Krooninen sairaus

tiivistelmä

PIK3CA

voimistumista, vahvistusta ja mutaatio on laajalti raportoitu munasarjojen syöpien ja muiden kasvaimien, jotka viittaa vahvasti siihen, että

PIK3CA

on lupaava terapeuttinen kohde. Kuitenkin tähän mennessä mekanismeista

PIK3CA

sääntelyä ja aktivointi

in vivo

on vielä epäselvä. Aikana tumorigeneesin, isäntä-kasvain vuorovaikutukset voivat olla kriittinen rooli muokkaamalla kasvain. Täällä me raportoimme uudella mekanismilla, jonka kautta kasvainta microenvironment aktivoi

PIK3CA

onkogeeni. Osoitamme, että

PIK3CA

säätelyyn ylöspäin tapahtuu proliferoimattomissa kasvain alueet

in vivo

. Me tunnistaa ja kuvata

PIK3CA

5 ’ylävirtaan transkription säätelyalueen ja vahvisti, että

PIK3CA

transkriptionaalisesti säädellään NF-KB-reitin. Nämä tulokset tarjoavat uuden mekanismin kautta, josta kasvain mikroympäris- aktivoi suoraan onkogeenisiä reittejä tuumorisoluissa.

Citation: Yang N, Huang J, Greshock J, Liang S, Barchetti A, Hasegawa K, et ai. (2008) Transcriptional asetus

PIK3CA

Oncogene NF-KB munasarjasyövässä mikroympäristössä. PLoS ONE 3 (3): e1758. doi: 10,1371 /journal.pone.0001758

Academic Editor: Edathara Abraham, University of Arkansas, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 tammikuu 2008; Hyväksytty: 07 helmikuu 2008; Julkaistu: 12 maaliskuu 2008

Copyright: © 2008 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NCI P01-CA83638 SPORE munasarjasyövässä (urakehitys Award, LZ); munasarjojen Cancer Research Fund (GC ja LZ); Mary Kay Ash hyväntekeväisyysyhdistykseksi (LZ) ja American Cancer Society (LZ). AG tukivat osaksi ala- predoctoral apurahan Helleenien opetusministeriön (Program HERACLITOS, EPEAEK). DK osittain jota Italian Association for Cancer Research (AIRC).

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

fosfatidyyli-3 ”kinaasi (PI-3-kinaasi) on solunsisäinen anturi lipidisubstraatin spesifisyys osallisena monenlaisia ​​syöpään liittyvien signalointireittien osallistuvat kasvaimen solujen aineenvaihduntaa, selviytymistä ja proliferaatiota [1], [2], [3], [4 ], [5], [6], [7]. Se on palvelukseen ja aktivoidaan useita reseptorityrosiinikinaaseilla ja generoi toisiolähetit kautta fosforylaation kalvon inositolin lipidien klo D3 asemassa [3], [8]. PI-3 kinaasi todettiin ensimmäisen putatiivisiksi onkogeenin koska sen kyky sitoa polyoma keskelle T-antigeenin [9], [10]. Molecular cloning PI-3-kinaasien paljasti suuria ja monimutkaisia ​​perhe, joka sisältää kolme luokkaa useita alayksiköitä ja isoformit [3], [8]. Kuitenkin miten kukin alayksikkö tarkasti edistää etenemistä ja ylläpito syöpä on juuri tunneta [3], [5].

PIK3CA

geeni koodaa katalyyttistä alayksikköä P110-alfa, yksi kolmen katalyyttinen alayksikkö proteiineja luokan IA PI-3-kinaasien, jotka ovat yleensä aktivoituvat kasvutekijän reseptorityrosiinikinaaseihin.

PIK3CA

todettiin linnun retrovirus-koodattu onkogeenin, joka muuntaa kanan alkion fibroblasteissa [11]. Lukuisat viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että

PIK3CA

ja alavirran polut ovat usein kohdistettu genomivahvistuksen, mutaation tai yli-ilmentymisen kiinteitä kasvaimia kuten munasarjasyöpä [12], [13], [14], [15], [16] , [17], [18], [19], [20]. Aiemmat tutkimukset funktio

PIK3CA

ovat pääasiassa keskittyneet sääntelyn circuitries sisällä syöpäsolun.

In vitro

,

PIK3CA

on kriittinen rooli solujen eloonjäämistä ja proliferaatiota [1], [2], [3], [4], [5], [7]. Kuitenkin tähän mennessä ei tiedetä,

PIK3CA

olettaa erilaisia ​​rooleja riippuen tilasta ja /tai asiayhteys, jossa kasvain solu löytyy. Lisäksi on epäselvää, miten tällainen rooleja

PIK3CA

saattaa vaikuttaa kasvaimen miljöö.

Dynaaminen välisen vuorovaikutuksen geneettisten vapauttamisen kasvainsoluissa ja reaktiivinen molekyyli- ja solutason muutokset isäntäsoluissa asuttavat kasvain microenvironment on ratkaiseva rooli pahanlaatuisiksi ja syövän etenemistä ja kasvua [21], [22]. Hankinnan jälkeen kriittisen geneettisiä muutoksia, kasvainsolut altistetaan metabolinen /iskeeminen stressi ja muokata ympäröivä microenvironment. Puolestaan ​​isäntäsoluissa palvella muokata kasvain, edistää valinnan syöpäsolujen hyötyvät kasvain microenvironment vaikutteita. Synnynnäisen ja adaptiivisen immuunivasteen mekanismeja kasvaimia huipentui tulehdus ovat saaneet merkittävää huomiota tässä yhteydessä, koska tulehdus on osoitettu edistävän syövän kasvua ja etenemistä [23], [24], [25]. Kasvaimeen liittyvät leukosyyttien tuottaa lukuisia proangiogeeninen edistävät tekijät kasvaimen verisuonten muodostumista [26], [27], [28], [29]. Lisäksi tumatekijä kappa-B (NF-KB), kriittinen transkription säätelijänä tulehdus, on osoitettu olevan keskeinen rooli tulehduksen rakentuvassa syövän synnyn ja edistää kasvaimen kasvua ja etenemistä [25], [30], [31 ], [32], [33], [34], [35]. Täten on oletettu, että jatkuvaan dynaamiseen cross-talk välillä kasvainsolujen ja isäntäsoluja varmistaa selviytymisen kasvainsolujen ja ylläpitää kasvaimen kasvua [21], [22]. Vastavuoroinen vaikutukset kasvaimen-isännän yhteisvaikutuksia on määriteltävä niiden angiogeneesiä. Kuitenkin kuinka kasvain-isäntä vuorovaikutusten vaikuttavat suoraan kasvainsoluihin jää osittain määrittelemätön.

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC), yleisin munasarjojen maligniteetti, on edelleen johtava kuolinsyy gynekologisten syöpäsairauksia [36]. Puute ennaltaehkäiseviä strategioita, varhainen diagnostiset menetelmät ja tehokkaita hoitomuotoja toistuva munasarjakasvaimia luo pakottava tarve ymmärtää sen synnyssä ja tunnistamaan molekyylitason tavoitteet sekä diagnosointiin ja hoitoon EOC eri vaiheessa taudin etenemiseen [20], [37] , [38], [39], [40], [41]. Tässä tutkimuksessa selvitimme ilmaus

PIK3CA in vivo

ja sen suhteesta kasvaimen microenvironment ihmisen munasarjasyöpä. Tunnistaminen ja luonnehdinta

PIK3CA

5 ’transkription säätelyalue (TRR) yhdessä toiminnallinen validointi vahvistivat, että

PIK3CA

on transkriptionaalisesti säätelee microenvironment kautta tulehdusta ja NF-KB. Nämä tulokset tarjoavat uusi mekanismi, jonka kautta kasvainta microenvironment suoraan aktivoi onkogeeninen reittejä kasvainsoluissa ja edistää kasvaimen kasvua.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

yksilöihin, joita käytetään tässä tutkimuksessa kerättiin Pennsylvanian yliopistossa ja University of Torino, Italia [42]. Kudokset saatiin sen jälkeen, kun potilaan kirjallinen lupa yleisen kudos kokoelma protokolla hyväksymän toimielimen Institutional Review Board (IRB), University of Pennsylvania ja Torinon yliopiston. Kaikki kasvaimet olivat ensisijainen sivustoja, ja kerättiin aikaan rajaamisvai- kirurgian aiemmin hoitamattomia potilaita, joilla on vaiheen III ja IV munasarjasyöpä. Näytteet olivat snap-jäädytetään välittömästi ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Näytteet kerättiin paikallispuudutuksessa Institutional Review Board hyväksyntä ja jalostettu hyväksymiä HIPAA teko.

Cell Culture

Soluja viljeltiin DMEM-alustassa (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Invitrogen). Joissakin kokeissa soluja inkuboitiin media on rikastettu ihmisen rekombinantti-TNF-α (50 tai 100 ng /ml, BD Bioscience, San Jose, CA) ja eri aikoina, kuten on ilmoitettu.

Yhteensä RNA: n eristäminen ja määrälliset Real- aika RT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin 100-500 mg jäädytettyä kudosta tai 1 x 10

6 viljellyt solut, joissa TRIzol reagenssia (Invitrogen). Hoidon jälkeen RNaasittomalla DNaasia (Invitrogen), kokonais-RNA oli käänteistranskriptoituneet käyttäen Superscript First-Strand Synthesis Kit RT-PCR (Invitrogen) määritellyin edellytyksin toimittajalle. cDNA kvantifioitiin reaaliaikaisella PCR: llä ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Ihmisen

PIK3CA

eteenpäin aluke: TCA AAG GAT TGG GCA CTT TT, ja käänteinen aluke: GCC TCG ACT TGC CTA TTC AG. PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Green PCR Core reagenssit (Applied Biosystems, Foster City, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. PCR-monistus housekeeping-geeni GAPDH suoritettiin kunkin näytteen kontrollina näyte lastaus ja jotta normalisointi joukossa näytteitä. Standardikäyrä rakennettiin PCR-II TOPO-kloonausvektoriin (Invitrogen), joka sisälsi saman sisäänvedetty fragmentti ja monistettiin real-time PCR.

Tissue Microarray

kudos microarray rakennettiin, kuten on kuvattu aiemmin [43], [44]. Lyhyesti, kasvaimia upotettiin parafiiniin ja 5 um: n leikkeet värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla valita edustava alueiden koepaloja. Neljä ydin kudosbiopsioista saatiin kustakin näytteestä. Läsnäolo kasvain kudosta puettu näytteistä varmistettiin hematoksyliini- eosiini värjätään osiossa.

immunohistokemia (IHC) ja kuva-analyysi

IHC suoritettiin käyttäen Vectastain ABC Kit kuten valmistaja on kuvannut (Vector, Burlingame, CA). Käytimme seuraavat ensisijaiset vasta-aineet (kaikki BD Pharmingen, ellei muuta mainita): kanin anti-humaani-Ki67 (1:200, DAKO, Carpinteria, CA); kanin anti-humaani-sytokeratiini (1:200, DAKO); kanin anti-ihmisen p65 (1:400, Santa Cruz, Santa Cruz, CA); hiiren anti-humaani p110α (1:250 tai 1:50); rotan anti-hiiri-CD31 (1:200); hiiren anti-humaani HIF1Α (1:200); hiiren anti-ihmisen c-Jun (1:200); rotan anti-hiiri-CD11b (1:200). Vasta-aineet, inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa tai yön yli 4 ° C: ssa. Immunorektiosta visualisoitiin 3,3′-diaminobentsidiini (Vector). Double immunofluoresenssivärjäyksellä suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [45]. Lyhyesti, leikkeitä peräkkäin inkuboitiin 5% tavallista seerumi; ensisijainen vasta 2 tuntia; ja fluoresoivasti leimattuja sekundaarisia vasta-aineita (Vector) 30 min ajan. Osiot vastavärjättiin DAPI ennen tarkastetaan alla fluoresenssimikroskoopilla. Kuvat kerättiin Cool SNAP Pro väri digitaalikamera (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) ja värjäys indeksi analysoitiin Image-Pro Plus 4.1 ohjelmisto (Media Cybernetics).

TUNEL Pitoisuus

ApopTag peroksidaasi in situ havaitseminen pakki (Intergen) käytettiin visualisoimaan apoptoottisten solujen

in vivo

ja

in vitro

. Menettely suoritettiin valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, kasvaimen kudosleikkeet kiinnitettiin 1% paraformaldehydillä PBS: ssä, jonka jälkeen kylmää etanolin ja etikkahapon kiinnittämisen jälkeinen. Inkuboinnin jälkeen jäämiä digoksigeniinillä nukleotidin ja päätelaitteen deoksinukleotiditransferaasia yhden tunnin ajan 37 ° C: ssa, soluja inkuboitiin FITC-leimatun anti-digoksigeniini-vasta-ainetta.

Plasmidit

Hiiren

PIK3CA

cDNA jalomielinen lahjoitus tohtori Roberts (Harvard University). Nisäkkäiden ilmentämisplasmidi pCDNA3 oli Invitrogen. Jotta rakennettaisiin lusiferaasireportteri plasmideja, 5’TRRs ihmisen ja hiiren

PIK3CA

monistettiin BAC tai genominen DNA käyttäen Expand High Fidelity PCR System (Roche, Indianapolis, IN) ja lisätään ylävirtaan lusiferaasigeenin pGL3 -Basic vektori (Promega, Madison, WI). Sekvenssit 5’TRR kaikissa näissä reportteri konstruktit todennettiin DNA-sekvensoinnilla.

5 ’Rapid Amplification of cDNA Ends (5’-RACE) B

Kokonais-RNA uutettiin RNeasy Mini RNA Kit (Qiagen, Valencia CA) ja 5 ’RACE-järjestelmä (Invitrogen) käytettiin. 5’-RACE-PCR-tuote insertoitiin TA-kloonausvektoriin järjestelmä (Invitrogen).

plasmiditransfektiolla

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille 3 x 10

5 solua /kuoppa ja kasvatettiin yön yli -40% konfluenssiin ennen transfektiota. Kaikki plasmidit transfektoitiin FuGENE6 transfektioreagenssin (Roche) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Valitse neomysiini-resistentit solut, 400 ug /ml neomysiiniä (Invitrogen) levitettiin. Sillä shRNA kokeissa solut transfektoitiin siRNA ilmentävien pLTsuppressor1.0. In vitro tutkimukset osoittivat, että tukahduttaminen

PIK3CA

mRNA kesti jopa 30 päivää. Kaikki transfektio kokeet tehtiin kolmena kappaleena ja toistettiin ainakin kahdesti eri DNA-isolaatteja.

Luciferase Reporter Assay

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille 3 x 105 solua /kuoppa ja kasvatettiin yön yli 40% konfluenssiin ennen transfektiota. Testata promoottorin aktiivisuutta

PIK3CA

, yhteensä 0,5 ug reportteri-konstrukti ja 0,01 ug PRL-TK sisäinen valvonta (Promega) käytettiin kutakin transfektiota. Kaikki transfektiokokeis- tehtiin kolmena kappaleena ja toistettiin ainakin kahdesti eri DNA-isolaatteja. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, lusiferaasin analyysi suoritettiin Luminoskan Ascent (Thermo-Labsystems, Waltham, MA) käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sillä kotransfektiokokeissa, 1 ug kutakin pCMV-IκBα tai pCMV-IκBαM plasmidi (CloneTech, Mountain View, CA) käytettiin.

elektroforeettinen liikkuvuus Shift Assay (EMSA) B

Tumauute soluista valmistettiin käyttäen NE-PER ydin- ja sytoplasmisia Extraction Reagents plus Pysäytetään Protease Inhibitor Cocktail Kit (Pierce, Rockford, IL) noudattaen valmistajan protokollien ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes ne käytettiin. Rekombinantti NFKB (p50) tilattiin Promega. 5′-biotiini-leimattua DNA: ta sisältävien oligojen ihmisen villityypin

PIK3CA

NFKB sitoutumiskohta (GACGTGGGGGATTTTTCGCGTA), mutatoitunut ihmisen

PIK3CA

NFKB sitoutumiskohta (GACGTGGGCGATTTTTCGCGTA), sekoituskoodin ihmisen

PIK3CA

NFKB sitoutumiskohta (TCAGATAGACGAGACTTGAGTC), villityypin ohjaus NFKB sitoutumiskohta (AGTTGAGGGGACTTTCCCAGG) [35], mutatoitu ohjaus NFKB sitoutumiskohta (AGTTGAGGCGACTTTCCCAGG) syntetisoitiin ja kaksi täydentävää oligot liitettiin, jolloin saatiin kaksijuosteista koetin. EMSA suoritettiin käyttäen LightShift Kemiluminesenssiin EMSA Kit (Pierce). Tumauutteen (tai p50) ja 30 fmol leimattua koetinta inkuboitiin 10 x sitovaa puskuria plus 1 ug poly (dl-dC) 20 ul: ssa reaktioseosta systeemiin huoneenlämpötilassa 20 minuutin ajan. Koko 20 ui sitova reaktio ladattiin 7,5% polyakryyliamidigeelillä ja suorittaa huoneen lämpötilassa 0,25 x TBE 110 V 1-1,5 h. Elektroforesoitu sitova reaktio siirrettiin sitten Brightstar-Plus positiivisesti varautuneita Nylon kalvo (Ambion, Austin, TX) Trans-Blot SD Semi-Dry Sähköforeesisiirto Cell (Bio-Rad, Hercules, CA) 15 V 30 minuuttia ja rajat -sidoksellinen UV Stratalinker 1800 (Stratagene, La Jolla, CA) automaattisista cross-link tason 1 min. Detection of Biotiini-leimatun DNA-koetin tehtiin tiukasti seuraten valmistajan protokollaa.

Kromatiini Immunosaostaminen (chip)

ChIP määrityksessä havaitsemaan p65 sitoo ihmisen

PIK3CA

promoottori suoritettiin käyttäen Upstate ChIP iinianalyysikitissä (Upstate, Charlottesville, VA) valmistajan ohjeita. Leikatut DNA: ta inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli 2 ug immuunisaostamiseksi kanin polyklonaalinen IgG-vasta-p65 (Santa Cruz) tai 2 ug: normaali kanin kontrolli-lgG. Input ja chromatin-immunosaostettiin DNA: ta käytettiin PCR-templaattina havaitsemiseen p65 sitoo promoottorin (alukkeilla 5′-GCACCAAGACACTACCTTGAATC-3 ’ja 5′-CTCTGCAGTCCTTTGACTCACTT-3′) tai GAPDH (alukkeilla 5’-GACACCATGGGGAAGGTGAA -3 ’ja 5′-GAGTAGGGACCTCCTGTTTC-3’) käyttäen PCR Core kit (Roche).

Bioinformatics

etsiä mahdollisia transkriptiotekijän sitoutumiskohdista ihmisen ja hiiren

PIK3CA

5’TRRs suoritettiin käyttäen ohjelmaa Mat tarkastaja V2.2 at https://www.genomatix.de/online_help/help_matinspector/matinspector_help.html [46].

tilastot

tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS-tilasto-ohjelmistopaketti (SPSS). Kaikki tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD, ja p 0,05 käytettiin merkitys.

Tulokset

PIK3CA

on yliaktiivista proliferoimattomissa alueiden munasarjasyövän

paljastaa aluenäkökohdissa

PIK3CA

sääntelyn kasvain

in vivo

, ensin tarkasteltiin ilmentymisen p110α ihmisen munasarjasyövän yksilöitä. Mielenkiintoista on, että vahva p110α ilmentymistä havaittiin pääasiallisesti ryhmissä ei-lisääntyvän, Ki67- kasvainsoluja (kuvio 1 A-C). Näissä soluissa, p110α oli kulkeutua solukalvoon (kuvio 1 C). Sen sijaan, Ki67 + alueet esillä alhainen ilmentyminen p110α, joka pääasiassa sijaitsee sytoplasmassa, kun taas vain muutama Ki67 + -solujen esillä p110α on solukalvon (kuvio 1 B). Kudos mikrosiru käytettiin edelleen vahvistaa tämän tuloksen ihmisen munasarjasyöpä. 18 30 (60%) kasvaimissa, vahva p110α ilmentyminen (ja membraanilokalisaatiota) havaittiin pääasiassa Ki67- kasvaimen alueilla, kun taas muissa kasvaimissa vahva kalvo p110α ilmentyminen joko havaittu sekä sekä Ki67- ja Ki67 + kasvainsoluja (5 /30, 16,7%); lähinnä Ki67 + kasvainsoluissa (3 /30,10.0%); tai se ei ollut havaittavissa (4/30; 13,3%).

A-C Double immunovärjäyksen p110α (vihreä, FITC) ja Ki67 (punainen, Texas Red) ihmisen munasarjasyöpä B. Voimakas suurennos on alue A alhaisen ilmaus p110α. p110α ilmentyy alhaisilla tasoilla ja paikantuu sytoplasmaan Ki67-positiivisia kasvainsoluja. C. korkea suurennus alueen A, joilla on korkea ilmentymisen p110α. p110α ilmentyy korkeilla tasoilla ja paikantuu solukalvon in Ki67-negatiivisia kasvainsoluja. D ja E. immunohistokemiallinen paikallistaminen Ki67 mahdollistaa selkeän tunnistamisen alueilla yleistyvät ja alueiden proliferoimattomissa kasvainsoluihin

in vivo

2008 munasarjojen ksenograftikasvaimissa. E. Korkea suurennos alue D osoittaa rajan Lisääntyvä ja proliferoimattomissa alue. F H. Vahva ilmaisun ja solukalvon lokalisointi p110α löytyy vain Ki67-negatiivisia alueita. F. § vieressä D, värjättiin vasta-aine ihmisen p110α (1: 250 laimennus). G. Korkea suurennos alue F osoittaa rajan lisääntyvän ja proliferoimattomissa alue. H. Korkea suurennos alue G osoittaa kalvo lokalisaation p110α ei-lisääntyvän alueella. I. immunovärjäys ihmisen sytokeratiinia tunnistaa kasvainsoluja lisääntyvien ja proliferoimattomissa alueilla vuoden 2008 ksenograftimallissa. Viiva jälkiä välisen rajan kahteen alueeseen, jotka on määritelty Ki67 värjäytymistä viereisissä osassa (katso J). Sekä lisääntyvien ja proliferoimattomissa alueet ovat positiivisia ihmisen sytokeratiini- (FITC, vihreä), mikä osoittaa kasvaimen soluihin. Solujen tumat vastavärjättiin DAPI. J L. Double p110α ja Ki67 immunovärjäyksellä kartat

PIK3CA

aktivoinnin lisääntyvissä tai proliferoimattomissa alueilla vuonna 2008 ksenograftikasvaimissa. J. Ki67 (punainen, Texas Red) ja p110α (FITC, vihreä) näytteille vastavuoroisesti ilme. K ja L. Voimakas suurennos lisääntyvien alue (I) ja proliferoimattomissa alue (H) J.

edelleen vahvistaa tämän seurauksena olemme tutkineet ksenograftikasvaimissa generoidaan 2008 munasarjasyövän solulinja . Etuna tässä mallissa on, että erillisiä alueita lisääntyvien ja lepää kasvainsoluja voidaan selvästi tunnistaa

in vivo

Ki67 värjäytymistä (kuvio 1 D ja E) [47]. Samoin vastavuoroisesti ekspressiota havaittiin ihmisen yksilöiden, vahva p110α ilmentymistä havaittiin vain kasvainsoluissa in Ki67-, proliferoimattomissa alueet (kuvio 1 F H). Näillä alueilla p110α pääasiassa lokalisoitu solukalvon (kuvio 1 H). Kaksoisvärjäys vahvisti, että alueet ilmentävät p110α olivat itse asiassa asuu kasvainsoluja, jotka ilmensivät sytokeratiinista, epiteelin tuumorimarkkeri (kuvio 1 I K). Lisääntynyt primaarista vasta-ainetta pitoisuus (peräisin 1:200 1:50), heikko p110α ilmentyminen voidaan myös havaita Ki67 + alueilla, mutta p110α lokalisoitu diffuusisti sytoplasmaan näillä alueilla (kuvio 2). Siten onkogeeni

PIK3CA

merkittävästi yliaktiivista proliferoimattomissa alueilla ihmisen munasarjasyövän

in vivo

. Nämä proliferoimattomissa alueilla aina puuttuu verisuonten tukea ja sisältävät useita nekroottisen /apoptoottiset solut sekä rikas lymfosyyttien soluttautua (kuva 3).

. Immunohistokemiallinen värjäys p110α käyttämällä korkean ensisijaisen vasta-aineen pitoisuuden (01:50) paljastaa alhainen ilmentyminen p110α diffuusisti sytoplasmassa kasvainsolujen Ki67-positiivisia (Ki67 +) alueilla. B ja C. Voimakas suurennos proliferoimattomissa (B) ja lisääntyvissä (C) alueita A.

. Double immunovärjäys CD31 (punainen, Texas Red) ja p110α (vihreä, FITC) vuoden 2008 ksenograftimallissa. Vahva p110α värjäytymistä havaittiin pääasiallisesti kasvaimen alueilla sijaitsevat kaukana kapillaareja. B. Triple värjäys p110α (punainen, Texas Red), Ki67 (sininen, AMCA) ja TUNEL (vihreä, FITC) vuoden 2008 ksenograftimallissa.

tunnistaminen ja luonnehdinta ihmisen ja hiiren

PIK3CA

promoottorit

Ymmärtääksemme paremmin sääntelyn signaalit vaikuttavat säätelyä

PIK3CA

syövän, 5 ’ylävirran säätelysekvenssit ihmisen

PIK3CA

geeni oli tunnistettu. 5′-nopea monistus cDNA lopussa (5′-RACE) käytettiin tunnistamaan transkription aloituskohdasta (TSS) ihmisen

PIK3CA

(kuvio 4A ja B). 125 emäsparin segmentti, 5′-transloimaton alue (UTR) ja 2,3 kep: n TRR ihmisen

PIK3CA

kloonattiin ihmisen bakteerin keinotekoinen kromosomi (BAC, klooni numero: PR11-245C23). Olemme havainneet, että 5′-ylävirran säätelyalue ihmisen

PIK3CA

sijaitsee noin 50 kep ylävirtaan translaation aloituskodonista päällä (kuvio 4A). Tämä alue on erittäin runsaasti GC (kuvio 4B). Mapping RT-PCR vahvisti lisäksi TSS on

PIK3CA

, ja pieni liitos variantti tunnistettiin (kuvio 4C E). Hiiren

PIK3CA

5 ’ylävirtaan säätelysekvenssi kloonattiin myös samalla menetelmällä, ja sen havaittiin olevan 63,6%: n identtisyys ihmisen sekvenssin (kuvio 5) ja myös pieni introni.

. Kuva rakenteen ihmisen

PIK3CA

geeni ja sen 5 ’ylävirran säätelyalue. B. Alueella erittäin runsaasti GC löytyy

PIK3CA

5’TRR. C. Kuva käytettyjen alukkeiden kartoittamiseen RT-PCR

PIK3CA

transkription aloituspaikan (SST). D. Tulokset kartoitus RT-PCR. Ei ole mitään kaistan välillä forward-aluketta F1, joka sijaitsee ylävirtaan SST ja reverse-aluketta R sijaitsevat eksonin 1

PIK3CA

. Oikean koon bändejä voitiin havaita välillä alukkeen F2 tai F3 (molemmat sijaitsevat alavirtaan SST) ja reverse-aluketta RE pieni silmukoivat löytyy 5’UTR ihmisen

PIK3CA

geeni, joka voidaan havaita myös kartoittamalla RT-PCR (alukkeet F2 ja R). F. Yhteenveto tuloksista transkriptionaalista aktiivisuutta

PIK3CA

TRR fragmentteja.

edelleen karakterisoimiseksi transkriptionaalista aktiivisuutta promoottorialueen, koko 2,3 ke: n 5 ’TRR ​​tai vähitellen katkaistu promoottori fragmentit alakloonattiin yhdessä 316 tai 150 emäsparin transkripti alueesta PGL-perus toimittaja vektori paljastaa lusiferaasiekspressio (kuvio 4F). Vahva transkriptionaalinen aktiivisuus paikallistettiin -2340–159 emäsparin alueeseen lusiferaasianalyysissä, kun taas transkription aktiivisuus merkittävästi vähentynyt jälkeen -159 bp (kuvio 4F).

Seuraavaksi transkriptiotekijän sitoutumiskohtia ennustettiin ihmisten

PIK3CA

5’TRR

in silico

mukaan Genomatix (https://www.genomatix.de/index.html). Sitoutumiskohdat lukuisia stressiin liittyvien transkriptiotekijöiden havaittiin, kuten NF-KB; hypoksia-indusoituva tekijä (HIF); lämpöisku- proteiini (HSP); ja aktivaattori proteiini 1 (AP1) (kuvio 6). Siten stressi signaaleja välittävät nämä tekijät saattavat säädellä

PIK3CA

ilmentymistä proliferoimattomissa kasvainsoluihin alueilla väheni vaskularisaation ja lisääntynyt lymfosyyttien-tunkeutuva.

Expression ja lokalisoinnin ehdokas transkription tekijät

in situ

ilmaisu ja lokalisointi kolmen oletetun säätelytekijöiden syntyneiden yllä

in silico

analyysi, HIF1α; c-Jun, jäsen AP1 monimutkainen; ja p65-alayksikköä NF-KB, seulottiin vuonna 2008 ksenografteissa. Koska toiminta Näiden tekijöiden edellyttää ilmaisun ja tumaansiirtymiseen, me pidetään vahva ilmaisu ja ydinvoiman lokalisointi epäsuora todiste toiminnallisen aktivaation. Vahva ydinvoima HIF1α ilmentyminen nähtiin hajanaista solussa klustereiden Ki67- alueilla. HIF1α proteiini havaittiin myös Ki67 + alueilla, mutta se pääasiassa paikallisia sytoplasmaan (kuvio 7 A, D ja G). c-Jun-proteiini tiukasti ilmaistu väliset rajat Ki67 + ja Ki67- alueilla, joissa vain tumavärjäystä havaittiin. Harvoilla c-Jun-positiivisia soluja voitaisiin havaita Ki67 + alueilla, mutta ydin- c-Jun ei nähty Ki67- alueilla (kuvio 7 B, E ja H). Vahva ydinvoiman lokalisointi NF-KB /p65-proteiini nähtiin Ki67- alueilla ja Ki67 + lähialueilla Ki67- alueille (Kuva 7 C, F ja I). Mielenkiintoista on, että vahvin ydin- NF-KB /p65 havaittiin alueiden vieressä kudoksen kuolion (kuvio 7 F). Tämä data yhdessä

PIK3CA

promoottori analyysi viittaa siihen, että HIF1α ja NF-KB on osallisena ylösajon

PIK3CA

vuonna Ki67- alueilla

in vivo

. Sopusoinnussa tämän hypoteesin hypoksia /HIF-reitin on raportoitu säädellä

PIK3CA

syöpäsoluissa [48]. Koska hypoksinen sääntely

PIK3CA

on vahvistettu, me seuraavaksi keskittyneet sääntelystä

PIK3CA

jota NF-KB-reitin.

A-C immunohistokemiallinen värjäys ehdokas transkriptiotekijöiden HIF1α, c-Jun ja NF-KB 2008 ksenografteissa. Viiva osoittaa rajan Ki67 + p110α-alhainen, ja Ki67- p110α korkea alueilla. D F. Korkea suurennos A: sta C: nä, näyttää ilme ja ydinvoiman lokalisointi HIF1Α, c-Jun ja NF-KB 2008 ksenografteissa. G I. kuva lokalisoinnin ehdokkaan transkriptiofaktoreiden HIF1α, c-Jun ja NF-KB vuoden 2008 ksenograftimallissa. Suuri pisteet tarkoittavat sytoplasman sijaintia, kun taas pieniä pisteitä edustavat tumaanohjaussignaali. Viiva edustaa rajan Ki67 + p110α-alhainen, ja Ki67- p110α-korkea alueilla.

NF-KB sitoutuu promoottoriin ja ylössäätelee

PIK3CA

ilme

yhdenmukainen tärkeä rooli NF-KB säätelyssä

PIK3CA

, löysimme NF-KB sitoutumiskohdan konsensus-sekvenssit ihmisen ja hiiren

PIK3CA

5’TRRs (kuvio 8A). Ihmisen promoottori NF-KB sitoutumiskohdan sijaitsi -807–786 bp. Testasimme onko NF-KB säätelee transkription aktiivisuus ihmisen

PIK3CA

promoottori

in vitro

. NF-KB: n aktivaatio vaatii vapauttamaan sen estävä alayksikkö IκBα, joka mahdollistaa NF-KB: n translokaatio tumaan [34], [35]. Ohimenevä pakko ilmentyminen villin tyypin IκBα tai mutantti-IκBα (IκBαM), jotka molemmat sitoutuvat NF-KB: n ja estää sen translokaation tumaan, heikennetty transkriptionaalista aktiivisuutta

PIK3CA

promoottorin, joka käy ilmi lusiferaasianalyysissä. Irrottaminen NF-KB: n sitoutumiskohta promoottorialueen kumosi inhiboivaa aktiivisuutta IκBα tai IκBαM (kuvio 8 B ja C).

. Kuva ennustetun NF-KB sitoutumiskohta ihmisen (ylhäällä) tai hiiren (alhaalla)

PIK3CA

promoottorialueen. B. Havainnekuva, jotka käsittävät lusiferaasi kytkettynä ihmisen

PIK3CA

promoottorin (Luc-2340/316) tai ilman NF-KB sitoutumiskohta (Luc-378/316). C. Yhteenveto lusiferaasiaktiivisuudet Luc-2340/316 ja Luc-378/316 ko-transfektoitiin pCMV IκBα tai pCMV IκBαM. D. Gelshift määritys käyttäen munasarjasyöpäsolu tumauutteesta jälkeen TNF-α stimulaatiota. Kaista 1, NF-KB: n sitoutumiskohdan villin tyypin ihmisen

PIK3CA

promoottori (paino- hu

PIK3CA

NF-KB: n koetin) yksin; kaistat 2 ja 3, paino- hu

PIK3CA

NF-KB anturi + tumauutteesta; kaista 4, ohjata NF-KB anturi + tumauutteesta, kaistat 5 ja 6, mutatoitunut hu

PIK3CA

NF-KB anturi + tumauutteesta; kaista 7, mutatoitunut ohjaus NF-KB anturi + tumauutteesta; kaistat 8 ja 9, scramble hu

PIK3CA

NF-KB anturi + tumauutteesta. E. Gel shift määritys käyttämällä yhdistelmä NF-KB /p50-proteiinin. Kaista 1, p- hu

PIK3CA

NF-KB koetin yksin; kaistat 2 ja 3, paino- hu

PIK3CA

NF-KB: n koetin + p50; kaista 4, mutatoitunut hu

PIK3CA

NF-KB koetin yksin; kaistat 5 ja 6, mutatoitunut hu

PIK3CA

NF-KB: n koetin + p50; kaista 7, hallita NF-KB koetin yksin; kaistat 8 ja 9, hallita NF-KB: n koetinta + p50.

ennustettu NF-KB: n sitoutuva sekvenssi ihmisen

PIK3CA

promoottorin testattiin edelleen käyttämällä geeliä shift määritystä. Nuclear proteiineja 2008 munasarjasyövän solulinja käsiteltiin TNF-α pystyivät siirtämään (sitoa) oligonukleotidisekvenssit sisälsi ennustetun NF-KB-sitoutumiskohdan ihmisen

PIK3CA

promoottori, mutta eivät pystyneet siirtämään joko mutantti tai mock oligonukleotidisekvenssit (kuvio 8 D). Lisäksi, yhdistelmä-DNA-NF-KB: n /p50-proteiini pystyi siirtämään oligonukleotidisekvenssit, jotka sisältävät ennustetun NF-KB: n sitoutumiskohtia, mikä vahvistaa niiden läsnäolo ihmisen

PIK3CA

promoottorin (kuvio 8 E). Lopuksi läsnäolo NF-KB: n sitoutumiskohtaa

PIK3CA

promoottori vahvistettiin kromosomi immuunisaostustesti (chip).

Tulehdus voi säädellä

PIK3CA

ilmaisun kautta NF KB-reitin

aikana kasvaimen kasvua, metabolinen /iskeeminen stressi indusoi kasvainsolun kuoleman, rekrytointi tulehdussolujen kuten makrofagit. Nämä release proinflammatoristen sytokiinien, jotka aktivoivat NF-KB-reitin [25], [33], [34], [35]. Kartoitimme jakelu kuolion, kasvain infiltroituneen makrofagien ja NF-KB: n vuoden 2008 ksenograftimallissa. Morfologiset kuolion havaittiin pääasiassa Ki67- p110α + alueet, sijaitsevat usein niiden keskustassa (Kuva 9). Reipas CD11b + makrofageja, jotka tuottavat pro-tulehdus sytokiinien, kuten TNF-α, todettiin yhdessä alueiden kuolion (kuvio 9 B-D).

. H & E-värjäys 2008 kasvaimen paljastaa näkyvä alue kuolion (N). B ja C. immunohistokemiallinen värjäys hiiren CD11 paljastaa makrofagien soluttautuvat on 2008 ksenograftin. CD11 + soluja tunkeutumaan kasvaimista Ki67-negatiivisten alueiden läheisyydessä kuolion. C. Korkea suurennos B. D. Double immunovärjäyksen CD11b (vihreä, FITC) ja Ki67 (punainen, Texas Red) paljastaa CD11 + makrofagien pääosin proliferoimattomissa Ki67-negatiivisia alueita. E. ChIP analyysi NF-KB: n sitoutuminen endogeeniseen

PIK3CA

promoottori.