Krooninen sairaus

tiivistelmä

Käytimme geeniekspressioprofilointi tunnistaa tulehdusta edistävien sytokiinien, jotka korreloivat virtsarakon syövän kehittymisen. Geeniekspressioprofiilit kudoksen Näytteitä tutkittiin cDNA microarray, joka sisälsi 103 ei-lihaksen invasiivisia virtsarakon syöpien (NMIBC), 62 lihasten invasiivisia virtsarakon syöpien (MIBC), 58 näytettä histologisesti normaalin näköinen ympäröiviin kudoksiin, ja 10 normaalia, terveillä henkilöillä joka toimi kontrollina kohortin vertailuun. Ryhmittelimme data-setit mukaan biologisen karakterisointeja ja keskittyi immuunivasteen geenejä, joissa on vähintään 2-kertainen ero ilmentymisen MIBC kontrolleja. Kokeellinen data-set tunnistettu 36 immuuni liittyviä geenejä, jotka olivat merkittävästi muuttuneet MIBC näytteissä. Lisäksi 10 geenejä säädellään ylöspäin ja 26 geenit säädellä vähentävästi MIBC näytteissä verrattuna normaaleihin kudoksiin. Niistä 10 sääteli molekyylejä tutkitaan, kapasiteetti sekä haavan paranemista muuttoliikettä ja invaasio tehostettiin vastauksena IL-5, IL-20 ja IL-28A virtsarakon syövän solulinjoissa (253J ja EJ-solut), verrattuna käsittelemättömät solut. Ilmaisu tasot IL-5, IL-20 ja IL-28A suurentunut potilailla, joilla MIBC. Kaikki 3 sytokiinien ja niiden reseptorien tuotettiin virtsarakon syövän solulinjoissa, määritettynä reaaliaikaisia ​​PCR, immunoblot-analyysi ja konfokaali immunofluoresenssimenetelmällä. Up-regulation of MMP-2 ja MMP-9 jälkeen havaittiin IL-5, IL-20 ja IL-28A stimulaation molemmissa solutyypeissä. Lisäksi, joka on EMSA-määritys osoitti, että hoito IL-5, IL-20 ja IL-28A indusoiman aktivaation transkriptiofaktoreiden NF-KB ja AP-1, jotka säätelevät MMP-9-promoottori. Lopuksi, MAPK: ja Jak-Stat signalointi havaittiin lisäyksen jälkeen IL-5, IL-20 ja IL-28A virtsarakon syövän soluissa. Tämä tutkimus viittaa spesifisten tulehdussytokiini (IL-5, IL-20 ja IL-28A) -välitteisen yhdistys virtsarakon syövän kehittymisessä. Kaikki 3 sytokiinit voivat olla tärkeitä uusia molekyylitason tavoitteet modulaatio maahanmuutto- ja hyökkäyksen virtsarakon syöpään.

Citation: Lee S-J, Lee E-J, Kim S-K, Jeong P, Cho Y-H, Yun SJ, et al. (2012) tunnistaminen proinflammatoristen sytokiinien Associated kanssa Muscle Invasiivinen virtsarakon syövän; Roolit IL-5, IL-20 ja IL-28A. PLoS ONE 7 (9): e40267. doi: 10,1371 /journal.pone.0040267

Editor: Nikolaos Frangogiannis, Albert Einstein College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu 26. tammikuuta 2012 Hyväksytty 4. kesäkuuta 2012 Julkaistu: 04 syyskuu 2012

Copyright: © 2012 Lee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Basic Science Research Program kautta National Research Foundation of Korea (NRF), rahoittama opetus-, Science and Technology (2010-0001736) ja Korean Healthcare Technology R Welfare, Korean tasavalta (A100651-1011-0000200). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

virtsarakon syöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisten kasvainten taloudellisesti kehittyneissä maissa, ja lähes kaikki pahanlaatuiset virtsarakon syövät ovat siirtymäkauden cell carcinoma (TCC), jotka syntyvät siirtymäkauden epiteeli [1], [2]. Kahdenlaisia ​​TCC on histopatologisesti luokiteltu: non-lihas invasiivisia virtsarakon syöpä (NMIBC) ja lihasten invasiivisia virtsarakon syöpä (MIBC) [3], [4]. Tällä ensimmäisellä kerralla, 70-80%: lla potilaista diagnosoidaan NMIBC joka rajoittuu mahalaukun. Loput tapaukset esittelee MIBC kanssa hyökkäys lihasvoima kerrosten virtsarakon. Potilaat, joilla NMIBC voidaan hoitaa, kun taas suurin osa kuolemista tapahtuu potilailla, joilla on tapaus MIBC [4]. Siksi paljon vaivaa on keskittynyt ymmärtämään mekanismeja MIBC kehityksen mahdollisia terapeuttisia sovelluksia.

Nykyään on laajalti hyväksytty, että rakkoon immunoterapia Bacillus Calmette Guerin (BCG) on tehokkain adjuvantti agentti hoitoon NMIBC [5] – [7]. Kuitenkin kaikkein käyttökelpoisia terapeuttisia menetelmä hoitoon potilailla, joilla on MIBC vielä tunnistettu. Siksi monet tutkimukset on tehty, jotta saat paremman käsityksen mekanismeihin MIBC kehitys, mikä voi johtaa löydettiin mahdollisia terapeuttisia hoito. Biokemiallisia ja biologisia tutkimuksia liittyy aggressiiviseen TCC on analysoitu määrittää prognostinen indikaattoreita, tai kehittää aineita diagnostisia ja terapeuttisia sovellus. Useita erityisiä molekyylimarkkerit on todettu geeniekspressioprofiilien virtsarakon syövän, kuten solun lukiertosäätelijöistä, soluproliferaatiota, apoptoosin ja angiogeneesitekijät [8]. Tulehdus on mukana kehittämässä useiden sairauksien, kuten ateroskleroosin, diabeteksen, ja kasvaimet, ja mukana on ulkonäkö lukuisia tulehduksellinen biomarkkerit [9] – [11]. Kuitenkin tulehduksellinen-fenotyyppi yhdistys, joka säätelee virtsarakon syövän kehitystä ja etäpesäke on edelleen huonosti.

valtava tietomäärä on osoittanut, että interleukiinit käyttää lukuisia toimintoja säätelemällä solujen kasvun, solujen eloonjäämistä, erilaistumista ja apoptoosia useiden sairauksien [11]. Interleukiinit voi myös osoittaa erillisiä vaikutuksia immuunivasteiden säätelyyn ja patogeneesin virtsarakon syöpä [4] – [7]. Käsittely interleukiini-6 (IL-6), nähtiin antituumorivaikutuksen kautta apoptoosin induktio hiiren virtsarakon karsinooma [12]. IL-15-geenin toimitus osoitti kasvaimen vastaisen vaikutuksen hiiren potilaalle tehdä virtsarakon syöpä malli [13]. Sitä vastoin, IL-6 hoidon on havaittu edistää solujen kasvua ihmisen virtsarakon syövän solujen

in vitro

[14]. Lisäksi IL-8 ja IL-17 on liitetty kasvaimen kasvun ja etäpesäkkeiden ihmisen virtsarakon syövän [15], [16]. Vaikka monet tutkimukset ovat analysoineet vaikutuksia interleukiinit kasvuun virtsarakon syöpä [12] – [16], sen tarkka merkitys ja molekyylimekanismin prosessissa muuttoliikkeen ja invaasion TCC liittyvä kliininen tutkimus ei ole selvitetty.

tässä tutkimuksessa olemme käytetään microarray perustuva lähestymistapa tunnistaa kliinisesti ja biologisesti informatiivinen ekspressiokuvioiden että eroa potilaiden välillä, joilla NMIBC ja MIBC ja kontrollinäytteitä. Tuloksemme keskittynyt eroja MIBC ja kontrollinäytteistä ekspressiokuvioita geenien merkittävä rooli tärkeimmissä solun prosessien tulehdusreaktioita. Geenit, joilla on vähintään 2-kertainen ero ilmentymisen MIBC vs. kontrolliraskauksiin sekä uudenlaisia ​​ominaisuuksia signaalireaktioteissä tulehduksellinen perustuva sarja virtsarakon TCC oli selvitetty.

Tulokset

Differential geeniekspressiomalleja potilailla Ryhmät

ominaista geeniekspressiomalleja 233 virtsarakon syövän potilaiden näytteitä; 103 NMIBCs, 62 MIBCs, ja 68 normaali limakalvo tai limakalvolle ympäröivän (vieressä) syövät (taulukko 1). Ensin levitetään hierarkkinen klusterointi analyysi geeniekspressiomalleja arvioida molekyyli- ominaisuuksia eri potilasryhmille. Kuten odotettua, hierarkkinen ryhmittely analyysi geenien ilmentyminen tietoja kaikista kudoksista saatiin 3 suuri klustereita, 1 edustavat normaalin virtsarakon limakalvon, 1 edustavat MIBC potilaan ryhmä, ja 1 edustaa NMIBC potilaan ryhmä (kuvio 1). Näin ollen geeni-ilmentymisen kuviot heijastaa molekyylirakenne oli helposti erotettavissa välillä virtsarakon kasvaimia ja ei-tuumorikudoksissa.

Genes ilme arvoja, jotka oli keskihajonta vähintään 0,7 valittiin (4145 geenit) . Punainen ja vihreä väri heijastaa korkean ja matalan ekspressiotasot, vastaavasti.

vieressä pyritty tunnistamaan geenin sarjaa, jotka ilmentyvät eri kesken 3 eri ryhmiin. Käytimme Venn-kaavio vertailu 2-geenin luetteloiden verrata geeniekspressiomalleja of NMIBCs ja MIBCs. Ensin tuotetaan 2 eri geeniä luetteloita soveltamalla 2 otoksen t-testi (kuvio 2A,

P

0,001). Gene lista A edustaa geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti välillä normaalin limakalvon ja NMIBC, ja geenien luettelon B edustaa geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti välillä normaalin limakalvon ja MIBC. Verrattaessa 2-geenin luettelot, 3 erilaista kuvioita havaittiin: S en (1452 geenit), S ja I (679 geenit), ja en S (381 geenit) (kuvio 2B). Geenit S en luokka osoitti NMIBC ilmentymistä malleja, kun taas geenien en S luokka näy MIBC erityisiä geeniekspressiomalleja. Geenit S ja I luokan näytteillä sekä NMIBC ja MIBC ilmentymismalleja, mikä tarkoittaa 679 geenien S ja I luokan oli yhteinen sekä NMIBC ja MIBC kehittämiseen.

(A) Venn-kaavio geenien valitseman 2 -sample t-testi. Sininen ympyrä (geeni lista S) edustaa geenit ilmentyvät differentiaalisesti normaalin limakalvon ja NMIBCs. Punainen ympyrä (geeni lista I) edustaa geenit ilmentyvät differentiaalisesti normaalin limakalvon ja MIBCs. Cut-off

P

-arvo on alle 0,001 levitettiin valita geenien lauseke, joka oli merkitsevästi erilainen näiden kahden ryhmän välillä. (B) Expression malleja valittujen geenien Venn-kaavio. Tiedot esitetään matriisimuodossa, jossa rivit edustavat yksittäisiä geenejä ja pylväät edustavat kukin kudosta. Punainen ja vihreä väri heijastaa korkean ja matalan ekspressiotasot, vastaavasti.

toiminnallinen luokitus Gene Expression allekirjoitus MIBC Development

Voit selvittää meidän geenien ilmentyminen allekirjoitus rikastui tiedossa biologisiin toimintoihin, bioinformatiikan toiminnallinen luokitus analyysit geenit, jotka ilmentyvät differentiaalisesti normaalin limakalvon ja MIBC tehtiin. Tämä analyysi paljasti useita MIBC kehitys liittyy toiminnallisia luokkia. Toiminnoille geenin sarjat on esitetty kuvassa 3. Olemme havainneet, että geenit osallistuvat solusyklin, syövän, solujen kasvun ja lisääntymisen, solukuoleman, ja DNA-replikaatioon ja -korjaus merkittävästi rikastettu. Olemme myös havainneet, että geenit osallistuvat infektio mekanismeja, immunologinen sairaus, ja tulehduksellinen sairaus oli läsnä myös merkittävä määrä. On mielenkiintoista, että merkittävä määrä osallistuvien geenien munuais- ja urologiset sairaus, solujen kehitystä, kudoksen kehittäminen, ja kehityshäiriöitä havaittiin, joka inspiroi luottamusta tuloksiin. On ollut paljon edistystä virtsarakon syövän tutkimus geenejä, jotka edistävät solusyklin, solujen kehitystä, solujen kasvuun, tai solujen lisääntymistä, jotka olivat erittäin merkittäviä toimintoja kuviossa 3. Jotta voitaisiin tunnistaa geenin ilmentymisen tasoa virtsarakon kasvaimet, me lisäksi analysoitiin microarray aineistoja. Yksittäiset kasvain näytteet virtsarakon syövän potilaiden paljasti 664 geeniä, jotka ovat differentiaalisesti ilmaistut kaikki kasvain kudosnäytteitä, jossa ero geenit olivat joko ylös- tai alaspäin säädelty (taulukko S1, S2, S3, ja S4).

Luokittelu rikastaminen määritettiin käyttäen Ingenuity Pathway Analysis (versio 8.8). Merkitys kunkin toiminnon arvioitiin käyttämällä Fisherin testiä menetelmällä. Kynnys tilastollinen merkitsevyys oli -log (

P

= 0,05).

Esillä olevassa tutkimuksessa olemme analysoineet ilmentymisprofiilin liittyvien geenien soluproliferaatiota, apoptoosin, solu Syklikontrollin, angiogeneesiä, haavojen paranemista, DNA-replikaation ja -korjaus, solun tukirangan, ja solujen välinen adheesio normaalin limakalvon ja MIBC (taulukko S1 ja S2). Vuonna MIBC, mRNA ekspressiotasot soluproliferaatiota liittyvien geenien VAX1, TTK, TPX2, TIMELESS, STIL, TBRG4, MCM7, KIF2C, HGS, DHCR7, CENPF, BRCA1, UHRF1, TRAIP, RECQL4, RACGAP1, sääntelyviranomaisten, MKI67, KISS1R, KIF15, ING1, IMPDH1, FGF18, E2F1, DLG7, BUB1B, BUB1, BRCA2, ja BLM oli säädelty verrata normaalin limakalvon (taulukko S1). Seuraavan klusteri koostuu apoptoosiin liittyvien geenien, jotka olivat yli-ilmentynyt (TOP2A, SCOTIN, MTP18, GSK3b, FANCG, BIRC5, AKT1S1, YARS, TRIB3, TRAF2, SCARB1, RAD21, FAF1, ESPL1, E2F2, BCL2L12, ATF5, ja AATF) in MIBC (taulukko S1). Geenit perheisiin kuului korreloi solun tukirangan ja olivat huomattavasti yli-ilmentynyt MIBC: TUBG1, SPTBN2, SPAG5, SCYL1, RCC2, RAE1, PRC1, PPP4C, NUSAP1, MYOHD1, LMNB2, KIFC1, KIF4A, KIF20A, KIF14, KIAA1688 , GTSE1, CCNB1, C9orf48, C18orf24, AZI1, AURKB, TUBA6, STMN1, SNIP, SLC9A3R1, SAC3D1, ODF2, NEK2, LMNB1, KNTC1, KIF22, ITGB4BP, FAM33A, CCNB2, ja ANLN (taulukko S1). Olemme myös havainneet sääteli ilmentyminen soluadheesion liittyvät molekyylit, kuten TSTA3, TROAP, ADAM15, TINAG, PVR, PPFIA1, CELSR3, ja ADRM1 on MIBC (taulukko S1). Profylaktista molekyyli geenejä, mukaan lukien TOP2A, POLD1, Pfs2, ORC1L, MCM7, NPR1, ja FGF18 ovat säädellään ylöspäin MIBC (taulukko S1). Kuitenkin sääteli ilmentymistä angiogeenisen tekijän VEGF yllättäen havaittu NMIBC (taulukko S1). DNA: n replikaatio ja huoltoon liittyviä geenejä säädellään ylöspäin MIBC: TDP1, DNA2L, TYMS, VAK, POLQ, POLE2, POLD2, POLA2, ORC6L, MCM10, PRPF19, MGC32020, GTF2H4, EME1, RUVBL2, RAD51AP1, NUDT1, FANCB, ja FANCA (taulukko S1). Lopuksi, esillä oleva tiedot osoittivat yli-ilmentynyt tasoilla solusyklin geenien, jotka edistävät kasvaimen etenemiseen ja invaasio: UBE2C, TREX1, RCC1, PSMD8, PA2G4, LIN9, GSG2, E2F3, CDT1, CDK5RAP1, CCNF, ZWINT, PKMYT1 , CDC45L, CCNE2, CCNA2, SUV39H1, RAD54L, POLD1, HCAP-G, H2AFX, GPS1, FLJ22624, FANCD2, CHAF1A, CDCA3, ASPM, XRCC2, SPBC25, SMC4L1, SGOL1, SC65, PTTG1, POLE, PBK, MCM2, KNTC2 , KIAA1794, EXO1, CIT, CHAF1B, CEP55, CDCA8, CDCA5, CDCA2, CDCA1, C20ort172, ANAPC11, cdc2, CDC20, CDC25C, Cdc7, CDC27, ja CDC25A (taulukko S1).

IL-5, IL-20 ja IL-28A Edistää Migration ja invaasiota Virtsarakon syövän solut

Virtsarakon syöpä on immuuni- tai tulehdukseen liittyvien sairauksien, ja immunoterapia kuten rakkoon tiputtamisen Bacillus Calmette-Guerin (BCG) on tärkein hoito vaihtoehto NMIBC estää taudin etenemistä [5] – [7], [9]. Kumulatiivinen tutkimukset ovat osoittaneet, että muutos sytokiinitasoja voisi olla keskeinen tapahtuma määritettäessä taudin etenemistä virtsarakon syöpään [17] – [19]. Seuraavaa analyysiä varten, siis, valitsimme immunologisen tai tulehduksellisten toimintoja meidän toiminnallinen luokitus tulokset (kuvio 3). Koska kuolema virtsarakon syöpäpotilailla on vahvasti sidoksissa kehittämiseen MIBC [4], olemme analysoineet geeniekspressiomalleja edustavia immuuni- tai tulehdukseen liittyvä geenejä, vertaamalla MIBC ja vertailunäytteet (taulukko 2 ja 3). Kymmenen (10) näiden geenien (IL-5, IL-26, IL-22RA1, IL-1RAPL1, IL-1F5, IL-17RB, IL-17RE, IL-20, IL-28A, ja TRAF2) osoittivat lisääntyneen ekspression ja 26 geenit olivat säädellä vähentävästi MIBC näytteissä, verrattuna kontrolliin näytteet (taulukko 2 ja 3). Olemme jaettu 10 ylös-geenien 3 tyyppiin: (1) sytokiinien (IL-26, IL-5, IL-20 ja IL-1F5) (2) sytokiini-reseptorit (IL-22RA1, IL-17RB, IL 17RE, IL-1RAPL1, ja IL-28AR1), ja (3) sytokiinireseptorin sovittimen proteiinin (TRAF-2). Ensinnäkin tutkia kyvyn aiheuttaa maahanmuutto- ja invaasio, käytimme sytokiinien IL-26, IL-5, IL-20 ja IL-1F5. Toinen, käytimme sytokiinin IL-22, IL-17E, IL-17C ja IL-28A, koska nämä sytokiinit välittää soluvasteiden sen vuorovaikutus niiden reseptorien (IL-22 /IL-22RA1, IL-17E /IL-17RB, IL-17C /IL-17RE, IL-28A /IL28AR1) [20] – [23]. Siinä tapauksessa, IL-1RAPL1, käytimme yli-ilmentyminen IL-1RAPL1 cDNA-geenin, koska ligandin IL-1RAPL1 ei vielä ole tunnistettu [24]. Lopuksi käytetään myös TRAF2 cDNA geeni olimme kloonattu. Aiemmat raportit osoittivat, että MIBC kehitys oli voimakkaasti yhteydessä maahanmuuttoon ja hyökkäys syöpäsolujen [4], [15]. Sen määrittämiseksi, onko ylös-geenien in MIBC aiheuttaa migraation ja invaasion virtsarakon syövän solujen, suoritimme arpeutumisprosessit määritykset ja invaasio määritykset virtsarakon syövän 253J ja EJ-soluihin käyttäen rekombinanttiproteiineja tai cDNA geenejä. Niistä 10 molekyylejä tutkitaan, IL-5, IL-20 ja IL-28A tehostaa merkittävästi sekä haavan paranemista muuttoliike ja invaasion 253J soluja, verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuvio 4A ja 5A). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin EJ soluissa (kuvio 4B ja 5B). Lisäksi, soluproliferaatiota ei havaittu missään 3 tapausta sytokiinin käsiteltyjen virtsarakon syövän solujen (kuvio S1A ja B). Kuitenkin muut 5 sytokiinien ja 2 geenejä ei ollut vaikutusta migraation ja invaasion virtsarakon syövän solujen (kuvio S2, S3, ja S4).

(A, B) Konfluentit virtsarakon syövän soluja inkuboitiin seerumittomassa väliaineessa ja käsiteltiin rekombinanttiproteiinin IL-5, IL-20 ja IL-28A osoitetut ajat. Leveydet vamman linjat tehdään Sitten solut tutkittiin 0 ja 24 tuntia. Haavan paranemista muuttoliike edustaa leveydet vamman linjat.

(A, B) Solut sijoitettiin ylempään kammioon, ja osoitetut pitoisuudet IL-5, IL-20, ja IL-28A sijoitettiin alhaisen hyvin ja kemotaksista kammion. Tunkeutuneet solujen lukumäärät laskettiin jälkeen ilmoitettu kertaa. Tulokset ilmaistaan ​​määrä tunkeutuneet solujen verrattuna käsittelemättömään verranteeseen, määritettynä 3 itsenäisestä kokeesta. **

P

0,01 verrattuna ilman hoitoa.

IL-5, IL-20 ja IL-28A Ekspressio Up-säännelty Potilaat, joilla MIBC

validoimiseksi tasoa IL-5, IL-20 ja IL-28A, me seuraavaksi mitattuna mRNA tasot 62 MIBCs ja 68 normaalia näytteiden reaaliaikaisella PCR: llä. Tulokset osoittivat, että ekspressiotasot IL-5, IL-20 ja IL-28A-mRNA oli yleisesti suurempi MIBC potilailla kuin terveillä henkilöillä (kuvio 6), mikä viittaa siihen, että IL-5, IL-20, ja IL-28A on vahvasti ja merkittävästi liittyy invasiivisia virtsarakon syöpä.

Quantitative real-time PCR: ää käytettiin vahvistamaan geenin IL-5, IL-20 ja IL-28A on MIBC potilailla ja terveillä yksilöitä. Kliinisistä näytteistä saatiin 62 MIBC potilaista ja 68 terveiden yksilöiden. MRNA eristettiin ja käytetään suorittamaan reaaliaikainen PCR-IL-5, IL-20 ja IL-28A. Tulokset ovat edustettuina IL-5, IL-20 ja IL-28A-mRNA: n ekspression suhteen GAPDH mRNA: n ilmentymisen. *

P

0,01 verrattuna terveillä henkilöillä.

IL-5, IL-20, IL-28A, ja niiden reseptorit tunnistanut Reaaliaikainen PCR, Immunoblotvärjäys ja konfokaali immunofluoresenssimikroskopialla on virtsarakon syövän soluissa

sen määrittämiseksi, onko IL-5, IL-20 ja IL-28A-mRNA ilmennettiin sekä 253J ja EJ-soluja, real-time PCR suoritettiin. Kuten kuviossa 7A ja D: n ilmentyminen IL-5, IL-20 ja IL-28A mRNA endogeenisesti havaittiin molemmissa solulinjoissa. Hoitoa sekä solulinjoja 10% FBS: ää 24 tunnin ajan osoitti merkittävää up-regulation of IL-5, IL-20 ja IL-28A ilmentymisen mRNA-tasot (kuvio 7A ja D). Lisäksi, reaaliaikainen PCR-analyysi osoitti, että ekspressio reseptorien 3 sytokiinien, IL-5Rα, IL-20R1, ja IL-28AR1 sekä 253J ja EJ-soluja (kuvio 7B ja E). IL-5, IL-20 ja IL-28A-proteiinit havaittiin immunoblottauksella proteiiniextraktien molemmissa solulinjoissa (kuvio 7C ja F). IL-5, IL-20 ja IL-28A-proteiinin ekspressio lisääntyi lisäämällä 10% FBS: ää (kuvio 7C ja F). Käyttämällä immunofluoresenssilla konfokaalimikroskopialla, tutkimme seuraavaksi osa-sijainti solun IL-5, IL-20 ja IL-28A-proteiinin molemmissa solulinjoissa. Kaikki 3 sytokiinien dispergoitiin sytoplasmassa ja reuna-ydin- alueilla (kuvio 8A ja B).

(A, B, D ja E) Soluja inkuboitiin eri pitoisuuksien FBS: ää 24 h , ja mRNA: n ilmentymisen tasoja IL-5, IL-20, IL-28A (A, D) ja niiden reseptorien (B, E) kvantifioitiin reaaliaikaisella PCR: llä. Tulokset ilmaistiin IL-5, IL-20, IL-28A ja reseptorin mRNA: n ekspression suhteen GAPDH mRNA: n ilmentymisen. *

P

0,01 verrattuna ilman hoitoa. (C, F) Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla FBS: ää 24 tuntia, ja proteiinin tasot IL-5, IL-20 ja IL-28A analysoitiin immunoblottauksella. GAPDH ilmentyminen käytettiin lastaus ohjaus.

(A, B) 253J ja EJ-soluja, vastaavasti, värjättiin vasta-aineiden QD565-konjugoidulla IL-5, IL-20 ja IL-28A (punainen). Molemmat ytimet (anti-DAPI) ja sytoplasmassa (anti-tubuliinia Alexa488) vasta- värjätään DAPI (sininen) ja tubuliinia Alexa488 (vihreä).

IL-5, IL-20, ja IL -28A Aktivoi MMP-9 Expression kautta transkriptiotekijöiden NF-KB ja AP-1 in virtsarakon syövän solut

Aiemmat raportit osoittivat, että MMP-9-ekspressio tiiviisti virtsarakon syövän leviämisen ja muuttoliike [4], [15], [25] – [29]. Tuloksemme osoittivat, että IL-5, IL-20 ja IL-28A stimuloi migraation ja invaasion virtsarakon syövän solujen (kuva 4 ja 5). Nämä tulokset sai meidät tutkimaan, onko IL-5, IL-20 ja IL-28A indusoi MMP-9 ilmentymistä. Hoitoa sekä syöpien soluja IL-5 aiheutti merkittäviä ylössäätöä MMP-9 ilmentymistä pitoisuudesta ja ajasta riippuvaisella tavalla, havaittiin käyttämällä gelatiinitsymografialla ja immunoblot-analyysi (kuvio 9A, 9B, 10A, ja 10B) . Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin hoidon jälkeen joko IL-20 tai IL-28A, vastaavasti (kuvio 9A, 9B, 10A ja 10B). Lisäksi MMP-2, toinen matriksimetalloproteinaasi, myös stimuloida IL-5-, IL-20- ja IL-28A-käsiteltyjä soluja, kuten 253J ja EJ-soluja (kuvio 9A, 9B, 10A, ja 10B). 5′-säätelyalue ihmisen MMP-9-promoottori sisältää useita konsensusyksiköitä NF-KB: n, AP-1, ja Sp-1 transkriptiotekijöiden [30] – [32]. Päättelimme, että MMP-9: n ilmentyminen IL-5, IL-20 ja IL-28A voidaan korreloida lisääntynyt aktiivisuus NF-KB: n, AP-1, ja Sp-1 tumassa. Tätä varten teimme elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä (EMSA) käyttäen tumauutteita virtsarakon syövän solujen aiheuttama IL-5, IL-20 ja IL-28A. IL-5, IL-20 ja IL-28A indusoi merkittävää kasvua NF-KB ja AP-1 sitovaa toimintaa 253J solulinjoissa (kuvio 11). Ei spesifinen sitoutuminen komplekseja osaksi Sp-1 havaittiin soluissa, joita käsiteltiin tahansa interleukiinit (kuvio 11). Kuitenkin, kun kyseessä on EJ-solut, sekä IL-5 ja IL-28A stimuloi NF-KB: n sitoutumisen aktiivisuutta (kuvio 12). Lisääntynyt NF-KB ja AP-1 sitovaa toimintaa havaittiin IL-20-käsiteltyjen EJ-soluja (kuvio 12).

(A) Soluja kasvatettiin 70% konfluenssiin DMEM 10% FBS: ää, ja väliaine vaihdettiin seerumia. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla IL-5, IL-20 ja IL-28A: ssa 24 tuntia. (B) aika-riippuvainen MMP-9 ilmentymistä virtsarakon syövän soluissa indusoiman IL-5-, IL-20- ja IL-28A. Soluja seerumia inkuboitiin IL-5-, IL-20- ja IL-28A (100 ng /ml), eri aikoja. Vakioitu väliaine (A) ja (B) analysoitiin tsymografisen MMP toimintaa. Proteiini MMP-2, MMP-9 ja GAPDH määritettiin immunoblot-analyysillä.

(A) Confluent-soluja viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, ja väliaine vaihdettiin seerumin vapaata välineellä. Soluja stimuloitiin osoitettujen konsentraatioiden IL-5, IL-20 ja IL-28A: ssa 24 tuntia. (B) induktio ajasta riippuvia MMP-9 ekspression IL-5-, IL-20- ja IL-28A-käsiteltyjen virtsarakon syövän soluissa. Soluja seerumia stimuloitiin IL-5-, IL-20- ja IL-28A (100 ng /ml) ilmoitetaan kertaa. Tsymografisen MMP aktiivisuus analysoitiin vakioitua elatusainetta (A) ja (B). Proteiini MMP-2, MMP-9 ja GAPDH oli asetettu immunoblot-analyysillä.

Soluja viljeltiin seerumittomalla alustalla, joka sisälsi ilmoitetut pitoisuudet IL-5, IL-20 ja IL -28A. 24 tunnin kuluttua, tumauutteista soluista analysoitiin EMSA Aktivoidun NF-KB: n, AP-1, ja Sp-1 käyttäen radioaktiivisesti oligonukleotidikoettimia.

Soluja inkuboitiin seerumittomassa elatusaineessa varten osoitettujen konsentraatioiden IL-5, IL-20 ja IL-28A: ssa 24 tuntia. Sitten, ydinvoiman otteita solut altistettiin EMSA testata NF-KB, AP-1, ja Sp-1 sitoutumisaktiivisuus käyttämällä radioleimattua oligonukleotidikoettimia.

induktio MAPK ja Jak-Stat Signaling Pathway in Virtsarakon syövän indusoiman IL-5, IL-20 ja IL-28A

Koska signalointi sytokiinien ensisijaisesti aktivoi Jak /Stat ja MAPK signaalintransduktioreitteihin [8], tutkimme seuraavaksi signalointi cascades indusoi IL-5, IL-20 ja IL-28A virtsarakon syövän soluissa. Kokeet, tehtiin 253J ja EJ-soluja. IL-5 indusoi aktivoituminen ERK1 /2, JNK, JAK1, JAK2, STAT1, Stat2, ja Stat3 vuonna 253J soluissa (kuvio 13A ja 14A). Stimulaatio EJ-solujen IL-5 johti aktivaatioon ERK1 /2, p38MAPK, JAK1, JAK3, STAT1 ja Stat3 (kuvio 13B ja 14B). Lisäksi, IL-20 lisäsi aktivaation ERK1 /2 sekä 253J ja EJ-soluja (kuvio 13A ja 13B). Aktivointi JAK2, JAK3, Stat2, ja Stat5: n havaittiin IL-20-käsiteltyjen 253J soluissa (kuvio 14A). Käsittely IL-20 stimuloi aktivointi JAK1, JAK2, STAT1, Stat2, ja Stat5: n vuonna EJ soluissa (kuvio 14B). Siinä tapauksessa, IL-28A, aktivointi ERK1 /2 havaittiin 253J-soluissa (kuvio 13A), p38MAPK aktivointi oli säädellään ylöspäin EJ-soluja (kuvio 13B). Hoito 253J solujen IL-28A aiheuttama aktivointi JAK2, JAK3, Stat3, ja Stat5: n (kuvio 14A). Lisäksi aktivointi JAK2, STAT1 ja Stat3 indusoitiin IL-28A hoidon EJ-soluja (kuvio 14B). Kuitenkin AKT aktivointi ei vaikuttanut IL-5-, IL-20- ja IL-28A-käsiteltyjen virtsarakon syövän solujen (kuvio S5a ja B).

(A, B) Soluja inkuboitiin IL -5, IL-20 ja IL-28A (100 ng /ml) ja ilmoitettu ajat, ja otettiin sitten talteen, hajotettiin ja suoritettiin immunoblot-analyysi aktivointitasoa MAPK käyttäen spesifisiä vasta-aineita.

(A, B) Soluja käsiteltiin IL-5, IL-20 ja IL-28A (100 ng /ml) ja osoitetut ajat, ja otettiin sitten talteen. Aktivointi tasot Jak-Stat detektoitiin immunoblot-analyysillä käyttäen spesifisiä vasta-aineita.

Keskustelu

Monet tutkimukset ovat käyttäneet geeniekspressioprofilointi virtsarakon syöpään käyttäen mikrosiruja. Aiemmat tutkimukset, joissa analyysi geeniekspressioprofilointi ovat keskittyneet soluproliferaation, solusyklin säätelyssä, DNA: n replikaatio ja korjaus, apoptoosin, signaalitransduktion, transkriptiotekijät, angiogeneesi, soluadheesiota, haavan parantumisia, ja solun tukirangan. Esillä olevassa tutkimuksessa, ilmentymiskuviot useiden kasvaimeen liittyvien klassisen geenit (esim, VEGF, PGF, FGF18, AKT, E2F1, ATF5) sisällä microarray aineisto havaittiin, kuten on ennustettu. Hierarkkinen klusterointi analyysi ehdotti, että monet geenit voivat osallistua sääntelyn verkoissa, joissa useita biologisia järjestelmiä, joita tarvitaan virtsarakon syövän kehittymisen. Kuitenkin tiedetään vähän immunologista tai tulehduksellisten liittyvän sytokiinien mukana kehittämässä ihmisen virtsarakon syöpään.

tulosten perusteella nykyisestä microarray aineisto, olemme selvittäneet erot immuunivaste geeniekspressiomalleja normaalin ja MIBC. Kymmenen (10) geenejä (taulukko 2) oli säädelty perustuu niiden geeniekspressiomalleja vuonna MIBC, verrattuna normaaliin limakalvo näytteitä, mikä viittaa siihen, että nämä ylös geenien liittyvät läheisesti kehittämiseen virtsarakon syöpä. Ensimmäisessä vaiheessa tutkimuksen, näistä 10 geeneistä löysimme 3 suuri sytokiinien, IL-5, IL-20 ja IL-28A, jotka osallistuvat maahanmuutto, invaasio, ja MMP ilme vaikuttamatta solujen lisääntymistä, mikä osoittaa koordinoidun klusterin jotta etenemistä TCC määritettynä arpeutumisprosessit muuttoliike, invaasiomääritys, zymografian, proteiini tasoilla, ja EMSA toiminnan tason. Lisäksi meillä on myös tunnistettu, että MAPK ja Jak /Stat signalointi aktivoituvat virtsarakon syöpäsolujen käsittelyn jälkeen IL-5, IL-20 ja IL-28A.

IL-5 tunnistettiin alun perin T -solujen korvaa tekijä (TRF), ja sen jälkeen havaittiin säännellä aktivointi, leviämisen, ja selviytyminen eosinofiilien [33]. IL-5 on myös osoittautunut tärkeäksi säätimen erilaistumista hiiren B-solujen [34]. IL-5-reseptorin on heterodimeeri, joka koostuu α- ja β-alayksiköitä. Α-alayksikkö on ligandi-spesifinen (IL-5Rα), kun taas β-alayksikön (βc) on yhteinen IL-3 ja IL-5 [33], [34]. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että IL-5 aktivoidaan Lyn [35], Jak2 /STAT1 [36], MAPK [35], Syk [37], ja PI3K [38] eosinofiilien. Aktivointi Jak2, Btk tyrosiinikinaaseja, PI3K, Shc, Vav, ja HS1was liittyy IL-5-indusoi B-solujen [39]. IL-5 promoottori, joka sisältyy olennaisia ​​transkriptiotekijöitä, mukaan lukien SP1, E12 /E47, Oct-2, ja c /EBPβ B-soluissa ja eosinofiilit [40]. Käyttö rBCG rokotteiden hoitoon virtsarakkokarsinoomat ei tuottanut TH-2 tyypin sytokiinien, mukaan lukien IL-5 tasoa [41]. Esillä olevassa tutkimuksessa, sekä IL-5 ja IL-5Rα havaittiin RT-PCR: llä ja immunoblottaus virtsarakon syövän soluissa. Olemme myös tunnistaneet aktivoinnin ERK1 /2, p38MAPK, JNK, JAK1, JAK2, JAK3, STAT1, Stat2, ja Stat3 virtsarakon syövän soluissa. Havaintomme tässä kokeessa on sopusoinnussa tuore raportti osoittaa, että verenkierron tasot IL-4, IL-5 ja IL-10 oli merkittävästi korkeammat virtsarakkosyöpäpotilaan seerumissa kuin normaaleissa näytteissä [19]. Niinpä nousu IL-5 tasoa tässä tutkimuksessa voisi olla syynä lisätyn kehittämisestä virtsarakon kasvainsolujen ja niiden kyvyttömyys tunnistaa tulehduksellinen.

IL-20, pleiotrooppisten tulehduksellinen sytokiini, löytyy keratinocyte ja tunnistettu jäsen IL-10-perheen sytokiinit, joka sisältää IL-10, IL-29, IL-20, IL-22, IL-24 ja IL-26 [42], [43]. IL-20 stimuloi signaaleja 2 vaihtoehtoisten heterodimeerisiä komplekseja, jotka koostuvat joko IL-20R1 ja IL-20R2 tai IL-22R1 ja IL-20R2 [42], [43]. Tulokset tässä tutkimuksessa osoitti, IL-20 ja IL-20R1 virtsarakon syövän soluissa. Mitä signalointi, IL-20 indusoi Stat3 aktivaation keratinosyyteissä [42]. Aiempi raportti osoitti MAPK, kuten ERK1 /2, p38 MAPK, ja JNK, IL-20-käsiteltyjen HUVEC-solujen [44]. IL-20 hoito myös indusoi aktivoinnin Jak2 /Stat3 ja ERK1 /2 väylän GBM8901 glioblastoomasoluissa [45]. Tuloksemme virtsarakon syöpäsolujen osoittavat, että IL-20 indusoi aktivaation ERK1 /2 ja Jak1, Jak2, Jak3, STAT1, Stat2, ja Stat5: n. Lisäksi, IL-20 liittyy useita tulehdussairauksien [45], [20], mukaan lukien psoriasis, nivelreuma, munuaisten vajaatoiminta, aivovamma, ja ateroskleroosi.