Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kemoterapia vastus potilailla, joilla peräsuolen syöpä (CRC) voi liittyä syövän läsnäolon kantasolujen (CSCS), mutta taustalla mekanismi (t) jää epäselväksi. Karsinooma liittyvä fibroblasteja (valuuttalisiin) ovat kiinteästi mukana kasvaimen uusiutumisen sekä kohdistaminen niihin lisää Chemo-herkkyyttä. Me tutkimme, fibroblastit saattaa lisätä CSCS siten välittävä kemoterapian resistenssin. CSCS eristettiin joko potilaasta johdettujen ksenografteissa tai CRC solulinjat perustuu ilmaus CD133. Ensimmäinen, CSCS havaittiin olevan luonnostaan ​​vastustuskykyisiä solukuolema kemoterapian. Lisäksi, fibroblasti-johdettu väliaine (CM) edistää prosenttiosuus, kyky muodostaa klooneja ja kasvaimen kasvua CSCS (eli CD133 + ja TOP-GFP +) käsittelemällä 5-fluorourasiilin (5-Fu) tai oksaliplatiinin (OXA). Lisätutkimukset osoittivat, että eksosomeiksi, eristetyt CM, samoin otti edellä mainittuja vaikutuksia. Esto eksosomi eritys väheni prosenttiosuutta, kyky muodostaa klooneja ja kasvaimen kasvua CSCS. Kaikkiaan meidän havainnot viittaavat siihen, että lisäksi kohdistaminen CSCS, uusia terapeuttisia strategioita estämään valuuttalisiin eritystä jopa ennen kemoterapiaa kehitetään saamaan parempia kliinisiä hyötyjä kehittynyt CRC.

Citation: Hu Y, Yan C, Mu L, Huang K, Li X, Tao D, et al. (2015) Fibroblast-Johdettu Eksosomit Osallistutaan Chemoresistance kautta Pohjustus Cancer kantasoluja peräsuolen syövän. PLoS ONE 10 (5): e0125625. doi: 10,1371 /journal.pone.0125625

Academic Editor: Christopher Heeschen, Espanjan National Cancer Center (CNIO), ESPANJA

vastaanotettu: 04 tammikuu 2015; Hyväksytty: 24 maaliskuu 2015; Julkaistu: 4. toukokuuta 2015

Copyright: © 2015 Hu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro. 81172065, 81272660), Program New Century Excellent Talents in University (nro NCET-12- 0208), Scientific Research Foundation varten Palautetut Overseas Kiinan Scholars, State Opetusministeriö (nro JYBHG201002), perustutkimus rahastojen Central yliopistot (HUST, No.01-18-540005), Tongji sairaala rahastoja Palautettu Overseas Tutkijat ja Outstanding Young Scientists (2012yq004) (kaikki JCQ). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi johtavista syistä syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti, ja sen kuolleisuus on kasvanut tasaisesti viime vuosikymmeninä [1]. Chemotherapies ole parantanut kliinisiä tuloksia potilailla, joilla on uusiutuva tai metastaattinen CRC. Parempi ymmärrys mekanismeista resistenssin CRC on välttämätöntä kehittää entistä tehokkaiden hoitomuotojen, jotka voivat hyötyä CRC potilaita.

CRC on heterogeeninen, ilmentää kirjava solujen morfologiaa ja histopatologisia esityksiä. Kokeelliset todisteet olemassaolosta syövän kantasoluja (CSCS) CRC on viime aikoina osoittanut käyttämällä ensisijaista ihmisen CRC kasvainnäytteestä [2, 3]. CSCS ovat arveltu olevan luonnostaan ​​vastustuskykyisiä kemoterapiaa. Toistuva CRC upon kemoterapiaa usein rikastunut varten soluista, jotka ilmentävät CSC markkereita, kuten ABCB5 [2, 4]. Kuitenkin taustalla olevien mekanismien kehitetään yhä.

karsinooma liittyvien fibroblasteja (valuuttalisiin) ovat tiiviisti mukana kasvaimen ylläpitoon ja etenemiseen. Valuuttalisiin raportoidaan myös merkittävää osuutta säätelyssä kasvaimen herkkyys erilaisia ​​kemoterapian, ja kohdentamalla ne dramaattisesti vähentää chemoresistance [5, 6]. Täällä ensimmäinen vahvistaa, että kemoterapia ensisijaisesti suunnattu ei-CSCS johtuu solun itsenäistä vastuksen CSCS, ja lisäksi paljastaa, että valuuttalisiin prime CSCS ja lisätä lääkeresistensseihin upon kemoterapian avulla CAF-johdettu eksosomeiksi.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

peräsuolen adenokarsinooma kudosnäytteitä saatiin potilailta, jotka tehtiin kirurgisten sisällä Tongji sairaalan Tongji Medical College, Huazhong tiede ja teknologia. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta tutkittavilla ja kaikki pöytäkirjat hyväksynyt eettinen komitea Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong tiede ja teknologia (IRB ID: 20141106) ja tehtiin periaatteiden mukaisesti ja Helsingin julistuksen .

vasta-aineen ja reagenssien

Monoklonaalinen hiiren anti-ihmis-CD133 ja hiiren anti-humaani-EpCAM-vasta-aineet hankittiin Miltenyi Biotec (pääkonttori, Saksa). Anti-α-SMA-vasta saatiin Dako (Tanska). Anti-FAP hankittiin Abcam (Cambridge, UK) ja anti-vimentiinista ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Anti-Wnt3a ja anti-beeta Actin ostettiin Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Alexa Fluor 488-konjugoitu vuohen anti-hiiri-IgG saatiin Jackson ImmunoResearch (Pennsylvania, USA). GW4869, 5-fluorourasiili (5-Fu) ja oksaliplatiinin (oksa) hankittiin Sigmalta (St. Louis, USA). Matrigel saatiin B.D. (Franklin Lakes, NJ).

Solulinjat ja soluviljelmä

Ihmisen paksusuolen syövän soluja (SW620) ja ihmisen fibroblastisoluja, jotka ovat peräisin normaalista paksusuolen kudokset (18Co) hankittiin American Type Culture Collection (Manassas VA). Syöpään liittyvä fibroblasteissa (valuuttalisiin) eristettiin peräsuolen syöpä yksilöitä. SW620-soluja, 18Co-soluissa sekä valuuttalisiin johdetut kasvaimia viljeltiin DMEM (Invitrogen, Kalifornia, USA), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Life Technologies, NY, USA) 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa ilmakehässä 5% CO

2 ja 95% ilmaa.

valmistaminen yksisolususpensioi- kasvaimista

Ensisijainen Kolorektaalituumorien tai ksenograftikasvaimissa jauhettiin täysin kokoon 1mm

3 ja suspendoitiin sitten DMEM /F12 (Invitrogen, Kalifornia, USA), joka sisälsi 1,5 mg /ml kollagenaasia ⅳ (Invitrogen, Kalifornia, USA), 20 ug /ml hyaluronidaasia (Sigma, St. Louis, USA), 1% penisilliini /streptomysiiniä (Life Technologies, NY , USA) ja 1,25 mg /ml amfoterisiini B: tä (Sigma, St. Louis, USA) 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan. Digestion jälkeen, kudokset pestiin PBS: llä ja suodatettiin 40 uM mesh (BD Falcon, CA, USA). Poistaa punasoluja, soluja inkuboitiin punasolujen lyysipuskuria (eBioscience, California, USA) jäillä 10 minuutin ajan ja pestiin kahdesti PBS: llä. Sitten solut suspendoitiin uudelleen PBS: ään kokeita varten.

eristäminen valuuttalisiin ja perustamalla CRC ksenograftikasvaimissa (XhCRC) B

eristämiseksi valuuttalisiin, yksittäisistä soluista saatu naispuolinen potilas Duke B peräsuolen adenokarsinooma viljeltiin DMEM: ssä, jossa oli 10% FBS: ää. Jälkeen inkuboitiin 3 tunnin ajan, tarttumattomat solut pestiin pois PBS: llä, jolloin kiinnittyneet solut, jotka koostuivat pääasiassa makrofagien, epiteelisolujen ja fibroblastien. Sen jälkeen viljellään useita päiviä, makrofagit ja epiteelisolujen kuoli pois, jättäen solut, jotka olivat fibroblastien kaltainen ja johdonmukaisesti α-SMA, vimentiinistä ja FAP positiivinen. Ensisijainen fibroblastiviljelmät Kokeissa käytettiin jopa kulkua 10. vahvistaa CRC ksenografti kasvainmuoto, yksi ensisijainen peräsuolen syövän solut ovat peräisin naispotilas Duke C peräsuolen adenokarsinooma istutettiin kahdenvälistä selän naisten NOD /SCID.

Fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) ja puhdistus CD133

+/- CRC-solujen

FACS suoritettiin valmistajan ohjeiden käyttämällä FACS Aria II Cell Sorter (BD, Biosciences, CA , USA). Jos haluat erottaa CD133

+ ja CD133

– /lo solujen SW620-soluissa, solut leimattiin PE /APC-konjugoitua hiiren anti-ihmisen CD133-vasta-aineita. Yleensä vain ylin (CD133

+) ja pohja (CD133

– /lo) 10-20% soluista puhdistettiin pois. Jos haluat erottaa CD133

+ ja CD133

– /lo solujen ksenografteissa, XhCRC kasvaimet hajotettiin yhden soluihin edellä kuvatulla tavalla ja sen jälkeen värjättiin APC-konjugoidun hiiren anti-ihmisen CD133 ja PE-konjugoidulla hiiren anti-ihmisen EpCAM vasta-aineita, ja EpCAM

+ CD133

+ ja EpCAM

+ CD133

– /lo CRC solut puhdistettiin pois.

Solukuolemaan analyysi

solukuolema CSCS ja ei-CSCS arvioitiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japani). Lyhyesti, solut siirrostettiin täydellisessä väliaineessa 3000 solua /kuoppa 96-kuoppaisille levyille. 12 tunnin kuluttua ymppäämisestä, soluja käsiteltiin joko 5-Fu (1 uM) tai oksa (1 uM). Ja 72 tuntia myöhemmin, 10 ui CCK-8-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Sitten levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 tunti, solujen elinkelpoisuus määritettiin skannaamalla mircoplate lukijalla 450 nm: ssä.

elatusaine valmisteen

fibroblasteja maljattiin ja viljeltiin DMEM /F12, jossa 10% FBS: ää 24 tuntia, ja pestiin sitten kolme kertaa PBS: llä ja lopuksi viljeltiin 3 ml seerumitonta DMEM: ää /F12: ssa 2 tuntia. Elatusaine kerättiin talteen ja suodatettiin 0,22 um: n suodattimen (Merck Millipore, Massachusetts, USA) solujätteiden poistamiseksi.

eristys ja karakterisointi eksosomeiksi vapauttaa fibroblastit

Eksosomit eristettiin viljellyistä fibroblasteja käyttäen Yhteensä eksosomi Isolation Kit (Invitrogen, Kalifornia, USA). Lyhyesti, 0,5 ml yhteensä eksosomi eristäminen reagenssia lisättiin kuhunkin 1 ml suodatettua väliaine, ja sekoitettiin hyvin kääntelemällä. Sen jälkeen inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa, seosta sentrifugoitiin 12000 x g 70min 4 ° C: ssa ja kaikki supernatantti poistettiin imemällä [7]. Eksosomi pelletit suspendoitiin kätevä tilavuus DMEM /F12 -alustassa. Toinen eksosomi eristäminen menetelmä suoritetaan sarja- sentrifugoimalla kuten aikaisemmin on kuvattu [8]. Cellular supernatantti ensin sentrifugoitiin 2000 x g 30 min, 10000 x g 40 min heikentävistä kuolleet solut ja solujäte. Ja sitten, eksosomien ja eksosomi-köyhdytettyä liukoinen fraktiot erotettiin ultrasentrifugoimalla 100000 x g 4 ° C: ssa 70 min.

morfologia ja hiukkaskoko eksosomeiksi oli tunnusomaista kautta transmissioelektronimikroskoopilla (FEI Tecnai 20, Philips) toimivat 160kV. Eksosomi proteiinit uutettiin eksosomeiksi käyttämällä SDS-liuotuspuskuria (250 nM Tris-HCI, pH 7,4, 2,5% SDS). Proteiinit ladattiin 10% SDS-polyakryyliamidigeeleillä, siirrettiin elektroforeettisesti nitroselluloosakalvoille. Hiiren anti-ihmisen CD81-vasta-aineita (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, klooni: 1.3.3.22, 1: 100) käytettiin immunoblottauksella. Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin käyttäen Super Signal West Femto Suurin herkkyys Substrate (Thermo Scientific, Waltham, MA).

estäminen eksosomi vapautumisen

edelleen vahvistaa vaikutusten eksosomeiksi, eksosomi pääsee ympäristöön on estetty viljellään 10 uM GW4869, erityinen estäjä puolueettomille sfingomyelinaasi 2 (nSMase2) [9]. Kun oli inkuboitu 24 tuntia, väliaine, joka sisälsi GW4869 heitettiin pois ja solut pestiin PBS: llä 3 kertaa. Sitten tuoreet DMEM /F12-väliainetta lisättiin, ja väliaine kerättiin, kuten edellä on kuvattu.

Sphere-muodostumisen määritys

Basic menettelyjä alan muodostumisen määritys on kuvattu aikaisemmin [10]. Solut suspendoitiin uudelleen standardi palloja muodostavan väliaineen [DMEM /F12 (Invitrogen, Kalifornia, USA), jota oli täydennetty 1 x B27 seerumin korvikkeena (Invitrogen, Kalifornia, USA), 20 ng /ml ihmisen rekombinantti epidermaalista kasvutekijää ja 20 ng /ml emäksinen fibroblastikasvutekijä tekijä (Sigma, St. Louis, USA). CRC solut maljattiin 300 ~ 500 solua /kuoppa 24-kuoppaisille ultra-low kiinnikelaatat (Corning, Massachusetts, USA) kanssa tai ilman anto 5-Fu (1 uM) tai oksa (1 uM). Serial pallo muodostumista määrityksissä, ensimmäisen sukupolven palloja kerättiin, eritellyt 0,025% trypsiini /EDTA, suodatetaan 40 um mesh ja uudelleen pinnoitettu kuten edellä. Tämä prosessi toistettiin jopa 3 sukupolvea. Kun kemoterapiaa, tai /ja CM /eksosomeiksi, kemoterapeuttisten aineiden ja /tai CM (200 ui) /eksosomeiksi (vastaa 200 ui CM) lisättiin 2 päivän välein. Kun 5 ~ 14 päivää, palloja, joiden halkaisija ≥ 50 um pisteytettiin ja esitetty kyky muodostaa klooneja (%) kuvioissa.

Animal tutkimus

Eläinten protokollia hyväksyttiin yliopiston komitea käytön ja hoidon Eläimet (UCUCA) Tongji Medical College, Huazhong tiede ja teknologia. Kaikissa kokeissa Solujen elinkelpoisuus varmistettiin trypaanisiniekskluusiolla testi ja solut suspendoitiin uudelleen 100 ul: ssa PBS /Matrigel-seokseen (1: 1 tilavuus), ja sen jälkeen injektiona ihonalaiseen kudokseen vasemman ja oikean takaisin alueelle käyttäen 27 gaugen neula. SW620-soluja implantoidaan ihon alle 4-viikkoisen naaras-Balb /c-nu-hiirissä, ja XhCRC soluja istutettiin 4-viikkoisen naaras-NOD /SCID-hiiriin. Neljästä viiteen hiiriin istutettiin per ryhmä. CM (200μ) tai eksosomeiksi (yhtä suuri kuin 200 ui CM) Sitten ruiskutetaan ihon alle joka 2 päivää. Samalla kaikki hiiret intraperitoneaalinen injektoitiin kemoterapeuttisen aineen, 5-Fu (100 mg /kg ruumiinpainoa) tai oksa (10 mg /kg) kerran viikossa. Kasvaimia seurattiin, ja kasvainten tilavuudet tutkittiin joka kolmas päivä. Sen jälkeen uhrataan, kasvaimet poistettiin hiiristä ja punnittiin arvioida kasvaimen kehitystä. Rajoittamiseksi laimennuksen määrityksiä, 100000, 10000, 1000, ja 100 puhdistetaan CD133

+ ja CD133

– /lo CRC soluja istutettiin inimmunodeficient hiiriin. Kasvain-aloittamista taajuus ja tilastollinen merkitsevyys arvioitiin kanssa ääriarvoina Laimennus Analysis (ELDA) ’limdil ”-toiminto (https://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html).

Immunofluoresenssimikroskopia

Immunofluoresenssimikroskopia aiemmin kuvattu [11] .CAFs tai XhCRC soluja viljeltiin 0,17 mm peitelaseja tai lasipohjaisella Petri ruokia yksikerroksisessa yössä. Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (PFA) 10 min huoneen lämpötilassa ja sen jälkeen estämällä 5% (w /v) naudan seerumialbumiinia (BSA) PBS-puskurissa 1 tunti. Ensisijainen vasta-aineet laimennettiin 1:50 5% BSA. Sen jälkeen inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa, sitten solut huuhdeltiin kolme kertaa PBS: llä ja sen jälkeen inkuboitiin Alexa Fluor 488-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineilla (laimennettu 1:50 5% BSA) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Lopuksi, DAPI (4 ’, 6-diamino-2-fenyyli, Sigma) käytettiin visualisoimaan solutumien 10 min huoneen lämpötilassa. Objektilasit tutkittiin alla -konfokaalimikroskoopilla (FV1000, Olympus).

Dil-leimatun eksosomeiksi siirtää

Puhdistettu eksosomeiksi peräisin 18Co solut leimattiin lipofiilisten fluoescentcarbocyanine väriaineiden Dil mukaan valmistajan protokollan (Santa Cruz Biotecnology, CA, USA) .18Co-eksosomeiksi suspendoitiin 100 ui PBS: ssä ja inkuboitiin 1 ul Dil 15 minuuttia 37 ° C: ssa, pestiin kahdesti liiallisen värin poistamiseksi ja niitä inkuboitiin SW620-solujen 37 ° C: ssa yön yli.

Lentivirusvektorikonstruktit toimittaja määrityksissä

TCF /LEF toimittaja ilmenemisen liikkeelle GFP (TOP-GFP) lentivirus hankittiin SBO Medical Biotechnology Company, Shanghai, Kiina. SW620-solut infektoitiin TOP-GFP lentivirus MOI = 25 72 tunnin ajan. Saat pallo muodostumista määrityksiä, TOP-GFP

+ ja TOP-GFP

– fraktiot selvitetty FACS ja päällystetty ultra-low kiinnityslevyt edellä kuvatulla tavalla. Arvioituihin vaikutuksiin CM /eksosomeiksi annetun Wnt aktiivisuuteen CD133

+ jakeet, 50000 CD133

+ SW620-solut infektoitiin TOP-GFP lentivirus ja maljattiin 6-kuoppaisille levyille, minkä jälkeen CM /eksosomeiksi hoitoon tai plus kemoterapiaa. 3 päivän kuluttua inkuboinnin ilmentyminen TOP-GFP analysoitiin virtaussytometrialla.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitettiin keskiarvona ± SD. Yleensä pariton kaksihäntäinen Opiskelijan

t

-testi tai kaksisuuntainen ANOVA suoritettiin IBM SPSS Statistics 18 vertailla eroja avulla eri hoitoryhmään.

P

-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

CD133 tunnistaa CSCS in CRC solulinjassa ja ksenografti johdetut peräsuolen syöpä kasvain

CSCS ovat harvinaisia ​​väestönosat peräsuolen syöpä, joilla on itseuudistuvien ja tuumorigeeniset kapasiteettia [12]. Käyttö CD133, pinta maker, rikastuttaa CSCS on välttämätöntä erottaa tuumorigeenisemmiksi ja ei-tuumorigeeniset solut [2]. Me ensin ksenograftikasvaimissa (XhCRC) johdettu naispotilas Duke C peräsuolen adenokarsinooma naaras NOD /SCID. Kun ksenograftikasvaimissa kasvoi, kasvaimet käsiteltiin yksisolususpensioi-, ja me sitten selvittäneet kaksi solupopulaatioiden (ts EpCAM

+ CD133

+ ja EpCAM

+ CD133

– /lo) joka perustuu ekspression epiteelin markkerin (toisin sanoen, EpCAM) ja oletetun CSC markkeri (toisin sanoen, CD133) (kuvio 1A) kantavassa puhtaus EpCAM

+ CD133

+ ja EpCAM

+ CD133

– /lo-solut oli sekä 96% (kuvio 1 B). Sen vahvistamiseksi, että EpCAM

+ CD133

+ solujen rikastuttaa CSCS teimme rajoittavan laimennuksen määrityksiä. Kuten odotettua, EpCAM

+ CD133

+ solujen osoitettiin korkeampi kasvaimen tuotantokapasiteettia (

P

0,001) (kuvio 1 C). Samoin puhdistettu CD133

+ SW620-soluissa, laajasti käytetty CRC solulinjan, myös aloittaa myöhemmin (

P

0,001) (kuvio 1 C). Yhdenmukainen LDAs, sarja pallo-muodostelman analyysit osoittivat, että puhdistettu EpCAM

+ CD133

+ soluja kyettiin kuljetettiin vähintään kolmen sukupolven ja osoittivat lisääntynyttä pallo-etenevän kapasiteettia, kun taas EpCAM

+ CD133

– /lo-solut muodostivat paljon vähemmän pallojen 1

o sukupolven (

P

0,001) ja EpCAM

+ CD133

– /lo cell-aloittanut palloja lopetettava 2

o sukupolvi (kuvio 1D ja 1E). Lisäksi puhdistettu CD133

+ SW620-solut, myös osoitti progressiivisesti lisääntynyt pallo-lisäys kapasiteetti verrattuna CD133

– /lo SW620cells (

P

0,001) (kuvio 1F ja 1G ). Nämä tulokset osoittivat, että CD133

+ CRC solut hallussaan pitkäaikainen kyky muodostaa klooneja sekä ksenograftikasvaimissa ja SW620-soluissa, mikä viittaa siihen, että CD133

+ CRC soluja, meidän koejärjestelmässä, voi rikastuttaa luulotellun CSCS. Jotta Yksinkertaisuuden vuoksi tästä eteenpäin viittaamme EpCAM

+ CD133

+ tai CD133

+ ja EpCAM

+ CD133

– /lo tai CD133

– /lo solujen CSCS ja ei-CSCS, vastaavasti.

(A) Kaaviokuva CD133

+ ja CD133

– /lo kasvainsolut lajittelun dissosioituneista peräsuolen ksenografti kasvain FACS. (B) Edustava esimerkki jälkeisen lajittelu analyysi lajitellut CD133

+ ja CD133

– /lo XhCRC soluja. (C) Tumor-aloittamisen taajuus CD133

+ ja CD133

– /lo CRC solut immuunivajaissa hiirillä (PO) Serial pallo muodostumisen määritykset puhdistetulla CD133

+ ja CD133

– /loCRC soluja (ts XhCRC ja SW620). Kuulat laskettiin (D, F) ja edustavat kuvat näkyvät (E, G) .Scale baareja, 100 pm. ***

P

0,001.

CSCS osoittavat solun autonominen chemoresistance

CSCS on raportoitu olevan suhteellisen resistenttejä kemoterapia [13-16], me kuulustelivat vaste CSCS ja ei-CSCS tavanomaisten kemoterapeuttisten aineiden (5-Fu tai oksa) CCK-8 aktiivisuuden määrityksissä. Itse asiassa sekä XhCRC ja SW620-solut, kemoterapian aiheuttama solukuolema väheni merkittävästi CSCS verrattuna ei-CSCS (kuvio 2A,

P

0,01 5-Fu ryhmä,

P

0,001 oksa ryhmässä, 2B,

P

0,001), mikä osoittaa, että CSCS voi olla luontaisesti resistenttejä kemoterapia-aineiden. Ratkaisee lopullisen solun fenotyyppi vastaa tätä eroa, käsittelimme irtotavarana XhCRC ja SW620-solujen kanssa 5-Fu tai oksa ja 3 päivää, ja sitten havaitaan ekspressoivien solujen prosenttiosuus CD133 virtaussytometrialla. Kuten odotettua, CD133

+ -solujen lisääntynyt 0,5-1-kertaiseksi, kun kemoterapeuttisen hoidon (kuvio 1 D ja 1 E), ja lisäksi, että jäljellä CRC-solut (eli, joissa on enemmän CD133

+ solut), osoitti myös lisääntynyttä sphere- muodostaen kapasiteetti (kuvio 2E,

P

0,01, 2F,

P

0,001), mikä viittaa siihen, että kemoterapia, todellakin, rikastaa CSCS kolorektaalisyövässä kautta CSC-solu-autonominen chemoresistance.

(A, B), Cell syöttämällä analyysi CSCS ja ei-CSCS päässä XhCRC tai SW620-soluja määritettiin CCK-8 aktiivisuuden määrityksessä, kun kemoterapeuttisen hoidon (5-Fu tai oksa). **

P

0,01, ***

P

0,001. (C, D) rikastaminen CSCS irtotavarana solujen XhCRC (C) ja SW620-solut (D) määritettiin FACS-analyysi perustuu CD133 ilmaisun yhteydessä kemoterapiaa. (E, F) Sphere muodostavaa kapasiteetti bulk soluja (XhCRC tai SW620-solut) esikäsiteltiin kemoterapia-aineiden tai DMSO (Ctrl). **

P

0,01, ***

P

0,001.

Fibroblastin johdettu väliaine pohjustettu SW620 CSCS ja siten osaltaan lääkeresistenssin

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että kasvain mikroympäristölle välittää lääkeresistensseihin [17], ja karsinooma liittyvä fibroblasteja (valuuttalisiin), koska tärkeä osa microenvironment, ovat vahvasti mukana kemoterapeuttisten vastus [18, 19]. Todellakin, kun solunsalpaajahoitoa, valuuttalisiin voitaisiin aktivoida ja ylläpitää CSCS pool mikä osaltaan lääkeresistenssin [20]. Kuitenkin tuore tutkimus on osoittanut, että valuuttalisiin, jopa ilman aktivointia kemoterapeuttisten aineiden, edistää kasvaimen stemness kolorektaalisyövässä [21], mikä tarkoittaa, että valuuttalisiin voi prime CRC solujen lisääntyminen kasvain stemness ennen kemoterapiaa, ja jotka voivat siten vaikuttaa terapeuttisia vastus.

Voit selvittää fibroblastit prime CSCS siten edistää lääkeresistenssi, me korjattuna väliaine viljellyistä 18Co (18Co-CM) ilman kemoterapeuttisten aineiden kanssa. Suoritimme sitten pallo muodostumisen määritykset kanssa 18Co-CM in SW620 CSCS annettaessa 5-Fu tai OXA. Odotetusti, 18Co-CM käsitelty SW620 CSCS syntyy yhä suurempia aloilla kuin SW620 CSCS kontrolliviljelynesteessä (

P

0,001) (kuvio 3A). Edelleen vahvistavat vaikutukset 18Co-CM in vivo, me istutetaan 50000 CSCS ihonalaisesti kahden- selän Balb /c-nu-hiiriä (n = 5), joka injektoitiin intraperitoneaalisesti kemoterapeuttisten aineiden kanssa, joka viikko, ja myös sai injektion 18Co- CM tai vertailualustassa välein 2 päivää. Vuonna yhteensopivuutta

in vitro

tuloksiin, 18Co-CM käsitellyillä hiirillä ilmeni korkeampi kasvaimen esiintymistiheys, nopeampi kasvaimen kasvu ja suurempien kasvaimia, mikä osoittaa, että 18Co-CM kykenee suojaamaan ksenograftikasvaimissa kemoterapiaa (kuvio 3B ja 3C). Nämä havainnot viittaavat siihen, että fibroblasti-johdettu väliaine ilman kemoterapiaa hoito voi prime CSCS ja siten edistää chemoresistance CRC.

(A) Sphere muodostava kapasiteetti SW620 CSCS käsitelty 18Co johdettuja CM kemoterapian aikana (5-Fu tai OXA). Edustavia mikroskooppiset kuvat näkyvät. Mittaviivat 100 um. (B, C) 18Co-johdettu väliaine vaikuttaa kasvaimen kasvua SW620 CSCS on Balb /c-nu-hiiriä käsiteltiin OXA. Kasvaimen kasvu käyrät on esitetty C, Kuvassa D on kasvaimen painot ja kuvien lopussa kokeissa. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD; *

P

0,1; **

P

0,05; ***

P

0,001.

CAF-johdettu väliaine pohjustettu XhCRC CSCS ja edistettävä chemoresistance

Tutkitaan onko valuuttalisiin prime CSCS eristetään potilaasta johdettujen ksenografti (XhCRC) siten edistää lääkeresistenssin. Ensin erotettiin ja viljeltiin primäärikarsinoomaan liittyvien fibroblasteissa (valuuttalisiin) peräisin naispuolinen potilas Duke B peräsuolen adenokarsinooma, ja immunovärjäys vahvisti, että nämä solut olivat positiivisia fibroblastien markkereita, kuten vimentiinista [22], α-SMA [23] ja FAP [ ,,,0],24] ja negatiivinen epiteelisolujen markkeri EpCAM [25] (Kuva 4A). Sitten korjattu väliaine viljellyistä valuuttalisiin (CAF-CM) ja suorittaa pallo-muodostumisen määritykset CAF-CM tai kontrolloida väliaineen XhCRC CSCS. Yhdenmukainen löydökset SW620 CSCS, CAF-CM edistetään myös pallo-sähköntuotantokapasiteetti XhCRC CSCS ja suojattava niitä kemoterapia (5-Fu tai oksa) (kuvio 4C,

P

0,001 5-Fu ryhmä

P

0,01 oksa ryhmä). Kuten aikaisemmin ilmoitettiin, kemoterapia voi vain aiheuttaa syövän solujen apoptoosin, mutta myös muuta kasvain microenvironment kiinteissä kasvaimissa [20, 26]. Sen arvioimiseksi, kemoterapia tekee joitakin eroja kasvaimia aiheuttavista vaikutuksista valuuttalisiin, käsittelimme valuuttalisiin 5-Fu /oksa tai DMSO: ssa 12 tuntia, ja sen jälkeen huuhtelu kemoterapeuttiset aineet, väliaine kerättiin, kuten on kuvattu

Materiaalit ja menetelmät

. Kuitenkin meidän data paljasti, että ei ollut merkitsevää eroa kemoterapiaa saaneilla valuuttalisiin ja DMSO-käsiteltyjen valuuttalisiin, kaikki CAF-CMS voisi lisätä palloja muodostavan kapasiteetti XhCRC CSCS (kuvio 4D,

P

0,001 DMSO -CM /5-Fu vs. kontrolli,

P

0,01 oksa- CM vs. kontrolli), mikä tarkoittaa, että valuuttalisiin jo prime CSCS kautta parakriinisesti ennen kemoterapiaa. Tutkimaan edelleen vaikutuksia CAF-CM kasvaimen kasvua XhCRC CSCS, me ihon alle injektoidaan 50000 XhCRC CSCS kahdenvälisiä selän naisten NOD /SCID (n = 4), joka sai samaan oksa ja CAF-CM. Yhdenmukainen

in vitro

havainnot, CAF-CM-käsitellyn XhCRC CSCS syntyy nopeammin kasvavien ja suurempien kasvaimia verrattuna vertailualustassa (kuvio 4E ja 4F). Vastaavasti käsiteltäessä 5-Fu, CAF-CM-käsitellyn XhCRC CSCS aloittaa myöhemmin kasvaimissa verrattuna vertailualustassa (Kuva 4G).

(A) valuuttalisiin johdettu potilaasta näytteestä todensi positiivinen immuunivärjäykseen CAF markkereita (α-SMA, vimentiinistä ja FAP) ja negatiivisen immuunivärjäykseen epiteelin markkeri (EpCAM). Mittaviivat 30 um. (B) XhCRC CSCS todensi positiivinen immuunivärjäykseen epiteelin merkki (EpCAM) ja CSC merkki (CD133), Mittaviivat 10 pm. (C) Sphere muodostavan kapasiteetin XhCRC CSCS in valuuttalisiin johdettu elatusaine (esim., 5-FU, OXA, DMSO-käsiteltyjen valuuttalisien). (D) Sphere muodostavan kapasiteetin XhCRC CSCS käsiteltiin CAF-johdettu CM kemoterapian aikana (5-Fu tai OXA). Edustavia mikroskooppiset kuvat näkyvät. Mittaviivat 50 um. (E, F) CAF-johdettu CM vaikuttaa kasvaimen kasvuun XhCRC CSCS naisten NOD /SCID käsitelty oksa. Kasvaimen kasvu käyrät on esitetty E, Kuvassa F ovat kasvaimen painot ja kuvien lopussa kokeissa. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD; *

P

0,1; **

P

0,05. (G) CAF-johdettu CM vaikuttaa kasvaimen kasvuun XhCRC CSCS istutetaan naisen NOD /SCID käsiteltäessä 5-Fu.

Yhdessä nämä tulokset osoittavat selvästi, että valuuttalisiin prime CSCS ja siten edistää chemoresistance kolorektaalisyövässä kautta, jotka erittävät liukoista tekijä (t).

fibroblastit johdettu eksosomeiksi prime CSCS olla chemoresistance

Viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että eksosomeiksi, liukoisia tekijöitä, jotka erittyvät erilaisia ​​soluja , ovat sekaantuneet etäpesäkkeitä ja lääkeresistenssi [8, 27, 28]. Oletimme, että eksosomeiksi voisi myös edistää lääkeresistenssin meidän koejärjestelmässä. Siksi meidän ensimmäinen puhdistettu eksosomeiksi peräisin 18Co-CM ja CAF-CM kuvatulla

Materiaalit ja menetelmät

, ja sitten vahvistivat rakenteellisia alle faasikontrasti- elektronimikroskoopilla (kuvio 5A) ja immunoblottaus eksosomi markkeriproteiinina CD81 (kuvio 5B). Sen tutkimiseksi, fibroblasti-erittyy eksosomeiksi voivat siirtyä CRC soluihin, me merkitty eksosomeiksi Dil, on lipofiilinen fluorescentcarbocyanine väriainetta. Havaitsimme, että Dil-leimatun eksosomeiksi peräisin 18Co solut tarttunut SW620-solujen 12 tunnin kuluttua koinkubaation (kuvio 5C). Sitten käsitelty CSCS puhdistetun eksosomeiksi sijaan CM, ja todettiin, että sekä SW620 ja XhCRC CSCS käsiteltiin eksosomeiksi syntyy enemmän palloja (

P

0,01) (kuvio 5D ja 5E), viittaa siihen, että eksosomeiksi, jotka ovat johdettu fibroblasteista, voi prime CSCS entistä chemoresistance. Edelleen vahvistaa, että fibroblasti-erittyvän eksosomeiksi sijaan muut liukoiset tekijät ottaa edellä vaikutuksia, otimme standardi ero Ultrasentrifugoinnin sijasta Total eksosomi Isolation Kit, eristää eksosomeiksi. Samanlainen kit-puhdistettu eksosomeiksi, CM-pelletti saaneista SW620 CSCS muodostuu enemmän palloja verrokkiin verrattuna pellettien (

P

0,001 5-Fu ryhmä,

P

0,01 oksa ryhmä), ja eksosomi vaje supernatanttia 18Co-CM ei ottanut tätä vaikutusta (

NS ohjaus pelletti vs supernatantti

) (kuvio 5F). Edelleen vahvistaa, onko fibroblasti johdettuja eksosomeiksi sovitella lääkeresistenssi, käsittelimme fibroblasteja (18Co ja valuuttalisiin) kanssa GW4869, tietyn neutraalin sfingomyelinaasin (nSMase) estäjä, joka estää eksosomeiksi vapauttaa, ja sitten saatu CM (eli eksosomi-köyhdytettyä CM) . Yhdenmukainen aiempien havaintojen eksosomi-köyhdytettyä CM huomattavasti vähentynyt chemoresistance of CSCS (kuvio 5G,

P

0,001, 5 H, 5-Fu ryhmä,

P

0,001 OXA ryhmä). Lisäksi

in vivo

osoittivat myös, että XhCRC CSCS, kun taas käsitelty CAF johdettuja eksosomeiksi, syntyy nopeammin kasvava (kuvio 5I ja 5K) ja suurempien kasvaimia (

P

0,05 ) (kuvio 5J ja 5L) kemoterapian aikana (5-Fu tai OXA). Nämä tiedot osoittavat selvästi, että fibroblastit johdettu eksosomeiksi pohjustettu CSCS olla lääkeresistenssin.

(A) läpäisevällä elektronimikroskoopilla kuva eksosomeiksi peräisin 18Co-soluissa ja valuuttalisien. Mittaviivat 100 nm. (B) Western blottaus CD81 eksosomeiksi. (C) edustaja mikroskopiaan SW620-solujen altistettiin Dil-leimattua eksosomeiksi 12 tuntia. (D, E) Sphere muodostavaa kapasiteetti SW620 tai XhCRC CSCS käsitelty 18Co /CAF-johdettu eksosomeiksi kemoterapian aikana (5-Fu tai OXA). (F) Sphere muodostavan kapasiteetin SW620 CSCS käsiteltiin ultrasentrifugaatiolla puhdistettua 18Co-johdettu eksosomeiksi kemoterapian aikana (5-Fu tai OXA). (G, H) fibroblasteja käsiteltiin 10 mM GW4869 (liukenee DMSO) 24 tunnin ajan. CMS peräisin GW4869 /DMSO-esikäsitellyt fibroblasteja lisättiin CSCS. (I-L) CAF-johdettu eksosomeiksi vaikuttaa kasvaimen kasvuun XhCRC CSCS naisten NOD /SCID-hiirissä, joita hoidettiin 5-Fu tai OXA. Kasvaimen kasvu käyrät on esitetty I (5-Fu) ja K (oksa), ja kasvaimen painot ja kuvien lopussa kokeissa on esitetty L (5-Fu) ja J (OXA). Tiedot esitetään keskiarvona ± SD; *

P

0,1; **

P

0.05.

Eksosomit prime CSCS kautta Wnt-signalointireitin

Aiemmin on osoitettu, että Wnt signalointia toiminta on toimiva markkeri syövän kantasoluja ja on ratkaisevan tärkeää säilyttää stemness paksusuolen syövät. Samalla tavalla normaaliin suoliston kantasoluja, Wnt aktiivisuus ei ole pelkästään solun luontainen ominaisuus, jota voidaan käyttää määrittelemään paksusuolen syövän kantasoluja (CSC) väestön, mutta se säätelee myös ulkoista microenvironment [29-32] . Wnt aktiivisuus on kumppaniaan T-solu tekijä /lymfaattisen tehostajana tekijä (TCF /LEF) perhe transkriptiotekijöiden, jotka aktivoivat tiettyjä Wnt kohdegeenien [33, 34].

kuulustella onko eksosomeiksi prime CSCS kautta Wnt signalointia