PLoS ONE: G4-DNA muodostumista HRAS Järjestäjä ja Rational Design Decoy Oligonukleotidit Cancer Therapy
tiivistelmä
HRAS
on esikasvaintekijän mukana kasvainten synnyssä virtsarakon syöpä .
HRAS
promoottori tunnistimme kaksi G-rikas elementtejä,
HRAS
-1 ja
HRAS
-2, että kertaiseksi, osaksi antiparalleerin ja rinnakkaisen Nelivaiheinen (
qhras
-1,
qhras
-2). Kun toimme järjestyksessä
HRAS
-1 tai
HRAS
-2 kahden pisteen mutaatioita, jotka estävät Nelivaiheinen muodostuminen, transkriptio kasvoi 5-kertaiseksi, mutta kun me vakiintui G-kvadrupleksien guanidiini- ftaalosyaniinit, transkription laski 20%: iin kontrolliarvoista. Chip huomasimme, että sekvenssi
HRAS
-1 sitoo ainoastaan MAZ, kun taas
HRAS
-2 sitoo MAZ ja SP1: kaksi transkriptiotekijöiden tunnustaa guaniini laatikoita. Olemme myös havainneet, EMSA että yhdistelmä-MAZ-GST sitoutuu sekä
HRAS
kvadrupleksien, vaikka SP1-GST vain sitoutuu
qhras
-1. Yli-ilmentyminen MAZ ja SP1 synergistisesti aktivoi
HRAS
transkriptio, vaikka hiljentäminen kukin geeni RNAi syntyy vahva alas-säätely transkription. Kaikki nämä tiedot osoittavat, että
HRAS
G-kvadrupleksien käyttäytyvät kuin transkription repressorit. Lopuksi, suunnittelimme houkutuslintuna oligonukleotideja jäljitteleviä
HRAS
kvadrupleksien, laakeri (R) -1-O- [4- (1-Pyrenylethynyl) fenyylimetyyli] glyserolia ja LNA muutoksia lisäämään vakautta ja nukleaasiresistenssi (G4- houkuttimina). G4-houkuttimina tukahdutettu
HRAS
transkription ja aiheutti voimakkaan antiproliferatiivista vaikutusta, jota välittää apoptoosin, vuonna T24 virtsarakon syövän soluihin, joissa
HRAS
on mutatoitunut.
Citation: Membrino , Cogoi S, Pedersen EB, Xodo LE (2011) G4-DNA Formation
HRAS
Promoottori ja Rational Design Decoy Oligonukleotidit Cancer Therapy. PLoS ONE 6 (9): e24421. doi: 10,1371 /journal.pone.0024421
Editor: Mark Isalan, Center for Genomic asetus, Espanja
vastaanotettu: 03 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 09 elokuu 2011; Julkaistu: 08 syyskuu 2011
Copyright: © 2011 Membrino et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: AIRC 2010 ”Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro”. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelu manuscruipt.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
ras-geenin perhe koostuu kolmesta toiminnallista esikasvaintekijöiden (
HRAS
,
sääntelyviranomaisten
ja
KRAS
), jotka koodaavat guaniini-sitovia proteiineja jakaminen korkea homologia (p21
RAS) [1]. Nämä proteiinit, joka sijaitsee sisemmän solukalvon läpi farnesyylitrans- ryhmä [2], ovat aktiivisia, kun ne ovat sitoutuneet GTP, ja aktiivinen, jos GTP hydrolysoituu bruttokansantuotteeseen [3]. Ras-proteiinit säätelevät solujen vasteita monille solunulkoiseen ärsykkeisiin, mukaan lukien mitogeenit ja erilaistumisen tekijöitä [4]. Ras-geenit ilmentyvät kudosspesifisellä tavalla:
HRAS
ilmentyy voimakkaasti ihoa ja lihaksia
KRAS
paksusuolen ja kateenkorvassa ja
sääntelyviranomaisten
mies- siemennestettä kudos [1]. Ras-geenit on samanlaiset rakenteet ja sekvenssit viisi eksonia, joista ensimmäinen on Koodaamattomat, ja niitä ylläpidetään silmukointipaikoista. Intronit, sen sijaan, ovat eri pituisia ja sekvenssit [1]. RAS esikasvaintekijät muutetaan onkogeenien pistemutaatioilla jotka vähentävät kapasiteettia koodatun proteiinin hydrolysoimiseksi GTP bruttokansantuotteeseen, sillä seurauksella, että p21
RAS pysyy konstitutiivisesti aktiivinen. Hyperactivated ras proteiinit stimuloivat fosforylaatio kaskadeja lukien Raf /MEK /ERK-reitin, joka johtaa hallitsemattomaan soluproliferaatioon [5], [6]. Mutaatiot ras-geenit ovat usein monissa ihmisen kasvaimissa [7], [8].
HRAS
mutaatiot ovat harvinaisempia, mutta niillä on suuri esiintyvyys ihon papillomas ja virtsarakon kasvaimissa [9]. Koska 80% rakkokasvaimista satama
HRAS
mutaatioita [10] ja yli puolet rakkokasvaimista yli-ilmentää
HRAS
[11], sekä mutaation ja yli-ilmentyminen ovat tärkeitä tekijöitä kasvainten synnyssä virtsarakon syövän [12]. Oikeastaan se on viime aikoina osoittanut, että matalan tason ilmauksia konstitutiivisesti aktiivinen
HRAS
aiheuttama yksinkertainen urothelial liikakasvu, kun kaksinkertaistamista aktivoitua
HRAS
onkogeeni laukeaa nopeasti kasvava ja tunkeutuu kasvaimia koko virtsan suolikanavan. Koska keskeistä roolia
HRAS
yli-ilmentymisen ja mutaatioita kasvainten synnyssä virtsarakon syövän, yksi houkutteleva terapeuttinen strategia voisi olla estää
HRAS
transkriptio molekyyleillä, jotka kykenevät heikentää aktiivisuutta geenin promoottori. Tämän tavoitteen kysyimme, miten
HRAS
transkriptio säädellään. Havaitsimme, että promoottori
HRAS
sisältää useita kopioita GGGCGGG elementin tai sen komplementti. Tämä G-box on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa Sp1-transkriptiotekijän [13], [14]. Ylävirtaan transkription aloituskohdasta (TSS) on ajojen guaniinit ulottuu yli kolme SP1 sivustoja, jotka ovat mahdollisia sivustoja G-Nelivaiheinen muodostumista. Olemme siis arveltu, että G-rikas elementtejä saattavat vaikuttaa transkription säätelyyn. G4-DNA ovat epätavallisia rakenteita stabiloidaan tasomaisia neljä guaniinit (G-kvartetti) liittyvät toisiinsa, jonka Hoogsteen vetysidoksia [15]. Reunat päätelaitteen G-kvartetti on kytketty silmukoita, jotka voivat vaihdella sekä pituudeltaan ja topologia, joka aiheuttaa erilaisia konformaatioita [16]. Genominlaajuisten analyysit ovat osoittaneet, että ajojen guaniinit on runsaasti geenin promoottori ympäröivillä alueilla TSS [17] – [20]. On teorian, siksi että G4-DNA saattaa olla mukana transkription säätelyyn [21] – [25]. Tutkimuksemme tarjoaa vakuuttavia todisteita, että
HRAS
transkriptio säätelee vuorovaikutusta SP1, MAZ ja G4-DNA, joka toimii transkription repressori. Perusteella tämä löytö olemme suunnitelleet G-rikas oligonukleotidien spesifistä
HRAS
joka on voimakas antiproliferatiivinen vaikutus virtsan syöpäsoluissa joissa on mutantti
HRAS
. Vaikka sytotoksisuutta tiettyjen G-rikas oligonukleotidien on aiemmin raportoitu, niiden vaikutusmekanismia ei vielä täysin ymmärretä [26], [27]. Tutkimuksemme osoittaa, että suunniteltu Nelivaiheinen muodostava oligonukleotidit voivat toimia sitomalla MAZ ja mikä heikentää
HRAS
transkriptio. Niiden voimakas antiproliferatiivinen vaikutus T24 virtsarakossa syöpäsoluja, G4-houkuttimina näyttävät olevan erittäin lupaavia efektori lääkkeitä virtsarakon syövän hoidossa.
Tulokset
HRAS
promoottori on rakenteellisesti polymorfinen
promoottori ihmisen
HRAS
geeni puuttuu tyypillinen TATA ja CAAT laatikoita, sisältää suuren G + C-pitoisuus (80%) ja useita kopioita GGGCGGG (G-box) tunnustama transkriptiotekijä SP1 [13], [14]. Kolme G-laatikkoa lähimpänä RNA aloituspaikat päällekkäin Nelivaiheinen muodostavia sekvenssit, eli
HRAS
-1 (435-462, hakunumero J00277) ja
HRAS
-2 (506-530 , J00277) (kuvio 1). Tuoreen tutkimuksen, Nelivaiheinen muodostava sekvenssit kattaa SP1 sitovia alkuaineita on useita geenejä [28]. Olemme saaneet ensimmäisen vihjeen, että
HRAS
promoottori on rakenteellisesti polymorfinen kun sekvensoimalla ekspressiovektorit erityisesti rakennettu tätä tutkimusta varten. Kun Sekvenointialuke-extension reaktiot suoritettiin alukkeilla komplementaarisia G-rikas lohkon, Taq yllättäen pidätettiin
HRAS
-2 tai
HRAS
-1 G-rikas elementtejä. Sen sijaan alukkeilla täydentää C-rikas lohkon emme noudata mitään estettä. Tämä viittaa siihen, että molemmat
HRAS
-1 ja
HRAS
-2 sekvenssit muodostunut epätavallinen rakenteita. Meidän hypoteesi varmistettiin polymeraasi-stop määrityksissä. Suunnittelimme kaksi lineaarista villityypin malleja sisältäviä
HRAS
-1 tai
HRAS
-2 ja yksi mutantti mallin, jossa neljä G → T tehtiin mutaatioita
HRAS
– 2 estää Nelivaiheinen muodostumista. Alukepidennysmenetelmää reaktiot osoittivat, että Taq-polymeraasin läsnä ollessa kalium pidätettiin 3 ’päähän
HRAS
-2 tai
HRAS
-1, juuri ennen ensimmäisen ajon guaniinit, pitämisessä muodostumista G-Nelivaiheinen rakenne kunkin G-rikas elementti (kuva S1).
Kaksi G-rikas elementtejä (
HRAS
-1 ja
HRAS
– 2), joka sijaitsee ylävirtaan transkription aloituskohdasta voidaan mahdollisesti taita G-Nelivaiheinen rakenteita. Nelivaiheinen muodostava G-rikas elementtejä sisältävät sitoutumiskohtia transkriptiofaktoreiden MAZ ja SP1.
Promoottorisekvensseihin
HRAS
-1 ja
HRAS
-2 muodostavat stabiileja G4-DNA rakenteet in vitro
käsityksen G-kvadrupleksien muodostama
HRAS
G-rikas elementtejä saatiin DMS-footprinting, ympyrädikroismilla (CD) ja fluoresenssiresonanssi- (FRET) kokeissa. Kuvio 2 esittää tulokset, jotka saatiin sekvenssin
HRAS
-1. DMS-jalanjäljet 27-mer
HRAS
-1 vedessä tai puskurissa, joka sisälsi 100 mM Li
+ tai Cs
+ (kaistat 1, 4, 5) osoittavat, että kaikki guaniinit reagoivat DMS . Sen sijaan, kun läsnä on 50, 100 tai 140 mM KCI (kaistat 2, 3, 9) guaniinit G-kulkee A-D asteittain suojattu, kun taas guaniinit G8 ja G14 muuna ”TTGC” ja ”CGCA ”sekvenssit eivät ole. Tämä pilkkoutumiskuviota viittaa siihen, että
HRAS
-1 taittuu G-Nelivaiheinen (
qhras
-1). Läsnäollessa 50 nM TMPyP4,
HRAS
-1 antaa vahvan jalanjälki joko alhaisilla (1 mM) tai korkea (100 mM) KCI pitoisuus (kaistat 7, 8) [29]. Kuten odotettua, mutanttisekvenssi
h1-mut
, joissa
HRAS
-1 neljä G → T mutaatioita, jotka poistavat taitto, ei anna mitään jalanjälki. Määrittää lohkon suunta
qhras
-1 käytimme CD (kuva 2c, d). CD-spektri
qhras
-1 100 mM KCl: a on tunnusomaista positiivinen ja negatiivinen ellipticities on 287 ja 260 nm, vastaavasti, mikä on tyypillistä vastakkaisiin konformaatio [30]. Kuumentamalla näyte saimme sulamiskäyrään (287 nm elliptisyytenä
versus
lämpötila), joka ei ollut täysin päällekkäin kanssa jäähtymiskäyrää, koska ensimmäinen oli hieman kaksivaiheisesti kun taas toinen oli monofaasisten. Vielä herkkä analyysimenetelmä saatiin FRET-sulamispiste kokeet sekvenssi
HRAS
-1 end-leimattu FAM ja TAMRA on 5 ja 3 ’päähän, tässä järjestyksessä. Saimme hyvin ratkaistu kaksivaiheisesti sulamiskäyrä- kanssa
T
M: n 53 ja 67 ° C osoittaa, että
HRAS
-1 taittuu ainakin kahdessa kvadrupleksien (kuvio 2e). Kun pitoisuus
HRAS
-1 lisättiin yhtä suuruusluokkaa 200 nM ja 2 uM,
T
M: n ei muuttunut: käyttäytymistä tyypillinen molekyylin sisäinen rakenne ( ei näytetty). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että
HRAS
-1 omaksuu antiparalleerin Nelivaiheinen joka voisi olettaa erilaisia topologioita: yksi lateraalimerkein silmukat on kuvassa 2f [16]. Vaikka me tietävät footprinting ja CD tietojen osalta guaniinit jotka ovat mukana muodostumiseen antiparallel
qhras
-1, käsityksen rakenne tämän Nelivaiheinen saadaan vasta NMR. Kuvio 3 esittää tulokset, jotka saatiin sekvenssin
HRAS
-2. DMS-jalanjäljet 24-mer
HRAS
-2 osoittaa, että 10, 50, 100 ja 140 mM KCl (kaistat 2-5), G-kulkee A-D on suojattu DMS, kun taas G10 , G12, G13, G21 ja G22 reagoivat DMS. Tämä osoittaa, että guaniinin kolmisoinnut muodostavan Nelivaiheinen olisi G3-G4-G5, G7-G8-G9, G14-G15-G16, G18-G19-G20. Se, että G16 on joitakin reaktiivisuus DMS viittaa siihen, että pentaguanine G12-G16 venytys voi osallistua sen Nelivaiheinen joko G14-G15-G16 tai G13-G14-G15. Mutantti
h2-mut
sekvenssin ja villityypin
HRAS
-2 100 mM Li
+ tai Cs
+ ei antanut mitään jalanjälki (kaistat 6-8). Footprinting läsnä ollessa 50 nM TMPyP4 on erittäin vahva (kaistat 9, 10). CD kirjo
HRAS
-2 osoittaa vahvaa elliptisyytenä 260 nm osoitus G-Nelivaiheinen kanssa rinnakkainen konformaatio (kuvio 3c) [30]. Tämä rakenne on niin vakaa, että CD 85 ° C: ssa näkyy edelleen voimakasta 260 nm elliptisyydestä. Vakaus eri KCI pitoisuuksia määritettiin sekvenssi
HRAS
-2 leimattu FAM ja TAMRA. Suoritimme FRET-sulaminen kokeissa 20, 40, 60, 100 ja 140 mM KCI ja saadaan
T
M arvot 78-82, 85, 90 ja 92 ° C, vastaavasti (Kuva 3d). Tällöin myös
T
M: n ei muutu, kun pitoisuus nostettiin kertaluokkaa (200 nM 2 uM) (ei esitetty). Kaiken kaikkiaan meidän tiedot osoittavat, että
HRAS
-2 muodostaa rinnakkaisen G-Nelivaiheinen (
qhras
-2), jonka otaksuttu rakenne päätellä DMS-footprinting ja CD pitäisi olla joko 1/1/4 tai 1/2/3 silmukoita (kuvio 3e). Lopullinen rakenne toimeksianto on mahdollista vain perusteella NMR-tiedot.
(a) Villityypin (
HRAS
-1) ja mutatoitunut (
h1-mut
) sekvenssit analysoitiin DMS-footprinting. Täysi neliöt osoittavat DMS-reaktiivinen guaniinit, avoimet neliöt osoittavat DMS-reagoimattomia guaniinit; (B) DMS-footprinting on
HRAS
-1 vedessä (kaista 1);
HRAS
-1 50 ja 100 mM KCl (kaistat 2 ja 3);
HRAS
-1 100 mM CsCl tai LiCl (kaistat 4 ja 5);
h1-mut
100 mM KCl (kaista 6);
HRAS
-1 50 mM TMPyP4, 1 mM KCI (kaista 7);
HRAS
-1 50 mM TMPyP4, 100 mM KCI (kaista 8);
HRAS
-1 140 mM KCI (kaista 9);
h1-mut
100 mM KCl (kaista 10); (C) CD-spektrit 25 ja 90 ° C osoittavat, että
HRAS
-1 taittuu antiparalleerin G-Nelivaiheinen; (D) sulamiskäyrät Nelivaiheinen
HRAS
-1 saatu piirtämällä 287 nanometrin elliptisyytenä vastaan T.
T
M noin 63 ° C: ssa saatiin lämmityksen ja jäähdytyksen käyrät ; (E) FRET-sulamisen käyrät Nelivaiheinen
HRAS
-1 leimattu FAM ja TAMRA osoittavat, että se taittuu kahdessa G-kvadrupleksien kanssa
T
M 53 ja 67 ° C (Esim. 475 nm, Em. 520 nm); (F) Mahdolliset konformaatioita
HRAS
-1, joka perustuu footprinting ja CD tiedot, ovat antiparallel kvadrupleksien kanssa sivusuunnassa ja sivusuunnassa /lävistäjä silmukoita. Nelivaiheinen lateraalimerkein silmukat on esitetty kuvassa.
(a) villityypin ja mutatoidun
HRAS
-2 sekvenssit analysoitiin DMS-footprinting. Täysi neliöt osoittavat DMS-reaktiivinen guaniinit, avoimet neliöt osoittavat DMS-reagoimattomia guaniinit; (B) DMS-footprinting on
HRAS
-2 vedessä (kaista 1);
HRAS
-2 1, 10, 50, 100 mM KCI (kaistat 2-5);
HRAS
-2 100 mM LiCl tai CsCI (kaistat 6,7);
h2-mut
100 mM KCl (kaista 8);
HRAS
-2 50 nM TMPyP4, 1 mM KCI (kaista 9);
HRAS
-2 50 nM TMPyP4, 100 mM KCI (kaista 10). Guaniinit G10, G12, G13 ja G21, G22 lohkaistaan taas muut guaniinit eivät ole (paitsi G16 osoittaa alhainen reaktiivisuus). Mutant
h2-mut
ei osoita footprinting 100 mM KCI; (C) CD-spektrit Nelivaiheinen
HRAS
-2 eri lämpötiloissa välillä 25 ja 90 ° C: ssa viittaavat siihen, muodostumista vastakkaisiin G-Nelivaiheinen; (D) FRET-sulamista Nelivaiheinen
HRAS
-2 20, 40, 60, 100 ja 140 mM KCl: a on esitetty vain yksi siirtymä T
M, 78, 82, 85, 90, 92 ° C; (E) mahdollinen G-Nelivaiheinen rakenne
HRAS
-2, rinnakkainen konformaation kanssa 1/1/4 tai 1/2/3 silmukoita, jotka perustuvat footprinting ja CD tiedot.
G4-DNA epävakautta pistemutaatioiden
HRAS
-1 ja
HRAS
-2 voimakkaasti upregulate
HRAS
transkriptio
Koska sekvenssit
HRAS
-1 ja
HRAS
-2 sijaitsevat välittömästi ylävirtaan transkription aloituskohdasta ja muotoa
in vitro
vakaa G-kvadrupleksien, kysyimme mitä tapahtuu
HRAS
transkriptio kun kapasiteetti Nelivaiheinen muodostumisen sekvenssit
HRAS
-1 ja
HRAS
-2 poistetaan. Ongelman vaiheessa rakensimme plasmidin, pHRAS-luc, joissa tulikärpäsen lusiferaasi vetämänä
HRAS
promoottori. Alkaen pHRAS-luc meillä on saatu mutageneesillä kaksi mutantti plasmidit: pHRAS-Mut1 ja pHRAS-Mut2, jossa kaksi guaniinit toisen ja kolmannen G-tetrads oletetun kvadrupleksien korvattiin tymiinin /sytosiini tai tymiiniä (kuvio 4a) . Nämä mutaatiot kumosi kapasiteettia sekvenssit
HRAS
-1 ja
HRAS
-2 taittaa osaksi Nelivaiheinen (kuva S2). Villityypin ja mutantti-plasmidit kotransfektoitiin HeLa-soluissa, joissa PRL-CMV, vektori koodaa
Renilla
lusiferaasi. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen mittasimme tulikärpäsen ja
Renillaa
lusiferaaseista toimintaa lysaatit käsittelemättömien ja käsiteltyjen solujen. Tulokset esitetään kuviossa 4b, joka estää Nelivaiheinen muodostuminen aiheuttaa dramaattinen kasvu tulikärpäsen lusiferaasin ilmentymisen, jopa 5-kertainen verrattuna kontrolliin. Tämä viittaa vahvasti siihen, että G-kvadrupleksien muodostama sekvenssit
HRAS
-1 ja
HRAS
-2 rakenteellisia elementtejä
HRAS
promoottori jotka käyttäytyvät repressoreina, havaittuna että
CMYC
geeni [21].
(a) Kaksi G4-DNA epävakautta pistemutaatioiden
HRAS
-1 tai
HRAS
– 2 elementti on otettu käyttöön. Plasmidi pHRAS-Mut1 sisältää mutatoitunut
HRAS
-1 elementti, kun taas plasmidi pHRAS-Mut2 sisältää mutatoitunut
HRAS
-2 elementti; (B) Dual lusiferaasianalyysissä osoittaa, että pistemutaatiot aiheuttavat jopa 5-kertainen
HRAS
promoottorin aktiivisuutta (katso kuva 5 legenda).
G4-DNA vakauttava guani- ftaalosyaniinit tukahduttaa
HRAS
transkriptio
koska Nelivaiheinen DNA käyttäytyy repressorin elementti
HRAS
, tutkimme vaikutus transkriptio G4-DNA vakauttava ligandeja. Koska niiden spesifisyyden G4-DNA, meidän kokeissa käytettiin ligandeina muutettu ftalosyaniinit: tetrakis (di-guanidiini) ftalosyaniini (DIGP) ja sen Zn sisältävä johdannainen Zn-DIGP (kuvio 5a) [31] – [33] . HeLa-soluja käsiteltiin ensin 1 tai 5 uM DIGP tai Zn-DIGP 24 tuntia ja sitten ko-transfektoitiin seoksella pHRAS-luc ja PRL-CMV. Transfektion jälkeen solut annettiin kasvaa 48 tuntia ennen kuin tulikärpäsen ja
Renilla
lusiferaasit aktiivisuus mitattiin luminometrillä. Kontrollina (i) käsittelimme solut TMPyP2, porfyriinin, joka ei sitoudu G4-DNA [34]; (Ii) käytimme reportterina vektorin pHRAS-Mut1 tai pHRAS-Mut2 joissa on mutatoitunut G-elementti pysty muodostamaan Nelivaiheinen rakenteen. Kuvio 5b, c, d osoittaa, että DIGP ja Zn-DIGP inhiboivat voimakkaasti lusiferaasin villityypin pHRAS-luc, kun taas TMPyP2 ei. Lisäksi ftalosyaniinit eivät inhiboi lusiferaasin soluja käsiteltiin mutantti plasmidit pHRAS-Mut1 tai pHRAS-Mut2, sopusoinnussa sen kanssa, että G-kvadrupleksien ei voida muodostaa nämä vektorit. Nämä tiedot lisänäyttöä että kvadrupleksien
qhras
-1 ja
qhras
-2 toimivat transkription repressors.
(a) rakenne tetrakis (di-guanidiini) ftalosyaniini (DIGP) käytetty, jossa on Zn sisältävä analogi Zn-DIGP, lusiferaasin kokeisiin; (B) Dual Lusiferaasimäärityksiä osoittavat, että guani- ftaalisyaniinit DIGP ja Zn-DIGP, vakauttava
HRAS
-1 ja
HRAS
-2 kvadrupleksien, tukahduttavat
HRAS
promoottorin aktiivisuutta. Tätä vaikutusta ei havaittu mutantti plasmideilla pHRAS-Mut1 ja pHRAS-Mut2 (kontrolli) (kaistat c ja d). Suhteellinen lusiferaasia saadaan R
T /R
NT x 100, jossa R
T ja R
NT ovat (tulikärpäsen lusiferaasi) /(
Renilla
lusiferaasin) in T24-soluissa käsitelty ftaalisyaniinit ja käsittelemättömien solujen. Erot ohjaus tukee opiskelijan
t
testi, P 0,05 (yksi tähti), P 0,01 (kaksi tähdellä).
transkriptiotekijöiden SP1 ja MAZ sitoutuvat Nelivaiheinen muodostamalla sekvenssit (QFS)
HRAS
-1 ja
HRAS
-2
Kuten transkriptio tiedot viittaavat siihen, että molemmat sekvenssit
HRAS
-1 ja
HRAS
-2 ovat kriittisiä transkription, kysyimme ne tunnistaa ydin- proteiineja. Vastaus tähän kysymykseen saatiin liikkuvuutta-shift määrityksissä kanssa HeLa tumauutteesta. Kuvio 6a osoittaa, että sekä
HRAS
duplexes muodossa, jonka HeLa tumauutteesta erillisiä DNA-proteiini-kompleksit, mikä muistuttaa merkitystä näiden sekvenssien
HRAS
transkriptio. Ishii
et al.
Osoitti, että sekvenssi
HRAS
-2, joka sisältää kaksi kopiota GGGCGGG, sitoo SP1 [13], [14]. Kuitenkin sekvenssit
HRAS
-1 ja
HRAS
-2 pitäisi myös vuorovaikutuksessa myc liittyvät sinkki sormella transkriptiotekijä (MAZ), sen sitoutumiskohta oli (G /C) GG (C /A) GGG [35], [36]. Itse asiassa, on raportoitu, että MAZ ja Sp1 usein transkription säätelemiseksi yhteistoimintaan tavalla [37], [38].
(a) EMSA osoittaa muodostumista DNA-proteiini-komplekseja dupleksit
HRAS
-1 ja
HRAS
-2 ja HeLa tumauutteesta; määriä uutetta käytettiin (ug) on merkitty radioaktiivisesti DNA oli noin 4 nM. Kirjaimet a, b ja c osoittavat DNA-proteiini-komplekseja; (B) Kromatiini immunosaostusanalyysille osoittaa vuorovaikutusta MAZ ja SP1 sekvenssit
HRAS
-1 ja
HRAS
-2. Vuorovaikutus MAZ ja SP1 kanssa
HRAS
sekvenssit analysoitiin monistamalla PCR: llä 190 emäsparin (
HRAS
-1) ja 161 emäsparin (
HRAS
-2) fragmentit. Molemmat bändit monimutkaisille MAZ:hras-1 on saatu läsnä ja poissa ollessa Mg
2+ seoksessa (c) EMSA osoittaa sitoutumista MAZ-GST ja SP1-GST kvadrupleksien
qhras
-1 ja
qhras
-2.
sen todistamiseksi, että SP1 ja MAZ sitoutuvat sekvenssit
HRAS
-1 ja
HRAS
-2 alle
in vivo
olosuhteissa, suoritimme kromatiinin immunosaostuksella (chip) kokeissa. Elävät HeLa-soluja käsiteltiin formaldehydin silloittamiseksi DNA-proteiini-komplekseja, kromatiinin leikattiin palasiksi ja sitten immunosaostettiin anti-MAZ ja anti-Sp1-vasta-aineita (Ab: t). Runsaus
HRAS
promoottorijaksoihin Immunosaostumien mitattiin PCR: llä käyttäen spesifisiä alukkeita sekvenssit
HRAS
-1 ja
HRAS
-2. Tulokset esitetään kuviossa 6b osoittavat, että: IgG Ab ei immunosaostaa DNA-proteiinia sisältävät kompleksit sekvenssin
HRAS
-1 tai
HRAS
-2 (negatiivinen kontrolli); anti-MAZ Ab teki immuunisaostumassa DNA-proteiini-kompleksi, joka sisältää
HRAS
-1 ja
HRAS
-2; anti-Sp1 Ab vedetty alas kompleksin
HRAS
-2. Mittaamalla intensiteetti bändejä, huomasimme, että
HRAS
sekvenssit olivat runsaampaa Immunosaostumien anti-MAZ ja anti-SP1 Abs kuin IgG Ab immuunisaostumassa. Olemme näin ollen, että alle
in vivo
olosuhteissa MAZ liittyy sekvensseille
HRAS
-1 ja
HRAS
-2, kun SP1 liittyy sekvenssin
HRAS
-2. Tämä vahvistettiin EMSA rekombinantin MAZ ja SP1 (kuva S3). Kuten aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että MAZ sitoutuu G4-DNA hiiren
KRAS
[24] ja
c-myb
[39] promoottorit, tutkimme, se sitoutuu myös
HRAS
kvadrupleksien. Suoritimme EMSA rekombinanteilla MAZ ja SP1, joka ilmaistiin
E. coli
kuten GST-fuusioproteiinit (kuva S4). Kuviossa 6c on esitetty, että pH: ssa 7,4, 50 mM KCI,
qhras
-1 ja
qhras
-2 kasvavia määriä MAZ-GST muodossa – kun läsnä on 100-kertainen ylimäärä nonradiolabelled poly d (IC) – kaksi hidastuu bändejä muodostumisen vuoksi kaksi DNA-proteiini-komplekseja, todennäköisesti kanssa 01:01 ja 01:02 stoikiometria. On tärkeää huomata, että 50 mM CsCl, jossa
HRAS
sekvenssit ovat rakenteettomia (ks DMS jalanjälki), molemmat kompleksit epätasapainoon osoittaa, että DNA-proteiini-vuorovaikutus välittyy Nelivaiheinen rakennetta. Puskurissa pH: ssa 9, jossa MAZ todennäköisesti muuttaa oman taitto, DNA-proteiini-vuorovaikutus inhiboituu myös. Testasimme myös sitoutumisen SP1-GST
HRAS
kvadrupleksien ja totesi, että SP1-GST vuorovaikutuksessa antiparallel
qhras
-1 Nelivaiheinen, mutta heikommassa tavalla verrattuna MAZ.
MAZ ja SP1 synergistisesti aktivoida
HRAS
transkriptio
Sen todistamiseksi, että MAZ ja SP1 osallistuvat
HRAS
transkriptio, me kotransfektoidaan plasmidi pHRAS-luc HeLa-soluissa joko pMAZ (koodaus MAZ) tai pSp1 (koodaus SP1) tai molempia plasmideja (kuvio 7a). Kun pMAZ tai pSp1 kotransfektoitiin kanssa reportteri vektori, taso lusiferaasin ilmentymisen kasvoi 50% kontrolliin verrattuna. Kun sekä pMAZ ja pSp1 kotransfektoitiin reportteri vektori, transkription kasvoi lähes 3-kertaiseksi kontrolliin verrattuna, mikä osoittaa, että molemmat proteiinit synergistisesti aktivoitu
HRAS
promoottori. Synergian oli voimakkaampi (7-kertainen kontrolliin verrattuna), kun pMAZ ja pSp1 kotransfektoitiin mutantti vektorin pHRAS-Mut1 tai pHRAS-Mut2, laakeri mutatoitu
HRAS
-1 tai
HRAS
– 2 sekvenssejä, jotka eivät pysty muodostamaan Nelivaiheinen rakenteita. Tämä viittaa siihen, että transkriptio aktivoituu sekvenssit
HRAS
-1 ja
HRAS
-2 ovat levitetyssä duplex konformaatioon. Lisäksi todisteena siitä, että transkriptio edellyttää sekä MAZ ja SP1, me pudotti Luotettavat shRNA kummankin transkriptiotekijöiden erikseen (kuva S5). HeLa-soluja käsiteltiin shRNA spesifisiä MAZ tai Sp1 ja tasot
HRAS
transkriptien mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä, 48 ja 72 tuntia hoidon jälkeen. Voidaan nähdä, että
HRAS
transkription alennettiin 30 ja 20% verrokista, 48 h käsittelyn jälkeen anti MAZ ja anti SP1 shRNA, vastaavasti (kuvio 7b). Yhdessä meidän tiedot osoittavat, että
HRAS
transkriptio aktivoituu synergistisesti MAZ ja SP1.
(a) transfektoiduissa HeLa-soluissa pHRAS-luc /PRL-CMV, pHRAS-luc /PRL-CMV /pMAZ; pHRAS-luc /PRL-CMV /pSp1; pHRAS-luc /PRL-CMV /pMAZ /pSp1. Dual lusiferaasi määritykset suoritettiin 24 h transfektion jälkeen. Suhteellinen luminiscence saadaan R
T /R
NT x 100, jossa R
NT on (tulikärpäsen lusiferaasi) /(
Renilla
lusiferaasin) in T24 soluissa, joita käsiteltiin vain pHRAS-luc ja PRL-CMV, kun taas R
T on (tulikärpäsen lusiferaasi) /(
Renilla
lusiferaasin) in T24-soluissa käsitelty pHRAS-luc + pMAZ ja /tai pSp1 + PRL-CMV. Erot ohjaus tukee opiskelijan
t
testi, P 0,05 (yksi tähti), P 0,01 (kaksi tähdellä); (B) taso
HRAS
transkriptin HeLa-soluissa, joissa MAZ tai SP1 pudotettiin validoituja shRNAs.
MAZ destabilizes
HRAS
G-kvadrupleksien
Koska MAZ on välttämätöntä
HRAS
transkription ja tunnistaa
qhras
-1 ja
qhras
-2, kysyimme, onko nämä kvadrupleksien ovat levittyvät MAZ. Voit vastata tähän kysymykseen, suoritimme FRET-sulaminen kokeita yhdistelmä-MAZ-GST. Nelivaiheinen
qhras
-1 end-leimattu FAM ja TAMRA inkuboitiin 50 mM KCI, 30 minuuttia, kun läsnä on kasvavia määriä MAZ-GST tai kontrolliproteiini (BSA tai trypsinogeenin). Sulamiskäyrät (-dF /dT) osoitti, että
qhras
-1 yksin sulaa sen tyypilliset kaksivaiheisesti profiilin
T
M 53 ja 67 ° C (kuva 8a käyrä 1 ). Mutta kun
qhras
-1 inkuboitiin MAZ-GST (moolia proteiinia) /(moolia DNA) suhde r = 2,5, 5, 10 (käyrät 4, 5 ja 6), sulamis- profiili muuttunut merkittävästi, kun
T
M: n putosi ~46 ° C. Tämä osoittaa, että sekä
qhras
-1 kvadrupleksien ovat horjuttaa MAZ-GST. Kuten odotettua, epäspesifinen proteiineja, kuten BSA: ta tai trypsinogeeni r = 10 ei vaikuttanut sulaminen
qhras
-1 (käyrät 2,3). Koska sen korkea vakautta kaliumia (
T
M = 78 ° C: ssa 10 mM KCI),
qhras
-2 analysoitiin 100 mM NaCl, jossa
T
M oli 65 ° C. Inkuboitiin MAZ-GST r = 2,5, 5, 10 on esitetty, Nelivaiheinen suli 42 ° C: ssa, mikä osoittaa, että myös
qhras
-2 sen horjuttaa MAZ-GST, mutta ei BSA: lla trypsinogeenin. Olemme myös todeta, että GST ollut vaikutusta sulamisesta
HRAS
kvadrupleksien (kuvio S6b). Lisävalvontatoimenpiteenä että teimme sulkea pois, että bakteerien proteiineja ei vaikuttanut Nelivaiheinen epävakautta oli sekoittaa Glutathione Sepharose 4B hartsi uute on saatu ei-transformoidut BL21 DE3 pLysS bakteereja. SDS-PAGE-analyysi eluaatti 10 mM pelkistettyä glutationia osoitti, että ei ole bakteeri-sitoutuneiden proteiinien ei-spesifisesti hartsiin (kuvio S6a).
FRET-sulamispiste koe osoittaa, että 50 mM KCI, MAZ-GST r = 2,5, 5 ja 10 (r = [MAZ] /[G4-DNA]) (käyrät 4, 5 ja 6) destabilizes Nelivaiheinen
qhras
-1 50 mM KCI, 50 uM Zn-asetaatti [käyrä 1 (paneeli a)] ja Nelivaiheinen
qhras
-2 100 mM NaCl, 50 uM Zn-asetaatti [käyrä 1, (paneeli b)]. BSA ja TR (trypsinogeeniä) r = 10 ei ole mitään vaikutusta
qhras
-1 ja
qhras
-2 kvadrupleksien) (käyrät 2 ja 3, paneelit a ja b); (C) Kaavamainen esitys
HRAS
transkription ehdottaman asetuksen tässä tutkimuksessa. Kun kriittinen promoottorielementeistä
HRAS
-1 ja
HRAS
-2 taitetaan, ne toimivat transkription repressorit. Tähän viittaa se, että Nelivaiheinen-horjuttaa pistemutaatioiden
HRAS
-1 ja
HRAS
-2 johtavat merkittävään kasvuun transkription, kun taas Nelivaiheinen vakauttava ftalosyaniineja todettu tukahduttamaan transkriptio . MAZ kautta sen kyky tunnistaa Nelivaiheinen rakenteita, tulisi palvelukseen promoottori kriittisellä alueella. MAZ-DNA vuorovaikutus destabilizes G-kvadrupleksien, kriittinen
HRAS
-1 ja
HRAS
-2 elementtejä olettaa duplex konformaatio, joka suosii sitoutuminen SP1 ja muiden proteiinien transkription koneiden . Nämä tapahtumat johtavat transkriptiotekijöiden.
Olimme yllättyneitä siitä piirtyy toimintaa MAZ, kuten olemme viime aikoina raportoitu, että MAZ vakiintunut hiiren
KRAS
Nelivaiheinen [24]. Olisi kuitenkin pidettävä mielessä, että MAZ on kuusi sinkkisormia voivat olla vuorovaikutuksessa DNA monimutkaisella tavalla, kuten havaittiin qTBP42 ja CBF-A [40], [41]. Nämä proteiinit häiritsevät dimeerinen Nelivaiheinen muodostaman FMR1 d (CGG)
n toista mutta myös vakauttaa telomeerisesti Nelivaiheinen d (TTAGGG)
n. CBF-4 ja qTBP42 neljä RNP verkkotunnuksia mutta vain kaksi osallistuvat G4-DNA: n sitoutuminen. On osoitettu, että eri RNP yhdistelmät ovat vastuussa joko vakauttaa tai epävakautta toimintaan.
G4-DNA-syötti ODN matkimalla
HRAS
kvadrupleksien estävät transkriptiota ja solujen kasvua
Ottaen huomioon, että
HRAS
transkriptio aktivoituu yhdistetyn toiminnan MAZ ja SP1 ja että
qhras
-1 ja
qhras
-2 sitoutuvat MAZ (
qhras
-1 sitoutuu myös SP1), suunnittelimme syötti vastaisen strategian
HRAS
onkogeeni. Me perusteltu, että nämä oligonukleotidit matkimalla kvadrupleksien
qhras
-1 tai
qhras
-2 (G4-houkuttimina) pitäisi eristää MAZ ja estävät
HRAS
transkription sekä solun kasvua ( Kuva 8c).