Krooninen sairaus

tiivistelmä

tyroidihormonireseptorin (TR) välittää ratkaisevan vaikutuksia kilpirauhashormonin (T3) cellular kasvua, kehitystä ja erilaistumista. Vähentyneen ilmentämisen tai inaktivoimaan somaattiset mutaatiot TR on löydetty ihmisen syövissä, maksan, rinta-, keuhko-, ja kilpirauhasen. Mekanismit TR-liittyvän syövän synnyn eivät ole vielä selvillä. Luoda toiminnon TRp kilpirauhassyövän hoitoon solujen proliferaatiota, olemme rakentaneet rekombinantti adenovirusvektori, AdTRβ, joka ilmentää ihmisen TRβ1 cDNA. Kilpirauhassyöpä solulinjoja, joissa TRp proteiinin tasot olivat merkittävästi vähentynyt verrattuna ehjänä kilpirauhasen kudoksia infektoitiin AdTRβ ja toiminta TRp solun proliferaatio ja migraatio analysoitiin. Ligandisitoutuneena TRp aiheuttama HDAC1 ja HDAC3 irtaantuu, ja histoni asetylaatio liittyvät RhoB promoottori ja parannettu ilmaus RhoB mRNA ja proteiini. In AdTRβ-infektoituja soluja, T3 ja farnesyylitransferaasin estäjä (FTI) -käsittelyä indusoi jakelu RhoB solukalvon ja parantaa runsaasti aktiivisen GTP: hen sitoutuneen RhoB. Tämä RhoB proteiini johti p21-liittyvän solusyklin pysähtymisen G0 /G1 vaiheeseen, seuraava soluproliferaation inhibointi ja invaasiota. Kääntäen, alentavat solujen RhoB by Sirna pudotus in AdTRβ infektoimissa soluissa johti downregulation p21 ja estivät solusyklin pidätyksen. Kasvu BHP18-21v ksenograftien

vivo

merkittävästi inhiboi AdTRβ injektiolla FTIs-hoitoa, verrattuna kont- virus-ruiskutetaan kasvaimia. Tämä uusi signalointireitin laukaisi ligandisitoutuneena TRp tarjoaa tietoa mahdollisista mekanismeista leviämisen ja invaasion kilpirauhassyövän ja voi tarjota uusia terapeuttisia kohteita kilpirauhassyövän.

Citation: Ichijo S, Furuyan F, Shimura H, Hayashi Y, Takahashi K, Ohta K, et ai. (2014) aktivointi RhoB signalointireitin by tyroidihormonireseptorin β kilpirauhassyövän hoitoon soluissa. PLoS ONE 9 (12): e116252. doi: 10,1371 /journal.pone.0116252

Editor: Makoto Makishima, Nihon University School of Medicine, Japani

vastaanotettu: 12 elokuu 2014; Hyväksytty: 05 joulukuu 2014; Julkaistu: 30 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Ichijo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat JSPS KAKENHI (Grant Number 24591359). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kilpirauhasen hormonin (TR) ovat ligandista riippuvan transkriptiotekijöiden, jotka välittävät toimintamuotoihin kilpirauhashormonin (T3) solujen kehitystä, kasvua ja erilaistumista. Kaksi ihmisen TR geenejä, THRA ja THRB, jotka sijaitsevat eri kromosomeissa, koodata T3-sitova isoformit (TRα1, β1, β2 ja β3), jotka on ilmaistu kudos- ja kehityksen riippuvaisella tavalla [1]. Viimeisten vuosikymmenten aikana merkittävästi on edistytty ymmärtämisessä TR toimien ylläpitää normaalia solujen toimintaa. Kuitenkin roolit TR ihmisen syövässä ei ymmärretä hyvin. Alennettu ilmentyminen TR, koska hypermetylaation tai poistaminen TR geenien ihmisen syövissä viittaa siihen, että TR voi toimia tuumorisuppressoreilla [2]. Läheinen yhdistys somaattisten mutaatioiden TR kanssa kilpirauhassyövän edelleen tukee käsitystä, että menetys normaaliin toimintaan TR voi aiheuttaa hallitsemattoman kasvun ja menetys solujen erilaistumista [3].

Ymmärtääksemme toiminnalliset seuraukset ligandin -bound TRp vaikutukset muuhun signaalireaktioteissä kilpirauhasen syöpäsoluja, keskityimme RhoB joka on jäsen Ras superperheen isoprenylated pieniä GTPaaseja, jotka säätelevät aktiini stressiä kuituja ja rakkula liikenne [4]. Muut RhoGTPases, jotka sisältävät RhoA ja RhoC, edistää syövän synnyn, invaasio, ja etäpesäkkeiden [5]. Sen sijaan, RhoB on antiproliferatiivinen ja proapoptoottiset vaikutuksia syöpäsolujen ja yliekspressio RhoB voi estää solujen vaeltaminen, invaasio, ja etäpesäkkeiden [6]. Kalvo yhdistys RhoB proteiinin tapahtuu joko geranylgeranylated (RhoB-GG) tai farnesylated muutoksia. RhoB vastaa farnesyylitransferaasin estäjä (FTI) -käsittelyä vahvistuksella-of-function mekanismi, joka on tunnettu siitä, että nousu on RhoB-GG muodossa, joka estää proliferaatiota tai apoptoosin syöpäsoluissa [7]. Siten muuttunut ilmentyminen ja toiminta RhoB voi olla ratkaisevaa merkitystä syövän etenemisen ja terapeuttisen vaikutuksen.

Tässä tutkimuksessa selvitimme funktio ligandisitoutuneena TRp kilpirauhasen syöpäsoluja. Ligandisitoutuneena TRp aiheuttama RhoB proteiinin ilmentymistä, mikä johtaa lisääntyneeseen ilmentymistä p21 seuraa alentunut solujen lisääntymisen ja liikkuvuuteen. FTI-hoito tehostetun nämä antiproliferatiivista toiminnot ligandisitoutuneena TRp. Tuloksemme tunnistaa RhoB säätelyä tärkeänä askeleena kohdentaa kilpirauhassyöpä solujen lisääntymisen ja syövän etenemiseen. Tämä uusi signalointireitin laukaisi ligandisitoutuneena TRp tarjoaa tietoa mahdollisista leviämisen ja invaasion mekanismeja kilpirauhassyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

BHP18-21 soluja, joka raportoi Ohta

et al.

[8], toimitettiin lahjana Dr. Jerome Hershman, UCLA. BHP18-21v soluja, jotka ilmentävät Pax-8, mutta ei ilmaista joko tyroglobuliini tai kilpirauhasen transkriptiotekijä-1-geenin, eristettiin BHP18-21v soluihin [9]. FRO ja WRO soluja, jotka oli raportoitu lainaus [10], [11] oli ystävällisesti Dr. Shunichi Yamashita, University of Nagasaki. Nämä solulinjat eivät ole

de

novo

solulinjoja mutta on jo raportoitu [8], [10], [11] ja olivat ystävällisesti lahjaksi meidän yhteistyökumppaneita. Kaikki solut kasvatettiin RPMI 1640 -alustassa, jossa oli 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS), kosteutetussa inkubaattorissa 5% CO

2-ilmakehässä. DNA-profilointi syöpäsolulinjojen analysoitiin Promega Japan (Tokio, Japani) ja se on esitetty taulukossa 1. Kilpirauhasen hormonin, trijodityroniinin (T3) ja farnesyylitransferaasi-inhibiittorin (FTI), FTI-277, hankittiin Sigma Aldrich (St. . Louis, MO). Soluja inkuboitiin hartsilla-riisuttu (T

3-köyhdytettyä) FBS [12] ja infektoitiin sitten 30 MOI AdTRβ tai valvonnan AdLacZ. Soluja inkuboitiin väliaineessa tai ilman 30 nM T3 tai 5 uM FTI.

rakentaminen adenovirusyhdistelmävektoreita

AdTRβ on ΔE1-ΔE3 rekombinantti-adenoviruksen, joka ekspressoi ihmisen TRp geenin [13] valvonnassa on välitön varhainen promoottori (CMV). Rakentaminen AdTRβ virus on aiemmin kuvattu [13]. AdLacZ, joka sisältää CMV-promoottorin hallinnassa

lacZ

geeni, hankittiin Quantum Biotechnologies (Montreal, Kanada) ja sitä käytettiin kontrollina. AdTRβPV on rekombinantti adenovirusvektori, joka ilmentää ihmisen TRβPV, joka on dominantti negatiivinen mutantti TRp [14], valvonnassa sytomegaloviruksen välitön varhainen promoottori. FLAG-TRβPV plasmidi [15], käytettiin templaattina kloonaamiseksi

TRβPV

osaksi pShuttle2 (Clontech, Mountain View, CA) käyttäen polymeraasiketjureaktiota. PCR-alukkeet olivat: FLAG-Apal-5 ’(AAGGGCCCGCCGCCATGGACTACAAAGACGATGACGAC), ja TRβPV-3’ KpnI (AATGGTACCTTCAGTCTAATCCTCGAACACTTCC), jossa aaltoalleviivaus restriktiokohtia. Adenovirusvektori konstruoitiin sitten käyttämällä Adeno X ilmaiseminen System (Clontech) valmistajan protokollan. Rekombinanttiadenovirusten olivat Plakkipuhdistettua, kerättiin 48 h infektion jälkeen 293-solut, ja puhdistettiin kaksinkertaisella cesiumkloridigradientissa ultrasentrifugoimalla [16]. Virustiitterit määritettiin plakkikokeet viljellyillä 293-soluihin [16] ja adenovirus titraus (Clontech).

Plasmidi rakentaminen ja Lusiferaasimäärityksiä

RhoB reportteriplasmidilla -726 /+ 86 RhoB -Luc plasmidi ystävällisesti Dr. Dimitris Kardassis (Kreetan yliopiston Medical School) [17]. Ohimenevä Kotransfektioita tehtiin kolmena kappaleena. Renilla lusiferaasiplasmidin kotransfektoitiin normalisointia. Plasmidi transfektiot suoritettiin AdTRβ tai kontrolli viruksella infektoituja kilpirauhassyöpä soluihin käyttämällä Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Grand Island, NY). Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin tai ilman T3 vielä 24 tuntia. Dual lusiferaasi määritykset suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (Promega, Madison, WI).

ChIP määrityksessä

ChIP analyysit suoritettiin käyttämällä yksinkertaista ChIP entsymaattinen kromatiinin immunosaos- kit (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). AdTRβ-infektoidut solut (5 x 10

7), joita oli käsitelty tai ei T3 fiksoitiin 1% formaldehydiä, ja pilkotun kromatiinin immunosaostettiin anti-histoni 3 (positiivinen kontrolli), normaali kanin IgG: tä (negatiivinen kontrolli), anti- asetyyli histoni 3 (Lys 9), anti-histonideasetylaasi- (HDAC) 1 tai anti-HDAC3 vasta-aineita. Viisisataa ui laimennettua kromatiinin immunosaostettiin 5 ug kutakin vasta-ainetta ja proteiini G magneettiset helmet mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kvantitatiivinen reaaliaikainen (RT) -PCR tehtiin käyttämällä SYBR green reaaliaikainen PCR-kittiä (Life Technologies). Aluke sekvenssejä, joita käytetään RT-PCR olivat: eteenpäin 5′-GCAGCAGCAGCGCAGACT-3 ’ja reverse 5′-ACTCGGCCTAGCTCTCTC-3’.

Quantitative real-time-käänteiskopioijaentsyymi PCR

Kokonais-RNA uutetaan soluista käyttämällä RNeasy mini (Qiagen, Valencia, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kvantifioinnin jälkeen spektrofotometrisesti, 5 ug kokonais-RNA: ta käänteistranskriptio cDNA: n saamiseksi käyttämällä 160 uM deoksinukleotiditrifosfaattia, 50 ng satunnaisia ​​heksameerialukkeita ja 200 yksikköä SuperScript II mukaisesti valmistajan suositusten (Life Technologies). Taqman ihmisille RhoB, TRp, ja 18S rRNA hankittiin Life Technologies. mRNA-tasot määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR ovat aikaisemmin kuvanneet Furuyan

et al.

[18].

Western blot-analyysi

Tutkimus hyväksyi eettinen komitea yliopiston Yamanashi. Normaali kilpirauhasen kudoksia vastakkaisesta koru karsinoomien saatiin leikkauksen jälkeen potilaat antoivat kirjallisen tietoisen suostumuksen. Koskevista asiakirjoista tietoon perustuva suostumus, joka hyväksyi eettinen komitea, pidettiin yliopistollisen sairaalan säilytyskaappi. Normaali kudosta 4 potilaista oli yhdistettiin varten Western blotting kokeilu. Kudokset jäädytettiin nestetypessä heti resektio. Proteiini lysaatit normaalin kilpirauhasen kudosten ja syövän solulinjat valmistettiin käyttämällä soluhajotuspuskurin (Cell Signaling Technology) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kalvon proteiini puhdistettiin AdTRβ-tartunnan BHP18-21v soluissa käyttämällä membraaniproteiini puhdistuskittiä (GE Healthcare Life Science, Pittsburgh, PA) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Määritys proteiinin runsauden Western blot -analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu [19] käyttämällä seuraavia primaaristen vasta-aineiden (1:500 laimennos): anti-RhoB ja anti-fosforyloitu Rb (Cell Signaling Technology); anti PPARy, anti-p21, anti-tubuliinin, ja anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX). Negatiivinen kontrolli siRNA ja siRNA vastaan ​​RhoB ostettiin Dharmacon (Thermo Fisher, Leicestershire, UK). Western blot-analyysi siRNA-transfektoiduissa soluissa suoritettiin seuraavasti: Cancer solulinjoja (1,0-1,3 x 10

5), infektoitiin adenoviruksella (MOI 30) inkuboitiin T3: ssa 12 h ja sitten 50 nm: n siRNA transfektoitiin solut käyttämällä Lipofectamine 2000 (Life Technologies) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 48 tunnin kuluttua solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (Ca

2 + /Mg

2 + vapaa) ja analysoitiin kuten edellä on kuvattu.

immunosaostus analyysi

analysoida proteiinin ilmentymistä TRp soluissa, 500 ug proteiinia lysaatti kilpirauhaskudokseen, HepG2 tai virus-transfektoitujen kilpirauhassyöpä solulinjoja immunosaostettiin 5 ug C3 hiiren monoklonaalinen vasta-aine C-pää on TRp (Santa Cruz Biotechnology) tai 5 ug hiiren IgG kuten tekstissä käyttämällä Dynabeadsilla proteiini G immunosaostuksella kit (Life Technologies) mukaan valmistajan protokollaa. Western blot -analyysi suoritettiin käyttäen anti-TRp-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology) vastaan ​​N-terminaalinen TRp peptidi tai anti-TR a-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology) vastaan ​​N-terminaalinen TRa peptidi. Solun lysaatit AdTRβ-infektoidut solut immunosaostettiin Rhotekin RBD merkitty agaroosihelmiä ja runsaasti GTP: hen sitoutuneen RhoB analysoitiin pull-down-määrityksessä käyttämällä RhoB aktivaatiomääritys kit (Cell Biolabs, Inc. San Diego, CA).

Cell-syklin analyysi

solut värjättiin 20 ug /ml propidiumjodidia (Life Technologies) ja analysoitiin käyttäen BD Biosciences FACS Calibur virtaussytometrillä (Franklin Lakes, NJ) ja Cell Quest ohjelmistoversio 3.0. Prosenttiosuus solujen G

1, S tai G

2 /M vaiheessa laskettiin käyttäen ModFitLT versiota 3.1.

Solulisääntyminen ja invaasio määrityksissä

Numero solujen mitattiin käyttämällä ei-radioaktiivista soluproleferaatiomäärityksessä (Cell Counting Kit-8, Dojindo, Kumamoto, Japani), kuten aiemmin on kuvattu Furuya

et ai

[19]. Soluinvaasion mitattiin käyttäen Cytoselect Cell Invasion iinianalyysikitissä (Cell Biolabs, Inc.), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Soluviljelmän elatusainetta 10% FBS: ää käytettiin kemoattraktantti alempi hyvin kammion. Uudelleenhydratoinnin jälkeen tyvikalvon, kilpirauhasen syöpä solulinjoja istutettiin ylempään osastoon kammion seerumivapaassa väliaineessa (1 x 10

4 solua per kuoppa) T3 tai FTI-hoitoa. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 24 tuntia, ei-tunkeutuvat solut poistettiin ylemmältä pinnalta, ja solut, jotka olivat tunkeutuneet kalvon (8 um huokoskoko), saavuttaa alapinnan olivat värjättiin CyQuant GR loisteputki Dye. Niiden fluoresenssi analysoitiin 480 nm: ssä käyttäen fluoresenssilevylukijaa.

vierassiirrännäisiä BHP18-21v solujen ja vektorin injektiota

BHP18-21v soluja (1 x 10

7) istutettiin vatsan ihonalainen kudos 8-viikon ikäisiä urospuolisia nude-hiirten (BALB /C

nu /nu

). Kolme viikkoa myöhemmin, kun kasvaimet olivat saavuttaneet noin 1 cm halkaisijaltaan, hiiret satunnaistettiin kokeellinen tai kontrolliryhmään (6 hiirtä ryhmää kohti). Viisi x 10

8 plakkia muodostavaa yksikköä AdTRβ tai AdLacZ 100 ul: ssa PBS: ää injektoitiin kasvaimia. Adenovirus anto toistettiin 7 päivän välein. Kullakin ajanhetkellä, kaikki hiiret olivat myös intraperitoneaalisesti 100 mg /kg /kehon painoa FTI-277. Päivänä 30 hiiret tapettiin CO

2 hengitettynä. Kasvaimia, jotka olivat hiiristä poistettiin kiinnitettiin 10% puskuroituun formaliiniin ja upotettiin parafiiniin. Leikkeitä permeabilisoitiin 0,2% Triton X-100 PBS: ssa 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Seerumin vapaan T3 ja TSH-tasot määritettiin käyttämällä vapaan T3 ELISA Kit (Phoenix Pharmaceuticals, Inc., CA) ja TSH määritys kit (Uscn Life Science Inc, Wuhan, Kiina), vastaavasti, mukaan valmistajan ohjeiden. Institutionaalisten bioturvallisuuteen komitea yliopiston Yamanashin hyväksyi eläinkokeiden ja yhdistelmä-DNA.

Tilastot

Tulokset ilmoitetaan keskiarvoina ± S.D. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysi tai parittoman 2-tailed Opiskelijan

t

-testi, ja todennäköisyys-arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

tutkia TRp funktion kilpirauhassyöpä soluproliferaatioon, olemme keskittyneet analyysiin RhoB, joka on tavoite TRp ja ilmentyy hyvin vähäisinä määrinä 130 ihmisen syövän solulinjoissa [20]. Tähän tutkimukseen, käytimme 3 kilpirauhassyöpä solulinjoissa, BHP18-21v, FRO ja WRO, jotka infektoitiin 30 MOI AdTRβ tai AdLacZ. Ensin analysoidaan TRp proteiinin ilmentyminen näissä soluissa. Viisisataa ug kokosolulysaatissa proteiini immunosaostettiin monoklonaalisella vasta-aineella, joka tunnistaa TR C-terminaalin alueella, jonka jälkeen Western blot -analyysi, jossa vasta-aine on N-terminaalinen TRp peptidi. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, TRp ilmentyminen havaittiin selvästi positiivisesta kontrollista; ehjä kilpirauhaskudokseen (kaista 1) ja HepG2-soluihin, jotka ilmentävät funktionaalista TR [21] (kaista 2), ja myös AdTRβ-tartunnan BHP18-21v, FRO ja WRO solujen (kaistat 6-8). Ei TRp proteiinin ilmentyminen havaittiin AdLacz-tartunnan BHP18-21v, FRO tai WRO soluissa (kaistat 3-5) tai HepG2-soluissa, jotka oli immunosaostettiin hiiren monoklonaalisen IgG-vasta-ainetta negatiivisena kontrollina (kaista 9). Tubuliinin ilmentyminen proteiinin lysaattia (10 ug) analysoitiin myös latauskontrollina (Fig. 1 B). Analysoimme myös TRa ilmentymistä näissä solulysaateista Western blot analyysi immunosaostettiin proteiinien vastaisen vasta-aineen N-terminaalisen TRa peptidi. TR a ilmentyminen havaittiin positiiviset kontrollit; kilpirauhaskudokseen ja HepG2 (kaistat 1 ja 2, vastaavasti). Ei TR a-proteiinin ilmentymistä havaittiin BHP18-21v, FRO tai WRO soluja, jotka infektoitiin AdLacZ (kaistat 3-5) tai AdTRβ (kaistat 6-8). Down-säätely PPAR ilmaisun ja sen toiminta pidetään yksi mekanismi kilpirauhasen syövän synnyn [22]. Siksi analysoitiin myös proteiinin ilmentymistä PPAR vuonna BHP18-21v, FRO tai WRO soluja (Fig. 1 C). PPARy ilmentyminen aleni näissä syöpäsoluissa verrattuna ehjä kilpirauhaskudoksen mutta infektio AdTRβ ei ollut vaikutusta ilmaisun PPARy kilpirauhasen syöpäsoluja. Nämä tiedot osoittavat, että kolmen AdTRβ tai AdLacZ tartunnan testatut solulinjat ovat hyvä malli analyysi TRp toiminnon.

. Western blot solulysaattien (500 ug) on ​​valmistettu normaalista kilpirauhaskudokseen, positiivisista kontrolli HepG2-soluissa, tai kilpirauhasen syöpä solulinjoja BHP18-21v, FRO ja WRO jotka infektoitiin AdTRβ tai kontrolloida AdLacZ virus. Lysaatit immunosaostettiin (IP) ja 5 ug hiiren monoklonaalista anti-TRp-vasta-aine (C3), joka tunnistaa TRp C-päähän, tai 5 ug: lla normaalia hiiren IgG: tä (IgG), kuten on ilmoitettu. Blotit vastaisella vasta-aineella N-terminaalinen TRp peptidi (TRp) tai vasta-aine on N-terminaalinen TRa peptidi (TR a). B. Tubulin ilmentyminen kokosoluliuotteissa käytettiin latauskontrollina. C. Western blotting-analyysi ilmentymistason PPARy-proteiinin (ylempi paneeli) solu-uutteissa (20 ug proteiinia lysaattia). Tubuliinia myös blotattiin latauskontrollina (alapaneeli).

vieressä analysoitiin vaikutusta T3 hoidon AdTRβ- tai AdLacZ-tartunnan kilpirauhassyöpä solulinjoissa on RhoB ilmentymistä (Fig. 2A-C ). T3-hoitoa (30 nM) AdTRβ-tartunnan (kaistat 1-4), mutta ei AdLacZ-tartunnan (kaistat 5-7) BHP18-21v, FRO ja WRO soluja 6, 12 tai 24 h merkittävästi parannettu ilmaus RhoB mRNA: n ajan riippuvalla tavalla verrattuna ei-käsitellyn non-viruksen infektoimien solujen. Lisäksi Western blotting-analyysi osoitti, että T3-hoitoa 12 tai 24 h indusoidun RhoB proteiinin ilmentymistä AdTRβ-tartunnan BHP18-21v, FRO ja WRO soluissa, mutta ei AdLacZ-infektoituneissa soluissa (kuvio. 2D-F, kaistat 2-4 ja kaistat 5-7 vastaavasti). Näin ollen, induktio RhoB mRNA: ta ja proteiinin ilmentyminen on T3 /AdTRβ riippuvaista kilpirauhassyöpä solulinjoissa.

Expression tasot RhoB mRNA (A-C) tai proteiini (D-F) AdTRβ-tartunnan, ohjaus AdLacZ-tartunnan, tai ei-tartunnan kilpirauhassyöpä solulinjoja altistettiin 30 nM T3 0, 6, 12 tai 24 h kuten on osoitettu. (A-C): n ekspressio RhoB ja 18S-mRNA määritettiin käyttäen reaaliaikaisen RT-PCR: llä 100 ng cDNA: ta. Suhteellinen mRNA: n ilmentymisen tasot määritettiin mielivaltaisesti asettamalla arvo ohjaus virus-infektoiduista soluista inkuboitiin T3-väliaineessa 1. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± S.D. (

n

= 6). *,

p

0,05. (D-F) Western blot-analyysi 20 ug proteiinia solujen lysaatteja suoritettiin käyttäen vasta-aineita RhoB (ylempi paneeli) tai tubuliinin (alempi paneeli), jota käytettiin latauskontrollina.

selventämiseksi mekanismeista, joiden avulla ligandisitoutuneena TRp tehostettu ilmentyminen RhoB in AdTRβ-tartunnan BHP18-21v, FRO ja WRO soluja, analysoitiin vaikutus T3 hoidon näistä solulinjoista on transkriptionaalista aktiivisuutta RhoB promoottorin. AdTRβ- tai valvontaa AdLacZ-infektoidut solut siis ohimenevästi transfektoitu RhoB promoottori-lusiferaasireportteri- konstrukti, -726 /+ 86 RhoB-Luc. Lusiferaasiaktiivisuus ohjaa RhoB promoottori tehostui merkittävästi in AdTRβ-infektoiduissa soluissa, mutta ei AdLacZ-infektoiduissa soluissa seuraavat T3-hoidon (Fig. 3A-C).

(A-C) RhoB promoottori-lusiferaasi reportteri määrityksiä. Adenovirus-tartunnan BHP18-211v (A), FRO (B), tai WRO (C) solut transfektoitiin 1 ug RhoB promoottori-lusiferaasireportteriplasmidi ja inkuboitiin vielä 24 h, poissa tai läsnä ollessa 30 nM T3. Suhteellinen promoottorin toiminta (Lusiferaasiaktiivisuus) määritettiin mielivaltaisesti asettamalla arvo ohjaus virus-infektoiduista soluista inkuboitiin T3-väliaineessa 1. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± S.D. (

n

= 6). *,

p

0,05. (D-F) ChIP määritys käyttäen AdTRβ-tartunnan BHP18-211v (D), FRO (E), tai WRO (F) käsiteltyjä soluja tai ilman 30 nM T3. Vasta-aineita, jotka tunnistavat histone3 (H3), asetyloitu H3, HDAC1, HDAC3 tai kaniinin normaalilla IgG: tä käytettiin immunosaostus kromatiinin. Syöttö osoittaa, 10%: n kromatiinin. PCR-tuotteet erotettiin 2%: isessa agaroosigeelissä.

transkriptio RhoB promoottorin estyy transkriptiorepresso- rekrytoivat histonideasetylaaseja (HDAC: t) poistamiseksi asetylointi lysiinitähteiden on histones3 (H3) hännät [23]. Se on vakiintunut, että asetylaatio tilan hännän domeenit histones3 (H3) muutos aikana transkription aktivoinnin RhoB promoottori [24]. Sen määrittämiseksi, onko induktion RhoB geenin ilmentymisen ligandisitoutuneena TRp korreloi muutoksiin asetylointi tilan H3 promoottorialueen RhoB geenin, kromatiinin immunosaostus (ChIP) määritykset suoritettiin. AdTRβ-tartunnan BHP18-21v, FRO tai WRO soluja inkuboitiin kanssa tai ilman T3: ssa 24 tuntia ja ChIP analyysit suoritettiin käyttäen vasta-aineita H3, asetyloitu H3, HDAC1 ja HDAC3. Kuten on esitetty kuviossa. 3D-F, H3 löydettiin fragmentit RhoB promoottori (kaista 3) in AdTRβ-tartunnan saaneiden solujen kanssa tai ilman T3-hoitoa. Kuitenkin HDAC1 ja HDAC3 liittyi fragmentteja RhoB promoottorin vain silloin, kun soluja inkuboitiin ilman T3, eikä silloin, kun soluja inkuboitiin T3 (HDAC1 /3, kaistat 5 ja 6, vastaavasti). Yhdenmukaisia ​​näiden tulosten kanssa ei ole asetyloitu H3 liittyi promoottorin ilman T3 käsittelyyn, ja että läsnä on T3, H3, joka on liittynyt promoottori on erittäin asetyloitiin (kaista 4). Nämä tulokset osoittivat, että ligandi-sidottu TRp indusoiman RhoB transkription kautta muuttaminen histoni asetylaatio tilan kilpirauhasen syöpäsoluja.

vieressä analysoitiin vaikutusta ligandisitoutuneena TRp matkapuhelinverkon sijaintia ja toimintaa RhoB. Tätä varten käytimme agentti FTI. FTI hoito solujen indusoi kalvon yhdistys RhoB muuttamalla RhoB lisäämällä lipidiosia [4]. Kalvo yhdistys RhoB on tärkeä sen toimintaan. Ensin määritetään vaikutus 5 uM FTI hoidon RhoB proteiinin ilmentymistä AdTRβ-tartunnan BHP18-21v soluissa, joita oli käsitelty tai ei T3 (30 nM). Western blotting kokosolulysaateista käsitellyn /käsittelemättömien AdTRβ-tartunnan BHP18-21v solujen RhoB vasta-aineella (Fig. 4A) osoitti, että FTI-hoito ei muuttanut T3 induktio RhoB ilmentymisen (kaistat 2 ja 4) ja ei tehostanut RhoB proteiinin ekspressio AdTRβ-tartunnan BHP18-21v solujen puuttuessa T3-hoidon (kaista 3).

AdTRβ-tartunnan BHP18-211v solut altistettiin to30 nM T3 ja /tai 5 uM farnesyylitransferaasin estäjä ( FTI) 24 tuntia ja analysoitiin sitten seuraavasti. A. Western blotting-analyysi ilmentymisen tason RhoB proteiinin (yläpaneeli) solu-uutteissa (20 ug proteiinia lysaattia). Tubuliinia myös blotattiin latauskontrollina (alapaneeli). B. Solulysaatit immunosaostettiin Rhotekin RBD-tagged -agaroosihelmien. GTP: hen sitoutuneen RhoB in sakat analysoitiin Western blottauksella käyttäen vasta-ainetta vastaan ​​RhoB. C. Western blotting-analyysi RhoB proteiinin kalvon proteiinin osa. GAPDH blotattiin membraaniproteiinina merkki latauskontrollina (alapaneeli).

Sitten analysoimme vaikutusta T3 hoidon kanssa /ilman FTI co-hoidon RhoB toimintaa. Kuten muutkin pienet GTPaasit, RhoB säätelee molekyylitason tapahtumia pyöräilyä väliin inaktiivisessa GDP-sitoutunutta ja aktiivista GTP-sitoutunut muoto. Aktiivisen GTP-sitoutunut muoto, RhoB sitoutuu spesifisesti Rho-sitovan domeenin (RBD) ja Rhotekin säännellä alavirran signalointia porrastetusti. Siksi analysoitiin runsaasti GTP-sitoutuneen RhoB solulysaateista ja AdTRβ-tartunnan BHP18-21v soluissa, joita oli käsitelty tai ei T3 ja /tai FTI immunosaostuksella solulysaateista, joissa Rhotekin RBD-leimatun agaroosihelmiin ja sen jälkeen immunoblottauksella, ja RhoB ( kuva 4B). Nämä avattavasta analyysit osoittivat, että ei ainoastaan ​​runsaasti RhoB mutta myös runsaasti aktiivisen GTP-sitoutunut muoto RhoB in AdTRβ-tartunnan BHP18-21v soluissa tehostettiin T3-hoito (kaista 2) ja voimakkaasti tehostaa FTI ja T3 co-käsittelyä (kaista 4). Ei GTP-sitoutunut RhoB havaittiin FTI käsiteltyjä soluja ilman T3-hoitoa (kaista 3). Nämä tulokset osoittivat, että ligandisitoutuneena AdTRβ aiheuttama RhoB proteiinin BHP18-21v soluissa oli aktiivinen kinaasi, jonka toiminta tehostui yhtäaikainen käsittely FTI.

Voit selvittää, T3 ja FTI voisi aiheuttaa kalvo yhdistys RhoB in AdTRβ-tartunnan BHP18-21v solut, solun pinnan proteiinit biotinyloitiin. Biotinyloitu proteiinit solulysaateista sitten vedetään alas streptavidiinilla helmiä ja analysoitiin immunoblottauksella anti-RhoB vasta-aineella (Fig. 4C). T3-hoito indusoi ilmentymisen RhoB on solukalvon (kaista 2), joka parantaa suuresti yhtäaikainen käsittely FTI (kaista 4). FTI-hoito ei lisätä RhoB proteiinin ilmentymisen solun kalvo AdTRβ-tartunnan BHP18-21v solujen puuttuessa T3-hoidon (kaista 3). Nämä tulokset osoittivat, että T3 aiheuttama kalvon yhdistys RhoB joka tehostettiin FTI co-hoitoa tai olivat T3 induktion RhoB aktiivisuuden AdTRβ-tartunnan BHP18-21v soluissa.

sykliineistä riippuvaiset kinaasit (CDK ) estäjä, p21, on negatiivinen säätelijä solusyklin etenemisen ja on yksi alavirran tavoitteet RhoB. Vahvista aktiivisuuden RhoB in AdTRβ-tartunnan BHP18-21v käsiteltyjen solujen T3 ja /tai FTI, olemme analysoineet proteiinin ilmentymistä p21 Western blot -analyysillä (kuvio. 5A-C). p21 ilmentymistä analysoitiin soluissa, jotka oli transfektoitu RhoB kohdistettujen tai ohjaus siRNA vahvistaa RhoB riippuvuus p21changes. Kolme kilpirauhassyöpä soluja esi-viljeltiin T3-väliaineessa riisuttu seerumia, kuten kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät”. FTI-hoito ei lisätä p21-proteiinin ilmentymistä siRNA-ohjaus AdTRβ-infektoituja soluja ilman T3-hoitoa (kaista 2). In AdTRβ infektoimissa soluissa, ilmentymisen taso p21 lisättiin käsitellyissä soluissa T3 (kaista 3), ja suuresti parantaa yhtäaikainen käsittely FTI (kaista 4) verrattuna ei-käsitellyissä soluissa (kaista 1). Kuitenkin p21 ei indusoitunut T3 ja ICE hoitoon AdTRβ-infektoitujen solujen 24 h transfektion jälkeen RhoB kohdistetun siRNA (kaista 5). p21 estää toiminnan CDK, mikä hypo-fosforylaatioon retinoblastoomaproteiinia (Rb), joka puolestaan ​​aiheuttaa solusyklin pysähtyminen G0 /G1 vaiheessa [25]. Analysoimme fosforylaatio Rb (p-Rb) in AdTRβ-tartunnan kilpirauhassyöpä käsiteltyjen solujen T3 ja /tai FTI [(Fig. 5 (A-C)). Rb fosforyloitiin AdTRβ-tartunnan BHP18-21v, FRO tai WRO solujen kanssa tai ilman T3-hoitoa (kaistat 1 ja 3). FTI-hoito yksinään ei estänyt fosforylaatiota Rb AdTRβ-infektoiduissa soluissa (kaista 2). Rb fosforylaatio oli merkittävästi vähentynyt AdTRβ-tartunnan saaneiden solujen samanaikainen hoito T3 ja FTI (kaista 4). Toisaalta, esto Rb-fosforylaation ei havaittu T3 ja ICE hoitoon AdTRβ-infektoitujen solujen transfektion jälkeen RhoB kohdistetun siRNA (kaista 5).

(A-C) Western blot analyysi ilmentymistaso p21 tai fosforyloidun Rb-proteiinin AdTRβ-tartunnan BHP18-21v (A), FRO (B), tai WRO (C) solut, jotka altistettiin 30 nM T3 yksin 12 h tai 30 nM T3 plus 5 uM FTI 12 tuntia, tai ilman siRNA knockdovvn RhoB kuten. Tubuliinia blotattiin latauskontrollina (alhaalla paneelit). (D-F) prosenttiosuus solujen G

0 /G

1, S tai G

2 /M vaiheessa laskettiin käyttäen ModFitLT versiota 3.1. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± S.D. (

n

= 6). *,

p

0,05.

lisäksi tutkineet solusyklin vaiheissa näiden solujen virtaussytometriaa käyttämällä (Kuva. 5D-F). Si-ohjaus AdTRβ-infektoiduista soluista, hoito T3 ja FTI indusoi merkittävää kasvua G0 /G1 vaiheeseen väestön verrattuna ei-käsitellyn tai T3-käsitellyt solut, kun taas RhoB kohdistetuissa siRNA-transfektoiduissa soluissa, T3 + FTI hoito oli mitään vaikutusta solupopulaation G0 /G1 vaiheeseen. Lisäksi hoito T3 ja FTI vähensi solujen G2 /M-vaiheeseen SI-ohjaus-, mutta ei RhoB kohdistettuja siRNA-AdTRβ-infektoiduissa soluissa. Nämä tulokset osoittavat, että tehostettu RhoB ilmentymistä AdTRβ-tartunnan syöpäsolut käsiteltiin T3 ja FTI, liittyi lisääntynyt ilmentyminen p21 ja eston solusyklin etenemisen.

Sen varmistamiseksi, että havaitut muutokset p21 ilmaus heijastuu muutoksia solujen lisääntymisen, me seuraavaksi analysoidaan vaikutuksia TRp syövän solujen lisääntymistä käyttämällä MTT-määritystä. Tässä määrityksessä BHP18-21v, FRO tai WRO solut infektoitiin 30 MOI AdTRβ ja, sen jälkeen 12 h inkuboinnin adenoviruksen sisältävässä väliaineessa, viljeltiin soluja tai ilman T3 (30 nM) ja 5 uM FTI varten 24 tai 72 h. Sen jälkeen, kun 24 ja 72 tunnin inkuboinnin solujen määrä oli lisääntynyt ilman T3-hoitoa, mutta aleni, kun läsnä on T3, ja se oli merkittävästi vähentynyt, kun läsnä on T3 ja FTI (Fig. 6A-C).

(A-C) Soluproliferaatiomääritys. BHP18-21v (A), FRO (B) tai WRO (C) Soluja inkuboitiin T3-köyhdytettyä väliaineessa 24 tuntia ja infektoitiin sitten 30 MOI AdTRβ. Sitten soluja inkuboitiin alustassa, jossa T3 ja /tai FTI vielä 24 tai 72 h. Suhteellinen solujen lukumäärät määritettiin mielivaltaisesti asettamalla arvo ohjaus viljelmiä inkuboitiin T3-väliaineessa 1. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± S.D. (

n

= 6). *,

p

0,05. Kuten on esitetty kuviossa. *,

p

0,05. *,

p

0,05.