Krooninen sairaus

tiivistelmä

p53-geeni on mutatoitunut enemmän kuin 50% ihmisen kasvaimista. Mutant p53 kykenee onkogeenisessä toiminto ja se on usein erittäin ilmaistaan ​​syöpäsolujen takia kiertäminen proteasomeja riippuvan hajoamisen. Siten aktivoimalla proteasomin riippuvaa hajoamista mutantti p53-proteiini on houkutteleva strategia syövän hallintaan. Aiemmin olemme huomanneet, että arseenitrioksidi (ATO), lääke akuutin promyelosyyttileukemian, hajoaa mutantti p53-proteiinin kautta proteasomin reitin. On kuitenkin vielä epäselvää, mikä on E3-ligaasi että tavoitteet mutantti p53 hajoamista. Nykyisissä tutkimuksessa olemme pyrkineet tunnistamaan E3 ligaasilla tarpeen ATO välittämää hajoamista mutantti p53. Olemme havainneet, että ATO indusoi ilmentymisen Pirh2 E3-ligaasia transkriptionaalisella tasolla. Olemme myös havainneet, että knockdovvn Pirh2 inhiboi, kun taas ektooppinen ilmentyminen Pirh2 parantaa, ATO aiheuttama hajoaminen mutantti p53-proteiinin. Lisäksi olemme havainneet, että Pirh2 E3-ligaasi fyysisesti vuorovaikutuksessa ja tavoitteet mutantti p53 polyubiquitination ja myöhemmin proteasomaalisten hajoamista. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että ATO yhteistyössä HSP90 tai HDAC estäjä edistää mutantti p53 hajoamista ja kasvun hidastuminen kasvainsoluissa. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että ATO edistää mutantti p53 hajoamista osittain indusoimalla Pirh2 riippuvan proteasomireitillä reitin.

Citation: Yan W, Jung YS, Zhang Y, Chen X (2014) Arseenitrioksidi aktivoi Proteasome- riippuvainen hajoaminen Mutant p53-proteiinin syöpäsoluissa osan kautta Enhanced Expression of Pirh2 E3 Ligase. PLoS ONE 9 (8): e103497. doi: 10,1371 /journal.pone.0103497

Editor: Yi Li, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 3. heinäkuuta 2014; Julkaistu: 12 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Yan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukee osittain National Institutes of Health Grant CA 121137 ja CA 076069. Rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Missense mutaatioita p53 geeni, pääasiassa ryhmittyneet ytimen sisällä DNA: ta sitovan domeenin, esiintyy suuri osa ihmisen kasvaimissa [1]. Nämä mutaatiot tuottavat p53-proteiinien, joilla on muuttunut sekvenssi-spesifisen DNA: n sitova aktiivisuus, joka ei voi aiheuttaa joukko kohdegeenien villityyppisen p53: n kasvaimen suppression [2]. Lisäksi mutantti p53-proteiinien on todettu kasvaimia synnyttävän toimintaa, määritellään voitto toiminto (GOF) [3], [4].

Vaikutukset mutantin p53 kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen ovat kauaskantoisia. Verrattuna p53-null hiiret, mutantti p53 knock-hiirillä on merkittävästi erilainen kasvain spektrit ja yleisyydestä tuumorimetastaasin [5] – [7]. Tärkeintä on, kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että korkean mutantti p53 korreloi aggressiivisempia kasvaimia ja huonompi tuloksia [8] – [10]. Lisäksi mutantti p53 on kliinisesti merkittävä, koska sen ilmentyminen tekee soluista resistenttejä kemoterapeuttisten [11], [12]. Ilmeisesti voitto funktio mutantti p53 riippuu osittain sen transkriptioaktiviteettia [5], [13] – [18], ja sen vallitsevasti negatiivista kohti p53 perhe [19] – [23].

Toisin kuin villityypin p53, mutantti p53-proteiini on löydetty kiertää proteasomin riippuvan hajoamisen [24] – [28], mikä sen hyperstabilization kasvaimissa [29]. Useat mekanismit voivat aiheuttaa mutantti p53-proteiini kiertää proteasomin riippuvaa hajoamista. Yksi mahdollisuus on, että kasvaimeen liittyvän stressin voivat saada aikaan vuorovaikutusta mutantti p53 kanssa kaperoni proteiineja, kuten HSP70 ja HSP90, joka inaktivoi E3-ligaasi-MDM2 ja siru ja siten stabiloi mutantti p53 [24] – [27]. Todellakin, esto HSP90 ilmentymistä tai aktiivisuutta vapauttaa MDM2 ja sirun hajota mutantti p53 [26], [30]. Toinen mahdollisuus on, että mutantti p53 kykenee muodostamaan amyloidia aggregaatit kasvaimia, jotka ovat resistenttejä proteasomaalisten hajoamista [27], [31]. Kyky mutantti p53 vakauttaminen esittelee perustavanlaatuinen arvoitus in terapeuttisen intervention syöpäpotilaat mutantti p53. Näin ollen tehokkaat aktivoituminen proteasomin riippuvan hajoamisen mutantin p53 syöpäsoluissa on terapeuttista merkitystä.

Viime aikoina olemme havainneet, että arseeni tavoitteet mutantti p53 hajoamista, mikä johtaa kasvun estämiseen kiinteän kasvaimen soluihin [32] . Arseeni on metalloidipelkistintä liittyy merkittävä teho ja kohtalaisen haittavaikutuksia akuutissa promyelosyyttileukemian, myelooma, ja myelodysplastista oireyhtymää [33]. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että arseeni indusoi villityyppisen p53, TAp73, ja TAp63 kasvainsoluissa [32], [34]. Nämä toimet arseenin tarjoavat strategian vähenevät mutantti p53 dominanttinegatiivivaikutus toimintojen ja muiden GOF toimintaa. Vaikka arseeni vähentää vakautta mutantti p53-proteiinin kautta proteasomin reitin [32], E3-ligaasi että tavoitteet mutantti p53 hajoamiselle ei tunneta. Tässä tutkimuksessa olemme käsitellä tätä kysymystä kehittämisen helpottamiseksi arseenitrioksidin (ATO) mahdollisena syöpälääkettä ohjata kasvainten mutantti p53.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

ihmisen haimasyövän solulinja MIA PaCa-2 (joka sisältää mutantti R248W) ja ihmisen keratinosyyttisolulinjan HaCaT (joka sisälsi mutantti H179Y /R282W) viljeltiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [35].

Plasmidit ja siRNA

Ihmisen täyspitkän Pirh2, Pirh2-DN (E3-ligaasi-viallisen mutantin), ja Pirh2-ΔRING (RING finger domain deleetiomutantti) käytettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [36]. Kaikki Pirh2 proteiinit FLAG-tunnisteella N-päässä. FLAG-leimatun ubikitiinipromoottori ekspressiovektoriin pcDNA3 käytettiin kuten aiemmin on kuvattu [36].

kaksi pientä häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) vastaan ​​Pirh2, 5′-CAU GCC CAA CAG ACU UGU G dTdT-3 ’ja 5’ -GGA AGU GCA GUG CAU AAA C dTdT-3 ’, ja kaksi salattu siRNA, 5′-GCA GUG UCU CCA RTY ACU dTdT-3′ ja 5’-GGC CGA UUG UCA AAU AAU U dTdT-3 ’, hankittiin alkaen Dharmacon RNAi Technologies. SiRNA: t transfektoitiin soluihin käyttämällä SilentFect (Bio-Rad) mukaan valmistajan protokollaa. Solut kerättiin ilmoitettuina aikoina transfektion jälkeen lisäkokeita varten.

Vasta

Kanin anti-p53 (FL-393) ostettiin Santa Cruz Biotechnology Inc. Kanin polyklonaalista Pirh2 ostettiin alkaen Bethyl Laboratories Inc. hiiren monoklonaalinen anti-FLAG M2 ja kanin anti-aktiini hankittiin Sigmalta.

Käänteinen transkriptio-PCR-määrityksen

Kokonais-RNA eristettiin soluista käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen). cDNA syntetisoitiin käyttäen Iscript ™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). Mitata Pirh2 mRNA, RT-PCR tehtiin forward-aluketta 5′-CTGCGAGCACTATGACAGAG-3’and käänteinen aluke 5′-TTCATAGCTAGGCATAAGTTAC-3 ’. Aktiini monistettiin forward-aluketta 5’-TCCATCATGAAGTGTGACGT-3 ’ja reverse-aluke 5′-TGATCCACATCTGCTGGAAG-3’.

proteosomin inhibitiotesti

Solut ympättiin 24 tuntia, käsittelemätön tai esikäsitelty proteasomi-inhibiittoria MG132 (4 uM) 2 tunnin ajan, ja sitten se käsiteltiin ATO: ssa 6 tuntia.

immunosaostus ja Western-blot-analyysi

immunosaostus koe suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [37]. Lyhyesti, HaCaT ja MIA PaCa-2-soluja käsiteltiin 5 tai 7,5 uM ATO: ssa 6 tuntia. Solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, hajotettiin hajotuspuskurissa (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, ja 0,4 mM PMSF), sonikoitiin, ja kirkastettiin sentrifugoimalla . Solulysaateista (500 ug kokonais-proteiinit) inkuboitiin 4 tunnin ajan 4 ° C: ssa, jossa on esitetty vasta-aineiden, joka on kytketty proteiini A-agaroosi-helmiä (Sigma), ja sitten pestiin lyysipuskurilla. Immunosaostettiin proteiini kompleksit ja koko solun lysaatit altistettiin SDS-PAGE: lla. Kunkin sarjan, 5% kokosolu-lysaattia käytettiin tulo-ohjausyksikköön. IgG-vasta-ainetta käytettiin negatiivisena kontrollina. Immunoblotit visualisoitiin SuperSignal West Femto kemiluminesenssiin detektioreagensseja (Pierce).

GST fuusioproteiinivalmisteella

glutationi S-transferaasi (GST) hännitetty Pirh2, Pirh2-ΔRING tai Pirh2-DN oli ilmaistaan ​​pGEX-4T-3 (Amersham Pharmacia Biotech). Rekombinantti GST-merkittyjen proteiinien puhdistettiin kuten aiemmin on kuvattu [37]. Lyhyesti, GST fuusiot Pirh2, Pirh2-ΔRING, ja Pirh2-DN ilmennettiin E. coli BL21 (DE3) (Novagene) induktion 0,5 mM IPTG: llä 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Bakteeri-solut kerättiin ja suspendoitiin sitten GST lyysipuskuria (200 mM Tris-Cl, pH 8,0, 0,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, ja 0,4 mM PMSF: ää). Sen jälkeen, solulysaatit sonikoitiin ja kirkastettiin sentrifugoimalla. GST-fuusioproteiinit puhdistettiin käyttäen glutationi-Sepharose-helmiä (Amersham Pharmacia Biotech) mukaisesti valmistajan protokollan.

p53 ubikitinaation määrityksessä

35S-merkittyä villityypin p53 tai mutantti-p53 ( R175H ja R273H) proteiinit syntetisoitiin in vitro transkription ja translaation käyttäen TNT T7 kytketty retikulosyyttilysaattia (Promega). 5 ui (~ 2 x 10

4 cpm) in vitro käännetty p53 lisättiin GST-Pirh2 (2 ug) ja sekoitetaan jäissä 1 tunnin muodostaa GST-Pirh2-p53 komplekseja. Kompleksit lisättiin ubikitinaation puskuriin (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM ATP: tä, 5 mM MgCl

2, 2 mM DTT: tä, ja 1 x energian palautuminen liuosta (ERS)), joka sisältää E1 (100 ng) , E2 (200 ng), ja ubikitiini (2 ug), ja inkuboitiin 30 ° C: ssa 2 tuntia. Lopuksi, reaktioseokset erotettiin SDS-PAGE: lla ja analysoitiin autoradiografialla. E1, E2, ERS, ubikitiinifuu- hankittiin Boston Biochem.

Tilastot

Kaksi-ryhmä vertailuja analysoitiin kaksipuolista Studentin

t

testiä.

p

arvot laskettiin, ja

p

0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Arseenitrioksidi heikentää mutantin p53-proteiinin välityksellä proteasomin riippuva pathway

on hyvin tunnettua, että kasvainsolut, hyperstabilization mutantti p53-proteiini johtuu kiertäminen proteasomin riippuvaisten hajoaminen [24] – [27], [31], [38]. Siten aktivoituminen proteasomin riippuvan hajoamisen mutantti p53 kasvainsoluissa on terapeuttinen merkitys. Aiemmin havaittiin, että ATO vähentää stabiilisuutta mutantti p53-proteiinin kautta proteasomin reaktiotien [32]. Mikä tärkeintä, olemme osoittaneet, että pudotus endogeenisen mutantti p53 herkistää, kun taas ektooppinen ilmentyminen mutantin p53 desensitizes, kasvainsolujen arseenin hoitoon [32]. Johdonmukaisesti toinen tutkimus osoitti, että arseeni-indusoimaa hajoamista mutantti p53 inhiboi proliferaatiota p53R273H ekspressoivia soluja annoksesta riippuvaisella tavalla [39]. On kuitenkin vielä epäselvää, mikä E3-ligaasi vastaa arseeni-indusoitu mutantti p53 hajoamista. Tämän testaamiseksi me vahvisti, että arseeni aiheuttama hajoaminen mutantti p53 on kautta proteasomireitillä-riippuvaisen reitin. Tätä tarkoitusta varten HaCaT-soluja olivat käsittelemättömiä tai käsiteltiin 4 uM MG132, estäjä 26S-proteasomin, puuttuessa tai läsnä ATO. Huomasimme, että arseeni-indusoitu mutantti p53 hajoaminen oli täysin poistettiin MG132 (Fig. 1A). Samoin havaittiin, että arseenin aiheuttama hajoaminen mutantti p53-proteiinin estyi MG132 in MIA PaCa2 soluissa (Fig. 1 B). Lisäksi olemme havainneet, että, toisin kuin vaikutus proteasomi-reitin villityypin p53-proteiini [40], inhibitio proteasomin reaktiotien yksinään kykene tasoon, mutantti p53-proteiinin (Fig. 1A-B), mikä on yhdenmukaista aiemman raportin [41]. Yhdessä nämä tulokset vahvistivat, että arseeni aktivoi proteasomin riippuva hajoaminen mutantin p53: n tuumorisoluissa.

Western blotit valmistettiin uutteet HaCaT (A) ja MIA PaCa-2 (B-solut), jotka olivat käsittelemättömiä tai esikäsitelty 4 uM MG132: ssa 2 tuntia, ja sitten käsittelemätön tai käsitelty ATO: ssa 6 tuntia.

Arseenitrioksidi heikentää mutantin p53-proteiinin kautta induktion Pirh2 E3-ligaasia

Aiemmin olemme havainneet, että arseeni indusoi ilmentymisen Pirh2 E3-ligaasia hajota ΔNp63 onkogeenisen proteiinin jäsen p53 perheen [34]. Pirh2 tiedetään olevan E3-ligaasia kohdistettu villityypin p53-proteiinin hajoaminen [42], [43]. Siten tutkimme, ATO indusoi ilmentymisen Pirh2 kasvainsoluissa, joissa on mutantti p53. Olemme havainneet, että käsittelemällä ATO, taso Pirh2 transkriptien määrä oli lisääntynyt MIA PaCa-2 ja HaCaT soluja (Fig. 2A), samanaikaisesti kasvua Pirh2 proteiinin (Fig. 2B). Nämä tiedot osoittivat, että ATO voi kopiointia indusoi Pirh2 hajoaminen mutantti p53 tuumorisoluissa.

(A) taso Pirh2 transkriptio lisääntyy ATO. RT-PCR-analyysi suoritettiin kokonais-RNA eristettiin MIA PaCa-2, ja HaCaT-soluja käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin 7,5 uM ATO 2-6 h. Aktiini-mRNA monistettiin latauskontrollina. (B) Western-blotit valmistettiin otteita MIA PaCa-2 ja HaCaT solut käsittelemättömiä tai käsiteltiin kuten (A), ja sen jälkeen vasta-aineilla vastaan ​​Pirh2 ja aktiini, vastaavasti.

Seuraavaksi tutki ektooppinen ilmentyminen Pirh2 parantaa arseenin aiheuttamaa hajoamista mutantti p53-proteiinin. Olemme havainneet, että ektooppinen ekspressio Pirh2 tai ATO hoito yksinään merkittävästi vähentynyt taso mutantin p53 HaCaT ja MIA PaCa-2-solut (Fig. 3A-B). Mikä tärkeintä, olemme havainneet, että yhdistelmä ektooppinen ilmentyminen Pirh2 ja ATO hoito edelleen vähentynyt taso mutantin p53 (Fig. 3A-B). Nämä tiedot osoittivat, että mutantti p53 voidaan hajottaa Pirh2 E3 ligaasilla, ja aktiivisuus Pirh2 voidaan parantaa ATO hoidon kautta tuntemattomia mekanismeja.

(A-B) Western-blotit valmistettiin otteita HaCaT (A ) ja MIA PaCa-2 (B-solut), jotka oli transfektoitu pcDNA3: lla tai pcDNA3-FLAG-Pirh2 24 h, ja käsiteltiin sitten 5 tai 7,5 uM ATO: ssa 6 tuntia. Jälkeen blotit tutkittiin vasta-aineita FLAG-tag, p53, ja aktiini, vastaavasti. (C) Kaavamainen esitys Pirh2 proteiinin yhdessä sijainnit Zn Finger ja RING verkkotunnuksia, kaksi korvaaminen mutaatiota C145S ja C148S kehässä domain (Pirh2-DN), ja poistaminen RING toimialueen Pirh2 (Pirh2-ΔRING). (D-E) ektooppinen ilmentyminen Pirh2-DN tai Pirh2-ΔRING on vähän, jos lainkaan vaikutusta tasoon mutantti p53. Western blotit valmistettiin uutteet HaCaT (D) ja MIA PaCa-2 (E) soluja, jotka oli transfektoitu pcDNA3: lla, pcDNA3-FLAG-Pirh2-DN, pcDNA3-FLAG-Pirh2-ΔRING tai pcDNA3-FLAG-Pirh2 varten 24 h. Jälkeen blotit tutkittiin vasta-aineiden FLAG-leimattua Pirh2, p53, ja aktiini, vastaavasti.

On tunnettua, että Pirh2 vaatii RING verkkotunnuksen ubiquitinate villityypin p53 proteasomaalisten hajoamiseen [44]. Sen määrittämiseksi, ovatko E3 ligaasin aktiivisuuden Pirh2 tarvitaan säätelemiseksi mutantti p53 ilme, kaksi FLAG-merkitty Pirh2 mutantit, Pirh2-ΔRING (puuttuu etusormi domain) ja Pirh2-DN (joka sisältää kaksi korvaaminen mutaatioita C145S ja C148S kehässä domain), käytettiin (Fig. 3C). Osoitimme, että toisin kuin villin tyypin Pirh2, ektooppinen ilmentyminen Pirh2-ΔRING tai Pirh2-DN oli kykenemätön alenevassa tason mutantti p53-proteiinin HaCaT ja MIA PaCa-2-solut (Fig. 3d-E).

edelleen tutkia endogeenisen Pirh2 välittää arseenin aiheuttama hajoaminen mutantti p53-proteiinin, HaCaT ja MIA PaCa-2-solut transfektoitiin väliaikaisesti salattua siRNA (Scr-1 ja -2) tai siRNA vastaan ​​Pirh2 (siPirh2-1 ja -2) 3 d, ja sitten valehoidettujen tai käsitelty ATO. Olemme osoittaneet, että taso Pirh2 väheni merkittävästi Pirh2, mutta ei sekoiteta, siRNA: t (Fig. 4A-B). Mikä tärkeintä, huomasimme, että Pirh2 Knockdown pystyi pelastamaan arseenin aiheuttamaa hajoamista mutantti p53 (Fig. 4A-B). Totesimme myös, että arseeni-hoito lisäsi Pirh2 ilmentymistä, samanaikaisesti vähentynyt ilmentyminen mutantin p53 (Fig. 4A-B).

Western blotit valmistettiin uutteet HaCaT (A) ja MIA PaCa-2 (B ) soluja, jotka oli transfektoitu salattu siRNA # 1 (Scr-1) (kaistat 1-2), Scr-2 (kaistat 5-6), siRNA vastaan ​​Pirh2-1 (siPirh2-1) (kaistat 3-4), tai siPirh2-2 (kaistat 7-8), ja käsiteltiin sitten ATO: ssa 6 tuntia. Jälkeen blotit tutkittiin vasta-aineiden Pirh2, p53, ja aktiini, vastaavasti.

Pirh2 fyysisesti vuorovaikutuksessa mutantti p53-proteiinin polyubiquitination

E3-ligaasi usein fyysisesti vuorovaikutuksessa sen substraattien meidän tutki Pirh2 fyysisesti assosioituu mutantti p53. Tämän testaamiseksi HaCaT ja MIA PaCa-2-soluja käsiteltiin ATO: ssa 6 tuntia, ja sitten endogeenisen mutantti-p53: n ja Pirh2 soluissa immunosaostettiin vasta-aineita p53 ja Pirh2, vastaavasti. Osoitimme, että endogeeninen Pirh2 havaittiin mutantti p53 immunokompleksit (Kuva. 5A). Lisäksi, mutantti p53 havaittiin Pirh2 immunokompleksien (Fig. 5B). IgG: tä käytettiin negatiivisena kontrollina aikana immunosaostus ja kykenemätön immuunisaostamiseksi mutantin p53 tai Pirh2 (Fig. 5A-B).

(A) HaCaT ja MIA PaCa-2-soluja käsiteltiin 5 tai 7,5 uM ATO varten 6 h. Solu otteita HaCaT (vasemmalla) ja MIA PaCa-2 (oikealla) solut immunosaostettiin anti-p53 tai kontrolli-lgG. Immunokompleksien käytettiin sitten havaitsemaan mutantin p53 ja Pirh2 yhdessä kokosolulysaateista syötteenä ohjaus. (B) Koe suoritettiin, kuten on kuvattu (A), paitsi että anti-Pirh2 vasta-ainetta käytettiin immunosaostukseen. (C-E) In vitro syntetisoidun

35S-merkittyä villityypin p53 (C), R175H (D), ja R273H (E) sekoitettiin GST, GST-merkityn Pirh2, Pirh2-DN, tai Pirh2-ΔRING . Kompleksit sekoitettiin sitten puskurilla, joka sisältää E1, E2 (UbcH5b) ja Ub ja sitten inkuboitiin 30 ° C: ssa 2 tuntia. Ubikitinoituja p53 analysoitiin SDS-PAGE: lla ja autoradiografialla. (F) malli Pirh2 välittämää hajoaminen mutantti p53 aiheuttamien ATO.

Seuraavaksi, tutkimme Pirh2 toimii E3 ligaasia ubikinaa- mutantti p53. Tämän testaamiseksi in vitro ubikitinaa- määritys suoritettiin

35S-leimatun mutantin p53R175H tai p53R273H yhdessä rekombinantti GST-Pirh2, GST-Pirh2-DN tai Pirh2-ΔRING. Olemme osoittaneet, että mutantti-p53s oli polyubiquitinated mukaan Pirh2 mutta ei Pirh2-DN ja Pirh2-ΔRING (Fig. 5D-E, vertaa kaista 3 kaistat 4 ja 5). Koska villityyppi-p53 on tunnettu kohde Pirh2, villityyppisen p53 käytettiin positiivisena kontrollina. Samoin, osoitimme, että villityyppinen p53 polyubiquitinated jonka Pirh2 mutta ei Pirh2-DN ja Pirh2-ΔRING (Fig. 5C, vertaa kaista 3 kaistat 4 ja 5). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että Pirh2 kykenee polyubiquitinating mutantin p53.

Arseenitrioksidi yhteistyössä HSP90 tai HDAC-inhibiittori edistää mutantti p53 hajoamista ja kasvun hidastuminen kasvainsoluissa

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että kasvainsolut, kaperoniproteiinina HSP90 vuorovaikutuksessa mutantti p53 muodostaa MDM2-p53-HSP90 monimutkainen ja siten stabiloi mutantti p53 [24], [26], [45]. Niinpä HSP90 inhibiittorit 17AAG ja geldanamysiinistä häiritä MDM2-p53-HSP90 kompleksin hajottamiseksi mutantti p53 [26], [30], [45]. Lisäksi, SAHA, estäjä HDAC: ien, todettiin vähentävän ilmentymistä mutantti-p53: n kautta estämällä HDAC8-välitteisen mutantti p53 transkriptio [46] ja HDAC6-välitteisen mutantti p53-proteiinin stabiilisuus [30]. Tutkimaan edelleen, onko estäjiä HSP90 ja HDAC: t pystyvät indusoimaan Pirh2 ilmaisun hajottamaan mutantti p53, HaCaT ja MIA PaCa-2-soluja käsiteltiin 17AAG tai SAHA. Osoitimme, että 17AAG tai SAHA hoito ollut juurikaan vaikutusta ilmentymistä Pirh2 proteiinin HaCaT (Fig. 6A) ja MIA PaCa-2-solut (Fig. 6B). Tulos viittaa siihen, että ATO ja inhibiittorit HSP90 ja HDAC: t voivat hajota mutantti p53-proteiinin kautta eri reittejä. Niinpä arveltu, että ATO voi tehdä yhteistyötä HSP90 tai HDAC estäjä edistää mutantti p53 hajoamista ja kasvun hidastuminen kasvainsoluissa. Tämän testaamiseksi HaCaT ja MIA PaCa-2-soluja käsiteltiin ATO, 17AAG tai SAHA, yksin tai yhdessä. Olemme havainneet, että mutantti p53-proteiini oli merkittävästi vähentynyt ATO, 17AAG tai SAHA, ja edelleen väheni yhdistelmän ATO kanssa 17AAG tai SAHA (Fig. 6C-D). Johdonmukaisesti havaittiin, että proliferaation HaCaT (Fig. 6E) ja MIA PaCa-2-solut (Fig. 6F) oli merkitsevästi inhiboi ATO, 17AAG tai SAHA, ja edelleen estää yhdistelmä ATO kanssa 17AAG tai SAHA. Nämä tiedot viittaavat siihen, että yhdistelmä ATO muiden syöpälääkkeiden kanssa, kuten inhibiittorit HSP90 ja HDAC: t, voi saavuttaa synergistinen hoitoja kasvaimia kätkeminen mutantti p53.

(A-B) Western-blotit valmistettiin uutteet alkaen HaCaT (A) ja MIA PaCa-2 (B-solut), jotka olivat käsittelemättömiä tai käsiteltiin 1 uM 17AAG tai 2 uM SAHA 12 tuntia. Jälkeen blotit tutkittiin vasta-aineiden Pirh2 ja aktiini, vastaavasti. (C-D) Western-blotit valmistettiin uutteet HaCaT (C) ja MIA PaCa-2 (D) soluja, jotka olivat käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin 7,5 uM ATO, 1 uM 17AAG tai 2 uM SAHA, yksin tai yhdistelmänä 12 h. Jälkeen blotit tutkittiin vasta-aineiden p53 ja aktiini, vastaavasti. (E-F) HaCaT (E) ja MIA PaCa-2 (F) soluja käsiteltiin kuten (C-D) 24 tuntia. Eloonjääneiden solujen sekä kontrolli- ja testiryhmään laskettiin ja esitetään keskiarvona ± SD kolmesta erillisestä kokeesta. *,

p

0,05.

Keskustelu

Normaalioloissa villityyppisen p53 ilmentyy alhaisilla tasoilla johtuen hajoamisen välittämä E3 ligaaseilla mukaan lukien MDM2, Pirh2, COP1, ARF-BP1, ja WWP1 [43]. Sen sijaan, mutantti p53 usein kerääntyy korkea tuumorisoluissa, vaikka sen ilmentyminen normaaleissa kudoksissa on myös pidettävä matalalla tasolla toiminnan kautta MDM2 [28]. Kasvain-erityinen hyperstabilization mutantti p53 on kriittinen tekijä sen GOF. Todellakin, hiljentäminen mutantti p53 siRNA estää proliferaatiota ihmisen kasvainsolujen [16], [47]. Näin ollen, mutantti p53 hajoamiselle tarjoaa perustelut houkutteleva syövän vastaisen strategioita vaimentaa leviämisen syöpäsoluja. Äskettäin ehdotettiin, että nonproliferating kasvainsoluissa, tukahduttaa macroautophagy edistää liikevaihdon mutantti p53-proteiinin kautta kaperonia välitteisen autophagy in lysosomiin riippuvalla tavalla [29]. Valitettavasti, vaatimus ehdollisen asesulkua kasvainsolujen rajoittaa mahdollisuuksia kaperonia välitteisen autophagy kliiniseen käyttöön. Lisäksi tällä hetkellä saatavilla solunsalpaajahoitojen eivät kykene heikentävien mutantti p53. Esimerkiksi monet etulinjan syöpälääkkeiden lisätä sekä villityyppinen p53 ja mutantti p53 ja saattaa edistää kasvainten muodostumista ja etenemistä kasvaimissa mutantti p53 [28], [48]. Näin ollen stabilointi-mutantin p53 kemoterapia-aineiden paradoksaalisesti rajoittaa tehokkuutta näistä hoidoista.

Aiemmin olemme havainneet, että ATO, lääkkeen kliinisesti edullisia akuutti promyelosyyttinen leukemia, vähentää stabiilisuutta mutantti p53-proteiinin kautta proteasomin reaktiotien ja tukos proteasomeja reitin voi lievittää arseenin aiheuttama mutantti p53 hajoaminen [32], [49]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että ATO indusoi ilmentymistä Pirh2 E3 ligaasia. Lisäksi olemme havainneet, että knockdovvn Pirh2 inhiboi, kun taas ektooppinen ilmentyminen Pirh2 parantaa, arseenia aiheuttama hajoaminen mutantti p53-proteiinin. Meidän havainto viittaa siihen, että arseeni indusoima Pirh2 syöpäsoluissa aktivoi proteasomi-riippuvaisen mutantti p53 hajoamista (Fig. 5F). Vaikka mutantti p53 voidaan kohdistaa MDM2 normaaleissa soluissa, MDM2 voi polyubiquitinate mutantti p53 syöpäsoluissa [28]. Tämä vika johtuu todennäköisesti kohonneeseen HSP70 ja HSP90 syöpäsoluissa, jotka muodostavat komplekseja mutantti p53-proteiini [24] – [26], [45]. Lisäksi yli-ilmentynyt MDM2 isoformi B syöpäsolut voivat olla vuorovaikutuksessa täyspitkän MDM2 ja estää MDM2-välitteistä mutantti p53 ubikitinaation [38]. Nämä muutokset tarjoavat mahdollisuuden kohdistaa kasvaimia kätkeminen mutantti p53. Todellakin, huomasimme, että ATO yhteistyössä 17AAG tai SAHA estävän mutantti p53 ilmentymistä ja kasvainsoluproliferaation.

Vaikka ektooppinen ilmentyminen Pirh2 tai ATO hoito yksinään voi merkittävästi vähentää tason mutantti p53, yhdistelmä kohdunulkoisen ilmaisun ja Pirh2 ja ATO hoito vähentää edelleen tason mutantin p53 (Fig. 3A-B). Tämä merkitsee sitä, että kyky Pirh2 E3-ligaasia hajota mutantti p53 voidaan parantaa ATO hoitoon. Yksi mahdollisuus voi johtua ATO aiheuttaman translaation jälkeisiä modifikaatioita mutantti p53 ja Pirh2. Itse asiassa todettiin, että annettaessa arseenin akuutissa promyelosyyttinen leukemia (APL), PML-RARa fuusio onkoproteiinin läpikäy SUMOylation pienet ubikitiinistä kuten modifiointiaineita (SUMO) ja saatetaan sitten RNF4 välittämää proteasomaalisten hajoaminen [50], [51 ]. Inaktivointi SUMOylation täysin lohkojen PML hajoaminen [52]. Siten lisätutkimukset ovat aiheellisia tutkia, onko Pirh2 ja /tai mutantti p53 muuttamat SUMO, jota voidaan parantaa käsittelemällä ATO kasvainsoluissa.