Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kultananohiukkasia (BKTL) ovat osoittaneet lupaavia lääketieteellisiä sovelluksia syövän hoidossa säätelyyn osallistuvan solunsisäisten redox tasapainon. Aiemmin olemme raportoineet, että BKTL voi laukaista apoptoosin ja nekroosin ihmisen keuhkosyövän soluja (A549), kun L-buthionine-sulfoksimiini (BSO) käytettiin vähentää ilmentymistä solunsisäisen glutationin (GSH). Tässä tutkimme sytotoksisuus BKTL kohti keuhkosyövän soluja glutamaatin kysteiini ligaasi katalyyttinen alayksikkö (GCLC) oli vaiennetaan siRNA. Tuloksemme osoittivat, että BKTL aiheuttavat apoptoosia ja nekroosia transfektoiduissa soluissa GCLC siRNA nostamalla solunsisäisiä reaktiivisen hapen (ROS). Nämä havainnot osoittivat, että sääntelyn glutationin synteesin GCLC siRNA A549 solut voidaan aloittaa kultananopartikkeleilla aiheuttama sytotoksisuuden.

Citation: Liu M, Zhao Y, Zhang X (2015) knockdovvn Glutamaatti kysteiini Ligase katalyyttinen alayksikkö siRNA Aiheuttaa kultananopartikkeleilla-indusoitu sytotoksisuus in Lung Cancer Cells. PLoS ONE 10 (3): e0118870. doi: 10,1371 /journal.pone.0118870

Academic Editor: Pedro V. Baptista, Universidade Nova de Lisboa, PORTUGALI

vastaanotettu: 25 lokakuu 2014; Hyväksytty: 11 tammikuu 2015; Julkaistu: 19 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tuki National Natural Science Foundation of China (81102468 Y. Zhao). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Äskettäin kiinnostus kultananopartikkeleilla (BKTL) syövän diagnosoinnissa ja hoidossa, kuten lääkeaineen kantajia [1], solu kohdennusvektorit [2], kuvantaminen [3], säteilylle herkäksi [4-7], ja ei-invasiivisia ablaation hoitojen [8, 9] on kasvanut merkittävästi. BKTL tarjoavat etuja näissä sovelluksissa, koska niiden hyvästä bio [10], voimakas valon absorptio ja sironta vaikutus [11], korkea photothermal tulosprosentti ja valostabiilius [12-14], facile bioconjugation ja biomodification [15]. Lisäksi käyttö BKTL kuten syöpälääkkeet on tutkittu laajasti. Erilaisia ​​yrityksiä sisällyttää BKTL osaksi syöpähoitojen on tehty.

pelkistettyä glutationia (GSH), runsain solunsisäinen tioli, on tärkeää säilyttää solunsisäisessä redox tasapainoa ja on mukana vieroitus eksogeenisen ja endogeenisten aineiden kuten vierasaineiden, ionisoiva säteily, orgaaniset peroksidit ja raskasmetallit [16,17]. On osoitettu, että aggressiivinen kasvain voi olla herkkiä lääkkeiden avulla hoito perustuu modulaatioon GSH tason syöpäsoluissa [18]. On hyvin tunnettua, että glutationin syntetisoidaan sen muodostavista aminohapoista kahdessa peräkkäisessä, katalysoi glutamylcysteine ​​syntetaasin (GCL) ja GSH-syntaasia. GCL koostuu katalyyttisen alayksikön (GCLC) ja modulatory alayksikkö (GCLM), joka katalysoi ensimmäinen ja nopeutta rajoittava vaihe ja sillä on keskeinen rooli glutationi homeostaasiin [19]. Solunsisäinen GSH tasoja voidaan köyhdytetty kautta spesifinen esto GCL. L-buthionine-sulfoksimiini (BSO), estäjä GCL, tiedetään heikentävistä solunsisäiseen altaan glutationin ja siten aiheuttaa oksidatiivinen stressi [20]. Muutokset erityistoimet osallistuvien entsyymien GSH aineenvaihduntaa syöpäsolut ovat sekaantuneet oksidatiivista stressiä ja ehtyminen GSH saattaa lisätä alttiutta syöpäsolujen muita haitallisia tapahtumia [21-23]. Olemme raportoineet aiemmin, että BKTL näyttö sytotoksisuus keuhkosyövän soluihin, kun L-buthionine-sulfoksimiini (BSO) käytettiin pienentää ilmentymisen solunsisäisen glutationin [24]. Niin, kultananopartikkeleilla voidaan käyttää potentiaalisina terapeuttisina säätelemällä glutathione syöpäsoluissa. Vaikka BSO on eräänlainen eksogeenisen yhdisteitä. Vaikutus BSO soluilla toiminto on arvaamaton. Tässä työssä olemme arvioitiin vaikutus GCLC siRNA on BKTL aiheuttaman cytotoxity keuhkojen syöpäsoluja.

Meidän tietääksemme ei ole tutkimuksessa arvioidaan roolit GCLC siRNA BKTL-solukuolema. Ensisijaisena tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena on luonnehtia cytotoxity on BKTL keuhkosyövän soluihin GCLC joka pudotettiin siRNA.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

A549-soluja (Shanghai Cell Bank, Type Culture Collection komitea, Kiinan tiedeakatemia, kissa numero: TCHu150) ylläpidettiin RPMI-1640-alustassa, joka sisälsi 4,5 g /l glukoosia, 2 mM L-glutamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia, 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Soluja kasvatettiin 5% CO

2 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä.

transfektio siRNA A549 solulinjassa

Gene vaiennettu GCLC suoritettiin käyttämällä siRNA pudotus järjestelmässä . Ei-spesifinen ohjaus siRNA duplex [5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ’], GCLC siRNA-1 duplex [5′-GCUAAUGAGUCUGACCAUU (dTdT) -3′], GCLC siRNA-2 duplex [5’-CUAUGUGGUGU UUGUGGUA (dTdT) – 3 ’] ja GCLC siRNA-3 duplex [5′-GUAGUAUUCUGAACUACCU (dTdT) -3’] hankittiin Sigma-Aldrich. Lyhyesti, A549-solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille tiheytenä 1,5 x 10

5 per kuoppa. Seuraavana päivänä solut (~ 60-70% yhtymäkohta) kussakin kuopassa transfektoitiin negatiivisen kontrollin, GCLC siRNA (75pmol vapaassa FBS RPMI1640) käyttäen Thermo Scientific DharmaFECT transfektioreagenssit (Thermo Scientific) mukaan valmistajan ohjeiden. Yksi päivä myöhemmin, väliaine vaihdettiin normaaliksi kasvualustaa ja soluja viljeltiin vielä 48 tunnin ajan. Transfektoidut solut otettiin talteen ja niitä käytettiin PCR-, western blot-analyysi, ja GSH tason mittaus [25-27].

RNA: n valmistaminen ja semikvantitatiivinen RT-PCR

semikvantitatiivinen RT-PCR-β- aktiinia sisäisenä kontrollina suoritettiin tutkimaan muutoksen mRNA ilmentymisen GCLC A549-soluja transfektoitiin siRNA: illa. Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden [28]. Eristetty RNA (2 ug) peräisin siRNA käsitellyistä soluista käänteiskopioitiin yksijuosteiseksi cDNA reaktioseoksessa, joka sisältää: 10 mmol /L dNTP: tä, 1 ug oligo (dT) alukkeen, 20IU RNasin ja 200IU M-MLV käänteistranskriptaasia. PCR-monistus suoritettiin 0.4μg cDNA: reaktiotilavuudessa, joka sisälsi 3 pmol kunkin yksittäisen oligonukleotidialuketta, 10 mmol /L dNTP, ja 1.5IU Taq DNA-polymeraasia. Kaikkien reaktioiden, alustavat kokeet suoritettiin määrittämiseksi PCR-syklien lukumäärän, joissa kyllästyminen tapahtui, ja kokeissa mainitut suoritettiin useita syklejä, jotka edeltävät kylläisyyttä. Sekvenssit alukkeiden GCLC ja β-aktiinin ilmentymistä analyysit olivat: GCLC, forward-aluke: 5′-TCCAGGTGACATTCCAAGCC-3 ’; reverse-aluke: 5’-GAAATCACTCCCCAGCGACA-3 ’. Lämpösyklilaite yksikkö oli ohjelmoitu 36 sykliä 95 ° C 30 sekuntia, 60 ° C: ssa 30 sekunnin ajan ja 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. β-aktiinin, forward-aluke: 5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3 ’; reverse-aluke: 5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3 ’. PCR-tuotteet ajettiin elektroforeesissa 2% agaroosigeelillä (Sigma-Aldrich) ja visualisoitiin etidiumbromidivärjäyksen jälkeen yli UV-valon [29].

Western blotting

GCLC havaitsemiseksi, soluja kasvatettiin kuusi kuoppaiset levyt inkuboitiin negatiivisen kontrollin duplex ja GCLC siRNA duplex 24 tuntia, sitten viljeltiin normaalin kasvun väliaineessa vielä 48 tunnin ajan. Tämän jälkeen solut pestiin PBS: llä, trypsinoitiin ja kerättiin sentrifugoimalla. Tietty määrä 30 ug proteiinia kustakin näytteestä sekoitettiin latauspuskurilla, inkuboitiin 100 ° C: ssa 5 minuuttia ja erotettiin 10% SDS-PAGE. Sitten näytteet siirrettiin PVDF (polyvinylideenifluoridi) kalvo ja blokattiin 5% (w /v) kuorittua maitoa liuotetaan TBS + 0,05% (v /v) Tween-20 (TBST) ja yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja koetettiin GCLC (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), tai β-aktiini (1: 2000, Santa Cruz Biotechnology), 4 ° C: ssa yön yli. Seuraavat, kalvoja inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen (1: 4000 anti-kani, Cell Signaling Technology) yhden tunnin ajan, pestiin 3 kertaa TBST: llä ja kaistoja visualisoitiin käyttämällä ECL-reagenssia (Thermo Scientific) [30].

Yhteensä intrasellulaarisen glutationin (GSH) tasot

Cellular GSH pitoisuus analysoitiin käyttämällä glutathione kvantifiointi Kit (Beyotime instituutti Biotechnology). 5, 5′-ditiobis (2-nitrobentsoehappo) (DTNB) ja GSH reagoivat tuottaa 2-nitro-5-tiobentsoehappo ja glutationi disulfidi (GSSG). Koska 2-nitro-5-tiobentsoehappo on keltainen tuote, GSH-pitoisuus voidaan mitata 412 nm: ssä absorbanssista, jossa on kuopan levy, lukija. Lyhyesti, solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin tai kolme GCLC siRNA duplex 24 tuntia, sitten viljeltiin normaalissa kasvualustassa vielä 48 tunnin ajan. Lopussa hoidon, solut kerättiin ja pelletoitiin sentrifugoimalla 1000 rpm: llä 5 minuutin ajan, suspensoitiin uudelleen lyysipuskuriin, joka sisälsi 0,2% Triton X-100. Solulysaatit sentrifugoitiin 13,000g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantit käytettiin määrittämiseksi koko glutationin pitoisuuksia. GSH heikkeni GCLC siRNA käsitellyissä soluissa oli merkitty [31].

Sytotoksisuus mittaus

Sytotoksisuus määritettiin kautta solulaskennan. Havaitsimme, että inhibitio GCLC siRNA-1duplex on merkittävin yksi kolmesta GCLC siRNA duplex. Niin, A549-soluja inkuboitiin negatiivisen kontrollin tai GCLC-spesifisiä siRNA-1, ja sitten altistettiin eri annoksilla BKTL ylimääräisiä 72 tuntia. Lopuksi solut pestiin PBS: llä, trypsinoitiin trypsiini /EDTA-liuoksella ja suspendoitiin uudelleen lopulliseen tilavuuteen 2 ml solujen väliaine edelleen mittausta solujen elinkelpoisuuden. Solumäärät kussakin näytteessä laskettiin mikroskoopilla käyttäen Counting jaosto Set (Qiujing Inc) [32].

Solunsisäinen reaktiivisen hapen mittaaminen

tuotanto ROS mitattiin käyttäen 2, 7-dichlorodihydro loisteputki diasetaatti (DCFH-DA, Beyotime instituutti Biotechnology). DCFH-DA passiivisesti tulee solut, solu esteraasit toimia molekyylin muodostamiseksi ei-fluoresoiva ryhmä DCFH, joka on ioninen luonteeltaan ja siten loukkuun solujen. Reagoidessaan ROS johtaa hapettuminen DCFH on erittäin fluoresoivan yhdisteen dichloroflourescein (DCF). Lyhyesti, soluja kasvatettiin 6-kuoppalevyillä transfektoitiin negatiivisen kontrollin, GCLC siRNA-1 käyttäen Thermo Scientific Dharma teinen transfektio Reagenssit. Yksi päivä myöhemmin solut käsiteltiin BKTL (20 uM), BKTL (20 uM) ja eksogeenisten GSH (1 mM) tai BKTL (20 uM) ja ROS scavenger N-asetyyli-L-kysteiini (NAC, 1 mM) ja vielä 72 tuntia. Sitten solut pestiin PBS: lla kolme kertaa, ja sen jälkeen käsiteltiin 10 uM DCFH-DA. Sen jälkeen, kun inkuboitiin 30 minuutin ajan, solut trypsinoitiin, kerättiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään. Fluoresenssin intensiteetin soluja (50 000) kustakin kuopasta mitattiin fluoresenssispektrofotometriä (Thermo Scientific), jossa on heräte ja emissioaallonpituuksilla 488 ja 525 nm, vastaavasti. [33]

virtaussytometrinen analyysi apoptoosin ja kuolion

Cell laskenta tulos osoitti, että BKTL oli inhibitorinen toiminnon transfektoitujen solujen eloonjäämistä. Tutkimme, onko syy tämän eston on joko aikaisin apoptoosin tai myöhään apoptoosin /nekroosin. Nämä vaikutukset määritettiin fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) -merkattua anneksiiniV ja PI-värjäys (Invitrogen) virtaussytometrianalyysillä. Transfektoidut solut käsiteltiin BKTL, BKTL ja GSH, BKTL ja NAC. 72 tunnin kuluttua solut kerättiin ja pestiin kahdesti PBS: llä, inkuboitiin anneksiiniV-FITC ja PI 15 minuutin ajan huoneen lämpötilassa pimeässä. Apoptoottisten ja nekroottisten solujen arvioitiin virtaussytometrialla. Vähintään 1 x 10

4 solut analysoitiin näytettä kohti, ja neljänneksessä asetukset perustuivat kontrollinäytteistä. Eläviä soluja ovat negatiivisia molemmille propidiumjodidi (PI) ja anneksiini V, varhainen apoptoottiset solut ovat PI negatiivisia, mutta anneksiiniV positiivinen, kun taas myöhäinen apoptoottiset /nekroottisten solut ovat positiivisia sekä PI ja anneksiiniV. Kaikki virtaussytometrillä analyysit suoritettiin käyttäen kaupallisesti saatavilla Cell Quest ohjelmisto (BD Bioscience).

Mitokondrioiden kalvojännite ja solunsisäisen pilkottiin kaspaasi-3-määritys

JC-1 (5, 50, 6, 60-tetrakloori-1, 10, 3, 30-tetraethylbenzamidazolocarbocyanin jodidi, Beyotime instituutti Biotechnology) käytettiin arvioimaan muutoksia mitokondrion kalvon mahdollisia kuten aikaisemmin on kuvattu [24]. A549-soluja logaritmisessa kasvuvaiheessa maljattiin 6-kuoppaisille soluviljelylevyille ja inkuboitiin 24 tuntia, ja sitten transfektoitiin negatiivisen kontrollin tai GCLC-spesifisiä siRNA-1. Transfektoidut solut käsiteltiin tai ilman BKTL (20 uM) 72 tunnin ajan, tämän jälkeen solut kerättiin ja niitä inkuboitiin JC-1 30 minuutin ajan pimeässä 37 ° C: ssa. Värjäyksen jälkeen solut pestiin kahdesti PBS: llä ja analysoitiin virtaussytometrialla. [34]

solunsisäisen pilkottiin kaspaasi-3-transfektoituja soluja, jotka on käsitelty tai ei ole BKTL kerättiin ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä. Sen jälkeen käsiteltiin 0,1% Triton X-100 ja blokattiin 1% BSA: ta, soluja inkuboitiin katkaistun kaspaasi-3 (Asp175) vasta-ainetta (Alexa Fluor 488-konjugaattia, Cell Signaling Technology) 30 minuutin ajan. Sitten värjätyt solut analysoitiin virtaussytometrillä [24].

Tilastollinen

Tilastoeroja arvioitiin käyttäen varianssin analyysiä (ANOVA) ja Studentin t-testi kanssa Prism-ohjelmiston (GraphPad Software, Inc.). P 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä, ja tiedot leimattiin (*) ja p 0,05, (**) ja p 0,01, ja (***) ja p 0,001, vastaavasti. Kukin ryhmä testattiin kolmena kappaleena, ja kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa.

Tulokset

tehoa siRNA: iden vastaan ​​katalyyttinen GCL alayksiköt

tutkimiseksi pudotus vaikutus kolme 19-nukleotidisekvenssit katalyyttinen GCL alayksiköt, A549-soluja transfektoitiin negatiivisen kontrollin tai GCLC siRNA: ssa 24 tuntia, minkä jälkeen viljeltiin vielä 48 tuntia normaalissa kasvualustassa. Semikvantitatiivinen RT-PCR-analyysi suoritettiin tutkimaan GCLC mRNA: n ilmentymisen. MRNA-tasot on GCLC vähensi merkittävästi A549-soluja, jotka on transfektoitu GCLC siRNA. Sen sijaan negatiivinen kontrolli-siRNA oli vähemmän voimakas (Fig. 1A). Kaikissa transfektoiduissa soluissa GCLC siRNA, mRNA tasot GCLC olivat homogeenisia ilman merkittävää poikkeamaa. Samalla olemme arvioitu tehoa GCLC siRNA määrittämällä niiden kyky häiritä ilmaistaan ​​proteiinien Western blot. Kuten on esitetty kuviossa. 1B, GCLC siRNA estivät merkittävästi ekspressiota GCLC proteiinin A549-soluja. Kolme erilaista siRNA katalyyttisen GCL alayksiköt differentiaalisesti häiritsi ilmentymisen GCLC verrattuna negatiiviseen kontrolliin, siRNA ja GCLC siRNA-1 oli tehokkainta.

(A) GCLC mRNA-tasot A549-soluissa 24 tuntia transfektoitiin negatiivisen kontrollin siRNA, GCLC siRNA-1, GCLC siRNA-2 ja GCLC siRNA-3. GCLC siRNA vähensi GCLC mRNA tasot A549-soluja. (B) edustaja Western blot geeli asiakirjat GCLC ja tiivistää tietoja, jotka osoittavat, että tehokkuus geenien of GCLC siRNA. Soluliman proteiinit eristettiin transfektoiduista soluista. GCLC proteiinin tasot solu-uutteissa mitattiin Western blot -analyysillä ja normalisoitiin p-aktiinin ilmentymistä tasoilla. *** P 0,001, verrattuna negatiiviseen kontrolliin.

vaikutus GCLC siRNA solunsisäisiin GSH tasoilla A549

GCLC on välttämätöntä glutationin biosynteesin, joka ylläpitää glutationia pitoisuudet ehjillä soluilla. Olemme osoittaneet, että siRNA kohdistettu katalyyttinen GCL alayksiköt vähentää mRNA-tasot GCLC ja ekspression inhiboimiseksi GCLC proteiinin A549-soluja. Vahvistavan edelleen spesifisyyden ja tehoa GCLC siRNA, vaikutus GCLC siRNA solunsisäisiin GSH tasoilla mitattiin [32]. Kuten odotettua, verrattuna negatiivinen kontrolliryhmä, GCLC siRNA ilmeisesti vähensi GSH tasoilla ja GCLC siRNA-1 on merkittävin (Fig. 2), joka on vastaavuus tuloksista, joita olemme havainneet edellä. Ottaen huomioon nämä tulokset, GCLC siRNA-1 käytettiin seuraavassa kokeessa. Knock-down kokeet osoittivat, että GCLC siRNA vaikuttaa ilmaus GCLC ja johti merkittävään vähentämiseen GSH tuotannon.

sytosoliin eristettiin soluista, jotka oli transfektoitu negatiivisen kontrollin siRNA, GCLC siRNA-1, GCLC siRNA-2 ja GCLC siRNA-3. Solunsisäinen GSH-tasot määritettiin 412 nm: ssä absorbanssi kanssa kuopan levy, lukija. Tulokset edustavat keskiarvoa prosenttiosuus negatiivisen kontrollin (n = 3) ± SD 4 itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ** P 0,01, verrattuna negatiiviseen kontrolliin.

Euroopan GCLC siRNA säätelee solukuolemaa aiheuttama BKTL

Yhteensä GSH pitoisuus väheni merkittävällä tavalla vuonna A549-soluja, jotka on transfektoitu GCLC siRNA. Kun BSO käytettiin pienentää ilmentymisen glutationin A549-solut, BKTL osoitti selvää sytotoksisuus soluja [32]. Kuitenkin vaikutus GCLC siRNA on sytotoksisuutta BKTL on vielä tuntematon. Seuraavaksi, tutkimme BKTL muuttanut A549-soluja selviytyminen upon siRNA-välitteinen häiriö GCLC toimintaa. Tulosten perusteella on knock-down kokeissa, A549-soluja transfektoitiin negatiivisen kontrollin-siRNA tai GCLC siRNA-1, ja sitten altistettiin eri pitoisuuksia BKTL. Kuten Kontrollikoetta, GCLC siRNA ei aiheuttanut merkittävää sytotoksisuus A549-soluja (S1 Kuva.). Vaikka, havaitsimme, että BKTL annosriippuvaisesti inhiboivat A549-solujen esikäsitelty GCLC siRNA-1. Verrattuna negatiivinen kontrolliryhmä, hoito A549-solujen kanssa 50 uM BKTL johti merkittävästi vähentynyt väestön elävien solujen jälkeen heikentävien solunsisäistä GSH (Fig. 3).

A549-soluja transfektoitiin negatiivisen kontrollin tai GCLC siRNA- 1 24 tunnin ajan, minkä jälkeen viljeltiin vielä 3 päivää ilman BKTL, sen jälkeen kerättiin ja laskettiin. Kukin pylväs edustaa keskiarvo (± SD n = 4) kolminkertaisten määritysten. * P 0,05 verrattuna negatiiviseen kontrolliin.

BKTL aiheuttama sytotoksisuuden liittyy solunsisäisten ROS GCLC siRNA käsitellyissä soluissa

Koska ROS on ehdotettu kriittiseksi tekijäksi määrittämiseksi solukuoleman tilassa. Tutkimme lisäksi myös ROS osallistuvat säätelyyn BKTL solukuolema kun solut transfektoitiin GCLC siRNA. Kuten on esitetty kuviossa. 4, kun hiljentäminen GCLC ilmaisutapoja siRNA-1, BKTL johti noin 7-kertainen ROS tasoilla verrattuna negatiivisessa kontrolliryhmässä. Kuitenkin, kun solut käsiteltiin GCLC siRNA yksin vaikutus ROS ei havaittu ilman BKTL (S2 kuvio.). Eksogeeninen GSH ja NAC merkittävästi tukahdutti BKTL aiheuttamaa ROS tuotanto, joka voisi suojata GCLC siRNA käsiteltyjen solujen sytotoksisuuden BKTL. Nämä tulokset tarkoittavat, että sytotoksisuus BKTL on ainakin osittain liittyy kasvu ROS tasoilla GCLC siRNA-1 esikäsitellyt solut (Fig. 4).

Eksponentiaalisesti kasvavat solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin ja GCLC siRNA- 1 24 tuntia, seuraavia käsiteltiin BKTL (20 uM), BKTL (20 uM) ja GSH (1 mM), BKTL (20 uM) ja NAC (1 mM). ROS mitattiin. Käyrät osoittavat ROS (määritettynä DCF) tasot (%) verrattuna negatiivisen kontrollin soluihin. Kukin pylväs edustaa keskiarvo (± SD n = 4) kolminkertaisten määritysten. ** P 0,01

BKTL aloittaa apoptoosin ja nekroosin transfektoiduissa soluissa GCLC siRNA

Todisteet BKTL indusoivat solukuoleman ja parantaa tuotannon solunsisäisten ROS sai meidät tutkimaan edelleen onko BKTL aiheuttaa apoptoosin ja nekroosin GCLC siRNA käsitellyissä soluissa. Dual solujen värjäys anneksiini V-FITC: llä ja PI: n käytetään erottamaan apoptoottisten ja nekroottisten solujen normaaleista soluista. Kuten on esitetty kuviossa. 5, BKTL kasvattanut anneksiiniV-värjättyjen solujen kun GSH-tasot laskivat hiljentäminen GCLC ilme. Väestön koko PI-positiivisten solujen, joka käsittää apoptoosin ja nekroosin, oli myös merkittävästi lisääntynyt GCLC siRNA ja BKTL käsiteltyjä soluja. Käsittely GCLC siRNA yksinään ei lisännyt väestön apoptoosin ja nekroosin verrattuna kontrolliryhmään (S3 kuvassa.). Nämä tiedot osoittivat, että BKTL suhteellisen vaikuttavat anneksiini V-PI värjättiin solujen määrä soluissa, jotka on transfektoitu GCLC siRNA. Sen testaamiseksi, apoptoosin tai nekroosin aktivoitiin ROS, käytimme eksogeeninen GSH ja NAC. Hoito GSH ja NAC molemmat merkittävästi tukahdutti ulkonäkö anneksiini V ja PI-positiivisia soluja aiheuttama BKTL vuonna GCLC siRNA käsitellyissä soluissa (Kuva. 5). Nämä tulokset osoittivat, että BKTL aloittaa apoptoosin ja nekroosin nostamalla solunsisäisiä ROS tasoilla keuhkosyöpäsoluissa esikäsitelty GCLC siRNA.

Solut transfektoitiin joko muiden kuin kohde-ohjaus siRNA tai GCLC erityisiä siRNA-1. Yksi päivä myöhemmin solut käsiteltiin BKTL (20 uM), BKTL (20 uM) + GSH (1 mM) ja BKTL (20 uM) + NAC (1 mM) ja vielä 72 tunnin ajan. AnneksiiniV-FITC- ja PI-soluja mitattiin virtaussytometrialla. (A) fluoresenssivoimakkuuksien kuvio anneksiiniV-FITC ja PI-värjätään A549-solut käsittelyn jälkeen. (B) Prosenttiosuudet anneksiini V positiivisia tai PI-positiivisten solujen eri hoitoja. Kukin pylväs keskiarvo (± SD n = 3). ** P 0,01, *** P 0,001, verrattuna kontrolli.

BKTL aiheuttaa depolarisaation mitokondrion kalvon potentiaalia GCLC siRNA käsitellyissä soluissa

Koska depolarisaation mitokondrion kalvon potentiaalin (ΔΨm) on keskeinen rooli apoptoosin [35], tutkimme onko BKTL muuttunut mitokondrion kalvon potentiaalia transfektoiduissa soluissa GCLC siRNA-1. Fluoresoiva koetin JC-1 väriainetta käytettiin arvioimaan muutoksen mitokondrion kalvon potentiaalia ja fluoresenssin muutos (punaisesta vihreään) näytteitä mitattiin virtaussytometrialla. Havaitsimme, että BKTL aiheutti lisääntymisen vihreä /punainen fluoresenssi-intensiteetti GCLC siRNA käsitellyissä soluissa (Fig. 6). Kun taas solut, jotka on transfektoitu GCLC siRNA puuttuessa BKTL ei osoittanut mitään muutosta mitokondrion kalvon potentiaalia verrata kontrolliryhmään (S4 kuvassa.). Nämä tulokset osoittivat, että apoptoosin induktio ja nekroosia, jonka BKTL on GCLC siRNA esikäsitelty solujen liittyy läheisesti mitokondrion kalvon potentiaalia.

Kun transfektoitiin negatiivisen kontrollin siRNA tai GCLC siRNA-1, soluja käsiteltiin BKTL (20 uM ) ja vielä 72 tunnin ajan, sitten kerättiin ja värjättiin JC-1 pimeässä 37 ° C: ssa, huuhdeltiin PBS: llä. Fluoresenssin muutos (punaisesta vihreäksi) Näytteiden mitattiin virtaussytometrialla. Kukin pylväs edustaa keskiarvo (± SD n = 4) kolminkertaisten määritysten. *

p

0,05, verrattuna negatiiviseen kontrolliin, jossa ryhmä.

BKTL indusoida kaspaasi-3: llä transfektoiduissa soluissa GCLC siRNA

Mitokondrioiden-riippuvaista apoptoosia aloitetaan rekrytointi ja kaspaasi [36]. Niinpä edelleen kysyä kaspaasi-3 aktivoidaan BKTL indusoi apoptoosin GCLC siRNA käsitellyissä soluissa. Kun labiili sytosolin GSH allas oli uhanalainen GCLC siRNA, soluja viljeltiin kanssa tai ilman BKTL. Aktivointi kaspaasi-3 mitattiin käyttäen spesifisiä vasta-aineita, jotka tunnistavat erityisen pilkottu ja aktivoitu muoto virtaussytometrialla. Kuten on esitetty kuviossa. 7, BKTL huomattavasti kaspaasi-3 toimintaa GCLC siRNA käsitellyissä soluissa. GCLC siRNA yksin tuskin vaikutti aktiivisuutta cascase-3 verrattuna kontrolliryhmään (S5 Fig.). Siksi BKTL indusoitua apoptoosia pääasiassa mitokondrio-riippuvaista kaspaasi-reitin.

kaspaasi-3 mitattiin käyttäen spesifisiä vasta-aineita virtaussytometrialla. Solunsisäinen GSH vähenevät GCLC siRNA-1 sen jälkeen, kun noin 72 tunnin BKTL hoidon, solut kerättiin, käsiteltiin 0,1% Triton X-100 ja blokattiin 1% BSA: ta, inkuboitiin sitten pilkotaan kaspaasi-3 (Asp175) vasta-aine ( Alexa fluor 488-konjugaatti) 30 minuutin ajan. Fluoresenssi-intensiteetti mitattiin virtaussytometrillä. Kukin pylväs edustaa keskiarvo (± SD n = 4) kolminkertaisten määritysten. *

p

0,05 verrattuna negatiivinen kontrolliryhmä.

Keskustelu

Viime vuosina, apoptoosin induktio muutosten vuoksi solunsisäiseen redox tilan tiettyihin hapettava tai ei-oksidatiivisen ärsykkeiden on tullut painopiste laajan tutkimuksen [23, 25, 37, 38]. ROS ja GSH ovat kaksi suurta tekijöihin solujen redox tasapainon. ROS aiheuttavat usein soluvaurioita ja johtaa solukuolemaan, etenkin suurina pitoisuuksina. Farmakologinen GSH ehtyminen mukaan BSO erittäin herkistää kasvainsolut indusoimaa apoptoosia kemoterapeuttiset aineet. Näin ollen, manipulointi solun hapetus-pelkistys-tila edustaa toimivaa strategiaa varten apoptoosin induktion syöpälääkkeet. Samaan aikaan Kultananohiukkasia syövän diagnosointiin ja hoitoon on tullut kansainvälisen tutkimuksen hot spot. Aiemmin olemme huomanneet, että GSH metaboliareitti suoraan mukana vieroitus BKTL [24]. Kun solunsisäinen GSH ilmentyminen estyi BSO, sytotoksisuus BKTL oli ilmeinen. BKTL indusoivat solukuoleman reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) sukupolven A549-soluja, joilla on alhainen solunsisäisen glutationin [24, 32]. Geng F ja kollegat ovat raportoineet, että vuorovaikutus röntgensäteilyn kanssa BKTL indusoi kohonneita ROS tuotanto on yksi niistä mekanismeista, joiden BKTL voi parantaa sädehoidon munasarjasyöpä [39]. Oksidatiivista stressiä edistää kultaa nanohiukkasten aiheuttamaa sytotoksisuutta ihmisen leukemia (HL-60) ja hepatooma (HepG2-solut) [40]. Nämä tulokset edellyttäen selvää näyttöä siitä, että BKTL voidaan käyttää paitsi kantajina itselleen vaan myös mahdollisina terapeuttisina hyödyntämällä niiden kyky pienentää solunsisäisen GSH ilmaisun ja tuottaa sytotoksisia vasteita. Tässä tutkimuksessa hyväksymme GCLC erityisiä siRNA estää ilmentymisen GCLC ja johtaa laski merkittävästi GSH tuotannossa, ja sitten havaitaan sytotoksisuutta BKTL. Hoidon jälkeen GCLC siRNA, ROS havaittiin läsnä BKTL A549-soluissa. Tulos osoitti, että BKTL voivat vaikuttaa ROS tasoilla GCLC siRNA käsitellyissä soluissa. GSH ja NAC voi poistaa ROS neutraloimaan sytotoksisuuden BKTL keuhkosyövässä transfektoiduissa soluissa GCLC siRNA. Nämä tulokset syytteeseen, että sen jälkeen kaatamalla ja GCLC siRNA, ROS johtuvan solukuoleman aiheuttama BKTL keuhkojen syöpäsoluja.

On tunnettua, että erilaiset solukuolemareittejä rinnakkain nisäkässoluissa ja niiden aktivointi riippuu tyyppi ja intensiteetti ärsyke. Paljon merkitystä on annettu apoptoottisten ja nekroottisen solukuoleman kasvainhoitojen [41-44]. Useita tiloja solukuoleman ovat samanaikaisesti indusoidaan BKTL-alttiina keuhkosyöpäsoluissa alhainen solunsisäisen GSH, kuten apoptoosin ja nekroosin. Havaitsimme, että BKTL voivat aiheuttaa apoptoosin ja nekroosin samanaikaisesti, kun GCLC hiljennettiin siRNA keuhkojen syöpäsoluja. Nämä havainnot ehdotti, että sekä apoptoosin ja nekroosin ovat tärkeitä mekanismi BKTL-solukuolema.

Lopuksi kultananopartikkeleilla pelata yhä tärkeämpi rooli soveltamisessa kasvaimen vastaisen tutkimuksen. Kullan nanohiukkasten kerran konjugoitu GCLC erityisiä siRNA voi tehokkaasti indusoida kasvainsolun kuoleman. Kuitenkin laajempi ja eläinkokeissa eri eläinlajien tarvitaan ottamaan tämän tutkimuksen tulokset kliinisiin kokeisiin.

tukeminen Information

S1 Kuva. Vaikutus GCLC siRNA solun eloonjäämistä A549-solut.

Solut ympättiin ennen transfektoitu GCLC siRNA, ja sitten viljeltiin normaalissa kasvualustassa. Solumäärät laskettiin 48 tunnin välein solujen elinkelpoisuuden. Kukin pylväs edustaa keskiarvo (± SD n = 3) kolmen rinnakkaisen määrityksen.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0118870.s001

(TIF)

S2 kuviossa. ROS tuotanto A549-soluja, jotka on transfektoitu GCLC siRNA.

Soluja kasvatettiin 6-kuoppalevyillä transfektoitiin negatiivisen kontrollin tai GCLC siRNA. Yksi päivä myöhemmin solut viljeltiin normaalissa kasvualustassa vielä 48 tuntia ja sen jälkeen käsiteltiin 10 uM DCFH-DA. Fluoresenssin voimakkuus soluja mitattiin fluoresenssispektrofotometrillä. Pylväät edustavat keskiarvoa (± SD n = 3) kolmen rinnakkaisen määrityksen.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0118870.s002

(TIF)

S3 kuviossa. Apoptoottisten ja nekroottinen vaste A549-soluja, jotka on transfektoitu GCLC siRNA.

Jälkeen knockdovvn GCLC ilmaisun, solut värjättiin anneksiini V-FITC: llä ja propidiumjodidilla (PI) ja analysoitiin virtaussytometrialla. Edustavia virtaussytometristen Tulokset esitetään dot plot.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0118870.s003

(TIF)

S4 Fig. Vaikutus GCLC siRNA mitokondrion kalvon potentiaali (ΔΨm) A549-soluissa.

Käsiteltyjen solujen negatiivisena kontrollina tai GCLC siRNA värjättiin JC-1 20 min ajan 37 ° C: ssa. Fluoresenssin muutos (punaisesta vihreäksi) Näytteiden havaittiin sitten käyttämällä virtaussytometria. Tulokset edustavat keskiarvoa (± SD n = 3) kolmen itsenäisen kokeen.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0118870.s004

(TIF)

S5 Fig. Vaikutus GCLC pudotus on kaspaasi-3: A549-solut.

Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen negatiivinen kontrolli tai GCLC siRNA, soluja pidettiin normaalissa kasvatusalustassa lisää 48 tuntia. Kaspaasi-3 toimintaa näytteissä määritettiin käyttämällä pilkottiin kaspaasi-3 (Asp175) vasta-ainetta (Alexa Fluor 488-konjugaatti) virtaussytometrialla. Arvot on ilmaistu keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0118870.s005

(TIF) B

Tiedoksi

Kirjoittajat kiitos Dr Xiaohu Gu ja professori Yi Ding Shandongin yliopiston kemian ja kemiantekniikan, tukemiseksi kultananopartikkeleilla.