu mRNA ilmentämismääritykset taulukossa S1, ja DNA-promoottorisekvenssit analyysi taulukossa S2.

Quantitative real-time PCR (qPCR) suoritettiin Vaihe yksi Plus ja 7500 Device (Life Technologies Corporation, Applied Biosystems, Foster City , CA, USA), ja LightCycler 480 System (Roche, Mannheim, Saksa), käyttämällä Virta SYBR Green (Life Technologies Corporation, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ja Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific , Fermentas, Life Science, Foster City, CA,).

ehdot suhteellinen kvantitatiivinen PCR-reaktiossa käyttämällä Fermentas SYBR Green olivat seuraavat, yksi sykli 50 ° C 2 min, yksi sykli 95 ° C: ssa 10 min, 40 sykliä 95 ° C 15 s, 60 ° C: ssa 30 s, ja lisäksi vaihe 60 ° C: ssa 30 s. Kun taas Applied Biosystems Virta SYBR Green olivat seuraavat: yksi sykli 50 ° C 2 min, yksi sykli 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, 40 sykliä 95 ° C 15 s, 60 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 30 s. Lopussa PCR-reaktion, näytteet alistettiin sulamisanalyysikokeita spesifisyyden varmistamiseksi amplikonin, ja β-aktiini-geenin, käytettiin housekeeping normalisoinnin analyysiä.

Restriction Enzyme metylaatioherkät määritykset

metylaatiostatuksen genomista DNA: ta (200 ng), joka oli peräisin LNAT, LT ja LP kudosten ja keuhkosyövän solulinjat tutkittiin käyttäen 0,5 yksikköä jokainen yhdistelmä metylaatioherkkien restriktioentsyymien

HpaII

,

HpyCH4IV

ja /tai

Acil

(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) ja inkuboimalla 37 ° C: ssa, 4 h. Seuraaja metylaatioherkät PCR-monistus, joissa käytetään oligonukleotidiyhdistelmät (taulukko S2), joiden sisällä ennustetun CpG-saarekkeiden promoottorin n kohdegeenien (

MEOX2

,

HDAC9, TWIST1

, ja

AhR

), seuraavat perusteet saari koko 100, ja GC Prosentti 50,0 käyttäen MethPrimer liittää niin monta restriktiokohtia saavuttamiseksi entsyymien herkkä metylaatiostatuksen sisällä amplikonin ja viitenumerolla taulukossa S3.

metylaatioherkän PCR analyysit

metylointi tila (%) laskettiin perustuen metylaatioherkän PCR-määrityksissä, käyttämällä oligonukleotidiyhdistelmät sisältäviä CpG sivustoja sisällä on amplikoni klo promoottori n kohdegeenien tutkittu (

MEOX2

,

HDAC9, TWIST1

, ja

AhR

) kuvattu taulukossa S3. Lyhyesti, 50 ng pilkotun DNA: ta käytettiin hyväksi 25 ui kokonais-PCR-reaktion, ja tuotteen koot analysoidaan, mukaan Taulukko S3, seuraa seuraavaa PCR-olosuhteissa: yksi sykli 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, 40 sykliä 95 ° C ° C: ssa 15 s, 55 ° C: ssa 30 s ja 72 ° C 45 s.

Lisäksi, ihmisen keuhko (NSCLC) solulinjat a-427 ja iner-37 käytettiin standardoida entsymaattisen rajoitus olosuhteissa, kehittämällä

in vitro

metylaatio määrityksiä käyttäen CpG metyyli-transferaasi (M.SssI) ja S-adenosyylimetioniinilla (SAM), inkuboimalla 37 ° C: ssa 4 h. Standard metyloitua DNA ja ihmisen sperma DNA: ta terveiltä luovuttajilta käytettiin hyper-metyloidut ja hypo-metyloituja DNA ohjaimet entsymaattista rajoitus määrityksiä.

In vitro

DNA Metylointi ja histonimodifikaation inhiboitumismääritykset

A-427 ja iner-37 ihmisen NSCLC (adenokarsinooma) solulinjat (5 x 10

5 solua) käsiteltiin

in vitro

kanssa 5′-atsa- deoksisytidiinideaminaasia [4 uM ], estää

de novo

DNA: n metylaatio on sekvenssin promoottorit, ja /tai TSA [300 nM], inhiboimaan histonideasetylaaseja (HDAC: t) 48 tuntia.

Kromatiini immunosaostus (chip)

tuore LT (3 mm

3) jauhettiin nestemäisessä typessä jäädyttämistä ja kiinnitettiin 1% formaldehydiä aikana 10 min, ja heti neutraloidaan 0,125 M glysiiniä 5 minuutin aikana. Saadut solut pestiin 1% PBS: llä, ja lysoitiin puskurissa (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8, Triton X-100 1%, 0,1% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS) sisältäviä proteaasinestäjä

täydellinen Mini

1 tabletti 10 ml (Roche, Indianapolis, iN, USA).

Kromatiini LT näytteistä sonikoitiin käyttäen 10 pulssia 20 sekunnin w /u 60 wattia. 10 ug kromatiinin immunosaostettiin (ChIP) käyttäen kaupallista pakkausta EZ-Magna ChIP G (Millipore, Temecula, CA, USA), ja käyttämällä 2,5 ug anti-H3K27Ac, ​​anti-H3K4me3, anti-H3K27me3, anti-H3K9me3 ja anti -RNA Pol II aktivoituu vasta-aineita (Abcam, Cambridge Science Park, Cambridge, UK). 1 ug anti-hiiri-IgG: tä käytettiin negatiivisena kontrollina ChIP (Millipore, Temecula, CA, USA). Eheyttä ja laatua promoottorin sekvenssit Immuno-saostetun DNA: n (IP-DNA) arvioitiin PCR-monistuksella tuote 166 bp promoottori geenin sekvenssi GADPH, kuten toimittaja suositteli (Millipore, Temecula, CA, USA).

IP-DNA vahvistus ja siru Quantitative Analyysit käyttäminen qPCR määritykset

immunosaostettiin DNA (IP-DNA) 20 ng oli lineaarisesti monistettiin käyttäen koko genomista Amplification (WGA1) Kit (Sigma, St. Louis, MO , USA), ja sen jälkeen puhdistettiin MiniElute sarakkeet (QIAGEN, Hilden Renania-Westfalia, Saksa).

IP-DNA on saatu sekä LT näytteitä ja LT solulinjat analysoitiin qPCR absoluuttisia käyttäen LightCycler 480 System (Roche, Mannheim, Saksa), ja SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Fermentasilta Life Science, Foster City, CA, USA) ja oligonukleotidiyhdistelmät varten tavoitteet ja valvonta (taulukko S2).

IP-DNA 20 ng käytettiin reaktiota kohti, myös vahvistus standardikäyrien kehitettiin kautta sarjalaimennoksia natiivin DNA: perifeerisen veren mononukleaariset solut terveiden luovuttajien (100 ng, 10 ng, 1 ng, 0,1 ng, ja 0,01 ng), ja käyttämällä oligonukleotidisekvenssit tavoitteet (taulukko S2), ja oligonukleotidisekvenssin tarkastuksia C-fos promoottori otettu Kromatiini Immunosaostaminen kit Suurennus System (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).

Cellular sytotoksisuusmääritykset

Cellular elinkelpoisuus analyysit suoritettiin 96-kuoppalevyillä käyttäen 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium (MTS ) (Promega, Madison, WI, USA) puuttuessa tai läsnä ollessa onkologisesta lääkkeen sisplatiini. Tehdä tämän, 96-kuoppaisille levyille ympättiin 3000 ja 5000 solua 200 ul: ssa RPMI-1640-väliaineessa 48 h ja sitten inkuboitiin 10 ui MTS [5 mg /ml]: ssa 3 h, ja myöhemmin lukeminen 550 nm ja /tai 570 nm, käyttäen kaavaa: solujen elinkykyä = (OD näytteen /ohjaus OD) x 100. Samoin lääkeresistenssin käyrät kehitettiin annosvasteellisella riippuvainen tavalla käyttäen sarjalaimennoksia syöpälääkkeen sisplatiini.

Genetic hiljentäminen (siRNA transfektiokokeissa) B

Käytimme pieni häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) suunnattu

MEOX2

(sc-106233),

TWIST1

(sc-38604) ja ei-ihmis liittyvät mRNA: ta negatiivisena kontrollina (sc-37007 ja sC-44230), jotka kaikki saatiin Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas, USA). Lyhyesti, soluviljelmiä 3% antibiootti-free FCS inkuboitiin 96-kuoppalevyillä aikana 12 h ja sitten transfektoitiin RNAi Reagent, Lipofectamine (Life Technologies Corporation, Invitrogen, Foster City, CA, USA) ja siRNA: t, 50 nM, kokonaistilavuudessa 100 ui.

Western Blot

proteiinit uutettiin ja puhdistettiin menetelmällä TRIZOL (Invitrogen), suspendoitiin SDS 5% proteaasinestäjien kanssa (täydellinen mini, Roche, Indianapolis, IN, USA), ja kvantitoitiin Lowryn menetelmällä. Yhteensä proteiineja (30 ug) altistettiin pystysuoraan elektroforeesilla akryyliamidi geelit 12%, ja sitten siirrettiin nitroselluloosakalvoille käyttäen Trans-Blot-Turbo laitteet /siirtojärjestelmä (BioRad, Hercules, CA, USA). Membraaneja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa, estää vähärasvainen maito 5% PBS 1X /Tween 20: tä 0,1%, ja inkuboitiin 2 h vasta-aineiden kanssa (MEOX2) 1:1500, (TWIST1) 1:1500, (β-aktiini) 1 :3000, tai (GAPDH) 1:3000 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA). Membraaneja inkuboitiin aikana 1 tunti sekundaarisen vasta-aineen (anti-hiiri-HRP /anti-kani HRP) 1:10000, huoneenlämpötilassa ja luminolilla 1 min huoneenlämpötilassa käyttämällä C-numeroinen skanneri (Li-cor, Lincon, Nebraska, USA ) ja Hypercassette ja Films (Amersham, Chalfont, Buckinghamshire, Englanti).

TILASTOANALYYSI

Fisherin testiä,

t

-testin ja Mann Whitney-U tilastolliset testit olivat käytetään analysoida eroja potilasryhmät,

p

arvot ≤0.05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Käytimme myös Log-Rank (Mantel Cox) ja Gehan-Breslowin-Wilcoxonin eloonjäämisen käyrä kokeita. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS tilasto-ohjelmalla Mac-OS X (versio 11.0) ja GraphPad (versio 5.0).

Tulokset

Kromosomi Microaberrations ja Lisääntynyt Copy Number Variations (CNVs) High taajuuksien 7p22-21 ja 7p15 keuhkosyöpäpotilaiden

jotta voitaisiin tunnistaa yleisimmät geneettinen microaberrations sen todennäköinen geneettinen ekspressioprofiileja ja epigeneettiset poikkeamat keuhkosyöpäpotilaita, LNAT-, LP-, LT ja NSCLC solulinja johdettu DNA-näytteet (n = 30) tehtiin genomista hybridisointimäärityksillä on SNP 500 K mikrosiruja. Bioinformatiikan segmentaalinen Tarkastelu tunnistamisen kromosomimuutosten ja lisäsi CNVs että LT-valmistetut näytteet, joita ei havaittu LNAT johdettu sovitettu kudoksia. Tyypillisiä kromosomimuutoksia keuhkosyövän luettuna 3p poistot; monistaminen useita alueita kromosomeissa 5, 12, 14, 16, 18, 19 ja 20; ja vahvistus /poisto useilla alueilla kromosomin 8 tunnistettiin (kuvio 1A).

Focal analyysi koko genomin ja kromosomin 7 (A) Koko genomin monistamisen ja bioinformatiikan segmentaalisen analyysi kolmesta keuhkosyövän potilaat suoritettiin käyttämällä sovitetun, histologisesti viereisen ei-mukana keuhkokudoksessa (LNAT) ja keuhkosyövän (LT). (B) Koko genomin ja polttoväli analyysit normaalin keuhkojen, keuhkojen esiasteleesioita ja keuhkokarsinoomia (18-14 27 keuhkovauriotaso korkea CNV). (C) Keskipiste analyysi kromosomin 7 paljasti tiheä CNV at alueen 7p21 (nuoli) in edeltäjä keuhkomuutoksia ja keuhkokarsinoomia.

tiheä CNV käyttää polttoväli genomista analyysejä 7p22. 3-p22.1, 7p21.3-p21.1 ja 7p15.3-p15.2 (kuvio 1 B) havaittiin. Erityisesti, me havaitsimme DNA monistuksissa on 7p21.1 lokukseen LT ja LP-johdettujen näytteiden lähes 55%: ssa tapauksista (15/27 keuhkovaurioita), mukaan lukien 3 4 esiasteleesioita (kuvio 1C ja kuvio S1), joita ei ole havaittu LNAT johdettu näytteet (kuvio 1C).

Lisäksi olemme vahvistaneet kasvaa CNV on 7p-lokukseen sekä LP- ja LT-johdettu näytteitä SNP 6,0-alustan (kuva S2 ). 39 geenit kanssa korkeimmat muutoksen CNV on esitetty taulukossa S4. Nämä muutokset sijaitsivat 7p22.3-p22.1 ja 7p21.3-p21.1 sytogeneettisen alueilla, ja ne sisältyvät

ZNF12

,

RPA3

,

MEOX2

BZW2

,

TSPAN13

,

AGR2

,

AGR3

,

AhR

,

TWIST1

ja

HDAC9

. Muutokset

TWISTN

,

HNRNPA2

,

CBX3

,

HOXA

klusteri ja

EVX1

, jotka sijaitsevat 7p15. 3-p15.2, havaittiin myös (taulukko S4).

Olemme havainneet yhteensä 1376 geenien kopio numero muuttuu meidän ihmisen keuhkosyöpä näytteitä (File S1). Näistä geeneistä, 809 geenit monistettiin taajuudella 37-66% kromosomissa 7.

Tämän analyysin perusteella löysimme rikastuminen geenien mukana useissa solusignalointi reittejä, erityisesti solusyklikontrollin, solu liike solukuolema ja alkionkehityksen verkkoja (tuloksia ei ole esitetty), joista osa on lueteltu taulukossa S4, mikä viittaa siihen, että geneettinen ja /tai epigeneettiset aberraatioita pelaa toiminnallinen tärkeä rooli keuhkosyövän biologiassa.

lisäykset CNV osoitteessa 7p21 ja 7p15 korreloi mRNA ja proteiini-ilmentymän eikä DNA metylointi Lung Cancer

korrelaatio kasvu CNV ja suhteelliset mRNA ekspressiotasot sekä vaikutusta DNA: n metylaation mRNA ilmaisun profiilit analysoitiin keuhkojen karsinoomat. Käyttämällä qRT-PCR-määrityksissä, huomasimme, että vain

MEOX2

,

HDAC9

ja

TWIST1

(kuvio 2A), sekä

AhR

ja

EVX1

geenien (kuvio S3A-B) oli yli-ilmentynyt ja korreloivat positiivisesti CNV-high yhteydessä (kuvio 1 B ja C, ja kuvio S1), verrattuna muihin geeneihin 7p21 (ei esitetty). Ilmaisu Näiden geenien oli merkitsevästi korkeampi LT-johdettujen näytteiden kuin LNAT johdettujen näytteiden (

p

≤0.05). Lisäksi ydin- proteiinin tasot

MEOX2

,

HDAC9

ja

TWIST1

olivat johdonmukaisesti kasvanut LT-valmistetut näytteet (kuvio 2B) sekä

MEOX2

ja

TWIST1

proteiinin tasot /runsautta NSCLC solulinjoissa (kuvio S4A-C), kun taas näiden proteiinien ilmentymisen viereisessä keuhkojen parenchyma ja LNAT johdettuja näytteitä ei kasvanut (kuvio 2B ), kuten havaittiin käyttäen immunohistokemiaa. Kasvu

EVX1

ekspressio havaitaan kalvot LP- ja LT-johdettujen näytteiden ja NSCLC solulinjoissa (kuvio S5a-B).

(A)

MEOX2

,

HDAC9

ja

TWIST1

mRNA ilmaisun. Virhe pylväät edustavat 95% luottamusväli keskiarvon. (B) Proteiinin ilmentyminen viereisen ei-mukana keuhkokudoksessa (LNAT), keuhkojen esiasteleesioita (LP) ja keuhkosyövän (LT) (mikrovalokuvia on 200X ja 400X), sekä formaliinilla kiinnitetyt ja parafiiniin upotetut (FFPE) ja tuore (FF) kudokset, verrattiin. (C) promoottorisekvenssi metylointianalyysi. Erot olivat tilastollisesti merkittäviä suhteessa LNAT ja havaittiin käyttämällä Fisherin testiä, parittoman

t

-testin ja U-testi, *

p

≤0.05; **

p

≤0.005; ***

p

≤0.001. Virhepalkkien osoittaa min max sijoitus 95%: n luottamusväli, ja rasiakuvaajien edustavat standardipoikkeamaa keskiarvosta.

edelleen tutkia vaikutusta geenin liittyvien geenien ilmentymistä ja CNV, osallistuminen epigeneettiset muutoksia, erityisesti DNA: n metylaatio arvioitiin. Metylaatioherkkien entsymaattinen rajoitusta analyysit paljastivat pieniä eroja DNA: n metylaation prosenttiosuuden välillä LNAT- ja LT-johdettujen näytteiden promoottorin sekvenssejä

MEOX2

,

HDAC9

ja

TWIST1

(kuvio 2C), mikä viittaa välisen korrelaation puuttuminen mRNA: n ekspression ja DNA: n metylaatio (kuvio 2A ja 2C). Lisäksi tunnistimme väheneminen DNA: n metylaatio varten

MEOX2

,

HDAC9

ja

TWIST1

(

p

≤0.005 ja

p

≤0.001, vastaavasti), LP-johdettu näytteitä, joita ei havaittu LNAT- ja LT-valmistetut näytteet (kuvio 2C).

Niin ikään pariksi analyysin välillä LNAT- ja LT -johdannainen näytteet joissakin CNV-vapaa potilaiden paljasti myös mRNA yli-ilmentyminen

MEOX2

,

HDAC9

, ja

TWIST1

, mikä viittaa puute geneettinen (CNV) ja epigeneettiset (DNA: n metylaatio) korrelaatio (Kuva S6A-C), ja puute geneettisen-epigeneettiset korrelaation CNV-korkea potilailla (Kuva S7A-C); lukuun ottamatta, että

AhR

geenin välillä LNAT- ja LT-näytteet (kuvio S3A, S3C), ja välillä CNV-vapaa ja CNV-korkea potilailla (S6D, ja S7D). Yhteenvetona tietomme viittaavat siihen, että DNA: n metylaatio ei ole tärkein vastuussa havaitusta ilmentymiskuviot on 7p21 sytogeneettinen alueen keuhkojen karsinoomat, kuten NSCLC.

vähennysten histoni Code of H3K27me3 ja lisäykset H3K4me3 ovat liittyvä

MEOX2

ja

TWIST1

yliekspressio ja korreloivat Poor Clinical ennuste NSCLC

Siksi kysyimme, ovatko muut epigeneettisellä muutoksia voisivat osallistua sääntelyn vaikuttaa geenien, keskittymällä 7p21 sytogeneettinen alueen NSCLC.

tällä, kuten täysin riippumaton validointitutkimuksella rooli histonimodifikaation yliekspressio

MEOX2

ja

TWIST1

vuonna NSCLC potilaat arvioitiin. Tätä analyysiä varten ylimääräinen ryhmä potilaita, jotka oli tehty kliininen seurantaa tutkittiin, onko

MEOX2

ja

TWIST1

yli- ilmeneminen kasvainkudoksen liittyi tasot H3K27me3

vs.

H3K27Ac ja H3K4me3 ja saattaa määrittää ennustetta ja /tai vastata syöpäpotilailla hoidon pienisoluista keuhkosyöpää.

pariksi analyysin välillä LNAT- ja LT-valmistetut näytteet, yhdessä

MEOX2

ja

TWIST1

yli-ilmentyminen (kuvio 3A-B), paljasti vähentäminen H3K27me3 (kuvio 3C-D). Ne potilaat, joilla on alhaisempi rikastamiseen tasoille tukahduttavia histoni H3K27me3 ja korkea

MEOX2

ja

TWIST1

mRNA: n ilmentymisen (Kuva 3A-D) näkyy huonosta eloonjäämisasteesta, ja keskimäärin 6,2 kuukautta (DSE, RSCL, MGGR, GOMJ ja GCH potilasta), kun taas potilailla, joilla on korkeampi H3K27me3 rikastamiseen tasoilla ja alhainen

MEOX2

ja

TWIST1

mRNA: n ilmentymisen (Kuva 3A-D) näkyy paremmin eloonjäämisluvut, joissa on keskimäärin 53,4 kuukautta (GMRM, AEE, SPN, GHM ja PMA potilaita, joilla

p

≤0.0027) (kuvio 3E, taulukko 1).

(A)

MEOX2

ilme NSCLC ja LNAT johdettu näytteitä, ja (B)

TWIST1

ilmentymistä NSCLC ja LNAT johdettuja näytteitä. Virhepylväät edustavat keskivirheet keskiarvon kolme toistoa. (C) histonimodifikaation rikastamiseen profiilin

MEOX2

promoottorisekvenssin. (D) histonimodifikaation rikastamiseen profiilin

TWIST1

promoottorisekvenssin. Rasiakuvaajien edustavat keskiarvoa kolme toistoa. Analyysi paljasti korrelaation alhaisen mRNA ilmaisun ja H3K27me3 rikastamiseen. (E) Survival käyrä analyysit perustuvat Log-Rank (Mantel Cox) ja Gehan-Breslowin-Wilcoxonin testien suhteellisen ilmentymisen indeksi

MEOX2

plus

TWIST1

(

p

≤0.0027).

myös merkitsevästi kohonneeseen (

p

≤0.008) sortavasta histoni merkki H3K27me3 sekä

MEOX2

ja

TWIST1

promoottorisekvenssit vahvistettiin niille potilaille, joilla on korkeampi eloonjäämisaste (kuva 4A-B). Kuitenkaan mitään merkittäviä muutoksia H3K27Ac tasot havaittiin (kuvio 4C-D). Sitä vastoin kevyemmästä aktivoitumisen markkeri H3K4me3 havaittiin sekä

MEOX2

(

p

≤0.028) ja

TWIST1

(

p

≤ 0,0006) promoottorisekvenssejä korkean selviytymisen potilasryhmälle (kuvio 4E-F) ja korreloivat osittainen vastaus adjuvanttia sisplatiini tai karboplatiini, koska ensimmäinen rivi kemoterapia pienisoluista keuhkosyöpää (taulukko 1).

(A ) H3K27me3 rikastumista

MEOX2

promoottorisekvenssi (** U-testi,

p

≤0.01, ja F-testin,

p

≤0.0003) ja (B ) H3K27me3 rikastumista

TWIST1

promoottorisekvenssi korkea eloonjäämisen potilailla verrattuna potilaisiin, joilla on huono ennusteita (*** U-testi,

p

≤0.01, ja parittomalla t-testi

p

≤0.02). (C) H3K27ac rikastumista promoottorisekvenssin

MEOX2

(ei merkittäviä muutoksia) ja (D) H3K27ac rikastumista promoottorisekvenssin

TWIST1

korkean eloonjäämisen potilailla verrattuna potilaisiin, joilla on huono ennusteita (ei merkittäviä muutoksia). (E) H3K4me3 rikastumista

MEOX2

promoottorisekvenssi (* F-testin,

p

≤0.02) ja (F)

TWIST1

promoottorisekvenssi korkean eloonjäämisen potilailla verrattuna