Krooninen sairaus

tiivistelmä

Resistance kemoterapiaa yhä merkittävä este syövän hoidossa. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida molekyylimekanismin ja tehoa honokiol apoptoosin ja parantaa paklitakselikemoterapia prekliinisissä monilääkeresistenteiksi (MDR) syöpä malleja, kuten linjaa johdettu ihmisen MDR (KB-8-5, KB-C1, KB-V1) ja niiden vanhempien lääke herkkä KB-3-1 syöpäsolun linjat.

In vitro

analyysit osoittivat, että honokiol tehokkaasti esti lisääntymistä KB-3-1-solut ja MDR johdannaiset (IC

50 vaihtelevat 3,35 ± 0,13 ng /ml 2,77 ± 0,22 ug /ml), vaikka niiden merkittäviä eroja reaktiota paklitakselille (IC

50 vaihtelevat 1,66 ± 0,09 ng /ml 6560,9 ± 439,52 ng /ml). Honokiol indusoi mitokondrioiden riippuvainen ja kuoleman reseptori-välitteistä apoptoosia in MDR KB-soluissa, jotka oli liitetty EGFR-STAT3 signalointi ja vaimennussäätely STAT3 kohdegeenien. Yhdistetty hoito honokiol ja paklitakselin synergistisesti täydennetty sytotoksisuuden MDR KB-soluissa, verrattuna hoidon kumpaakin annettaisiin erikseen

in vitro

. Tärkeää on, että yhdistetty hoito esti merkitsevästi

in vivo

kasvua KB-8-5 kasvaimia ihonalaisen malli. Tuumorikudoksissa yhdistelmästä ryhmästä näkyy merkittävä inhibitio Ki-67 ilmentyminen ja lisääntyminen TUNEL-positiivisia soluja verrattuna kontrolliryhmään. Nämä tulokset viittaavat siihen, että kohdistaminen monilääkeaineresistenssin käyttäen honokiol yhdessä kemoterapian lääkkeet saattavat tarjota uusia terapeuttisia mahdollisuuksia.

Citation: Wang X, Beitler JJ, Wang H, Lee MJ, Huang W, Koenig L, et al. (2014) Honokiol Tehostaa Paclitaxel Teho monilääkeresistenteiksi Human Cancer Malli läpi apoptoosin. PLoS ONE 9 (2): e86369. doi: 10,1371 /journal.pone.0086369

Editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 2. lokakuuta, 2013 Hyväksytty: 08 joulukuu 2013; Julkaistu: 25 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat National Cancer Institute (NCI) kautta pään ja kaulan alueen syöpä SPORE palkinto (P50CA128613), P30 CA138292, ja AR47901. D.M.S., J.J.B., ja Z.G.C. haluaa myös tunnustusta Georgia Cancer Coalition tukea. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: A.R.M. Ruhul Amin tällä hetkellä on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Hyung Ju C. Shin hetkellä työskentelee kaupallinen yritys Quest Diagnostics, Atlanta. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Kemoterapia on edelleen yksi tärkeä hoitovaihtoehtoja monien syöpien kuitenkin huomattava prosenttiosuus potilaista kehittyy lääkeresistenssi aikana kemoterapiaa, ja väistämättä edisty ilman parannuskeinoa [1], [2]. Huolimatta merkittävästä edistymisestä lääkekehityksessä, paklitakselia ja sen laaja syövän vastaisen spektri on jähmettynyt häiriöitä mikrotubulusdynamiikan yhtenä tehokkaimmista syövän vastaisia ​​strategioita käytössä. Kuitenkin syntyminen lääkkeille vastustuskykyisten syöpäsolujen rajoittaa suuresti sen kliinisen tehon. Siksi on välttämätöntä kehittää uusia strategioita, joilla vähennetään tai voittaa chemoresistance syövän. Erilaisia ​​lähestymistapoja parantaa chemoresponse vuonna solunsalpaajaresistentti syöpä malleja on tutkittu, mukaan lukien yhdistämällä luonnontuotteet tai yhdisteitä paklitakseliin tai muun tavanomaisen kemoterapian reagenssit.

Honokiol on luonnollinen osa eristettiin kuori magnolia tree [2], [3], jota on perinteisesti käytetty ahdistuksen hoitoon liittyviä häiriöitä ja ruoansulatuskanavan valituksia [2], [4]. Kiinnostavaa, honokiol myös näytteillä tehokas syövän toimintaa [5], [6], [7] ja entisestään tavanomaisia ​​solunsalpaajahoitojen erilaisissa kokeellisissa malleissa ihmisen syövän, mukaan lukien krooninen lymfaattinen leukemia [3], eturauhassyöpä [8] ja multippelin myelooman [9]. Nämä suhteellisen laaja syövän vastaisia ​​ominaisuuksia ja suotuisa turvallisuusprofiili tehdä honokiol houkuttelevan lisälääkkeenä parantaa perinteisen kemoterapian kliinisissä.

yli-ilmentyminen antiapoptoottisten proteiinien on oleva mekanismi, joka edistää hankinta terapeuttisen vastarintaa, toistuminen ja etäpesäke. Yhä useammat todisteet osoittavat, että kolme anti-apoptoottiset proteiinit, ts surviviiniperäiset, Mcl-1, ja Bcl-2, voidaan liittyvät suoraan lääkeresistenssin syöpä [10], [11]. Esto näiden ratkaisevien eloonjäämistekijöiden on osoitettu laukaisevan apoptoosin ja herkistää syöpäsolut lääkehoidon [5] – [11], joten tämä lähestymistapa voidaan lupaavaa voittamisessa chemoresistance ja parantaa kemoterapia syövän.

Käyttämällä sarjan linjan johdettu KB ihmisen levy- syöpäsolulinjoja, joilla on selvä herkkyys paklitakselihoidolla, olemme osoittaneet, että honokiol voitaisiin tehokkaasti indusoida apoptoosia monilääkeresistenttien (MDR) syöpäsoluja. Mekaaniset tutkimukset osoittivat, että honokiol estää EGFR-STAT3 signalointireittiä, ja estää surviviinin ilmentymiseen ja muiden eloonjäämistekijät. Olemme edelleen osoittanut

in vivo

tehoa honokiol hoidossa MDR syövän ja parantaa paklitakselin tehoa.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

KB- 3-1 ja sen MDR johdannainen solulinjat jalomielinen lahjoitus tohtori Michael M. Gottesman (NCI, NIH, Bethesda, MD) ja on ominaista aiemmin [12]. KB-3-1-solut ylläpidettiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia. KB-8-5 ja KB-C1-soluja ylläpidettiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 0,01 ja 1 ug /ml kolkisiinia vastaavasti. KB-V1-solut ylläpidettiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 1 ug /ml vinblastiini. Poistamaan vaikutus kolkisiinin tai vinblastiinin kokeilun tuloksena, resistenttejä soluja viljeltiin lääkkeen väliaineessa viikon ajan ennen mitään koetta.

Cell Growth määritys

Solut ympättiin tiheydellä 5 x 10

3 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille quadruplet. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin lääkkeet lisättiin eri pitoisuusalueilla yksittäisinä aineina tai kahden lääkkeen yhdistelmät ja sitten inkuboitiin 72 tuntia. Vaihteluväli honokiol oli 0,625-20 ug /ml kaikkia neljää solulinjoissa. Paklitakselille, pitoisuusalueella on 0,19-97,5 ng /ml, 3,02 ng /ml 3,12 ug /ml, 12,1 ng /ml 25,0 ug /ml, ja 97,5 ng /ml 100 ug /ml KB-3-1 , KB-8-5, KB-C1, ja KB-V1-solut, vastaavasti. Solukasvun esto mitattiin määrittämällä solujen tiheys sulforodamiini B määrityksessä. Eston prosenttiosuus määritettiin vertaamalla solujen tiheys lääke-käsiteltyjen solujen kanssa, käsittelemättömään kontrolliin soluja. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

Apoptosis Analyysi

Apoptoosi analysoitiin kaikissa neljässä solulinjoissa. Soluja käsiteltiin honokiol, paklitakselin tai niiden yhdistelmä kuten kuvassa legendoja, trypsinoitiin ja pestiin kylmällä 1 x PBS: ää. Solut suspendoitiin uudelleen 1 x anneksiini sitovaa puskuria (BD PharMingen), ja värjättiin sitten anneksiini V-fykoerytriini (anneksiini V-PE; BD PharMingen) ja 7-AAD (BD PharMingen) 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Värjätyt näytteet mitattiin fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) kaliiperin penkki-top-virtaussytometrillä (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). FlowJo ohjelmisto (Puu Star, Ashland, OR) käytettiin apoptoosin analyysiä. Kokeet toistettiin 3 kertaa itsenäisesti.

immunoblottauksella

Kolmekymmentä mikrogrammaa proteiinia kokosolu-uutteita tai soluliman ja mitokondrioiden fraktiot määrällisesti, erotettiin SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Sen jälkeen, kun on estetty 5% rasvatonta kuivamaitoa TBS-T-puskuria, kalvoja inkuboitiin spesifisten vasta-aineiden yön yli 4 ° C: ssa. Hiiren anti-β-aktiini-vasta-aine (Trevigen, Gaithersburg, MD) käytettiin näyte lastaus ohjaus. Immunovärjättiin proteiinivyöhykkeet havaittiin kanssa tehostetun kemiluminesenssin (Amersham, Buckinghamshire, UK). Kokeet toistettiin 3 kertaa.

In vivo

antituumoriteholla Pitoisuus

eläinkoetta hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitean Emory University. KB-8-5-solut (5 x 10

5) injektoitiin s.c. osaksi 4-5 viikkoa vanhat naaraspuoliset karvattomia hiiriä (Kateenkorvattomiin

nu /nu

, Taconic NY). Kun kasvaimet olivat kehittyneet noin 100 mm

3, hiiret jaettiin neljään ryhmään (n = 7 tai 8) on tapa minimoida paino ja kasvaimen kokoa eroja ryhmien: kontrolliryhmä käsiteltiin 20% Intralipid ( Baxter Healthcare), honokiol ryhmä (1,0 mg /hiiri tai 50 mg /kg), paklitakselin ryhmä (20 mg /kg), ja honokiol (1,0 mg /hiiri tai 50 mg /kg) ja paklitakseli (20 mg /kg) yhdistelmä ryhmä . Honokiol liuotettiin 100% etanolia ja sekoitettiin 20% intralipidi on 01:14 (v /v) suhteen. Honokiol annettiin hiirille 3 kertaa viikossa 1,0 mg /hiiri (tai 50 mg /kg) intraperitoneaalisella injektiolla. Paklitakseli annettiin hiirille kerran viikossa 20 mg /kg läpi häntälaskimoon injektion. Hoidon jatkettiin 4 viikkoa. Kehon paino ja kasvaimen koko mitattiin kolme kertaa viikossa. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa:

V

=

//6 × suurempi halkaisija x (pienempi halkaisija) [13]. Hiiret tapettiin 4 viikkoa sen jälkeen, kun hoidon aloittamista. Kasvain ja elinkudokset (maksa, sydän, keuhko, pernassa ja munuaisissa) kerättiin H tulos esitettiin keskimääräinen suhde positiivisten solujen määrä ulos solujen kokonaismäärästä.

Tilastollinen analyysi

tilastollinen merkitys hoidettaessa solujen

in vitro

sytotoksisuusmääritys arvioitiin käyttämällä Studentin

t

-testi. Sillä

in vivo

antituumoriteholla määritys, log-lineaarinen sekoitettu malli satunnainen siepata käytettiin vertaamaan merkitystä keskimääräisen kasvaintilavuudet joukossa kunkin ryhmän. Tilastollinen merkitys hoidon vaikutusta mikrotubulusten, apoptoosin, ja soluproliferaatiota vierassiirrekokeissa tuumorikudoksissa arvioitiin käyttäen Kruskal-Wallisin testiä (yksisuuntainen ANOVA).

P

0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä kaikissa analyyseissä.

Tulokset

Honokiol Vähentää Elinkelpoisuus ja indusoi apoptoosia ihmisen MDR Syöpäsolut

MDR syöpäsolulinjoja KB-8-5, KB-C1 ja KB-V1 olivat peräisin huumeiden-herkkä vastine KB-3-1-solut, ja on laajalti käytetty kliinisesti käyttökelpoista tutkimuksessa lääkeresistenssin [14] , [15]. Nämä solut osoittivat selvästi herkkyyttä paklitakselihoidolla. Kuten on esitetty kuviossa. 1a, 1b, IC

50-arvot MDR solulinjoissa (KB-8-5:26.73 ± 1,01 ng /ml, KB-C1:195.0 ± 11,11 ng /ml, ja KB-V1:6560.0 ± 439,52 ng /ml) kasvoi 16-, 117- ja 4000-kertaiseksi, verrattuna vanhempien KB-3-1-solulinja (1,66 ± 0,09 ng /ml). Sopusoinnussa niiden kestävä fenotyyppi, MDR solulinjat oleellisesti ilmaista klassisen MDR merkki P-glycoprotien (Fig. 1b). Mielenkiintoista, 72 h-hoidon honokiol vähentää tehokkaasti elinkelpoisuutta MDR-solujen (KB-8-5:3.22 ± 0,14 ng /ml, KB-C1:3.04 ± 0,30 ng /ml, KB-V1:2.77 ± 0,22 ug /ml), jossa IC

50-arvot ovat samankaltaisia ​​kuin KB-3-1-solut (3,35 ± 0,13 ng /ml) (Fig. 1 c, 1 d). Apoptoosi-analyysi osoitti lisäksi, että honokiol indusoi apoptoosia ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 1e). 24 h jälkeen, honokiol hoidon prosenttiosuus apoptoottisten KB-3-1-solut oli 11,9 ± 3,9% (5 ug /ml honokiol), 32,9 ± 0,9% (10 ug /ml), ja 47,1 ± 2,7% (15 ug /ml); prosenttiosuus apoptoottisten solujen kasvoi 18,4 ± 2,1%, 51,5 ± 0,6%, ja 65,3 ± 1,6%, vastaavasti, jälkeen 48 h-hoito, joka nosti edelleen 72 tuntia. Honokiol myös indusoi samantasoisen apoptoosin muiden MDR-soluissa, mukaan lukien KB-8-5, KB-C1 ja KB-V1 (Fig. 1 e). Esimerkiksi 48-h hoito 10 ug /ml honokiol johti apoptoosin 51,5% KB-3-1-solut, 52,7% KB-8-5-solut, 52,9% KB-C1-soluja ja 67,6% ja KB-V1-solut, vastaavasti. Nämä tiedot ovat sopusoinnussa elinkyvyn (Fig. 1 c, 1 d), ja ehdottaa, että honokiol on voimakas sytotoksinen aine KB-soluissa riippumatta niiden eri paklitakselin herkkyydet.

(a, b) Kasvun estäminen vaikutus paklitakselia ja p-gp ilmentymisen KB-3-1, KB-8-5, KB-C1 ja KB-V1-solut. IC

50-arvot paklitakselin lääkkeille vastustuskykyiset KB-8-5, KB-C1 ja KB-V1-solut lisääntyivät 16-, 117- ja 4000-kertaiseksi verrattuna vanhempien KB-3-1-solut . (C, d) Kasvun estäminen vaikutus honokiol KB-3-1, KB-8-5, KB-C1 ja KB-V1-solut. IC

50-arvot honokiol vuonna lääkkeille vastustuskykyiset KB-8-5, KB-C1 ja KB-V1-solut samankaltainen kuin vanhempien KB-3-1-solut. (E) Honokiol indusoi apoptoosia KB-soluissa. KB-3-1 ja KB-8-5-soluja käsiteltiin 5, 10, 15 ug /ml honokiol 24, 48, ja 72 h. KB-C1 ja KB-V1-solut käsiteltiin honokiol 48 tuntia. Apoptoosi mitattiin anneksiini V-fykoerytriini värjäystä. * Tarkoittaa tilastollisesti merkitsevä p-arvot (*, versus kontrolli, p 0,05; **, vs. 5 ug /ml, p 0,05).

Honokiol indusoi Mitochondria- ja Death Reseptori (DR) – riippuvainen apoptoosi ihmisen syöpäsoluja

Tutkimme mekanismi honokiol aiheuttaman apoptoosin KB-soluissa. Kuten on esitetty kuviossa. 2a-c, honokiol indusoi pilkkomista PARP ja kaspaasi-3 annoksesta ja ajasta riippuvaa tavalla kaikissa testattu KB soluja, mikä osoittaa aktivoinnin apoptoottisten signaalien. Western blot-analyysit havaittu, että honokiol ei vain indusoi vapautumisen sytokromi

c

sytoplasmassa annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 2d), mutta myös lisääntynyt DR5 (Fig. 2d), pinta- reseptori proapoptootti- ligandien Apo2L /TRAIL. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että honokiol voi samanaikaisesti aktivoida mitokondrioiden riippuva (luontainen) apoptoosin ja DR-riippuvaiset (ulkoisia) apoptoosin KB-soluissa.

(a) KB-3-1-solut ja (b) KB -8-5-soluja käsiteltiin 5, 10, 15 ug /ml honokiol 24, 48 h. Täyspitkä ja pilkottiin PARP, pilkottiin kaspaasi-3 ja β-aktiini latauskontrollina havaittiin immunoblottauksella käyttämällä kokosolulysaateista. (C) KB-C1 ja KB-V1-solut käsiteltiin 5, 10, 15 ug /ml honokiol 48 tuntia. Lohkaista PARP havaittiin immunoblottauksella käyttämällä kokosolulysaateista. (D) ylempi paneeli, KB-8-5-soluja käsiteltiin 5, 10, 15 ug /ml honokiol 48 tuntia. Soluliman ja mitokondrioiden jakeet erotettiin ja immunoblotattiin sytokromi c (Cyto C) vasta-aine. COX4 (mitokondrion proteiinia) käytettiin osoittamaan tehokkuutta solufraktioinnin. Alempi paneeli, KB-8-5-soluja käsiteltiin 5, 10, 15 ug /ml honokiol 24 ja 48 tuntia. DR5 havaittiin immunoblottauksella käyttämällä kokosolulysaateista. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa, ja edustavia tiedot esitetään.

Honokiol Estää EGFR-STAT3 Signaling in ihmisen syöpäsoluja

EGFR-STAT3 signalointireitistä tärkeä rooli sääntelyssä kasvun ja eloonjäämisen syöpäsoluissa. Tutkimme vaikutukset honokiol useista keskeisistä komponenteista EGFR-STAT3 signalointireitin. KB-3-1 ja KB-8-5-solut käsiteltiin honokiol (5 ug /ml) ja 0,5, 1, ja 2 tuntia. Western blot-analyysi käyttämällä kokosoluliuotteista paljasti merkittävästi alentunut fosforylaatio EGFR on Try1173, indikaattori aktivoidaan EGFR (Fig. 3a). Olemme edelleen tutki fosforylaatiota aseman STAT3 (Tyr705), Akt (Ser473), ja ERK (Thr202 /Tyr204), kolme tunnettua EGFR alavirran signalointia komponentteja. Mielenkiintoista, honokiol hoito nopeasti esti phosphorlylation of STAT3 ja AKT, mutta ei ollut vaikutusta ERK-fosforylaation (kuvio. 3ab). Edelleen tutkia, onko ilmentymisen taso EGFR ja sen loppupään kohdeproteiineja inhiboi myös honokiol käsittely (5 ug /ml), käsittelimme solut 24, 48, ja 72 h. Kuten on esitetty kuviossa. 3cd, honokiol hoito esti proteiinin ilmentymistä EGFR, STAT3, ERK, ja AKT on ajasta riippuva tavalla KB-3-1 ja KB-8-5-solut. Samoin, fosforylaatio näiden proteiinien vähentynyt, kun honokiol hoitoon (Fig. 3cd). Johdonmukaisesti ekspressiotasot kolme tunnettua STAT3 kohdegeenien, eli surviviini, Bcl-2 ja Mcl-1, oli merkittävästi vähentynyt seuraavat honokiol hoidon (Fig. 3e).

KB-3-1 ja KB- 8-5-soluja käsiteltiin 5 ug /ml honokiol lyhyen aikaa (0,5, 1 tai 2 h) tai pitkän aikaa (24, 48, tai 72 h). Kokosolulysaateille immunoblotattiin varten ilmoitettu proteiineja. Vaikutus honokiol varhaisessa ajankohtina: (a) fosforylaatio EGFR ja STAT3; (B) Honokiol pienenee fosforylaatio AKT ja ERK. Vaikutus honokiol myöhään ajankohtina: (c) fosforylaatiota ja ilmentyminen EGFR ja STAT3; (D) fosforylaatiota ja ilmaus AKT ja ERK; (E) surviviinin ilmentymiseen, Bcl-2, Mcl-1. (F) Honokiol estää EGFR-signalointireitin ja downregulates STAT3 kohdegeenien annoksesta riippuvalla tavalla. KB-3-1 ja KB-8-5-soluja käsiteltiin 5, 10, 15 ug /ml honokiol 48 tuntia. Kokosolulysaateille immunoblotattiin varten ilmoitettu proteiineja. (G) Honokiol estää EGFR-STAT3 väylän KB-C1 ja KB-V1-solut. KB-C1 ja KB-V1-solut käsiteltiin 5, 10, 15 ug /ml honokiol 48 tuntia. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa, ja edustavia tiedot esitetään.

seuraava tutki annoksesta riippuvaa vastetta EGFR-STAT3 signalointi honokiol hoidon KB-3-1 ja KB-8 -5-soluja. Kuten on esitetty kuviossa. 3f, ilmaisu ja fosforylaatio EGFR (Try1173) määrä väheni, kun läsnä on 5 tai 10 ug /ml honokiol (48 h), ja vähennettiin edelleen annoksella 15 ug /ml honokiol (Fig. 3F). Johdonmukaisesti, ilmaisu ja /tai fosforylaatio EGFR alavirran signalointia komponentteja, mukaan lukien ERK, Akt, STAT3, surviviini, Bcl-2 ja Mcl-1, myös dramaattisesti inhiboi annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 3f). Samanlainen vaikutus honokiol on EGFR-STAT3 signalointi havaittiin myös sekä KB-C1 ja KB-V1-solut (Fig. 3G). Erityisen kiinnostavia, RT-PCR-analyysi havaitsi, että honokiol estäminen surviviinin ilmentyminen voi liittyä tukahduttaminen surviviinin transkription mRNA-tasolla (kuva S1).

Honokiol Tehostaa in vitro Sytotoksisuus Paklitakselin MDR syöpäsoluja

Tutkimme, onko estyminen surviviinin, Bcl-2 ja Mcl-1 honokiol voi herkistää MDR syöpäsolut tavanomaiseen kemoterapiaan kuten palictaxel. Kuten on esitetty kuviossa. 4, 24-h hoito joko honokiol (5 ug /ml) tai paklitakselia (450 ng /ml) johti ≤20% apoptoosin KB-C1-soluja, kun taas yhdistetyt hoitoon käytetään sekä honokiol ja paklitakselin johti noin 30% apoptoosin . Lisäksi on 48 tunnin ja 72 tunnin ajankohtina, kombinaatio tehokkaammin aiheuttaman apoptoosin (76% ja 86%, tässä järjestyksessä) in KB-C1 soluja kuin joko ainoana lääkkeenä (≤25%) tai ajoneuvon hallinnan. Johdonmukaisesti, yhdistetty hoito oli tehokkaampi apoptoosin kuin joko ainoana lääkkeenä MDR KB-8-5 ja KB-V1-solut (Fig. 4). Käyttäen KB-8-5-solut, kuten esimerkiksi, yhdistelmä-indeksi (CI) määritys vahvisti synergistisen vaikutuksen yhdistettynä hoidon honokiol ja paklitakselin vähentää elinkelpoisuuden MDR syöpäsolujen (taulukko S1).

(a ) KB-8-5, (b) KB-C1, ja (c) KB-V1-solut käsiteltiin 5 ug /ml honokiol, paklitakselin (15 ng /ml KB-8-5, 450 ng /ml KB-C1, ja 6 ug /ml KB-V1), tai kahden lääkkeiden ilmoitettuina pitoisuuksina 24, 48, ja 72 h. Apoptoosi mitattiin. * Tarkoittaa tilastollisesti merkitsevä p-arvot (*, yhdistelmä vs. honokiol, p 0,05; **, yhdistelmä verrattuna paklitakseliin, p 0,05). Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa.

Western blot -analyysin lisäksi havainneet, että yhdistetty hoito honokiol ja paklitakselilla oli tehokkaampi kuin kumpikaan aine yksin indusoimaan pilkkominen kaspaasi-3, PARP, ja vapauttamaan sytokromi

c myynnissä maassa mitokondrioiden KB-8-5-solut (Fig. 5a, 5b). 48–h hoito honokiol yksin tai yhdistelmä honokiol ja paklitakselin laski ilmaisun ja fosforylaatio EGFR, sekä muiden keskeisten EGFR-STAT3 signaloinnin komponentteja, mukaan lukien STAT3, p-STAT3 (Tyr705), ERK, p-ERK ( Thr202 /Tyr204), Akt ja p-Akt (Ser473). Proteiini surviviinin ilmentymiseen, Bcl-2 ja Mcl-1 oli myös merkittävästi alentunut kun hoito honokiol tai yhdistelmä honokiol ja paklitakseli. Mielenkiintoista kuitenkin paklitakselihoidon yksinään ei ole merkittävää vaikutusta näiden signalointi komponenttien tai kohdegeenien EGFR-STAT3 reitin (Fig. 5c).

(a) Honokiol parantaa paklitakselin aiheuttama PARP ja caspase- 3 lohkaisu KB-8-5-solut. Soluja käsiteltiin 5 ug /ml honokiol, 15 ng /ml paklitakselia, tai näiden kahden yhdistelmä lääkkeiden 24, 48, ja 72 h. Täyspitkä ja pilkottiin PARP, pilkottiin kaspaasi-3 ja β-aktiini latauskontrollina havaittiin immunoblottauksella käyttämällä kokosolulysaateista. (B) Honokiol parantaa paklitakselin n aiheuttamaa sytokromi

c

sytoplasmassa in KB-8-5-solut. Soluja käsiteltiin 5 ug /ml honokiol, 15 ng /ml paklitakselia, tai yhdistelmä 48 tuntia. Soluliman ja mitokondrioiden jakeet erotettiin ja immunoblotattiin sytokromi c (Cyto C) vasta-aine. COX4 (mitokondrion proteiinia) käytettiin osoittamaan tehokkuutta solufraktioinnin. (C) Honokiol estää EGFR-STAT3 signalointireitin ja downregulates STAT3 kohdegeenin ilmentymistä KB-8-5-solut. Soluja käsiteltiin 5 ug /ml honokiol, 15 ng /ml paklitakselia, tai yhdistelmä 48 tuntia. Kokosolulysaateille immunoblotattiin varten ilmoitettu proteiineja. (D) paklitakselin indusoi mikrotubulusten polymeroitumisen KB-8-5-solut. Lääkkeen aiheuttama vakauttamiseen mikrotubulusten on osoituksena kasvu mikrotubulia polymeraattimassassa tuloksena niputtamista havaittiin käsittelemällä sekä paklitakselin ja yhdistelmä; kuitenkin, honokiol yksinään ei ollut tehokas mikrotubulia vakauttaminen (suurennos 400x). Soluja käsiteltiin 5 ug /ml honokiol, 15 ng /ml paklitakselia, tai yhdistelmä 24 tuntia. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa, ja edustavia tietoja on esitetty.

Paklitakseli saa aikaan tuumorin vastaista aktiivisuutta sitoutumalla tubuliiniin sisällä ontelon mikrotubulusten, jolloin mikrotubulusten polymeroitumisen, stabilointi ja häiriöitä mikrotubulusten dynamiikka, mikä aiheuttaa mitoosi pidätys ja apoptoosin jakautuvat solut. Tutkia honokiol voi parantaa paklitakseli indusoi mikrotubulusten polymeroitumisen ja vakauttamisen, tutkimme vaikutus jokaisen hoidon mikrotubulusten KB-8-5 ja KB-C1 soluissa. Lääkkeen aiheuttama vakauttamisen kasvainsolujen ”interphase mikrotubulusten, mistä on osoituksena kasvu mikrotubulia polymeraattimassassa tuloksena niputtaminen, havaittiin käsittelemällä sekä paklitakselin ja yhdistelmä; kuitenkin, honokiol yksinään ei ollut tehokas muodostumista mikrotubulusten nippujen (Fig. 5d). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että honokiol parantaa

in vitro

sytotoksisuuden paklitakselin MDR syöpiä, voi tapahtua EGFR-STAT3 eloonjäämisen signalointi.

Honokiol Tehostaa in vivo tehoa Paklitakseli MDR Cancer ksenograftikasvaimissa

arvioitiin antituumorivaikutuksen tehosta honokiol, paklitakseli, ja niiden yhdistelmä hoidettaessa MDR syövän KB-8-5 ksenograftimallissa. Hoitoa jatkettiin 4 viikkoa. Kuten on esitetty kuviossa. 6a, annoksella 20 mg /kg kerran viikossa, 4 viikon injektion pelkkää paklitakselia ei merkittävästi estää kasvun KB-8-5 ihonalainen kasvaimia, verrattuna vehikkelikontrolliin (p = 0,917). Hoidon honokiol yksin (50 mg /kg, 3 kertaa viikossa, kautta i.p.) hieman esti tuumorin kasvua, mutta ero ei ollut merkitsevä (p = 0,194) (Fig. 6a). Sitä vastoin yhdistelmähoito dramaattisesti inhiboivat KB-8-5 kasvaimia, verrattuna kaikkiin muihin ryhmiin (vs. kontrolli: p 0,0001; vs. honokiol: p = 0,036; vs. paklitakseli: p = 0,004). Keskimääräinen kasvaimen tilavuus kussakin hoitoryhmässä päätepisteessä oli 2585,4 ± 510,0 mm

3 (kontrolli), 1810,2 ± 483,2 mm

3 (honokiol), 2591,3 ± 726,2 mm

3 (paklitakseli), ja 573,9 ± 146.1mm3 (yhdistelmä). Edustavan hiiren kustakin ryhmästä on esitetty (Fig. 6c). Nämä tulokset osoittavat, että honokiol voisi merkittävästi voimistaa antituumorivaikutuksen paklitakselin MDR syövän ksenograftikasvaimissa.

(a) kasvaimen kasvun KB-8-5-ksenografteissa estyi merkittävästi yhdistelmä-käsitellyn ryhmän verrattuna ohjaus (p 0,0001), honokiol (p = 0,0356) ja paklitakselin (p = 0,004) käsitellyissä ryhmissä. Tuumoritilavuudet että honokiol (p = 0,1942) käsitellyn ryhmän ja paklitakseli (p = 0,9165) hoidetussa ryhmässä ei ollut merkittävää eroa verrattuna kontrolli. (B) Kehon painot hiirten kaikissa ryhmissä. Kehon painot hiiristä kaikki neljä ryhmää olivat samanlaisia. (C) edustaja hiiren kustakin ryhmästä. (D) histopatologinen analysoi tärkeimpien elinten (maksa, perna, munuainen, sydän ja keuhkojen) kontrollista ja yhdistelmä hoitoryhmässä. (E) vaikutukset yhdistelmähoidon honokiol ja paklitakselilla solunjakautumisen, lisääntymistä ja apoptoosia in vivo. Parafinoidut kudosleikkeiden eri hoitoryhmien immunovärjättiin anti-KI-67-solujen lisääntymisen, ja TUNEL värjäys havaitsemiseksi apoptoottisten solujen. Apoptoottisia soluja näkyvät vihreinä; DNA vastavärjättiin DAPI sininen (suurennos 200x).

Arvioimme systeemistä myrkyllisyyttä honokiol, paklitakselin ja yhdistelmä kohtelun KB-8-5 ksenograftimallissa. Verrattuna kontrolliryhmään, ruumiinpaino hiiret kaikissa kolmessa hoitoryhmässä olivat samanlaiset, joka osoittaa vähäistä myrkyllisyyttä tutkituissa olosuhteissa (Fig. 6b). Johdonmukaisesti, histopatologisten analysoidaan ei löytänyt mitään merkittävää kudosvauriot tärkeimpien elinten (mukaan lukien maksa, perna, munuainen, sydän ja keuhkojen) kerätty kaikissa hoitoryhmissä, myös yhdistelmähoitoa (Fig. 6D).

suoritetaan edelleen IHC analyysi tutkia

in vivo

jokaisen käsittelyn vaikutus on ilmaus yleisestä kasvain biomarkkereita. Yhdistetty hoito vähensi kudoksen tason Ki-67 KB-8-5 kasvaimet (prosentteina Ki-67-positiivisia soluja: 3,84 ± 1,10) verrattuna, että kontrolliryhmässä (11,96 ± 2,86; p 0,001) , honokiol ryhmä (7,18 ± 2,07; p = 0,027), tai paklitakselin ryhmä (11,68 ± 1,82; p 0,001) (Kuva. 6e). Johdonmukaisesti, TUNEL määritys paljasti merkittävän kasvun apoptoottisten kasvainsolujen kasvainkudoksessa yhdistelmästä ryhmästä (7,07 ± 2,11) verrattuna, että kontrolliryhmässä (1,64 ± 0,17; p 0,001), honokiol ryhmä (5,45 ± 1,19; P 0,05) ja paklitakselin ryhmä (3,97 ± 3,58; p = 0,08) (kuvio. 6e). Nämä tulokset osoittavat, että honokiol voi herkistää MDR syöpäsolut paklitakselille läpi apoptoosin.

Keskustelu

Huolimatta menestystä ohimenevästi valvoa kliinisiä oireita syövän kemoterapian kanssa, merkittävä osa potilaista kehittää ”monilääkeresistenttisyyttä”, tai MDR, ja väistämättä edetä ole parannuskeinoa. On kiireesti kehittää uusia strategioita voittaa MDR ja parantaa tehokkuutta kemoterapiaa. Tässä tutkimuksessa tutkimme mahdolliset hyödyllisyyden luonnollinen yhdiste honokiol hoidossa solunsalpaajaresistentti syövän prekliinisin malleja. Olemme osoittaneet, että honokiol voitaisiin tehokkaasti indusoida solukuoleman syöpäsoluja riippumatta niiden resistenssi kemoterapiaa huumeiden paklitakseli. Merkittävää on, honokiol lisääntyi merkittävästi

in vivo

paklitakselin tehokkuutta kasvun estämisessä MDR syövän ksenograftimallissa. Olemme edelleen edellyttäen, molekyyli todisteita, että honokiol indusoi apoptoosia ja parantaa kemoterapian kautta EGFR-STAT3 signalointi ja downregulation useita eloonjäämistekijät, mukaan lukien surviviini, Bcl-2 ja Mcl-1. Nämä havainnot viittaavat siihen, että honokiol voisi olla lupaava herkistettäessä syöpäsolujen kemoterapiaa ja parantaa paklitakselin tehoa kliinisissä puitteissa.

EGFR yli-ilmentyminen on tiiviisti syövän etenemiseen, terapeuttisia vastus ja huono kliinistä tulosta pään ja kaulan syövän ja muut syöpätyyppeihin [16], [17], [18], [19]. EGFR-signalointireitin, mukaan lukien sen useita loppupään reittejä, kuten PI3K /AKT, ERK1 /2, JAK /STAT3 ja mTOR /NF-KB, on tärkeä rooli säätelyssä lisääntymistä, eloonjääntiä, muuttoliike ja chemoresistance syöpäsoluissa. EGFR signalointi, vuoksi tilannetta aktiivisesti lupaavana tavoite kehittää terapeuttisia kestävä ja toistuvia pään ja kaulan syövän ja muiden syöpää näppäimellä pienmolekyylisalpaajien ja vasta [20], [21]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että honokiol laski sekä fosforylaation ja ilmentyminen EGFR, mikä viittaa EGFR signaloinnin, joka on sopusoinnussa aikaisempien tutkimusten [5]. Kuten odotettua, ilmaus ja toimintaa useita tärkeitä komponentteja EGFR signalointi, kuten AKT, ERK ja STAT3, myös inhiboidaan solunsalpaajaresistentti KB soluissa upon honokiol hoitoa. Tuore tutkimus kertoi, että honokiol downregulates lämpöshokkiproteiini (HSP) 90 rintasyöpäsoluissa [22]. HSP90 ja muut kaperoni proteiineja, kuten HSP70 ja Hsp40 säädellä EGFR hajoamista. Keskeyttäminen HSP70 /HSP90-taitto sykli johtaa ubiquitinylation ja hajoaminen EGFR [23] [24]. Siksi on mahdollista, että honokiol edistää EGFR hajoamista ja estää EGFR signalointi kautta HSP90-riippuvaisen mekanismin.

Useat STAT3 kohdegeenien, kuten surviviini, Bcl-2 ja Mcl-1, on keskeinen rooli asetuksen