Krooninen sairaus

tiivistelmä

Survival niiden potilaiden haimasyöpä ovat erittäin huono johtuen sen oireeton eteneminen kehittynyt ja etäpesäkkeitä, joille nykyinen hoitoja edelleen suurelta osin tehoton. Siksi uusia terapeuttisia aineita ja hoitomuodot halutaan parantaa kliinisen tuloksen. Tässä tutkimuksessa määritimme vaikutuksia honokiol, biologisesti aktiivinen ainesosa itämaisen lääkeyrtti

Magnolia officinalis /grandiflora

, kahdella haimasyövän solulinjoissa, MiaPaca ja Panc1, yksin ja yhdessä standardin kemoterapeuttisen lääkeaineen gemsitabiini. Honokiol aiheutti kasvua estäviä vaikutuksia sekä haimasyövän solulinjoissa aiheuttamalla solukierron pysähtymisen G

1 vaihe ja apoptoosin induktion. Molekyylitasolla, honokiol merkittävästi vähensi Sykliini (D1 ja E) ja sykliiniriippuvaisten kinaasien (Cdk2- ja Cdk4), ja aiheutti kasvu Cdk inhibiittorit, p21 ja p27. Lisäksi honokiol hoito johti lisäämisen Bax /Bcl-2: n ja Bax /Bcl-x L-suhteet suosia apoptoosin haiman syöpäsoluja. Näiden muutosten mukana tehostettu sytoplasmisen kerääntymisen NF-KB kanssa samanaikainen väheneminen tumafraktios- ja vähentää transkription aktiivisuutta NF-KB: n reagoiva promoottori. Tämä liittyi vähentynyt fosforylaatio estäjä kappa B: alfa (IKB-α), mikä aiheuttaa sen vakauttamista ja siten lisääntynyt solun tasolla. Tärkeää on, honokiol myös voimisti sytotoksisia vaikutuksia gemsitabiinin, osittain rajoittamalla gemsitabiinin aiheuttama tumakertymään NF-KB: n käsitellyssä haimasyövän solulinjoissa. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot osoittavat, että ensimmäistä kertaa, kasvua estäviä vaikutuksia honokiol haimasyövän ja osoittaa sen mahdollisuuksia käyttökelpoisuus uutena luonnollinen agentti ehkäisyssä ja hoidossa.

Citation: Arora S, Bhardwaj A, Srivastava SK, Singh S, McClellan S, Wang B, et ai. (2011) Honokiol Pidätykset Cell Cycle, indusoi apoptoosia, ja Voimistaa gemsitabiinin sytotoksinen vaikutus Human haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 6 (6): e21573. doi: 10,1371 /journal.pone.0021573

Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 11, 2011; Hyväksytty: 2 kesäkuu 2011; Julkaistu: 24 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Arora et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat apurahan tuella National Institutes of Health /National Cancer Institute (NIH /NCI) (CA137513) ja USAMCI. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on yksi tappavan pahanlaatuisten Yhdysvalloissa kuolleisuus kasvaa joka tulevana vuonna [1], [2]. Arvion mukaan American Cancer Society, 43140 amerikkalaiset haimasyöpä vuonna 2010 ja 36800 kuoli, merkintä tämä maligniteetti neljänneksi yleisin kuolinsyy syöpään [2]. Koska sen oireeton etenemistä, haimasyövän diagnosoidaan vaiheessa, jolloin se on jo metastasoinut tai on paikallisesti edennyt [3]. Hoitomenetelmiä vastaan ​​taudin pitkälle edenneen ovat pitkälti epäonnistuneet ja noin 80% potilaista on diagnosoitu tämän pahanlaatuisen vielä kuolee 2-8 kuukautta [4]. Gemsitabiini standardi FDA hyväksytty lääke haimasyövän hoidossa, on raportoitu olevan minimaalisen tehokasta, joka parantaa potilaan selviytymistä pari viikkoa vain [3], [5]. Siksi on äärimmäisen tärkeää kehittää vaihtoehtoisia hoito-ja strategioiden tehokasta hallintaa haimasyövän.

Useita uusia strategioita, joiden kohteena kasvua edistäviä reittejä yksin ja yhdessä gemsitabiinin, on testattu haimasyövän ja parantaa hoitotulokseen [6]. Lisäksi, useat viimeaikaiset tutkimukset ovat tunnistaneet vapautettu signalointia elementit, kuten Ras, Akt, NF-KB, miRNA, jne., Joka ei ainoastaan ​​edistää syövän etenemisessä vaan myös antaa chemoresistance haimasyövän [7] – [9]. Induktio Näiden eloonjäämisreittejä tulokset aktivoimalla geenimutaatioita, menetys estävä reittejä ja /tai voimistumista kautta autokriinisiä ja paracrine signalointimekanismeja [3], [10]. Itse asiassa nyt on osoitettu, että kohdistaminen joidenkin näiden signaloinnin solmut voivat olla hyödyllisiä tuumorin kasvun estämisessä ja etenemiseen sekä palauttamaan herkkyyden kasvainsolujen sytotoksisille lääkkeille [3], [9], [10] .

Luontaistuotteet ovat olleet ytimessä syövän kemoterapiaa aiemmin useita vuosikymmeniä ja itse asiassa yli 60% nykyisestä syöpälääkkeitä ovat alkuperänsä luonnollisista lähteistä [11]. Useissa viimeaikaisissa tutkimuksissa, romaani kasviperäinen yhdisteitä on tunnistettu toimia syöpälääkkeitä mukauttamisella biologisten reittien [12]. Honokiol, biologisesti aktiivista biphenolic yhdiste eristettiin

Magnolia officinalis /grandiflora,

on saanut paljon huomiota, koska sen voimakas anti-neoplastisia ja antiangiogeenisiä ominaisuuksia [13], [14]. Se on tuottanut lupaavia tiedot vastaan ​​iho, paksusuoli-, keuhko- ja rintasyöpiä [13], [15] – [17]. Silmiinpistävä piirre honokiol anti-neoplastisia lääke on sen kyky estää tumatekijä kappa B (NF-KB), joka liittyy syövän solujen eloonjäämistä ja chemoresistance [9], [10], [18]. NF-KB-konstitutiivisesti aktivoitu erilaisia ​​hematologisia ja kiinteitä pahanlaatuisia kasvaimia, mukaan lukien haimasyövän ja ohjaa ilmentymistä joukko geenejä, jotka osallistuvat solujen proliferaation ja eloonjäämisen suoraan ja välillisesti mekanismien [18] – [20]. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet, ensimmäistä kertaa, vaikutukset honokiol vastaan ​​haimasyöpä. Meidän tiedot osoittavat, että honokiol estää niiden kasvun ihmisen haimasyövän solulinjoissa, MiaPaca ja Panc1, aiheuttamalla solukierron pysähtymisen ja apoptoosin induktion. Lisäksi meidän tutkimus antaa näyttöä roolin honokiol vuonna Kemoherkistävien haiman syöpäsoluja sytotoksisille vaikutuksia gemsitabiinin.

Tulokset

kasvua estävä vaikutus honokiol ihmisen haimasyövän soluja

Kaksi ihmisen haimasyövän solulinjoissa eli. MiaPaca ja Panc1 käytettiin mallina järjestelmän vaikutuksen tutkimiseksi honokiol haiman syöpäsolujen kasvua. Solut käsiteltiin honokiol (10-60 uM) osoittivat muutoksia morfologia verrattuna ajoneuvo (DMSO) hoidetun soluja. Yhä pitoisuus honokiol, solujen tuli pyöreä, kutistunut ja irrottaa kasvualusta (kuvio 1A), mikä on yhdenmukaista morfologiset muutokset liittyvät apoptoosin. Sen jälkeen, olemme määrällisesti sytotoksisia vaikutuksia honokiol mittaamalla prosenttia elinkelpoisuus käyttämällä WST-1-määritystä. Tuloksemme osoittivat, että honokiol indusoi annoksesta ja aikaa alentavan kasvun sekä haimasyövän solulinjoissa IC

50-arvot ~43.25, 31,08 ja 18,54 uM (vastaan ​​MiaPaca), ja ~47.44, 34.17 ja 21,86 uM (vastaan ​​Panc1) 24, 48 ja 72 h hoitoja, vastaavasti (kuvio 1 B). Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että honokiol on kasvua estäviä vaikutuksia haiman syöpäsoluja.

(A) MiaPaca ja Panc1 solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle (1 x 10

5 solua /kuoppa) ja annettiin saavuttaa 70-80% konfluenssiin ennen honokiol (10-60 uM) hoitoa 48 tuntia. Käsittelyn jälkeen merkittäviä muutoksia solun morfologiassa havaittiin sekä solutyyppien osalta tutkitaan faasikontrastimikroskoopin. Solut tuli pyöreä, kutistunut ja irrallaan solun pinnalla annosriippuvaisesti. Edustaja mikroskooppivalokuvat ovat yksi satunnainen näkökentät (suurennos 200X) käsiteltyjen solujen 20, 40 tai 60 uM honokiol. (B) MiaPaca ja Panc1 soluja kasvatettiin 96-kuoppaisilla mikrotiitterilevyillä (1 x 10

4 solua /kuoppa) ja käsiteltiin honokiol (10-60 uM) 70-80% konfluenssiin. Prosenttia Solujen elinkelpoisuus mitattiin WST-1-määritys 24, 48 ja 72 tuntia. OD-arvo kontrollisoluja (käsitelty yhtä suuri tilavuus DMSO: ta, lopulliseen pitoisuuteen, 0,1%), otettiin 100% elinkelpoisuuden. Honokiol inhiboi solujen elävyys annoksesta ja aikaa riippuvalla tavalla sekä solutyypeissä viittaa kasvainten vastaisen vaikutuksen honokiol. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD; (N = 3).

Honokiol aiheuttaa G

1 vaihe solukierron pysähtymisen ja indusoi apoptoosia haimasyöpäsoluissa

vastustamisesta syöpäsolun kasvua voi johtua joko pidätetty solusyklin etenemisen tai johtuen apoptoosin induktioon tai molemmat [12]. Tuloksemme solusyklin jakautuminen osoitti, että hoito honokiol johti rikastumista haimasyövän soluja G

1 vaihe, jossa on samanaikainen väheneminen solujen määrä S-vaiheessa (proliferatiivinen jae) (kuva 2). Havaitsimme ~1.28, 2,16 ja 2,46 taitoksia (in MiaPaca) ja ~1.08, 1,53 ja 1,93 taitoksia (in Panc1) väheneminen solujen määrä S-vaiheessa 20, 40 ja 60 uM annoksia honokiol, vastaavasti (kuvio 2 ). Apoptoosin määrityksiä, meidän tiedot osoittivat huomattavaa kasvua apoptoottisten indeksi (PE anneksiini V, positiivinen /7AAD-negatiiviset solut) annoksesta riippuvalla tavalla 24 h honokiol hoitoon (kuvio 3). 20, 40 ja 60 uM pitoisuuksina honokiol, havaitsimme ~1.25, 2,04 ja 3,96 taittuu kasvaa apoptoottisen indeksit MiaPaca ja ~1.34, 1,98 ja 3,32 taittuu kasvaa apoptoottisen indeksit Panc1 soluja, vastaavasti. Kaikkiaan meidän havainnot osoittavat, että honokiol on sekä sytostaattinen ja sytotoksisia ominaisuuksia vastaan ​​haiman syöpäsoluja.

MiaPaca ja Panc1cells (1 x 10

6 solua /kuoppa) synkronoitu viljelemällä seerumivapaassa 72 tuntia ja sen jälkeen inkuboimalla seerumia sisältävässä väliaineessa 24 tunnin ajan ja sen jälkeen käsittelemällä joko honokiol (20, 40 tai 60 uM) tai DMSO (kontrolli) 24 tunnin ajan. Solujen jakauma eri vaiheissa solusyklin analysoitiin propidiumjodidi (PI) värjäyksessä, mitä seurasi virtaussytometria. Tehostettu kertyminen MiaPaca ja Panc1 solujen G

1 vaiheen solusyklin havaittiin hoidon jälkeen honokiol annoksesta riippuvaisella tavalla (kuten on esitetty virtauksen histogrammit), jossa on samanaikainen väheneminen S-vaiheessa olevien solujen.

MiaPaca ja Panc1 soluja kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä (1 x 10

6 solua /kuoppa) ja sen annettiin saavuttaa 70-80% konfluenssiin. Soluja käsiteltiin joko honokiol (20, 40 tai 60 uM) tai DMSO (kontrolli) 24 tunnin ajan ja sen jälkeen värjättiin 7-AAD ja PE-anneksiini V ja sen jälkeen virtaussytometrialla. Alempi vasen neljännesten Kunkin paneelit osoittavat eläviä soluja (negatiivinen molemmille, PE anneksiini V ja 7-AAD). Oikeassa yläkulmassa neljännesten sisältävät nekroottista tai myöhään apoptoottiset solut (positiivinen molempien, PE anneksiini V ja 7-AAD). Alempi oikeus neljännesten edustaa alussa apoptoottisten solujen (PE anneksiini V positiivinen ja 7-AAD negatiivinen). Tiedot osoittavat annoksesta riippuva nousu apoptoottisten solujen määrässä sekä MiaPaca ja Panc1 solujen käsittelyn jälkeen honokiol kontrolliin verrattuna soluihin, mikä osoittaa, apoptotis indusoiva potentiaali honokiol.

Honokiol muuttaa ilmaus solusyklin ja eloonjääminen liittyvien proteiinien

tutkimiseksi mekanistinen perusta kasvua estäviä vaikutuksia honokiol, tutkimme seuraavaksi sen vaikutus ilmentymisen keskeisten proteiineja, jotka liittyvät soluproliferaatioon ja selviytymistä. Meidän data paljasti annoksesta riippuvan väheneminen Sykliini (D1 ja E) ja sykliiniriippuvaisten kinaasien (Cdk2 ja Cdk4); kun taas indusoima sykliini-riippuvaisen kinaasin estäjät (p21 ja p27) ei havaittu sen jälkeen, kun honokiol hoidon sekä MiaPaca ja Panc1 haimasyövän soluja (kuvio 4). Niistä selviytyminen proteiineja, havaitsimme annoksesta riippuvainen tasojen aleneminen anti-apoptoottisen proteiinin Bcl-2 ja Bcl-x L, kun taas samanaikainen kasvu tason pro-apoptoottisen proteiinin Bax havaittu (kuvio 5A), joka johtaa kasvu suhteessa Bax /Bcl-2 (kuvio 5B, ylempi paneeli) ja Bax /Bcl-x L (kuvio 5B, alempi paneeli). Nämä havainnot osoittavat, että honokiol muuttaa proteiinien ilmentymisen säätelyyn osallistuvan solusyklin ja apoptoosin antaa sen kasvua estävä vaikutus.

Haiman syöpäsolujen (MiaPaca ja Panc1) käsiteltiin joko honokiol (20, 40 tai 60 uM) tai DMSO (kontrolli) 24 tunnin ajan. Kokonaisproteiinista eristettiin ja sille suoritettiin immunoblot-analyysi eri solusyklin liittyvien proteiinien (sykliini D1, sykliini E, Cdk2, Cdk4, p21 ja p27). β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Voimakkuudet immunoreaktiivisia kvantitoitiin densitometrillä. Normalisoidut densitometrinen-arvot osoitetaan yläosassa nauhojen osoittaen annoksesta riippuvaa vähenemistä ilmentymisen sykliini D1, sykliini E CDK2 ja Cdk4 ja ekspression lisääntymisen sykliini-inhibiittorit; p21 ja p27, altistumisen jälkeen honokiol, sekä solutyypeissä.

(A) MiaPaca ja Panc1 soluja käsiteltiin joko honokiol (20, 40 tai 60 uM) tai DMSO (kontrolli) ja 24 h. Immunoblottaus suoritettiin Bcl-xl, Bcl-2: n ja Bax proteiineille, jota seuraa densitometrisesti immunoreaktiivisia bändejä. Normalisoidut densitometristä-arvot osoitetaan yläosassa bändejä. (B) Bar kaavio esitetään yhteenveto vaikutusten honokiol hoidon Bax /Bcl-2-suhde (ylempi paneeli) ja Bax /Bcl-x L-suhde (alempi kuva). Tiedot viittaavat siihen, että honokiol indusoi apoptoosia säätelemällä pro-apoptoottisen Bax ja vähen- tämisessä anti-apoptoottisten Bcl-2 ja Bcl-x L-proteiineja.

Honokiol vaimentaa konstitutiivisen NF-KB: n ihmisen haimasyövän soluja

NF-KB: n on konstitutiivisesti aktiivinen monissa syöpätyypeissä, mukaan lukien haimasyöpä [18] – [20], ja se on osoitettu, että aktivointi tämän signaloinnin solmun helpottaa solusyklin etenemistä [21] ja apoptoottisten vastus [22 ]. Näin ollen, olemme tutkineet, onko hoito haimasyövän soluja honokiol vaikuttaa NF-KB: n aktivaation haiman syöpäsoluissa. Ensin tutkittiin, mikä vaikutus honokiol on transkriptionaalista aktiivisuutta NF-κB- reagoivan promoottorin lusiferaasireport- määrityksessä. Meidän tiedot osoittivat annoksesta riippuvainen väheneminen transkriptionaalista aktiivisuutta NF-KB: n (~1.40, 2,08 ja 4,0 taittuu MiaPaca, ja ~1.29, 1,96 ja 5,26 taittuu Panc1-solut) 20, 40 ja 60 uM honokiol hoitoa, vastaavasti (kuvio 6A). Tukemiseksi edelleen tätä havaintoa, me seuraavaksi tutkittiin solun lokalisaatio (sytoplasminen vs. ydin-) p65-alayksikköä NF-KB. Meidän immunoblottaus tiedot osoittivat, ettei honokiol hoito aiheutti merkitty ja annoksesta riippuvainen väheneminen NF-KB: n tasot ydin- osa sekä MiaPaca ja Panc1 haimasyövän soluja samanaikaisesti kasvu solulimafraktio (kuvio 6B). Cellular jakelu NF-KB säätelee suhteellinen ilmentyminen sen biologisen estäjä IKB-, joka pitää NF-KB erottautuvat sytoplasmassa inaktiivisessa monimutkainen [23]. Näin ollen, olemme analysoineet sytoplasmisen uutteita honokiol käsiteltyjen haimasyöpäsoluissa määrittämiseksi lKB-α tasolla. Meidän tiedot osoittivat annoksesta riippuva nousu tason IKB-α upon honokiol-hoitoa (kuvio 6B). Tähän liittyi samanaikainen väheneminen IKB-α fosforylaation osoittaa lisääntynyt stabilointi IKB-α altistumisen jälkeen honokiol. Kaiken kaikkiaan, meidän tiedot osoittavat, että honokiol estää konstitutiivisen NF-KB: n haiman syöpäsoluissa.

(A) MiaPaca ja Panc1cells (0,5 x 10

6 solua /kuoppa) siirrostettiin 12-kuoppaiselle levylle . Seuraavana päivänä 60% konfluenssiin, solut kotransfektoitiin NF-KB lusiferaasireportteri ja TK-Renilla lusiferaasi (kontrolli) plasmidit. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin honokiol (20, 40, tai 60 uM) seuraavan 24 tunnin ajan. Proteiini lysaatit tehtiin ja lusiferaasia (Palo-fly, testi ja Renillaa, transfektion tehokkuus ohjaus) aktiivisuus arvioitiin käyttäen dual-lusiferaasimäärityssysteamiä. Data on esitetty normalisoitu kertamuutosta lusiferaasiaktiivisuudessa (keskiarvo ± SD, n = 3, * p 0,05). (B) yhteensä, ydin- ja sytoplasman uutteet valmistettiin soluista käsiteltiin honokiol (20, 40, tai 60 uM) ja 6 h ja ilmentymistä NF-KB: n /p65: n, p-IKB-α (S32 /36) ja IκB- α määritettiin Western blot -analyysillä. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Voimakkuudet immunoreaktiivisia kvantitoitiin densitometrillä. Normalisoidut densitometrian-arvot osoitetaan yläosassa bändejä osoittaa vähentynyt lokalisoinnin NF-KB /p65 nucleus kanssa samanaikainen kasvu sytoplasmassa. Sitä vastoin ilmaus p-lKB-α laskettiin johtaa kohonneeseen lKB-α. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittavat selvästi, että honokiol estää NF-KB: n aktiivisuuden kautta stabilointi lKB-α.

Honokiol chemosensitizes haiman syöpäsoluja gemsitabiinia myrkyllisyyden

Gemsitabiini on ainoa FDA- hyväksytty kemoterapeuttinen lääke vastaan ​​haimasyöpä; kuitenkin, se on minimaalisen tehokasta, koska chemoresistance [3], [5], [10]. Koska NF-KB: n pidetään yksi niistä mekanismeista, voimistamaan chemoresistance, tutkimme jos honokiol toimisi chemosensitizer haiman syöpäsoluissa. Haimasyövän soluja (MiaPaca ja Panc1) käsiteltiin gemsitabiini yksin tai yhdessä ala-IC

50 pitoisuuksia honokiol ja vaikutus kasvun inhibitio tutkittiin käyttäen solunelinkykyisyysmääritys. Tuloksemme osoittivat, että gemsitabiini esti kasvua haimasyöpäsoluissa annoksesta riippuvaisella tavalla ja yhdistettiin hoidon honokiol johtaneet huomattavaan vähenemiseen IC

50 gemsitabiinin (kuvio 7A). Klo 10 ja 20 uM annoksia honokiol vastaavasti erääseen ~1.53 ja 2,41-kertainen (vuonna MiaPaca) ja ~1.40 ja 2,08-kertainen (vuonna Panc1) vähenee IC

50 gemsitabiinin havaittiin merkitsee Kemoherkistävien vaikutusta honokiol (kuva 7A). Tunnistaa rooli NF-KB, tutkimme sen solu- lokalisointiin gemsitabiini (yksinään tai yhdessä honokiol) hoidetun haiman syöpäsoluja. Tuloksemme näkyvät tehostettu kertymistä NF-KB ydin- osasto ja samanaikainen väheneminen solulimafraktio kasvavia annoksia gemsitabiinin sekä MiaPaca ja Panc1 soluja (kuvio 7B). Erityisesti havaitsimme, että honokiol (jopa 20 uM annos) oli tehokas inhiboimaan gemsitabiinin-indusoidun NF-KB: n sekä MiaPaca ja Panc1 soluja (kuvio 7C). Nämä havainnot osoittavat selvästi, että honokiol voimistaa antituumoritehoon gemsitabiinin toimimalla kemiallis-herkistävä haiman syöpäsoluissa.

(A) MiaPaca ja Panc1 soluja kasvatettiin 96-kuoppaisilla mikrotiitterilevyillä (1 x 10

4 solua /kuoppa). Alemmilla yhtymäkohta, soluja käsiteltiin gemsitabiinin (1,25-40 uM) yksin tai yhdessä honokiol (10 tai 20 uM) 48 tunnin ajan. Prosentuaalinen elinkelpoisuus mitattiin WST-1 määrityksessä. Tiedot esitetään suhteellisina prosenttia elinkelpoisuus suhteessa käsittelemättömän tai honokiol ainoastaan ​​käsiteltyjä soluja kontrolloida kasvua tukahduttava vaikutus honokiol (keskiarvo ± SD, n = 3. *, p 0,05). Merkittävä väheneminen IC

50-arvot gemsitabiinin havaittiin soluissa yhteistyössä käsitelty honokiol. (B) Soluja käsiteltiin gemsitabiinin (5, 10 ja 20 uM) 6 tuntia ja ilmentymistä NF-KB /p65 ydin-, sytoplasman ja kokosoluliuotteista määritettiin Western blot-analyysi. Gemsitabiinihoidon solujen johti parantuneeseen tumakertymään NF-KB: n /p65: n annoksesta riippuvalla tavalla (C) Ydin ja sytoplasminen uutteet valmistettiin soluista käsiteltiin gemsitabiinin (10 uM), honokiol (20 uM) yksin tai yhdessä 6 h. Expression of NF-KB /p65 ydin-, sytoplasman ja kokosoluliuotteista määritettiin Western blot-analyysi. Tiedot osoittavat, että honokiol co-hoito rajoittuu gemsitabiini aiheuttama NF-KB /p65 tumakertymään. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että honokiol toimii chemosensitizer ja lisää sytotoksisia vaikutuksia gemsitabiinin haimasyövän.

Keskustelu

Haimasyöpä edelleen tuhoisa pahanlaatuisuuden puutteen vuoksi tehokas hoito hoitoon [3]. Tämä tutkimus osoitti, että honokiol (luonnollinen biphenolic yhdiste) on tehokas tukahduttamaan kasvua ihmisen haimasyövän soluja (MiaPaca ja Panc1) johtuen sen sytostaattinen ja sytotoksisia ominaisuuksia. Lisäksi tutkimuksemme säädetty näyttöä roolin honokiol vuonna Kemoherkistävien haiman syöpäsolujen gemsitabiinia myrkyllisyys. Honokiol esti NF-KB toimintaa ja aiheutti muuttunut ilmentyminen monien solukierron ja eloonjäämisen liittyvien proteiinien antaa sen kasvua ehkäisevästä ja Kemoherkistävien vaikutukset haiman syöpäsoluja.

vapautettiin kasvua syöpäsoluissa on usein johtuvan hallinnan menetykseen proliferatiivisessa ja apoptoottisten reittien [24]. Itse asiassa, molekyyli- tutkimukset ovat osoittaneet, että ilmentyminen solun lukiertosäätelijöistä ja proteiinit, jotka liittyvät solun eloonjäämisen on usein muutettu useita ihmisen syövissä, [25] – [27]. Solukierron säätelee koordinoivaan toimintaan Sykliinien, sykliiniriippuvaisten kinaasien (CDK) ja CDK-inhibiittorit [26], [28]. Havaitsimme, että hoitoon haimasyövän soluja honokiol johti G

1 vaiheen pysähtymisen solusyklin etenemisen ohella väheneminen sykliini D1, sykliini E, Cdk2- ja Cdk4 ja lisääntyminen p21 ja p27 proteiinitasolla. Sykliini D1 ja sen katalyyttinen kumppani Cdk4 hallitsevat G

1 vaihe, kun taas sykliini E ja Cdk2- monimutkainen säätelee solusyklin etenemisen G

1 S [26], [28]. Siksi meidän havainnot osoittavat, että honokiol aiheuttama pidätys haimasyövän soluja G

1 solusyklin vaihe saattaa välittämien downregulation Sykliinien ja CDK yhdessä säätelyä p21 ja p27-proteiineja, jotka muodostavat heterotrimeeristen komplekseja G

1-S CDK ja sykliinejä estävän niiden toimintaa [29]. Nämä tulokset ovat sopusoinnussa aiempien tutkimusten vaikutuksista honokiol ihmisen lymfaattisessa leukemia, levyepiteelikarsinooma keuhkosyövän ja rintasyövän solujen [16], [17], [30].

jälkeen G

1- vaihe solusyklin pysähtymiseen, solut voivat joko suoritettava korjauksia tai anna apoptoottista polku ylläpitää solujen eheyden ja poistaa virheellisesti /mutatoidun premaligneja ja neoplastiset solut [31]. Siten apoptoosin on yksi suojamekanismeja syöpää vastaan ​​taudin alkamisen ja etenemisen ja syöpäsolut ovat usein hankittu resistenssi apoptoosia [24]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme merkittävää apoptoosin honokiol-käsiteltyjen haimasyöpäsoluissa osoittaa, että honokiol pystyy voimistaa apoptoottisen koneiston. Solujen eloonjääminen ylläpitää hieno tasapaino suhteita pro-apoptoottisten (esim Bad: n ja Bax) ja anti-apoptoottiset proteiinit (esim, Bcl-2 ja Bcl-x L), jotka ohjaavat prosessin apoptoosia vapautumisen kaspaasien [ ,,,0],32], [33]. Näin ollen muuttunut ilmentyminen Bcl-2-perheen proteiinit havaittiin, kun honokiol hoitoon haimasyövän soluja tavalla, joka suosii kasvu suhteet Bax /Bcl-2: n ja Bax /Bcl-x L voi taustalla havaittu apoptoottisen vaikutuksen honokiol. Vapauttaminen apoptoosin liittyvien proteiinien on myös raportoitu kondrosarkoomasoluissa jälkeen honokiol hoidon tuen jatkamisen rooliaan apoptoosin induktion [34].

Havaitsimme myös NF-KB: n aktiivisuuden päälle honokiol hoito, joka liittyi esto IKB-α fosforylaation ja samanaikainen kasvu sen ilme. Transkriptiotekijä NF-KB: n konstitutiivisesti aktivoitu useita maligniteettien ja sen on raportoitu olevan patologisesti liitetty haimasyövän [18] – [20]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että kasvua estävä vaikutus on honokiol eturauhasessa ja paksusuolen syöpiä välittyy läpi NF-KB: n [35]. NF-KB-transkriptiotekijän koostuu heterodimeerejä koostuu Rel (p65, c-Rel ja RelB), p52 ja p50 proteiinien ja paikantuu sytoplasmassa-aktiivisessa muodossa kompleksi IKB (estäjä NFKB koostuvat α ja β-alayksiköt että maskit sen tumalokalisaatiosignaalin [36]. NF-KB on aiheuttanut, kun IKB-α saa fosforylaatio tapahtuu IKK (estäjä kinaasi) kompleksi, joka johtaa sen ubikinaation ja hajoamista. Tämä johtaa vapauttaa NFKB alkaen sytoplasmassa ja kuljetus tumaan, jota seuraa NF-KB-reagoiva promoottori. NF-KB: n tiedetään indusoivan sykliini D1, Bcl-2 ja Bcl-x L (muuttunut, kun honokiol hoidon olevassa tutkimuksessa) yhdessä taulukon proteiinien osallistuvat solujen proliferaation ja eloonjäämisen [37], [38]. sen vuoksi voidaan ehdotettu, että kasvua vaimentava haimasyövän soluja honokiol välittyy inhibition NF-KB: n.

Kliininen lopputulos haimasyöpä on pysynyt heikko johtuen kehittynyt ja metastaattisessa taudin aikaan diagnoosi ja tehottomuutta sallitun huumeisiin hoidon takia chemoresistance [3], [5], [10]. Tällä hetkellä gemsitabiini on kansallinen standardi kemoterapeuttisen lääkkeen haimasyövän hoitoon. Gemsitabiini häiritsee DNA-synteesiä johtaa solukierron pysähtymisen ja apoptoosin lopullinen kurssin [39], [40]. Yksi niistä mekanismeista, joka rajoittaa gemsitabiini teho saadaan aikaan NF-KB: n vastauksena sen hoito [41], jotka voivat aiheuttaa apoptoottista viivettä tai poistaminen. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, Kemoherkistävien vaikutus honokiol haiman syöpäsolujen gemsitabiinin myrkyllisyys. Lisäksi osoitimme, että gemsitabiinihoidon indusoi tumakertymään NF-KB, jota voitaisiin ehkäisee tehokkaasti yhteistyössä hoidon honokiol. Näihin rinnakkaisiin havainnot osoittavat, että NF-KB: n aktiivisuus voi myös välittää Chemosensiti- haimasyövän soluja honokiol. Itse asiassa on raportoitu aikaisemmin, että syövän vaikutukset kemoterapeuttisten aineiden voidaan tehostaa estämällä NF-KB: n aktiivisuuden [22], [41].

Yhteenvetona, olemme osoittaneet, että ensimmäistä kertaa kasvua inhiboiva ja Kemoherkistävien potentiaalia honokiol haimasyövän. Honokiol aiheuttaa G

1 vaihe solusyklin pysähtymiseen ja apoptoosin induktio muuttamalla ilmaus solusyklin ja selviytymisen liittyviä proteiineja. NF-KB voi olla yksi merkittävä mekanismien honokiol aiheuttama kasvua suppressoiva ja Kemoherkistävien vaikutuksia haiman syöpäsoluissa. Siksi olemme sitä mieltä, että honokiol voisi olla uusi lupaava luonnollinen aine hoitoon haimasyövän ja voi toimia myös chemosensitizer parantaa terapeuttista tehoa gemsitabiinin, joka on jo kliinisessä käytössä terapeuttisena lääkkeenä.

materiaalit ja menetelmät

reagenssit

Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM) ja Roswell park memorial institute (RPMI-1640) väliaine saatiin Thermo Scientific (Logan, UT). Sikiön-seerumia (FBS) oli Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA). Penisilliini, streptomysiini ja trypsiini-EDTA ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Honokiol hankittiin LKT Laboratories (St. Paul, MN). Gemsitabiini saatiin USAMCI apteekki. FuGENE transfektioreagenssi, fosfataasi /proteaasinestäjät cocktail ja soluproliferaation reagenssi WST-1 hankittiin Roche Diagnostics (Mannheim, Saksa). Propidiumjodidia /RNAasi värjäyspuskurilla ja PE anneksiini V apoptoosin detektioreagenssipakkaus hankittiin BD Bioscience (San Diego, CA). Tumauutteesta kit hankittiin Aktiivinen motiivi, LLC (Carlsbad, CA). Vasta-aineet Bcl-2, Bax ja p-IKB-α (Ser32 /36) (kanin polyklonaalinen), Bcl-xl ja NF-KB: n /p65: n (kani monoklonaalinen) ja IKB-α (hiiren monoklonaalinen) saatiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Vasta-aineet p21, Cdk4 (hiiren monoklonaalinen), P27, sykliini D1, sykliini E, Cdk2- (kanin polyklonaalinen), ja piparjuuriperoksidaasikonjugoitua sekundaariset vasta-aineet hankitaan Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). p-Actin (hiiren monoklonaalinen) vasta-aine hankittiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). ECL plus western blotting havaitseminen pakki hankittiin Thermo Scientific. pGL4.32 [luc2P /NF-KB -re /Hygro] plasmidi, PRL-TK-plasmidi ja Dual lusiferaasimäärityssysteamiä kit olivat Promega (Madison, WI).

Soluviljely ja hoitoja

ihmisen haiman solulinjat MiaPaca ja Panc1 (ATCC, Manassas, VA) pidettiin viljelmässä, kuten tarttuva kerroksena RPMI-1640 ja DMEM vastaavasti, jota on täydennetty 10% (v /v) FBS: ää, penisilliiniä (100 yksikköä /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml). Soluja ylläpidettiin 5% CO

2 kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Kasvua väliaine vaihdettiin joka 3. päivä ja solut jaettiin (1:03), jolloin se oli 80% konfluenssin. Hoitoja, kantaliuos honokiol (10 mmol /l), valmistettiin DMSO: ssa, säilytetään -20 ° C: ssa, ja laimennettiin tuoretta täydellistä elatusainetta välittömästi ennen käyttöä. Soluja käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla honokiol yksin, gemsitabiini yksin tai yhdessä (kuten määritelty kuvassa legendoja). Yhtä suuri tilavuus DMSO: ta (lopullinen konsentraatio, 0,1%), lisättiin valvontaa.

solukasvumäärityksessä

Solut ympättiin 96-kuoppalevyille (1 x 10

4 solua /kuoppa) päivää ennen hoitoja. Solujen elinkelpoisuus käsitellyistä soluista tutkittiin sen jälkeen, kun 24-72 h käyttäen WST-1 (4- [3- (4-jodifenyyli) -2- (4-nitrofenyyli) -2H-5-tetrazolio] -1, 3-bentseeni di-sulfonaatti) iinianalyysikitissä kohti valmistajan ohjeiden kanssa asianmukaista valvontaa. Tämä määritys perustuu pilkkominen WST-1 metabolisesti aktiiviset solut muodostavat vesiliukoisia formatsaaniksi. Absorbanssi formatsaanin mitattiin aallonpituudella 450 nm, jossa tausta on vähennetty 630, käyttäen Bio-Rad Benchmark mikrolevylukijaa (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Kasvu laskettiin prosenttia elinkelpoisuuden = [(A /B) x 100], jossa A ja B ovat absorbanssi käsiteltyjen ja kontrollisolujen, vastaavasti.

Cell-syklin analyysi

Vaikutus ja honokiol hoidon solusyklin etenemisen määritettiin virtaussytometrialla seuraavasti propidiumjodidilla (PI). Lyhyesti, soluja (1 x 10

6 solua /kuoppa) ympättiin 6-kuoppaiselle levylle ja synkronoitu viljelemällä niitä seerumivapaassa. 48 tunnin kuluttua väliaine korvattiin täydellistä elatusainetta, joka sisälsi halutun pitoisuuksia honokiol tai DMSO. Kelluvat ja kiinnittyneet solut kerättiin 24 tunnin jälkeen hoidon ja kiinnitettiin 70% etanolilla yön yli 4 ° C: ssa. Sitten solut värjättiin propidiumjodidilla, käyttäen PI /RNaasi värjäyspuskuria 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Stained solut analysoitiin virtaussytometrialla BD-FACS Canto ™ II (Becton-Dickinson, San Jose, CA) laskea prosenttiosuuden solupopulaation eri vaiheissa solusyklin käyttää Mod Fit LT ohjelmisto (Verity Software House, Topsham