Krooninen sairaus

tiivistelmä

Nykyinen genominlaajuisten microRNA (miRNA) lauseke allekirjoituksen analysointi käyttäen syvä sekvensointiteknologioihin voi ajaa löytö uusien syövän reittejä säädellään onkogeeninen ja /tai kasvaimen ehkäisevästä miRNA. Selvitimme genominlaajuisten miRNA ilmentymisen allekirjoitettavaksi virtsarakon syöpä (BC) syvät sekvensointitekniikan. Yhteensä kymmenen pienten RNA-kirjastoista, sekvensoitiin (viisi tasapainotusliivit ja viisi näytettä histologisesti normaalissa virtsarakossa epiteeli (NBE)), ja 13190619 ja 18559060 puhdas pieniä RNA lukee saatiin. Kaikkiaan 933 tunnettujen miRNA ja 17 uutta miRNA ehdokkaita havaittiin tämän analyysin. Tunnettuja miRNA, yhteensä 60 miRNA merkittävästi vaimentua BC verrattuna NBE. Olemme myös havainneet, että useat miRNA, kuten

miR-1 /133a

,

miR-206 /133b

,

let-7c /miR-99a

,

miR-143/145

ja

miR-195/497

, sijaitsivat lähekkäin viisi erillistä loci ja muodostivat aihekokonaisuuksien miRNA. Näistä klusteroitu miRNA keskityimme

miR-195/497

cluster koska tämä ryhmittyneet miRNA ei ollut analysoitu BC. Transfektio kypsä

miR-195

tai

miR-497

kahdessa BC solulinjoissa (BOY ja T24) esti merkittävästi syöpäsolujen proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota, mikä viittaa siihen, että

asennuspalveli- 195/497

klusteri toimi tuumorisuppressoreilla BC. Mitä geenit kohteena

miR-195/497

klusterin TargetScan algoritmi osoitti, että 6730-geenit olivat otaksuttu

miR-195/497

tavoitteet, ja 113 on täydennettävä signalointireiteissä tunnistettiin tämän analyysin. ”Pathways in syöpä” luokassa oli kaikkein rikastunut, joissa 104 ehdokasta kohdegeenien. Geenien ilmentyminen tietojen mukaan 27 104 ehdokkaan kohdegeenien todellisuudessa yläreguloituja BC kliinisissä näytteissä. Lusiferaasireporttiterilla määritykset ja Western blotting osoitti, että

BIRC5

ja

WNT7A

olivat suoraan kohteena

miR-195/497

. Lopuksi poikkeava ilmentyminen ryhmittyneet miRNA tunnistettiin syvä sekvensoinnilla, ja downregulation

miR-195/497

osaltaan BC etenemisen ja etäpesäkkeiden. Kasvain tukahduttava miRNA-välitteisen syövän väyliä tarjoavat uusia oivalluksia mahdollisia mekanismeja BC syövän synnyn.

Citation: Itesako T, Seki N, Yoshino H, Chiyomaru T, Yamasaki T, Hidaka H, ​​et al. (2014) MicroRNA Expression allekirjoitus Virtsarakon syövän Deep sekvensointi: Toiminnallinen merkitys

miR-195/497

Cluster. PLoS ONE 9 (2): e84311. doi: 10,1371 /journal.pone.0084311

Editor: Bernard W. Futscher, University of Arizona, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 huhtikuu 2013; Hyväksytty 13 marraskuuta 2013 Julkaistu: 10 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Itesako et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus oli osittain tukevat opetusministeriö, tiede, urheilu ja kulttuuri Grants-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (C), 23501298 ja 23592340, 2011. ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kehittyneissä maissa, virtsarakon syöpä (BC) on viidenneksi yleisin diagnosoitu kasvain ja toiseksi yleisin kuolinsyy potilailla, joilla urogenitaaliseen syöpäsairauksia. Yhdysvalloissa, on yli 73000 uutta tapausta ja 14000 kuolemantapausta vuosittain [1]. Japanissa useita uusia BC potilaista oli arviolta 17461 vuonna 2007 ja kuolemien määrä oli arviolta 7008 vuonna 2011 [2].

tasapainotusliivit voidaan jakaa kahteen ryhmään, ei-lihas-invasiivisen kasvaimet ja lihas-invasiivisen kasvaimet. Vaikka 70% -80%: lla potilaista on diagnosoitu ei-lihas-invasiivisia kasvaimet, korkea uusiutuminen (50% -70%) on havaittu tässä potilasryhmässä. Lisäksi joukossa toistuvia tapauksia, 15% BCS edetä lihas-invasiivisen sairauden [3]. Viiden vuoden selviytymisen kurssi potilailla, joilla on ei-lihas-invasiivisia BC on lähes 90%, kun taas potilailla, joilla on lihas-invasiivisen BC on noin 60% [4]. Lisäksi lähes 80%: lla imusolmukemetastaaseja kuolee viiden ensimmäisen vuoden aikana [5]. Koska useimmat kliinisissä tutkimuksissa kemoterapia kehittyneiden BC ovat osoittaneet vähäistä hyötyä, uusi ennustetekijöitä markkereita ja tehokkaampien hoitomenetelmien kehittäminen perustuvat tämänhetkisiin syöpää genomin analyysit ovat tarpeen.

löytyminen ei-koodaavan RNA ihmisen genomin oli tärkeä käsitteellinen läpimurto postgenomiset sekvensointi aikakausi [6]. Parempi ymmärrys ei-koodaavan RNA on välttämätöntä jatkuva edistyminen syöpätutkimuksessa. miRNA muodostavat luokan pienen, ei-koodaavan RNA-molekyylejä, 19-22 nukleotidiä, jotka moduloivat geeni-ilmentymisen. Asetus saavutetaan epätäydellinen liittäminen kohde RNA: iden (mRNA: t) proteiini-koodaus geenit ja transkription tai kopioinnin jälkeiset sääntely niiden ilmaisun [7]. Tällä hetkellä, 2042 ihmisen kypsän miRNA rekisteröidään miRBase vapauta 20.0 [https://microrna.sanger.ac.uk/]. Yhä useammat todisteet osoittavat, että miRNA myös edistää aloittamiseen, kehittämiseen ja etäpesäkkeiden eri syöpiä. Monet ihmisen syövissä näyttää poikkeavan ilmentymisen miRNA, joka voi toimia joko tuumorisuppressoreilla tai onkogeenien [8]. Siksi tunnistaminen poikkeavasti ilmaisi miRNA on ensimmäinen askel kohti valaisemaan miRNA-välitteinen onkogeenisen reittejä ihmisen syövissä.

Kehittäminen suurikapasiteettisten, syvä sekvensointitekniikan on nopeasti kattamatonta romaani tietoa miRNA. Deep Sekvensointianalyysin näyttää olevan ylivoimainen microarray- tai PCR-menetelmiä, jotka rajoittuvat tiedossa miRNA ja yleensä eivät sisällä täyttä listaa tunnetuista miRNA sekvenssit. Syvä Sekvensointianalyysin tulee kultakantaan menetelmä kattavan miRNA analyysin syöpää genomiikka. miRNA ilmaus allekirjoitukset BC saadaan syvä sekvensointitekniikan ovat johtaneet neljään uusien julkaisujen [9] – [12] ja tässä tutkimuksessa muodostaa viidennen kertomuksen. Yhteensä kymmenen pienten RNA kirjastot sekvensoitiin (viisi virtsarakkokarsinoomat ja viisi Hyväksytty, histologisesti normaalit näytteet urothelia), mikä 13190619 ja 18559060 puhdas pieniä RNA lukee tässä analyysissä. Havaitsimme 933 tunnetaan miRNA ja 17 uutta miRNA ehdokasta meidän sarjassa näytteitä.

Jotkut miRNA sijaitsevat lähellä toisiaan ihmisen genomin, ja siksi kutsutaan ryhmittyneet miRNA. Ihmisen perimässä, 247 ihmisen miRNA on todettu ryhmitellään klo 64 sivustoja välisellä miRNA etäisyydet alle 5000 bp [13].

miR-15a /16

klusteri, esimerkiksi hyvin tiedetään toimivan tuumorisuppressorina kohdistamalla useita onkogeenien, kuten

BCL2

,

MCL1

,

CCND1

ja

WNT3A

[14] – [16], kun taas

miR-17/92

klusteri on tunnustettu onkogeenin [17]. Raportoimme aikaisemmin, että

miR-1-1 /133a-2

ja

miR-1-2 /133 a-1

muodostettu klustereiden eri kromosomi loci ihmisen perimässä, 20q13.33 ja 18q11.2, vastaavasti, ja nämä klusterit toimivat tuumorisuppressorien, kohdistaminen useita onkogeeneistä ihmisen syövissä, mukaan lukien BC [18] – [24].

miR-143/145

cluster sijaitsee 5q32 lokuksessa ja oli myös raportoitu kasvain tukahduttava miRNA klusteri BC [25] – [28]. Valitsimme 60 vaimentua miRNA BC allekirjoitus ja tutkitaan niiden kromosomi loci. Mielenkiintoista, joukossa 60 miRNA, huomasimme, että useat muodostunut klusterit, kuten

miR-1 /133a

,

miR-206 /133b

,

let-7c /miR-99a

,

miR-143/145

ja

miR-195/497

.

tässä tutkimuksessa olemme arveltu, että

miR-195/497

klusteri toimi tuumorisuppressorina kohdistamalla useita onkogeenisten geenien erityinen syöpään liittyvien reittien BC. Perustuen tämän hypoteesin, suoritimme voitto-of-function tutkimusten MikroRNA transfektanteissa ja myös pyritty tunnistamaan uusia

miR-195/497

cluster välittämää molekyylikohteista ja kanavat,

in silico

analyysi . Ymmärtäminen rooli miRNA tarjoaa tehokkaan ja lupaava strategia miRNA liittyvän näyttöön perustuvia terapeuttisia hoitoon BC.

Tulokset

sekvensointi ja merkintään pienten RNA: iden

Kymmenen pientä RNA kirjastot (viidestä tasapainotusliivit ja viisi NBEs) sekvensoitiin käyttämällä syvä sekvensointitekniikan. Potilaiden ominaisuudet on esitetty taulukossa 1. Aluksi 13905124 ja 18938856 raaka järjestyksessä lukee tuotettiin kirjastoja. Suodattamisen jälkeen ja trimmaus lukee heikkolaatuisen ja sovittimet, mistä 13190619 ja 18559060 puhdas pieniä RNA lukee saatiin (taulukko 2). Jakauma nukleotidin pituisia puhtaan pienten RNA lukee vaihteli 16-38 nukleotidin kussakin kirjastossa. Runsain pituus oli 22 nukleotidia (kuva S1). Kaikki korkealaatuisten puhdas lukee suurempi kuin 18 nukleotidin kartoitettiin ihmisen genomiin ja näiden genomin täsmäsi lukee jaettiin eri pieniä RNA: iden mukaan niiden biogeneesiä ja merkintä (taulukko 3). Sekä tasapainotusliivit ja NBEs oli useita ja heterogeeninen pieniä RNA: iden lajeja, jotka sisältyvät miRNA, hajoamista fragmentteja ei-koodaavat RNA: t (tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA jne), genomista toistoja, mRNA: t, tai luokkiin RNA: t. Runsain RNA luokka kustakin kirjastosta oli miRNA. Sekvenssi tästä tutkimuksesta talletettiin DDBJ Sequence Lue Archive (tulonumero; DRA001043).

tunnistetiedot vaimentua miRNA perustuu miRNA ilmentymisen allekirjoitukset BC

erotettu laadukkaita puhdasta lukea sekvenssit kussakin kirjastossa kahteen ryhmään, miRNA tai ei-koodaavat RNA: t käyttäen NCBI GenBank tiedot, Rfam data ja miRBase. Tässä tutkimuksessa yhteensä 933 tunnettuja miRNA ja 17 ehdokasta uutta miRNA havaittiin korkealaatuisesta puhdas luku- sekvenssit (taulukot S1 ja S2). Ilmentymistasojen uuden miRNA ehdokkaita olivat alhaisia ​​ja toiminnallisten roolien ei arvioitu riittävästi (taulukko S2). Näistä syistä olemme jättäneet ne analyysiin. Kuitenkin toiminnallista merkitystä näiden uusien miRNA ehdokkaita on tärkeää ja ne tutkitaan tulevaisuudessa. Täällä keskityimme 933 tunnetaan miRNA ja vahvistetaan miRNA ilmaus allekirjoitus BC syvä sekvensoinnilla. Ilmentyvät eri miRNA tunnistettiin käyttämällä särmäysautomaatin ohjelman yleinen lineaarinen malli. Yhteensä 60 vaimentua miRNA valittiin tämän analyysin (taulukko 4).

Seuraavaksi kartoitettiin vaimentua miRNA ihmisen genomin ja löysi useita miRNA jotka olivat lähellä toisiaan ja ne kutsutaan klusteroituja miRNA, kuten

miR-1 /133a, miR-206 /133b, let-7c /miR-99a, miR-143/145

ja

miR-195/497

(taulukko 5). Koska rooli

miR-195/497

klusteri ei ole raportoitu BC keskityimme se lisätutkimuksiin. Kuten on esitetty kuviossa 1,

miR-195

ja

miR-497

sijaitsevat samassa kromosomissa samalla alueella (17p13.1), 209 bp: n päässä toisistaan.

miR-195

ja

miR-497

ovat introni

MIR497HG

geeni ihmisen kromosomissa 17q13.1, jossa ne erotetaan 209 emäsparin.

Expression tasot

miR-195

ja

miR-497

kliinisissä näytteissä

validoimiseksi ilmentymisen tasot

asennuspalveli- 195

ja

miR-497

kliinisissä näytteissä, me altistetaan 29 tasapainotusliivit ja 20 NBEs johtuvan silmukan RT-PCR. Huomasimme, että ekspressiotasot

miR-195

ja

miR-497

in tasapainotusliivit olivat merkittävästi alhaisemmat kuin NBEs (

miR-195

: 0,083 ± 0,078 ja 1,367 ± 1,178, P 0,0001;

miR-497

: 0,056 ± 0,058 ja 1,928 ± 2,425, P 0,0001) (kuvio 2A, B). Mielenkiintoista Spearman korrelaatiokertoimen saadut sijoitus testi paljasti merkittävä positiivinen korrelaatio ekspressiotasot

miR-195

ja

miR-497

kliinisissä näytteissä (r = 0,984, P 0,0001) (kuvio 2C).

A, B) ilmentymistä

miR-195

ja

miR-497

oli merkitsevästi pienempi 20 kliinisessä BC yksilöitä kuin 29 vieressä noncancerous yksilöitä.

RNU48

käytettiin sisäisen valvonnan. *, P 0,0001. C) merkittävä positiivinen korrelaatio miRNA ekspressiomalleja

miR-195

ja

miR-497

(rank testi Spearmanin korrelaatiokertoimen r = 0,984, P 0,0001).

vaikutus

miR-195

ja

miR-497

transfektioissa soluproliferaatioon, invaasio, ja siirtotoimien BC solulinjojen

tutkimiseksi toiminnallinen roolit näiden miRNA, suoritimme voitto-of-function tutkimusten avulla miRNA transfektanteissa. XTT-määritys osoitti merkittävää inhibitiota soluproliferaation

miR-195

ja

miR-497

transfektantit (BOY ja T24) verrattuna miR-verrokkitransfektantteja (prosentteina solujen elinkelpoisuuden BOY : 61,7 ± 1,4, 59,1 ± 0,9, ja 100,0 ± 2,2, tässä järjestyksessä, P 0,0001 ja muun T24: 66,0 ± 0,9, 67,7 ± 1,2, ja 100,0 ± 2,8, tässä järjestyksessä, P 0,0001) (kuvio 3A). Matrigel invaasiomääritys osoittaneet, että tunkeutuvat solumäärät merkittävästi laski sekä

miR-195

ja

miR-497

-transfected BOY ja T24 solulinjoissa verrattuna kontrolleihin (prosenttiosuus solun invaasio for BOY: 8,7 ± 3,1, 13,4 ± 1,7, ja 100 ± 12,3, vastaavasti, kukin P 0,0001 ja muun T24: 64,7 ± 16,2, 36,5 ± 7,5, ja 100 ± 18,7, vastaavasti, P = 0,009 varten

miR-195

transfektantin vs. kontrolli, P 0,0001

miR-497

transfektantin vs. kontrolli) (kuvio 3B). Haavanparantamislaite määrityksessä osoitti merkitsevän eston soluvaelluksen sekä

miR-195

ja

miR-497

-transfected BOY ja T24 soluja verrattuna kontrolleihin (prosenttiosuus haavan varten BOY : 51,2 ± 15,5, 43,9 ± 8,3, ja 100 ± 28,7, vastaavasti, kukin P 0,0001, ja T24: 70,1 ± 11,4, 72,3 ± 18,8, ja 100 ± 12,6, vastaavasti, kukin P 0,0001) (kuvio 3C).

Gain-of-function tutkimukset tehtiin käyttämällä

miR-195

ja

miR-497

-transfected BOY ja T24 verrattuna miR-verrokkitransfektantteja. A) Solujen lisääntyminen määritettiin XTT-määritys. B) Solujen invaasiota aktiivisuus osoittaa Matrigel invaasiomääritys. C) Cell muuttoliikkeen aktiivisuus määritetään haavan paranemista määrityksessä. *, P 0,0001; **, P = 0,009.

Ennustettu kohdegeenien ja syöpä reitit

miR-195/497

cluster

tutkia biologisia toimintoja

miR-195/497

cluster, suoritimme

in silico

analyyseissä käytetään kahta itsenäistä algoritmeja, TargetScan, ja GeneCodis3, ja julkinen microarray ilmaisun hyväksymien tietojen GEO. Työnkulun

in silico

analyysi on esitetty kuviossa 4. Aluksi TargetScan tietokanta osoitti, että 6730-geenit ennustettu tavoitteita

miR-195/497

klusteri, joka oli sama siemen sekvenssi ”GCUGCU” niiden 3′-alueet (3’UTR).

yhteensä 6730 geenit tunnistetaan TargetScan algoritmilla. Sitten 113 merkittävästi rikastettu signalointireitteihin tunnistettiin käyttämällä Kegg ja GeneCodis3 ohjelmia. Niistä alkuun 21 rikastetun reittejä on esitetty taulukossa S3. Ilmaisu tasot 104 geenien alkuun rikastetun polku (Pathways in cancer) lopulta arvioitiin. Niistä 27 otaksuttu kohdegeenien ilmentyivät BC kliinisissä näytteissä perustuu ekspressiotietojen GEO tietokannan (liittymisen numerot, GSE11783 ja GSE31684) (taulukko S4).

Perustuen Kegg koulutusjakson luokitusta, nämä geenejä sekaantuneet 113 väyliä, ja ”Pathways syövän” oli kaikkein merkittävästi rikastettu (taulukko S3). Kaikkiaan 104 geenit olivat mukana tämän reitin. Haimme onkogeenien kohteena

miR-195/497

klusteri perustuu oletukseen, että otaksuttu onkogeenien olisi yläreguloituja kliinisissä näytteissä johtuen downregulation kasvaimen ehkäisevästä

miR-195/497

miRNA . Käyttämällä GEO tietokannan analyysi, 27 geenejä valittiin

miR-195/497

-regulated onkogeeninen geenien BC (kuvio 5 ja taulukko S4). Vahvistaa tämän analyysin, valitsimme kaksi parasta ilmen- tymisen lisääntymisen geenejä (

BIRC5

ja

WNT7A

), ja validoitu ovatko miRNA säädeltiin

miR-195/497

( alla).

Heat kartan kaaviossa on ilmaus 27 kandidaattigeenejä mukana ”Pathways in cancer” in 90 BC yksilöiden ja kuusi viereisen noncancerous virtsarakon yksilöitä.

BIRC5

ja

WNT7A

olivat suoraan säätelee

miR-195/497

klusteri BC soluissa

mRNA ja proteiini ekspressiotasot

BIRC5

ja

WNT7A

oli vaimentua vuonna

miR-195

ja

miR-497-

transfektoitujen BOY ja T24 soluja verrattuna verrokkitransfektantteja (kuvio 6A, B).

)

BIRC5

ja

WNT7A

mRNA ilmaisu 72 h transfektion jälkeen

miR-195

,

miR-497

, ja miR-ohjaus.

GUSB

ilmaisua käytettiin normalisointia. B)

BIRC5

ja

WNT7A

proteiinin ilmentymisen 72 h transfektion jälkeen

miR-195

,

miR-497

ja miR-ohjaus.

GAPDH

käytettiin latauskontrollina. Suhde

BIRC5

tai

WNT7A

osoitteeseen

GAPDH

ilmentyminen arvioitiin käyttämällä ImageJ ohjelmistoa (ver. 1,43; https://rsbweb.nih.gov/ij/index .html). * P 0,01.

Seuraava suoritetaan lusiferaasireportterista Määrityksissä onko

BIRC5

ja

WNT7A

mRNA: t oli toiminnallinen kohdesivustoissa

miR-195

ja

miR-497

BC. Käytimme vektori, joka koodaa 3-’UTRs on

BIRC5

ja

WNT7A

mRNA: t, mukaan lukien oletetun kohdesivustoissa

miR-195

ja

miR-497

(asemat 198-204 ja 197-203, vastaavasti; taulukko S5). Olemme havainneet, että luminesenssi-intensiteetti väheni huomattavasti, kun läsnä on kohdepaikan

BRIC5

mukaan

miR-195

ja

miR-497-

transfektanttien (kuvio 7A ). Olemme saaneet saman tuloksen lusiferaasireport- määritys

WNT7A

geenin (kuvio 7B). Nämä tiedot osoittivat, että

miR-195

ja

miR-497

sitoutunut suoraan tiettyyn sivustoja 3′-UTR sekä

BRIC5

ja

WNT7A

mRNA: t.

luminenssi intensiteetti mitattiin

miR-195

ja

miR-497-

transfektanttien verrattuna miR-ohjaus transfektanttia. A)

miR-195/497

cluster sitoutumiskohdat 3′-UTR

BIRC5

mRNA. Lusiferaasireporttiterilla määritystä käytetty vektori koodauksen 3′-UTR alue

BIRC5

myös otaksuttu

miR-195/497

kohdesivustot.

Renilla

lusiferaasin arvot normalisoitiin tulikärpäsen lusiferaasi arvoihin. * P 0,01. B)

miR-195/497

cluster sitoutumiskohdat 3′-UTR

WNT7A

mRNA. Lusiferaasireporttiterilla määritys vektori on koodauksen 3′-UTR alue

WNT7A

myös otaksuttu

miR-195/497

kohdesivustoa. * P 0,01.

Keskustelu

Uskotaan, että miRNA säätelemään noin 30% kaikista geenien ihmisen genomin [29]. Normaaleissa soluissa, vuorovaikutus miRNA ja kohde- RNA: iden (mRNA: t), on tarkoin säädeltyä, kun taas tämä asetus on usein puuttuu syöpäsoluissa. Yhä useammat todisteet osoittavat, että miRNA ovat poikkeavasti ilmaistaan ​​monissa ihmisen syövissä ja niiden merkittävää osuutta aloittamisen, kehitys ja etäpesäke näiden syöpien [30]. Siksi tunnistaminen poikkeavasti ilmaisi miRNA on tärkeä askel analysoitaessa ihmisen kasvaimen synnyssä. Uusin analyysimenetelmä genomiikka, syvä sekvensointitekniikan, on mahdollista tunnistaa uusia kudosspesifisiä miRNA mukaan lukien ihmisen syövän kudoksissa [31]. Deep sekvensointitekniikan on tällä hetkellä kultakantaan kattava analyysi ihmisen miRNA. Tässä tutkimuksessa syvä sekvensointi tunnistaa suuri joukko miRNA jotka ilmentyvät eri välillä BC ja normaalin epiteelin.

määrittäminen ilmaus allekirjoitukset miRNA voivat nopeasti ja luotettavasti paljastavat miRNA jotka poikkeavasti ilmaistu syövissä. Siksi olemme aiemmin analysoitu miRNA lauseke allekirjoitukset käyttämällä PCR-pohjainen paneelit ja etsitään kasvaimen ehkäisevästä miRNA BC. Tällä tavoin voimme onnistuneesti tunnistettu kasvain tukahduttava miRNA kuten

miR-1

,

miR-133a

,

miR-145

ja

miR-218

[18] – [20], [25], [32] – [36]. Vertasimme aiemmat tulokset syvään sekvensointi allekirjoitukset kuvattu, jotta voimme liittää alkuperäisen datan asetettu uusi allekirjoitus. Tähän mennessä on ollut neljä tutkimuksia BC miRNA ilmaisun allekirjoitukset syvä sekvensoimalla analyysit [9] – [12]. Vuonna julkaistut tiedot,

miR-1

,

miR 145

,

miR-143

,

miR-125b

, ja

asennuspalveli- 100

on lueteltu yleisimmin vaimentua miRNA [9] – [12], tiedot vahvistivat oman allekirjoitus. Tämä seikka tukee tehokkuutta syvä sekvensointi allekirjoitusta, ja se viittaa siihen, että on olemassa uusi kasvain tukahduttava miRNA näissä uusia tietoja. Etuna tässä strategiassa on pystyä tunnistamaan uusia miRNA ehdokasta BC, joita ei ole aikaisemmin raportoitu. Löysimme 17 sellaiset sekvenssit, jotka saattavat muodostaa uusi miRNA ehdokkaita. Ne kuitenkin havaittiin hyvin alhaisilla tasoilla ilmaisun verrattuna tunnettuihin miRNA sekä syövän ja hyvänlaatuinen kudoksiin. Toiminnallinen merkitys näiden uusien miRNA ehdokkaita on tuntematon, ja se on tärkeää tulevaisuudessa tutkia niiden suhdetta ehdokas miRNA ja BC syövän synnyn. Esillä olevassa tutkimuksessa, emme käyttäneet kudosta mikro-leikkely, sen vuoksi myös tarkka osuus epiteelisolujen normaaleissa näytteissä ja tarkka osuus kasvainsolujen kasvaimen näytteet ovat tuntemattomia. Kuitenkin ohuen läppä normaalin virtsarakon limakalvon koostui pääosin NBE soluja, kun taas kasvainnäytteet muodostuu ensisijaisesti syöpä epiteelisolujen. Siksi uskomme, että vähäinen saastuminen muiden solujen ei ollut merkittäviä eivätkä vaikuta ilmentymistasojen MikroRNA.

MikroRNA voidaan jakaa perheisiin perustuen niiden sekvenssit tai klustereiksi perustuu niiden genomista loci. Klusteroitu miRNA transkriptoidaan coordinately ja ovat samanlaisia ​​tehtäviä säätelevät samat tavoitteet [37]. Esimerkiksi ilmaus

miR-1 /133a

cluster usein alennettu useita syöpiä, kuten BC. Tämä klusteri toimii tuumorisuppressorina kohdistuvat samoihin onkogeeninen geenejä, kuten

TAGLN2

ja

PNP

[18] – [23]. Vastaavia esimerkkejä on raportoitu muiden ryhmittyneet miRNA kuten

miR-15a /16

ja

miR-143/145

[14] – [16], [25] – [28]. Siten nämä tutkimukset osoittivat, että aihekokonaisuuksien miRNA voisi toimia yhdessä suoriutua toimintana kaikkialla samoja biologisia prosesseja ja sama kohdennettuja geenejä. Mitä tulee

miR-195/497

klusteri, on osoitettu, että

miR-195

säädeltiin vähentävästi useisiin syöpiin [38] – [40], ja se esti glukoosin oton, leviämisen, ja solukierron kohdentamalla

GLUT3

ja

CDK4

BC [41], [42]. On myös osoitettu, että m

IR-497

säädeltiin vähentävästi ja toimi tuumorisuppressorina kohdistamalla

BCL2

useita syöpiä [43], [44].

miR-195/497

klusteri toimi myös tuumorisuppressorina kohdistamalla

RAF1 /CCND1

rintasyövässä [45]. Validoiminen aiempia raportteja, arvioimme ekspressiotasot

miR-195

ja

miR-497

BC kliinisissä näytteissä ja olemme vahvistaneet, että

miR-195

ja

miR-497

merkittävästi vaimentua kasvainkudoksissa. Seuraavaksi tutkimme toiminnallinen merkitys

miR-195

ja

miR-497

BC käyttäen kahta solulinjoja, BOY ja T24. Palauttaminen kypsä

miR-195

tai

miR-497

syöpäsoluissa paljasti merkitsevän eston syöpäsolujen lisääntymistä, invaasiota ja muuttoliike. Nykyinen tieto ja aiemmat tutkimukset viittaavat siihen, että

miR-195/497

cluster toki toimivat tuumorisuppressorina BC.

miRNA ovat ainutlaatuisia niiden kyky säädellä monia proteiinin koodaavan geenejä. Bioinformatiikan ennusteiden mukaan miRNA säädellä enemmän kuin 30% proteiinia koodaavan geenien [29]. Syöpäsoluissa, normaali miRNA – mRNA verkkoja repinyt poikkeavasti ilmaisi miRNA. Olemme ottaneet kannan, jonka tunnistaminen uusia syövän reittejä ja vastaa kohde- geenejä säätelee kasvaimen tukahduttava

miR-195/497

klusteri on tärkeä ensimmäinen askel ymmärtämään BC oncogenesis. Tämän näkemyksen perusteella tunnistimme molekyyli polkuja ja tavoite oncogenes jotka säätelevät

miR-195/497

cluster käyttäen genominlaajuisten geenien ilmentyminen tietoja ja

in silico

analyysiin.

miR-195/497

klusteri kuuluu

miR-15/16/195/424/497

perhe, joka jakaa saman 3′-UTR sitova siemeniä sekvenssi (AGCAGCA). TargetScan tietokanta tunnistettu 6730 geenejä, jotka olivat ehdokas tavoitteita

miR-195/497

klusteri. Kegg polku analyysi osoitti, että nämä geenit sekaantuneet 113 väyliä, mukaan lukien ”Pathways syövän”, ”MAPK signalointi”, ”Endocytosis”, ”insuliini signalointi” ja ”Wnt signalointi”.

Näistä reittejä, me keskittyi ”Pathways in Cancer”, koska niiden välitöntä merkitystä. Mukaan meidän hypoteesin, kohdegeenien

miR-195/497

olisi yläreguloituja syöpäsoluja. Kun tutkimme ekspressiotasot 104 geenien ”Pathways syövän” ryhmässä, 27 geenejä yläreguloituja BC kliinisissä näytteissä, mikä viittaa siihen, että nämä geenit olivat ehdokas

miR-195/497

tavoitteet ja toimi onkogeenien BC. Vahvista luotettavuutta

in silico

selvitys mahdollisista kohdegeenien, me tarkistetaan onko

BIRC5

ja

WNT7A

geenit tosiasiassa sääntelee

asennuspalveli- 195/497

klusteri BC. Tuloksemme osoittivat, että

BIRC5

ja

WNT7A

olivat suoraan säätelee

miR-195/497

klusteri BC.

BIRC5

on jäsen apoptoosi-inhibiittori (IAP) -perheen ilmentyy monissa syövissä, mukaan lukien BC [46]. Sitä voidaan mitata virtsasta mRNA ja proteiini tasoilla, ja virtsa

BIRC5

raportoitiin diagnostisena biomarkkeri BC [47]. Viimeaikaiset tutkimukset muut ryhmät ovat osoittaneet, että useat MikroRNA kuten

miR-542-3p

,

miR-218

,

miR-708

ja

miR-203

suoraan esti

BIRC5

sen erilaisissa syöpätyyppien [48]. Tutkimuksemme on ensimmäinen viittaa siihen, että

BIRC5

voidaan säädellä

miR-195/497

klusteri BC soluissa. Siksi strategiamme tunnistaa uusia kasvain heikentävän miRNA-säännelty molekyylikohteista /reittejä BC on tehokas lähestymistapa miRNA-syöpätutkimukseen.

Johtopäätökset

Yhteenvetona rakennettu miRNA ilme allekirjoitukset kliinisistä BC näytteiden avulla syvälle sekvensoimalla kultakantaan menetelmällä. Yhteensä 60 miRNA vähensi merkittävästi BC yksilöitä. Olemme tunnistaneet useita vaimentua miRNA jotka sijaitsevat samalla genomin alueella muodostaa miRNA klusterin, kuten

miR-1 /133a

,

miR-143/145

,

miR-99a /let-7c

,

miR-195/497 miR-144 /451a

. Downregulation

miR-195/497

cluster oli yleinen tapahtuma BC kliinisissä näytteissä. Palauttaminen nämä miRNA esti merkittävästi syöpäsolujen proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota, mikä viittaa siihen, että

miR-195/497

toimivat tuumorisuppressoreilla BC. Meidän analyysi

miR-195/497

klusteri ehdotti, että se säännelty otaksuttu syövän reittejä ja onkogeenisten geenejä. Nämä havainnot edistävät analyysin BC syövän synnyn. Tunnistaminen kasvaimen esti

miR-195/497

klusteri ihmisen BC voi tuottaa uutta tietoa mahdollisista terapeuttisia kohteita hoidossa BC.

Materiaalit ja menetelmät

kliiniset näytteet ja soluviljelmissä

Kudosnäytteet miRNA seulontaan käyttämällä syvä sekvensointia saatiin viideltä BC potilaista ja viisi NBEs. BC potilaat olivat läpikäyneet cystectomy tai höyläysleikkaus rakkokasvaimista (TUR-BT) Kagoshima yliopistollisen sairaalan välillä 2003 ja 2010. Viisi NBEs olivat peräisin potilaista ei-BC sairauksia. O saastuminen syöpäsolujen havaittiin patologia. Toinen sarja 29 tasapainotusliivit ja 20 NBEs saatiin Kagoshima yliopistollisen sairaalan välillä 2003 ja 2010. Tätä ryhmää altistettiin reaaliaikaisen RT-PCR arvioida miRNA ekspressiotasoja. Näytteet lavastettu mukaisesti kasvaimeen solmu-etäpesäke luokitusjärjestelmän American sekakomitean Cancer /Union Internationale Contre le Cancer (UICC) ja histologisesti arvostellaan [49]. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ja tutkimuksemme hyväksyi bioetiikkaneuvoston Kagoshiman yliopistossa. Potilaiden taustoja ja kliinis ominaisuudet esitetään yhteenveto taulukoissa 1 ja 6.

Käytimme kaksi ihmisen BC solulinjoissa: BOY, joka perustettiin vuonna laboratoriossamme aasialaisesta miespotilas, 66-vuotias , joka oli diagnosoitu vaiheen III BC kanssa keuhkometastaasitestissä; ja, T24, joka oli invasiivinen ja saatu American Type Culture Collection. Nämä solulinjat pidettiin vähintään essential medium (MEM), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia: ssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2 ja 95% ilmaa 37 ° C: ssa.

Tissue keräämistä ja RNA uuttamalla

Kudosnäytteet upotettiin RNAlater (QIAGEN, Valencia, CA, USA) ja niitä säilytettiin -20 ° C: ssa, kunnes RNA suoritettiin. Kokonais-RNA, kuten miRNA, uutettiin jäädytetty kudoksista käyttäen Mirvana ™ miRNA eristyspakkausta (Ambion, Austin, TX, USA) valmistajan protokollan. Eheyden RNA tarkastettiin RNA 6000 Nano Assay Kit ja 2100 Bioanalyzer ™ (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).

Small RNA kirjasto valmistelu ja profilointi syvät sekvensoinnilla

Yhteensä-RNA: t viidestä tasapainotusliivit ja viisi NBEs tehtiin syvä sekvensointi. Kokeelliset sisälsi seuraavat vaiheet: pieni RNA: n eristys, cDNA-kirjastosta valmistelu, ja sekvensointi. Kokonais-RNA kustakin näytteestä oli koon fraktioitiin 15%: n PAGE-geelissä, ja 18-30 nukleotidin fraktio kerättiin. 5′-RNA-adapteri ligoitiin RNA T4-RNA-ligaasia. Ligatoitu RNA fraktioitiin koon, ja 36-50 nukleotidin fraktio leikattiin irti. 3′-RNA-sovitin sen jälkeen liitettiin Saostunut RNA: sta käyttäen T4 RNA-ligaasia. Ligatoitu RNA fraktioitiin koon, ja 62-75 nukleotidin osa (pieni RNA + sovittimet) leikattiin irti. Taulukko S1. Taulukko S2. Taulukko S3. Taulukko S4. Taulukko S5.