Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kuten äskettäin tunnistettu ja tunnettu geeni, p42.3 liittyy soluproliferaatioon ja kasvainten muodostumiseen. Ekspressiota p42.3 ylössäädellään ihmisen mahasyövän (GC), mutta sen taustalla vaikutusmekanismit ei ymmärretä hyvin. MikroRNA (miRNA) tiedetään elintärkeä sääntelyn rooli monissa solun prosesseissa. Täällä käytetään bioinformatiikan ja kokeellisten lähestymistapojen tutkimaan sääntelyn suhdetta miRNA ja p42.3 geeni. Osoitimme, että miR-29a voi tukahduttaa p42.3 ilmaisua sekä mRNA ja proteiini tasoilla kautta suoraan sitoutumalla sen 3’UTR. Lisäksi käänteinen suhde havaittiin miR-29a ja p42.3 ilmentymistä mahasyövän solulinjoissa ja GC kudosnäytteitä, erityisesti tapauksissa, joissa p42.3 säädeltiin vähentävästi. Yhdessä olemme selvitetty aikaisemmin tunnistamattomia roolit miR-29a ja osoitti, että miR-29a voi toimia, ainakin osittain, kohdistamalla p42.3 geenin ihmisen GC.

Citation: Cui Y, Su WY Xing J, Wang YC, Wang P, Chen XY, et al. (2011) MiR-29 Estää Cell proliferaatiota ja indusoi solukierron pysähtymisen kautta alassäätely p42.3 Human syöpään. PLoS ONE 6 (10): e25872. doi: 10,1371 /journal.pone.0025872

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 28 helmikuu 2011; Hyväksytty 13 syyskuuta 2011; Julkaistu: 05 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Cui et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Basic Research Program of China 973 ohjelman (2010CB5293, kansallinen korkean teknologian tutkimus- ja kehittämisohjelma Kiina (863 Program) (2006AA02A402, National Natural Science Foundation of Key Program (nro 30830055) ja ministeriön of Public Health, Kiina (nro 200802094) ja FJY. rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet että ei ole kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

p42.3 on uusi geeni, joka on hiljattain eristetty ja tunnistetaan mRNA differential display (mRNADD) tekniikkaa. täyspitkä cDNA p42 0,3 on noin 4,0 kb, ja geeni koodaa 389 aminohapon (aa) proteiini, joka on arvioitu molekyylimassa on 42,3 kDa. Lisäksi tutkimus on paljastanut, että sen ilmentyminen on solusyklin riippuvaista mahasyövän (GC) solulinjat. Sen proteiinin ilmentymisen huiput aikana M vaiheessa solusyklin, ja pienenee sen jälkeen solunjakautumisen; tämä osoittaa, että p42.3 voi olla osallisena solusyklin säätelyssä. Lisäksi vaimentaminen p42.3 mukaan Sirna (siRNA) johtaa ylösajon Chk2 ja downregulation sykliini B1, jotka ovat kaksi keskeistä osallistuvien proteiinien solukierron säätelyssä [1], [2]. Kun taas RT-PCR: llä ja immunohistokemiallinen analyysit ovat osoittaneet, että p42.3 on yliaktiivista GC verrattuna normaaliin kudosnäytteitä, toiminnallinen tutkimus on ehdottanut, että ehtyminen p42.3 ei voi johtaa ainoastaan ​​inhibitio GC soluproliferaation ja pesäkkeiden muodostuminen

in vitro

, mutta voi myös vähentää merkittävästi tuumorigeenisyyden nude-hiirissä [3]. Vaikka aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, kriittinen rooli p42.3 geenin patologian GC, erityisiä taustalla olevien mekanismien kanteensa epäselviä.

MikroRNA (miRNA) koostuvat luokan pieni (~ 22 nukleotidia), endogeeninen, ei-koodaavat RNA: t, joiden tiedetään olevan tärkeitä sääntelyn rooli geeniekspression [4]. Ensisijainen miRNA transkripti kutsutaan pri-miRNA [5], joka transkriboidaan RNA-polymeraasi II: n tai III [6], [7]. Pri-miRNA sitten lohkaistaan ​​Drosha-DGCR8 mikroprosessori kompleksin tuottamiseksi esiaste hiusneulamolekyyli (pre-miRNA), joka sitten viedään tumasta sytoplasmaan exportin-5 /Ran-GTP. Avustuksella kompleksin, joka sisältää RNaasi Dicer ja kaksijuosteinen RNA-sitovan proteiinin, TRBP, The -70 nukleotidin pre-miRNA jalostetaan kypsä miRNA [8]. Toiminnallinen säie kypsä miRNA ladataan RNA-indusoidun hiljentäminen kompleksi (RISC), joka sisältää proteiineja, argonaute (Ago) ja Tnrc6, kun taas toinen juoste on yleensä huonontunut [9]. Kypsän miRNA ohjaa RISC epätäydellisestä komplementaariset sekvenssit kohde-mRNA: iden tukahduttamiseksi sukulais-mRNA käännös, edistää transkriptio rappeutuminen, tai molemmat [10]. On arvioitu, että useimmat koodauksen geenit todennäköisesti säätelee miRNA ja, kun taas miRNA voi säädellä enemmän kuin yksi kohdegeenien, tiettyjä geenejä voidaan säädellä useita miRNA [11].

Kasvava todistusaineisto viittaa siihen, että miRNA osallistuvat monenlaisia ​​fysiologisia ja patologisia prosesseja, kuten kehitys, erilaistuminen, proliferaatio ja apoptoosi [12.13,14,15]. Vaikka poikkeavuuksia miRNA ilmaisun on määritelty monissa ihmisen kasvaimissa, mukaan lukien peräsuolen, maha- ja rintasyöpiä [16], [17], kuinka monta tällaista kasvaimia on edelleen kasvussa. Kuitenkin yksityiskohtaiset toiminnot miRNA tuumoreihin vielä selvittämättä.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-29 on monimutkaisia ​​toimintoja eri sairauksiin. MiR-29a voi käyttäytyä tuumorisuppressorina sekä keuhko- ja haimasyövän solulinjoissa, ja täten eksogeenisen yli-ilmentymisen miR-29a johtaa merkittävään vähenemiseen invasiivisia potentiaali ja lisääntymistä näistä solulinjoista [18]. Kasvain vaimennin rooli miR-29a tukee myös sen havaittiin downregulation monenlaisissa kiinteitä kasvaimia, kuten neuroblastooma, sarkoomat ja aivokasvainten [19]. Sen sijaan, miR-29a on yliaktiivista veltto ihmisen B-solujen krooninen lymfosyyttinen leukemia (B-CLL) [20], ja akuutti myelooinen leukemia (AML) [21], mikä viittaa mahdollisen kasvaimen promoottori rooli. Lisäksi poikkeava ilmentyminen miR-29a löytyy monia ei-pahanlaatuisia tauteja, mukaan lukien maksan fibroosi [22], diabetes [23] ja Alzheimerin taudin [24]. Vaikka monet geenit on jo vahvistettu olevan kohdistu suoraa miR-29a, kuten PPM1D [25], PI3K [26] ja neuroni navigaattori 3 [24], ne muodostavat vain erittäin pienen osan koko geenien miR-29a tavoitteet.

Tässä raportissa, osoitamme, että p42.3 ilmentymistä kontrolloitiin tasoilla sekä mRNA ja proteiinin miR-29a suoralla kohdentamista 3’UTR p42.3. MiR-29a voi tukahduttaa soluproliferaatiota ja aiheuttaa solusyklin pysähtymisen, ainakin osittain, kautta downregulation p42.3 ilmaisua. Lisäksi olemme havainneet, että ilmentyminen p42.3 proteiinin korreloi käänteisesti miR-29a ilmentymistä ihmisen GC kudoksissa.

Tulokset

p42.3-3’UTR on oletetusti kohdistettu miR -29a

Oletetut miRNA jotka ennustettiin kohdistaa p42.3 geenin useampi kuin yksi tietokanta analysoitiin. Kaksi ylintä miRNA jotka ennustettava kolmen kertaa valittiin lisävahvistusta ja kolme muuta miRNA, kuten miR-29a, jonka otaksuttu sitoutumiskohdat olivat lähellä kuin kaksi parasta valittiin myös ehdokkaiksi validointi. MiR-29a ennustettiin TargetScan ja miRGEN tietokantoja, mikä osoitti, että oletetun sitoutumiskohta oli asemissa 213-219 on p42.3-3’UTR (kuvio 1A). Muut ehdokkaat eivät ole lueteltu tässä.

. Sekvenssi miR-29a kanssa oletetun sitoutumiskohta ihmisen p42.3-geenin. Oletetun sitoutumispaikan mutantti on esitetty alemmassa paneelissa. B. asetus reportterigeenin ilmentymisen miR-29 a MKN-45-solut ko-transfektoitiin pri-miR-29a ja reportterigeenin, joka sisältää otaksutun sitoutumiskohdan. **:

P

0,01.

Suoraan kohdistettu p42.3-3’UTR by miR-29a

reportterigeenimäärityksessä palkattiin vahvista onko p42.3 oli välittömänä kohteena miR-29a. Villityypin ja mutantti-p42.3-3’UTR sisältävät oletetun sitoutumiskohdan miR-29a kloonattiin yksittäiset plasmidit ja fuusioidaan reportterigeenin. Fluoresoiva intensiteetti reportterigeenin pieneni merkitsevästi ryhmässä, joka oli kotransfektoitiin WTpcDNA3 /EGFP /p42.3 ja pcDNA3.1 /pri-miR-29a kontrolliin verrattuna. Lisäksi, ei ollut merkittävää laskua fluoresenssin voimakkuus ryhmässä, joka oli kotransfektoitu MUTpcDNA3 /EGFP /p42.3 (kuvio 1 B), joka edelleen varmistaa, että miR-29a indusoi downregulation p42.3-geenin ilmentymisen kautta spesifinen sitoutuminen oletetun sivustolla p42.3-3’UTR.

Expression of miR-29a ja p42.3 ovat kääntäen verrannollisia GC solulinjoissa

selville yhteyden P42 0,3 ja miR-29a, tutkimme endogeenisen ilmentymisen miR-29a ja p42.3 kuudessa ihmisen GC solulinjoissa (SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SNU-1 ja AGS) sekä yksi normaali mahan epiteelin solulinja (GES-1, kuva 2A-C). Olemme havainneet, että taso p42.3 mRNA oli merkittävästi korkeampi kuin normaali kontrolli kaikilla GC solulinjoissa lukuun ottamatta SGC-7901, jos ero ei ollut tilastollisesti merkittävä. Ilmentymisen taso p42.3 oli vaihteleva proteiinitasolla, mutta oli merkittävästi korkeampi kaikissa GC solulinjojen verrattuna GES-1.We osoitti myös, että miR-29a ilmentyminen oli alhainen neljä GC solulinjojen ( SGC-7901, MKN-45, MGC-803 ja AGS), joka paljasti käänteinen suhde p42.3 ilme. Vaikka ilmaus miR-29a oli suuri SNU-1, tämä ei ollut tilastollisesti merkitsevä. On syytä mainita, että korkea ilmentyminen miR-29a in MKN-28 oli poikkeus.

. Expression of p42.3 mRNA: ta ja kypsiä miR-29a kuuden GC solulinjoissa (SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SNU-1, ja AGS) normalisoitu normaali mahan epiteelin solulinja (GES -1) käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä. Endogeeninen viitteet olivat GAPDH ja U6 pieni ydin- RNA, vastaavasti. *:

P

0,05, **:

P

0,01. B ja C. ilmentäminen p42.3 proteiinin GC ja normaali mahan epiteelisolujen linjojen analysoitiin western-blottauksella (B) ja esitetty keskiarvona ± SD (normalisoitu, C). *:

P

0,05, **:

P

0,01.

MiR-29a säätelee p42.3 ilmaisu

sen arvioimiseksi, p42.3 oli tukahdutettu miR-29a, käsittelimme MKN-45 solujen jäljittelee ja inhibiittorit miR-29a 48 h, jotta eksogeenisesti ylä- ja downregulate ilmentymistä miR-29a nimenomaan; ilmentyminen p42.3 määritettiin sitten. Transfektion jälkeen MKN-45-solujen kanssa jäljittelee, MIR-29a ilmentyminen kasvoi noin 10-kertaiseksi, kun taas hoito estäjien kanssa vähensi miR-29a tasoa yli 50% (kuvio 3A-B). Tämä ehdotti, että sekä jäljittelee ja inhibiittorit miR-29a toimi tehokkaasti kokeissa. Yliekspressio miR-29a voisi merkittävästi tukahduttaa ilmentymisen p42.3 sekä mRNA ja proteiini tasolla, joka oli samanlainen vaikutus kuin hiljentämisen p42.3, jonka p42.3 siRNA (si-p42.3). Olemme myös havainneet, että Chk2 oli voimistunut ja cyclinB1 säädeltiin vähentävästi jälkeen vaiennettaisi p42.3 mukaan p42.3 siRNA. Mielenkiintoista on, että samanlaisia ​​vaikutuksia kohdistuu Chk2 ja cyclinB1 yliekspressoituminen miR-29 a MKN-45-soluja (kuvio 3C-D). Lisäksi transfektointi miR-29a estäjät dramaattisesti vähentynyt Chk2 ilmaisun ja lisääntynyt p42.3 ja cyclinB1 lauseke (kuva 3E-F). Tämä viittasi siihen, että miR-29a voi säädellä ilmentymistä p42.3 geenin MKN-45-soluissa.

. Effect of miR-29a jäljittelee endogeeniseen ilmaus p42.3 mRNA. Aikuinen miR-29 a eksogeenisesti voimistunut samalla endogeeninen ilmentyminen p42.3 mRNA oli merkittävästi vaimentua vuonna MKN-45 soluihin. **:

P

0,01. B. Vaikutus miR-29a estäjien endogeenisen ilmentymisen p42.3 mRNA. Aikuinen miR-29 oli ulkoisesti vaimentua, kun taas endogeeniset ilmentymistä p42.3 mRNA oli merkittävästi yläreguloituja MKN-45 soluihin. *:

P

0,05, **:

P

0,01. C ja D. Effect of miR-29a jäljittelee endogeenisen ilmentymisen p42.3, sykliini B1 ja Chk2 proteiinit olivat samanlaisia ​​kuin si-p42.3. Ilmentymistasojen p42.3 ja sykliini B1-proteiinin väheni merkittävästi, kun MKN-45-soluja käsiteltiin si-p42.3 tai miR-29a jäljittelee samalla tasolla Chk2 proteiinin lisääntynyt dramaattisesti. Data näytetään keskimääräisenä ± SD (normalisoitu, D). *:

P

0,05. E ja F. vaikutus miR-29a estäjien endogeenisen ilmentymisen p42.3, sykliini B1 ja Chk2 proteiinia. MiR-29a estäjät käänteinen ilmaisu havaitut muutokset C ja D. *:

P

0,05, **:

P

0,01.

MiR-29a inhiboi soluproliferaatiota in vitro

mukaan tietojen solulisäkasvumääritykselle, me kiinnitti imukyky käyrät aallonpituudella 450 nm transfektion jälkeen eri kestoja. Olemme havainneet, että solujen lisääntyminen estyi merkittävästi sen jälkeen, kun transfektio MKN-45-solujen p42.3 siRNA 48 h ja 72 h, ja vastaava kuvio todettiin sen jälkeen, kun solut transfektoitiin jäljittelee MIR-29a. Kuitenkin repressioasteen saavutetaan miR-29 jäljittelee oli suurempi kuin p42.3 siRNA-indusoidun downregulation (kuvio 4A). Päinvastoin, solujen kasvua edisti noin 10%, verrattuna negatiiviseen kontrolliin, kun transfektoitu estäjien miR-29a 48 tuntia, mutta oli vähentynyt 72 h (kuvio 4B). Tämä osoitti, että miR-29a voi estää solujen lisääntymisen kautta tukahduttaa ilmaisun p42.3.

. MiR-29a jäljittelee inhiboi solujen proliferaatiota ja estämällä nopeudella 48 tuntia oli noin 20% ja noin 40% 72 h, kun taas p42.3 siRNA esti solujen lisääntymisen noin 15% 48 h ja 72 h. **:

P

0,01. B. MiR-29a-inhibiittorit edistää solujen kasvua noin 10%: iin 48 tunnin, mutta vaikutus heikkeni 72 tuntia. *:

P

0,05.

MiR-29a estää solusyklin etenemisen

vaiennettu p42.3 by p42.3 siRNA voi aiheuttaa solusyklin pidätys; Siksi me tutkimme, miR-29a voi vaikuttaa solusyklin etenemisen kautta kohdistaminen p42.3 geeni. Sen jälkeen MKN-45-soluja transfektoitiin p42.3 siRNA 48 tuntia, huomasimme, että solusyklin pysäytettiin G1 vaiheessa (75,93%,

P

0,05), verrattuna negatiiviseen kontrolliin ( 66,18%). Huomasimme, että jäljittelee Mir-29a voi myös aiheuttaa G1 vaiheessa pidätyksen MKN-45 soluja käsitellään 48 tuntia (75,56%,

P

0,05; kuva 5).

Flow sytometrinen analyysi vahvisti, että molemmat p42.3 siRNA ja miR-29a matkii aiheuttama G1 vaiheen pysähtymisen että MKN-45 solulinjassa.

Expression of miR-29a ja p42.3 proteiinia GC ja niiden vastaavuus jossa kliinis ominaisuudet

Käyttämällä kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-tekniikkaa, miR-29a havaittiin 60 paria GC kudosten ja niiden yhteensovitettujen ei-syöpä viereisten kudosten, kun taas p42.3 proteiini taso arvioitiin myös näissä kudoksissa Western blottauksella. Out of 60 GC kudosnäytteistä, p42.3 ilme oli korkea 35 tapauksessa (35/60, 58,33%) suhteessa niiden yhteensovitettujen syöpäsolujen viereisten kudosten. Vuonna 25 tapauksissa, joissa p42.3 ilmentyminen säädeltiin vähentävästi, miR-29a ilmentyminen oli korkea 21 tapauksessa. MiR-29a ilmentyminen oli alhainen 27 tapauksessa (27/60, 45%). Edellä tiedot viittaavat siihen, käänteinen suhde miR-29a ja p42.3 proteiinin ilmentyminen kudosnäytteistä (

P

= 0,000, taulukko 1 ja kuvio 6), mutta korrelaatiokerroin ei ollut hyvä (r = -0,316 ).

oli käänteinen suhde ekspression p42.3 proteiinin ja miR-29a ja yhtälö niiden suhde oli y = -0.3458x + 2,8126 (y: ilmentymisen miR-29a, x : ilmaus p42.3 proteiinia).

Lisäksi miR-29a ja p42.3 proteiinin ilmentymistä arvioitiin, mitä tulee kliinis ominaisuuksia 60 potilasta, joilta kudosnäytteitä otettiin. Meidän havainnot ehdotti, että ei ollut selvää korrelaatioita p42.3 proteiinia ja miR-29a ilme, lla, kliinis-(taulukko 2).

Keskustelu

p42.3-geeni on erittäin konservoitunut nisäkkäissä ja, kuten onkogeeni, se voi olla tärkeä rooli asteittaista muutosta normaalin mahan epiteelin solut syöpäsoluja. Sen differentiaalikaavojen solusyklin aikana vaiheissa paljastaa, että p42.3 voi olla mukana solusyklin säätelyssä. Tämä vahvistettiin meidän tuloksia, jotka osoittivat, että p42.3 hiljentäminen voisi muuttaa ilmaus kahden keskeisen proteiineja, Chk2 ja sykliini B1, jotka osallistuvat solukierron säätelyssä. Käyttämällä menettämisestä toiminnon kokeissa osoitimme, että p42.3 saattaa stimuloida solujen lisääntymisen ja raportoitu tuloksemme osoittivat, että p42.3 yliekspressoitui GC kudoksissa verrattuna viereisen ei-syöpä limakalvon [3]. Kuitenkin molekyylimekanismeja tulos tämä poikkeava ilmentyminen p42.3 geenin GC tunnetaan huonosti, kuten käy ilmi puutteesta kirjallisuutta. MiRNA voi säädellä geeniekspressiota kohdistamalla sitoutumiskohdat kohde-mRNA: [27], ja ihmisen syövissä, monet miRNA jo sekaantuneet. Kuitenkin toiminta vain muutama on ymmärretty tähän mennessä, erityisesti GC [28].

Tässä raportissa, valitsimme miR-29a jatkotutkimuksiin reportterigeeni järjestelmä ja lopulta todettiin, että P42. 3 oli suora kohdegeeni miR-29a. Meidän tiedot osoittivat, että neljä tietokannat (TargetScan, microRNA.org, mikrokosmos tavoitteet versio 5 miRGen) käytettiin olivat tehokkaita, mutta ei täydellinen, työkaluja ennustamiseen miRNA tavoitteiden ja säädetty kokeellista näyttöä parannuksia taustalla algoritmi.

Osoitimme, että p42.3 ilmentyminen kääntäen verrannollinen kanssa miR-29a ilmentymistä neljässä GC solulinjoissa. Kolmessa näistä, MKN-45, MGC-803 ja AGS, tämä oli ilmeistä sekä mRNA ja proteiini tasolla, mutta tämä ei ollut asianlaita SGC-7901 solulinja. Lisäksi miR-29a ilmaisu ei ollut alhainen MKN-28 ja SNU-1 solulinjoissa. Yhdessä nämä havainnot pystyimme oletuksen, että säätelevän roolin miR-29a on monimutkainen GC solulinjoissa ja että miR-29a voi olla erilaisia ​​rooleja eri solujen taustat. Kuitenkin yksityiskohtaiset mekanismit miR-29a toimii GC solulinjoissa edellyttävät lisätutkimuksia.

Tutkimuksessamme miR-29a yliekspressio voi aiheuttaa samanlaisia ​​vaikutuksia kuin saavutetaan vaiennettaisi p42.3 by p42.3 siRNA. Molemmat p42.3 mRNA: ta ja proteiinia vaimentua, kun solut transfektoitiin p42.3 siRNA tai miR-29a jäljittelee sekä soluproliferaation ja solusyklin tukahdutettiin, kun solut tehtiin samalla häiriöitä. Siinä ehdotettiin, että miR-29a voi olla osallisena patogeneesissä GC kautta tukahduttaminen p42.3 geenin ilmentymisen. Emme kuitenkaan löydy kasvukäyrät että aste tukahduttamisen miR-29a matkii oli suurempi kuin p42.3 siRNA. Mielestämme tärkein syy tähän voi olla, että erityinen miRNA voisi säädellä satojen geenien valvoa solujen toimintaa. Esillä olevassa tutkimuksessa, miR-29a saattaa estää soluproliferaatiota, ainakin osittain, kohdentamalla p42.3.

tulokset osoittivat, että vaikka nopeus korkea ilmentymisen miR-29a oli 55% (33 /60) GC, p42.3 ilme oli alhainen 21 näistä tapauksista. Tämä viittaa siihen, että miR-29a voi olla tärkeä rooli GC kudoksissa alhainen ekspressiotasot p42.3.

Tässä tutkimuksessa olemme validoitu että p42.3 on välittömänä kohteena miR-29a. Olemme myös osoittaneet, että miR-29a voi estää solujen lisääntymistä ja estää solusyklin, ainakin osittain, kautta tukahduttaminen p42.3 ilmaisun GC. Voimme päätellä, että miR-29a voi olla ratkaiseva rooli ekspressiota sääteleviä p42.3 GC. Mielenkiintoista huomasimme, että p42.3 geeni voisi myös säätelemään miR-29a (tietoja ei esitetty tässä), mutta taustalla sääntelymekanismiin tutkitaan tulevaisuudessa.

Materiaalit ja menetelmät

Bioinformatics

neljä tehokasta tietotekniikassa että käyttää erilaisia ​​arvioitaessa järjestelmiä [29] – [32] käytettiin ennustamiseen sääntelyn miRNA että tavoite p42.3 geeni, mukaan lukien TargetScan (http: //www.targetscan.org/), microRNA.org (https://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do/), mikrokosmos tavoitteet versio 5 (https://www.ebi.ac.uk/enright-srv /mikrokosmos /htdocs /tavoitteet /v5 /) ja miRGen (https://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Targets.cgi#Results). Tavoitteet valittiin lisävahvistusta ryhmästä miRNA jotka ovat yhteisiä tuloksia syntyy useammasta kuin yhdestä haku.

kudosnäytteitä

Kuusikymmentä paria histopatologisesti vahvisti GC ja viereisen ei-syöpäkudoksessa näytteet saatiin potilailta, joille tehtiin kirurginen resektio on Renji sairaala sidoksissa Shanghai Jiaotong yliopiston lääketieteellisessä, Kiina välillä heinäkuussa 2007 ja tammikuussa 2009. Hyväksytty syöpäsolujen viereisten kudosten saatiin vähintään 5 cm: n päässä syöpäkasvaimen. Tutkimuksen hyväksyi tutkimuksen toimikunta Shanghai Jiaotong yliopiston ja tietoinen suostumus saatiin kaikilta potilailta, vaikka kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan.

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

Ihmisen GC solulinjoja, SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SNU-1 ja AGS, ja GES-1-normaalista mahalaukun epiteelin solulinja, joka hankittiin ATCC (USA), pidettiin RPMI 1640 (Gibco, Gaithersburg, MD, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa. Liuosta, jossa oli trypsiiniä (0,25%), käytettiin solujen irrottamiseksi viljelmän pulloon.

Vector rakentaminen

rakentamiseksi ilmentämisvektorit pri-miR-29a ensin monistettiin alukkeilla suunnitteli Primer Premier 5,0-ohjelmisto (taulukko 3), ja sitten kloonattiin pcDNA3.1 (Invitrogen). Tuottaa plasmidit, jotka sisälsivät oletetun sitoutumiskohdan miR-29a, sekä villityypin ja mutantti-sekvenssit asemasta 111-380, että p42.3-3’UTR syntetisoitiin kemiallisesti (kuvio 1A) ja sitten kloonattiin alavirran EGFP geenin

Bam

HI ja

Eco

RI sivustoja pcDNA3 /EGFP vektorin (Saierbio, Tianjin, Kiina).

reportterigeenimäärityksessä

MKN-45-soluja ympättiin kolmena rinnakkaisena 24-kuoppaiselle levylle päivänä ennen transfektiota. PcDNA3.1 (+) /ensisijainen-miR-29a kotransfektoitiin villityypin ja mut-pcDNA3 /EGFP /p42.3-3’UTR vastaavasti. Sitten 0,5 ug pcDNA3.1 (+) /ensisijainen-miR-29a ja 0,5 ug pcDNA3 /EGFP /p42.3-3’UTR lisättiin kuhunkin kuopista, kun taas 0,1 ug vektori pDsRed-C1 (Clontech ), joka ilmaisi RFP, lisättiin jokaiseen sekä endogeeninen viitteenä. Solut, jotka oli vain transfektoitu pcDNA3 /EGFP /p42.3-3’UTR tai pcDNA3 /EGFP /p42.3-3’UTR + pcDNA3.1 (+) käytettiin valvontaa. Solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen ja analysoitiin perustuen intensiteetti EGFP ja RFP fluoresenssi havaittiin käyttäen fluoresenssispektrofotometriä F-4500 (Hitachi, Japani).

Solun transfektio

transfektio MKN-45 soluihin suoritettiin käyttämällä Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen) seuraten protokollaa valmistajan. MKN-45-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille tai 96-kuoppalevyille 30% konfluenssiin päivä ennen transfektiota. Jäljittelee (100 nM, GenePharma) ja inhibiittorit (200 nM, RIBOBIO) Mir-29a käytettiin eksogeenisesti ylä- ja downregulate ilmentymistä miR-29a. Hiljentää p42.3 geenin ilmaisu, MKN-45-solut transfektoitiin siRNA vastaan ​​p42.3 (si-p42.3, 100 nM, GenePharma). Ohjaus RNA (nimetty NC) oli ei-homologinen tahansa ihmisen genomin. Sekvenssit oligonukleotidista on esitetty taulukossa 4.

Reaaliaikainen RT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen) ja sen jälkeen käsiteltiin RNaasi-vapaa DNaasi I (Fermentas, San Diego, CA, USA). Kokonais-RNA (500 ng), tehtiin käänteistranskriptio käyttäen PrimeScript RT reagenssia Kit (TaKaRa, Dalian, Japani). Aluke sekvenssejä voidaan käyttää monistamaan p42.3 ja GAPDH on esitetty taulukossa 3. ekspression analysoimiseksi kypsän miR-29a, 2 ug kokonais-RNA: ta suoritettiin käänteistranskriptio käyttäen All-in-One miRNA Q-PCR Detection Kit (GeneCopoeia, Guangzhou, Kiina). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR kypsälle miR-29a ja U6 suoritettiin valmistajan ohjeiden käyttäen ABI 7300 reaaliaikainen PCR-järjestelmä ja spesifisiä alukkeita suunnitellut GeneCopoeia, Kiina. Suhteellinen ekspressio p42.3 ja miR-29a normalisoitiin endogeenistä viite (GAPDH ja pieni nukleaarinen U6-RNA vastaavasti) ja suhteessa kontrolliin. Tulokset esitettiin kertainen muutos, joka on laskettu käyttämällä 2 (-ΔΔCT) menetelmää [33]; suhteellinen ilmaus suhde 1,0 katsottiin alhainen, kun taas suhde 1,0, pidetään erittäin ilmaisun [14].

Western blotting

Yhteensä proteiinin viljellyistä soluista ja kudoksista uutettiin RIPA lyysipuskuria, joka sisältää PMSF, mukaan valmistajan ohjeiden (Beyotime, Shanghai, Kiina). Proteiinipitoisuus mitattiin Bradfordin menetelmää käyttäen [34]. Kaiken kaikkiaan 40 ug proteiinia ajettiin elektroforeesilla 10% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin sitten PVDF-kalvolle (Millipore). Kalvo inkuboitiin p42.3-vasta-aineen (1:500, Abmart, Kiina), Chk2 vasta-ainetta (1:1,000, CST), cyclinB1 vasta-ainetta (1:1,000, CST) tai GAPDH (1:5,000, Kang Chen, Kiina) 4 ° C: ssa yön yli. Sekundaariset vasta-aineet leimattiin HRP (Kang Chen, Kiina) ja signaalit havaittiin käyttämällä ECL (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA). Tämän jälkeen kuvat analysoitiin ImageJ 1,43 ohjelmisto. Proteiini ilmentyminen normalisoitu endogeenistä viite (GAPDH), ja suhteessa kontrolliin. Suhteellinen ilmentyminen suhde 1.0 pidettiin heikkoa ilmentymistä, kun taas suhde 1,0, pidetään erittäin ilmaisun [14].

Soluproliferaatiomääritys

Harvested MKN-45-solujen (noin 5 x 10

4-solut) ympättiin 96-kuoppaisille viljelylevyille. Solujen lisääntyminen mitattiin 24 h, 48 h ja 72 h transfektion jälkeen, vastaavasti, käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japan) mukaan valmistajan protokollaa. Absorbanssi aallonpituudella 450 nm, mikä osoittaa positiivisen suhteessa kapasiteetin soluproliferaation, määritettiin spektrofotometrillä (E-LIZA MAT-3000).

Cell cycle määritys

Neljäkymmentä -eight tuntia transfektion jälkeen, solut poistetaan käyttämällä 0,25% trypsiiniä ja pestiin DPBS: llä (Gibco); sitten niitä kiinnitetään 70% etanolilla -20 ° C: ssa 24 tuntia. Virtaussytometrianalyysiä (EPICS XL Beckman Coulter), soluja inkuboitiin RNaasi (Fermentas) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, käsiteltiin PI (Sigma) ja suspendoitiin 300 ui: aan DPBS: ssä.

Tilastollinen analyysi

Data esitettiin keskiarvona ± SD vähintään kolmesta erillisestä kokeesta. Merkitys analysoitiin Studentin t-testiä ja ei-parametriset testit (U-testi ja Kruskal-Wallisin H-testi). Tilastollinen merkitys korrelaatiota ilmentymisen miR-29a ja p42.3 proteiini laskettiin chi-neliö testi ja Spearmanin listalla korrelaatio. Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS 13.0 ohjelmistoa (IBM, USA) ja erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä

P

0.05.