Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Vaikka kirurginen resektio on kulmakivi syövän hoitoon, paikallinen ja etäinen uusiutumisen edelleen vaikuttaa haitallisesti lopputulokseen merkittävä osa potilaista. Todisteet siitä, että vaihtoehtoinen debulking strategiaa, jossa radiotaajuisen ablaatio (RFA) indusoi tuumorin vastainen immuniteetin takia tähän tutkinnan tehoa esittävien RFA ennen kirurgista resektiota (pre-resectional RFA) on prekliinisissä hiirimallissa.

Experimental Suunnittelu

terapeuttinen tehokkuus ja systeemisen immuunivasteen arvioitiin ennalta resectional RFA hoitoon hiiren CT26 paksusuolen adenokarsinooman.

tulokset

hoito ennalta resectional RFA merkittävästi viivästynyt kasvaimen kasvua ja parantaa kokonaiselinaika verrattuna valeleikkaus, RFA, tai resektio yksin. Hiiret edeltävässä resectional RFA ryhmä, joka saavutti täydellisen vasteen osoittanut kestävä antituumorivaikutuksen immuniteetti upon kasvain uudelleen haaste. Jos hakija ei terapeuttista hyötyä immuunivajaissa hiirissä vahvistettiin, että kasvaimen valvonta ennalta resectional RFA riippuu ehjästä adaptiivisen immuunivasteen sijaan muutoksia fysikaaliset parametrit, jotka tekevät poistetun kasvaimia sopivampia täydellinen kirurginen. RFA aiheuttaa huomattavasti enemmän kasvaimeen CD8

+ T-lymfosyyttien infiltraatio, siten oleellisesti parantaa suhdetta CD8

+ efektori-T-solut: FoxP3

+ säätelijä-T-soluja. Tärkeää on, että pre-resectional RFA lisää huomattavasti antigeenispesifisten CD8

+ T-solujen tuumorin sisällä mikroympäristössä ja kasvaimen imusolmukkeiden mutta sillä ei ollut vaikutusta tunkeutumisen myelooinen johdettuja suppressorisolut, M1 makrofagien tai M2 makrofageissa on tuumorikohdat tai syrjäisillä imukudoselimiin (eli perna). Lopuksi ennalta resectional RFA primaarikasvainten hidastunut kasvu kaukaisten kasvaimia mekanismilla, joka riippuu systeemistä CD8

+ T-solu-kasvaimen vastaisen immuniteetin.

Johtopäätös

Parannettu selviytymisen ja kasvaimenvastaista systeeminen immuniteetti aikaansaama ennalta resectional RFA tukevat translationaalinen mahdollisuuksia tämän neoadjuvant hoitoon syöpäpotilailla, joilla on korkean riskin paikallisen ja systeemisen uusiutumisen.

Citation: Ito F, Ku AW, Bucsek MJ, Muhitch JB, Vardam -Kaur T, Kim M, et al. (2015) immuuniadjuvantin aktiivisuus Pre-Resectional Radiotaajuisen ablaatio Suojaa Paikallinen ja systeeminen uusiutumisen Aggressiivinen Hiiren peräsuolen syövän. PLoS ONE 10 (11): e0143370. doi: 10,1371 /journal.pone.0143370

Editor: Fabrizio Mattei, Instituto Superiore di Sanità, ITALIA

vastaanotettu: 10 helmikuu 2015; Hyväksytty 4 marraskuuta 2015 Julkaistu: 23 marraskuu 2015

Tämä on avoin pääsy artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 julkisuuteen omistautumista

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksilla National Institutes of Health (CA79765 ja AI082039 SS Evans, CA098156 ja CA109480 SO Gollnick ja P30CA016056 Roswell Park Cancer Institute); ja Jennifer Linscott Tietgen Family Foundation (J. J. Skitzki ja S.S. Evans). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kirurgia pysyy etulinjan hoito ja paras parantava vaihtoehto syöpäpotilaille, joilla kokoisen tauti. Tavoitteena kirurginen on täydellinen poistaminen kasvainten mikroskooppisen syöpää vapaa marginaalit. Valitettavasti monet potilaat kehittää paikallisia tai systeemisiä uusiutumisen huolimatta kehitys kirurginen tekniikka ja adjuvanttihoitoa tai sädehoitoa. Vuonna peräsuolen maksa etäpesäke, esimerkiksi relapsimäärä on jopa 60% potilailla, joille mahdollisesti parantava resektio, oletettavasti johtuen mikroskooppisen jäljellä taudin tai micrometastases läsnä leikkauksen aikana [1-3]. Todisteet korkea toistumisen ja metastasoituneen levittämistä potilailla leikkauksen ehdottaa lisäksi, että vaikka systeeminen antituumorivaikutuksen koskemattomuus näkyy kehittynyt syöpäpotilaille, vakaan tilan immuunivaste ei riitä antamaan riittävää kasvain ohjaus [4]. Mennessä kasvaimet ovat havaittavissa ne ovat jo kehittäneet mekanismeja paeta immunologisia tunnustamista ja poistaminen [4]. Siten resektoitiin kasvain näytteet on usein harva tunkeutuminen CD3

+ T-lymfosyytit, mukaan lukien CD8

+ sytotoksisten T-soluja, mikä korreloi huonon ennusteen useita histologisia kasvaintyypeissä lukien peräsuolen syöpä [5-7].

In situ

terminen ablaatio tekniikoita, kuten radiotaajuisen ablaatio (RFA), ovat nousseet lupaavia hoitovaihtoehdot voida leikata kiinteitä pahanlaatuisia kasvaimia [8, 9]. RFA on hyväksytty US Food and Drug Administration (FDA) ablaatiota varten primaaristen ja etäpesäkkeitä, ja sitä on sovellettu hoidettaessa erilaisia ​​kasvaimia, mukaan lukien maksa, peräsuolen, keuhko-, eturauhas-, munuais-, rinta-, aivo-, kilpirauhasen, melanooma, ja luukasvaimet [9]. Hallinnassa kolorektaalisyövän maksametastaaseista, RFA on käytetty useimmin

kautta

auki, laparoskooppisten tai kuvaohjatut perkutaaninen lähestymistapoja ja voidaan suorittaa yleisanestesiaa tai paikallispuudutusta minimaalisella komplikaatioita [8, 9]. RFA käytetään myös yhdessä kirurgisen resektion potilailla, joilla on useita maksaleesioiden jossa täydellinen resektio ei ole mahdollista johtuen kasvaimen lähellä elintärkeitä rakenteita (esim verisuonet tai sappitiehyeiden) tai riittämätön parenchyma tukemaan hepatektomian jälkeen toiminto [2, 10].

energia toimitetaan RFA aiheuttaa ionisia sekoitusta joka muutetaan kitkan osaksi polttoväli korkean lämpötilan hypertermia (≥50 ° C), aiheuttaen siten korjaamatonta soluvaurioita ja coagulative kuolion [8]. Tämän lisäksi suoran sytotoksisen antituumorivaikutus, RFA on osoitettu herättävän immunomodulatorisia vaikutuksia prekliinisissä ja kliinisissä tutkimuksissa [8, 11]. Toisin kuin kirurginen resektio, vaurioituneen kasvaimen kudoksen seuraavat RFA pysyy

in situ

ja tarjoaa lähde kasvain antigeenejä. Nämä antigeenit otetaan talteen ja käsitellään paikallisten dendriittisolut (DC) ja se on esitetty T-lymfosyyttejä tuumoriin tyhjennys imusolmukkeiden (TdLN), mikä johtaa laajenemisen kasvaimen CD8

+ efektori-T-solujen altaan [8 , 12, 13]. Erityisesti tiheä CD3

+ T-solujen infiltraatiota on raportoitu tuumorikohdat jälkeen RFA sopusoinnussa paikallisten antituumorivaikutuksen immuuni reaktiivisuus [14, 15]. Lisänäyttöä RFA aiheuttaman systeemisen immuniteetin johtuu prekliinisen ja kliinisen raportteja abscopal vaikutuksista liittyy spontaani regressio kaukaisten etäpesäkeleesioita jälkeen primaarikasvaimen ablaation [16-20]. Kuitenkin T-solu-riippuvaisen kasvainten vastainen immuunivaste tuottamat RFA potilailla ja hiiri malleja näyttää olevan suhteellisen heikko [11, 14, 15], ja suuri ongelma on edelleen korkea paikallisen uusiutumisen hoitoalueella, erityisesti kasvainten 3 cm tai lähellä suuria verisuoniverkostoja jossa veren virtaus rajat terminen pitoisuus kohdekudokseen kautta jäähdytyselementin vaikutuksia [2, 8].

Huoli kasvain uusiutumista muutosvyöhykkeellä subletaaleille hypertermia (≤45 ° C), joka ympäröi keskeinen nekroottinen alue on rajoittanut RFA pääasiassa palliation tai potilaille, jotka eivät siedä resectional leikkausta. Tässä testasimme hypoteesia, että paikallinen kirurginen tulos voitaisiin parantaa, jos RFA käytettiin ennalta resectional immunogeenisiä strategiaa lisätä antitumor koskemattomuutta. Raportoimme, että paikalliset ja systeemiset kasvaimen valvontaa ja kokonaiselossaoloaika paranivat merkittävästi seurauksena induktion CD8

+ T-soluvälitteinen adaptiivista immuunivastetta Ennalta resectional RFA hiirimallissa peräsuolen syövän.

Materiaalit ja menetelmät

hiiret

BALB /c- ja C57BL /6-hiiriä (8-12 viikkoa) olivat National Cancer Institute tai Charles River. Vaikea yhdistetty immuunivajaisiin hiiriä (CbySmn.CB17-Prkdc

SCID /J SCID /BALB /c; Jackson Laboratory) ja Clone 4 siirtogeenisiä hiiriä (CBy.Cg-

Thy1a

Tg (Tcra (C14, TcrbC14) 1Shrm /ShrmJ) antaisi α /β T-solureseptorin spesifinen Influenssahemagglutiniinitrimeerien (HA; Linda Sherman, Scripps Research Institute, La Jolla, CA) oli kasvatettu Roswell Park Department of Laboratory Animal Resources. Hiiret pidettiin pathogen- vapaa este olosuhteet. Kaikkien eläinten hoitoon ja menettelyt olivat mukaisesti toimielinten harjoittamaa eläinten terveyttä ja hyvinvointia ja hyväksynyt Roswell Park Cancer Institutional animal Care ja Käytä komitea (IACUC).

transplantable kasvainmuodoista ja CD8

+ T-solujen poistamista

tuumorisoluja (CT26 paksusuolen adenokarsinooma-soluihin ja CT26-HA johdannaisen transfektoitu geenillä, joka koodaa hemagglutiniini [21, 22], syngeenisiä BALB /c tai SCID-hiiriin, B16.F10 melanooma syngeenisiä ja C56BL /6-hiiret) viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% lämmöllä inaktivoitua vasikan sikiön seerumia (Life Technologies, Carlsbad, CA), 2 mM L-glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä, 50 ug /ml streptomysiiniä, 50 uM β-merkaptoetanolia, ja G418 (400 ug /ml; for CT26-HA). Kasvaimen solut (10

6 CT26 tai 3×10

5 B16, 100 ui PBS) ruiskutettiin s.c. kylkeen hiirissä, ellei toisin ole mainittu. Tuumoritilavuudet (vaihteluväli 150-500 mm

3) eivät olleet merkittävästi erilaiset välillä määritetty ryhmien aikaan hoidon aloittamisesta. Kasvaintilavuudet lasketaan määrittämällä lyhyiden (

l

) ja pitkä (

L

) halkaisijat (tilavuus = l

2 x L /2). Kokeellinen loppupisteet saavutettiin, kun kasvaimet ylittivät 20 mm halkaisijaltaan tai kun hiiret tuli kuolemaisillaan ja osoitti merkkejä sivusuunnassa recumbancy, kuihtuminen, vasteen puuttumisen haitallisille vaikutuksille, tai havaittavissa laihtuminen. Samanpuoleiseen nivusimusolmukkeesta tunnistettiin Sentinel TdLN sijaintinsa Evans sinisen väriaineen 1 minuutin kuluttua injektion väriaine lähellä s.c. kasvainpaikkaa. Mallintaa loppuvaiheen keuhkometastaasitestissä, 10

5 CT26 solua injektoitiin häntälaskimoon 7 päivää ensisijainen, s.c. kasvain injektio; 30 päivää myöhemmin, CT26 kyhmyjä laskettiin tutkijat sokaissut näyte identiteetti paisuttivat keuhkoissa värjätään 15% liuos musteella, ja valkaistu Fekete ratkaisu. For CD8

+ T-solujen in vivo, hiiriin ruiskutettiin i.p. 400 ug anti-CD8a mAb (53-6,72, BioXCell) 7 päivän välein alkaen välittömästi jälkeisen RFA hoitoa. CD8

+ T-solujen poistamista varmistettiin virtaussytometrillä käyttäen anti-CD8β mAb (YTS156.7.7, Pe-Cy7) (BioLegend); 2% CD3

+ -T-soluja CD8

+ jälkeen vasta-hoidon.

RFA

Hiiret nukutettiin inhaloitavien isofluraanilla kaasu (4% isofluraani anestesiaan induktioon; 1,5% ylläpitoon). Hiiret sijoitettiin vatsalleen sähkönjohtokykyinen maadoitus, ja kasvaimen alueen kastui tislattua vettä, ennen kuin kytket Starburst SDE koetin (AngioDynamics) keskelle kasvain. Maintining koettimen kärjen lämpötila on 90 ° C 1 minuutin ajan käyttäen RFA RITA 1500 generaattori (AngioDynamics) simuloitu kliinisessä ympäristössä ja kasvaimen uusiutumisen jälkeen RFA, kuten aiemmin on kuvattu Johnson et ai [23]. Sham RFA suoritettiin työntämällä mittapää kasvaimeen ilman sähkövirtaa. Lisätietoja kontrolliryhmää RFA annettiin ihon poispäin s.c. kasvain (eli yläselän). Hiiriä talteen lämpenemistä huopa ja annettava kipulääke (buprenorfiini 0,05 mg /painokilo) s.c. kivun hallintaan.

Kirurginen resektio

Hiiret nukutettiin inhaloitavien isofluraanilla kaasu- ja kasvaimia leikattiin 1 mm reunukset näkyvä raja kasvain. Fascia resektoitiin yhdessä kasvain (

kokonaisuutena

) kaikissa tapauksissa minimoida uusiutumisen syvistä marginaali. Patologinen arviointi kasvain /strooman rajapinta aikaan leikkautumis vuonna Sentinel hiirillä infiltratiivinen kasvain rajojen 40-60% hiiristä riippumatta siitä ennalta resectional RFA annettiin. Viillot suljettiin 4-0 Vicryl® ommel (Ethicon, Inc., Somerville, NJ) ja /tai terästä haavan leikkeet, jotka poistettiin 7-10 päivää. Koska kirurginen huijausta ohjaus, hiiret tehtiin 1 cm ihon viilto ja sulkeminen kontralateraaliseen kupeeseen ilman manipulointia tuumoripaikkaan. Valittujen kokeissa osittainen resektio suoritettiin, luokitellaan havaittavissa makroskooppiset ja mikroskooppiset jäljellä sairaus, jossa ~ 50% tuumorin massa leikattiin. Hiiriä talteen lämpenemistä huopa ja annettava kipulääke (buprenorfiini 0,05 mg /painokilo) s.c. kivun hallintaan.

Adoptive siirtäminen Clone 4 CD8

+ T-solujen

koottujen pernasolua imusolmuke (LN) solujen Clone 4 T-solureseptorin hiiret positiivisesti rikastettiin magneettinen solulajittelussa käyttäen CD8a T-solujen eristäminen kit (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Eristetty populaatiot muodostuivat ~ 85-90% L-selektiinin

hi CD44

pieni naiivi CD8

+ T-solut vahvistamaa virtaussytometrianalyysin. Vastaava määrä Clone 4 CD8

+ T-solut (5-10 x 10

6), joissa on seuranta väriainetta (4 uM TRITC, Molecular Probes) [22, 24] injektoitiin i.v. yksittäisiksi hiirille 6 tunnin kuluttua RFA tai huijausta hoito. TdLN ja kasvainten kudokset jäädytettiin optimaalinen leikkaus lämpötila yhdistettä (Sakura Finetek).

Serum IFN-γ analyysi

Seerumi hankittiin mice 1 vuorokaudessa ja 7 päivää-post RFA tai näennäinen hoidon kautta retro-orbitaalisena. Näytteet säilytetään pakastettuna -80 ° C: ssa määritykseen asti kaupallisten ELISA IFN-γ (R BD Biosciences) [22]. Immuuni komplekseja visualisoitiin käyttäen Vectastain Elite ABC ja DAB alustan sarjat (Vector Laboratories). Immunofluoresens- histologia, 9 um jääleikkeet kiinnitettiin -20 ° C metanoli /asetoniin (3: 1), ja värjättiin monoklonaalisilla vasta-aineilla (anti-hiiri-PNAd vasta-aine, MECA-79; anti-hiiri-CD31-vasta-aine, MEC 13,3, BD Biosciences) ja fluorikromi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Jackson ImmunoResearch), kuten on kuvattu [22, 24]. Digitaalisia kuvia ≥10 satunnaisesti valitun kentät (pinta-alayksikköä = 0,34 mm

2 per kenttä) on vangiksi tarkkailijat sokaissut näyte identiteetti käyttäen Olympus BX50 pystyssä fluoresenssimikroskooppiin varustettu SPOT RT kamera (Spectra Services). Lukumäärä adoptiivisesti siirrettyjen solujen sijaitsevat parenchyma TdLN tai kasvainten (ts nimeämä sijainti fluoresenssileimattua T-solujen ulkopuolella PNAd

+ tai CD31

+ alukset, vastaavasti) määrä määritettiin ImageJ ohjelmisto kuvatulla [ ,,,0],21, 24, 25].

Virtaussytometria

CT26 kasvaimia 1,100-1,700 mm

3 käytettiin RFA käsittelyn avulla on riittävästi jäljellä kasvainkudoksessa analysoida virtaussytometrialla . Kasvaimet tai pernat eriteltyjä (Medimachine, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) ja fenotyyppinen analyysi suoritettiin käyttäen Multiparametrimäärityksessä virtaussytometria seuraavien värjäys monoklonaalisia vasta-aineita: anti-CD8a (53-6.7, Pe-Cy7), anti-CD4 (RM4- 5, PerCP tai V450), anti-CD25 (PC61, APC), anti-L-selektiini (Mel-14, APC tai PE), anti-CD44 (IM7, FITC), anti-CD3 (17A2, FITC), anti- -CD11b (M1 /70, Pe-Cy7), anti-Gr-1 (RB6-8C5, APC), anti-F4 /80 (T45-2342, PE), anti-MHC-II (2G9, FITC), anti- CD45 (30-F11, BUV395) (BD Biosciences); anti-FoxP3 (FJK-16s, PE) (eBioscience); anti-CD8β (YTS156.7.7, Pe-Cy7), ja anti-CD206 (C068C2, BV421) (BioLegend). Virtaussytometria-analyysi tehtiin käyttäen LSR II tai LSRFortessa kanssa FACSDiva ohjelmisto (BD Biosciences) ja WinList käsittelyn ohjelman (Verity Software House).

Tilastollinen analyysi

tilastollinen merkitsevyys kasvaimen kasvua määritettiin 2-tie ANOVA toistettujen mittausten. Survival analysoitiin Kaplan-Meier menetelmä ja ryhmiä verrattiin käyttäen log-rank-testi tai joita Gehan-Breslowin-Wilcoxonin testi. Kaikki muut ryhmäeroja arvioitiin 2-tailed paritonta Studentin

t

-testi. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM ja

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Pre-resectional RFA parantaa paikallista kasvaimen ohjaus ja selviytymisen

sen määrittämiseksi, RFA hoitoa ennen kirurgista resektiota saattaa vähentää paikallisen uusiutumisen ja parantaa selviytymistä, käytimme hiirimallissa CT26 koolonadenokarsinooma simuloida hoitopaikassa, missä RFA esitetään alustavia kasvain ohjaus vaan seuraa usein paikallisen uusiutumisen. Pilottitutkimuksiin me optimoitu koko kasvain aikaan ablaation yhdessä lämpötilan ja keston RFA. Näitä tutkimuksia s.c. CT26 tuumorit suunnilleen sama koko (~ 150-500 mm

3 tilavuudessa) käsiteltiin RFA (1 minuutin ablaation 90 ° C) 10. päivänä istutuksen jälkeen. Resektio saman vaurion suoritettiin päivänä 17, kuten on esitetty kaavamainen kuviossa 1A ja 1B. Me päättänyt käyttää tätä 7 päivän väli RFA ja kirurgia jää riittävästi aikaa ensisijaisen tuumorin vastainen immuunivaste syntyy seuraavien ablaatio [11, 13, 26]. Ohjaus hiirillä oli resektio tai RFA vain 10. päivänä sen jälkeen valeleikkaus (ulkopuolella kasvain alue) päivänä 17, tai sham leikkauksia sekä päivänä 10 ja 17 (kuvio 1A).

(A) aikataulu hahmotellaan erilaisia ​​hoitoja käytetään. BALB /c-hiiriä (10-12 hiirtä /ryhmä) injektoitiin s.c. 10

6 CT26-solut vasempaan kylkeen päivänä 0. Käsittelyt tehtiin 10 päivän kuluttua kasvaimen siirrostamisen. Ensisijainen kasvaimia käsiteltiin kuten on osoitettu valeleikkaus, resektio (Rxn), tai RFA päivinä 10 tai 17 (B) kaaviokuva sekvenssi annon RFA (90 ° C 1 minuutin) 7 päivää ennen kirurgista resektiota. Kasvaimen kasvukäyrät (C) ja selviytymisen käyrät (D) hiirillä CT26 kasvaimia eri hoitoryhmissä. In (C) määrä pitkän aikavälin eloonjääneiden ilman kasvaimen uusiutumisen 150 Päivien tarkoitettu kunkin koeryhmän; for (D) *

P

0,001 valmiiksi resectional RFA ryhmässä verrattuna kaikkiin muihin ryhmiin. (E) selviäminen hiiriä (n = 9) pre-resectional RFA ryhmä altistettiin uudelleen 10

6 CT26 solujen contralateral (oikealla) kylkeen päivinä 150. Tuumorin kasvukäyrät on esitetty, jossa

T

= 0 vastaa aikaa injektion johdetun kasvaimia. Kontrollina, kasvaimen kasvua seurattiin istuttamisen jälkeen saman kasvainsoluannosta osaksi ei-kasvain (NT) -Koettu naiivi BALB /c-hiiriä (n = 10); *

P

0,005 määritettynä Kaplan-Meier-analyysi. Yksi edustava koe ≥ kolmen erillisen kokeen esitetään.

Käyttämällä tätä koesuunnitelma huomasimme, että hoito CT26 kanssa RFA yksin johti 60-80% kuolion yksittäisistä tuumorileesioissa seurasi ≥ 75% kasvain toistuminen jos ei lisähoitoa annettiin (kuvio 1 C). Samoin kirurginen yksin liittyi ≥ 75% paikallisia uusiutumisen korko. Sen sijaan yhdistelmä RFA seuraa resektio merkittävästi viivästynyt kasvaimen kasvulta verrattuna yhden ryhmissä tai sham poisto kontrolliryhmiin (kuvio 1C). Erityisesti, kasvaimen uusiutumisen ei havaittu yli 150 päivää vuonna ~ 80% (9 11 hiirtä) ja hiirillä, joita käsiteltiin yhdistelmällä RFA ja sen jälkeen leikkausta. RFA seurasi resektio edelleen verrokkeja parantunut eloonjääminen verrattuna kaikkiin muihin ryhmiin tämän tappavan CT26 kasvain malli (kuvio 1 D). Tässä suhteessa RFA seurasi resektio johti ~ 80% paikallisen uusiutumisen elinaika verrattuna ~ 20% eloonjääneitä kerta hoidon joko RFA tai resektio yksin.

Muita kokeita sulkea pois mahdollisuutta, että havaittu terapeuttinen hyöty yhdistettyjen RFA ja resektion voisi johtua

(1) B-erot kokonaisaika isäntä altistui tuumoriantigeeneille eri hoitoryhmissä (eli 10 vuorokautta resektio seurasi valeleikkaus ryhmä vs. 17 päivää for RFA + resektio ryhmä),

(2)

tehokkaampi leikkauksen takia alkuperäisen kasvaimen debulking edeltävissä resectional RFA, tai

(3) B-tulehdus käynnistyvät koetin sijoittelua (S1A kuvio). Näitä kokeita, havaitsimme parannusta ei CT26 kasvaimen kasvun viivästyminen tai eloonjääminen, jos alkuperäinen kasvain-debulking saavutettiin päivänä 10 osittaisella resektio (eli 50%: n vähennys syöpäkasvaimen) seurasi excisional resektio päivänä 17 tai sen jälkeen näennäinen RFA vuonna jossa ablaatio koetin sijoitettiin kasvaimiin ilman sähkövirtaa (S1B ja S1C kuvassa). Lisätutkimukset B16 syngeenisissä C57BL /6-hiirten (S2A-S2C kuvassa) totesi, että RFA on neoadjuvant asetus ennen leikkausta on samanlainen terapeuttista hyötyä kuin havaittiin CT26 koolontuumoreissa. Näin ollen suojaavan toiminnan ennalta resectional RFA eivät rajoitu tiettyyn histologinen kasvaimen tyyppi.

tunnusmerkki immuniteetin on kehittää immunologinen muisti on määritelty kyky on aikaisemmin altistettu kasvaimen antigeenejä käynnistää muistaa vastaus uudeellenaltistuksessa. Siksi me tutkimme, hiiret elossa yhdistetty RFA ja resektio CT26 kasvainten kehittämä antituumorivaikutuksen reaktiivisuus rechallenging pitkäaikainen eloonjääneitä (eli 150 päivän kuluttua ensisijainen kasvaimen istutuksen) kanssa s.c. CT26 kasvain contralateral kylkeen. Samanikäisiin, käsittelemättömän ei-kasvain (NT) -Koettu naiivi hiiriä käytettiin kontrolleina. Kuten kuviossa 1E, viivästyy merkittävästi uloskasvamisen CT26 kasvain havaittiin altistettiin uudelleen hiirillä, jotka oli aikaisemmin hoidettu RFA seurasi kirurginen. Yhdessä nämä tiedot ovat sopusoinnussa kehityksen adaptiivisen immuunivasteen jälkeen ennalta resectional RFA joka vähentää paikallisen uusiutumisen ja eloonjäämistä edistämällä kestäviä, systeeminen immuniteetti.

Survival hyväksi ennalta resectional RFA riippuu adaptiivinen immuniteetti

muodollisesti tutkia, RFA aktivointi kasvainspesifisen adaptiivista immuunivastetta ennen kirurginen on kausaalinen rajoittamiseksi kasvaimen kasvua selvitimme vaikutuksia tämän yhdistetyn hoito-ohjelman päälle CT26 syövän etenemisen vakava yhdistetty immuunivajausta (SCID) hiiriä, joilta puuttuu toiminnallinen T-solut ja B-solut (kuvio 2A). Survival käytettiin ensisijaisena päätepisteenä määrittämiseksi tehon koska analyysi primaarituumorin volyymi ei ollut informatiivinen immuunivajaissa hiiriä, jotka usein menehtyivät levitetty tauti (ts vatsakalvon) riippumatta primaarisen kasvaimen koon tai hoidon. Sen jyrkkä vastakohta eloonjäämishyötyä havaittu immunokompetenteilla hiirillä (kuvio 1 D), emme onnistuneet havaitsemaan säilyä SCID-hiirissä hoidettu yhdistetyn RFA ja resektion verrattuna jompikumpi hoito yksinään (kuvio 2B). Tämä riippuvuus adaptiivista immuunivastetta antaa lisänäyttöä siitä, että hyöty ennalta resectional RFA ei voida selittää pelkästään sillä perusteella sytoreduktiivisen vaikutuksista terminen ablaatio.

(A) aikataulu hahmotellaan hoitoryhmissä. SCID-hiiriin (5 hiirtä /ryhmä) istutettiin s.c. 10

6 CT26-solut vasempaan kylkeen päivänä 0. Hoito ryhmien incuded valeleikkaus, resektio (Rxn), tai RFA päivinä 10 tai 17 (B) Eloonjäämiskäyrät edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta; ns, ei merkittäviä määritettynä Kaplan-Meier-analyysi.

Pre-resectional RFA täydentää kiertävä Th1 /CD8

+ T-solu-suunnattu sytokiinien ja suhde CD8

+ T-solut että säätelijä-T-solujen kasvaimen mikroympäristössä

saadaan käsitys rooli immuunivasteen välittämisessä antituumorivaikutuksen ennalta resectional RFA arvioimme kiertävä immuuni sytokiinitasoja annostelun jälkeen RFA in CT26 kasvaimia. Löysimme suuntaus kasvu verenkierrossa pitoisuuksissa prototyyppiä Th1 /CD8

+ T-solu-suunnattu sytokiinin IFN-γ jo 1 jälkeisen päivän RFA verrattuna kontrollina käsiteltyjen hiirten ja jopa vahvempi IFN-γ induktio oli ilmeistä 7 päivää sen jälkeen, kun RFA jälkeen (kuvio 3A). Nämä tiedot ovat sopusoinnussa osuudet Th1 /CD8

+ T-solu-suunnattu sytokiinien tuottavan systeemisen antitumor immuunivasteen.

(A) IFN-γ profiilin seerumissa CT26 on kasvain hiirillä 1 ja 7 päivän kuluttua RFA hoitoa. *

P

0,02, huijausta vastaan ​​RFA. (B) edustaja mikrovalokuvia immuno- endogeenisen CD8

+ T-solujen ja kvantifiointi CD8

+ T-solujen infiltraatiota kasvainkudossektioista 7 päivää sen jälkeen, kun valeleikkaus tai RFA. Mittakaava, 100 pm. (C)

Vasen paneeli

, kvantifiointi cross- kasvaimissa 7 päivän hoidon virtaussytometrialla; CD8

+ T-solujen (CD3

+ CD8

+), CD4

+ T-solujen (CD3

+ CD4

+), säätelijä-T-solujen (CD3

+ CD4

+ Foxp3

+ CD25

+ T

reg), myeloidinen johdettuja vaimennin solujen (CD11

+ Gr-1

+ F4 /80

-); M1 (CD11

+ Gr-1

-F4 /80

+ CD206

loMHCII

hi) ja M2 (CD11

+ Gr-1

-F4 /80

+ CD206

hiMHCII

lo) makrofageja. Tiedot ovat 10

3 yhteensä solujen kasvain yksilöitä.

Oikea paneeli

, suhde CD8

+ T-soluja (T

eff, L-selektiini

alhainen CD44

hi): T

reg kasvaimissa määritettiin flow cytometry. (D)

Vasen paneeli

, kvantifiointi yhteensä leukosyyttien pernassa kasvain hiirillä 7 päivää lähettää RFA hoidon virtaussytometrialla.

Oikea paneeli

, suhde CD8

+ T-soluja (T

eff, L-selektiini

alhainen CD44

hi): T

reg pernassa. Data (B-D) edustavat ≥ 2 itsenäisen kokeen (

n

= 3-5 hiirtä ryhmää kohti); kasvaimen määrä vaihteli välillä 1,100-1,700 mm

3) aikaan RFA hoitoon. *

P

0,05, huijausta vastaan ​​RFA; ns, ei ole merkittävä.

Nämä havainnot yhdessä näyttöä pitkän aikavälin kasvain ohjaus jälkeen yhdistetyn RFA ja leikkaus, sai meidät oletuksen, että tehostettu paikallinen kasvain ohjaus saattaa liittyä muutoksia osuus kasvaimensisäisenä T-solujen osajoukot, jota ei ole aiemmin tutkittu seuraavasti RFA. Prekliinisissä tutkimuksissa kaneilla on raportoitu lisääntynyt kasvaimensisäisenä tunkeutuminen CD3

+ T-solujen käsiteltyjen leesioiden jälkeen RFA vaikka CD4

+ tai CD8

+ T-solujen alaryhmiä ei tutkittu [14, 27]. Kliiniset tutkimukset ovat lisäksi osoittaneet lisääntymiseen verenkierrossa kasvain-CD4

+ ja CD8

+ T-solujen maksasolukarsinoomassa potilaalla (HCC) 4 viikon kuluttua RFA hoito [15]. Kääntäen, RFA kuulemma aiheuttaa lasku verenkierrossa CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ immunosuppressiivisia säätelijä-T-solujen (T

reg) jälkeen 30 vuorokautta hoidon keuhkosyöpäpotilaita joka on huomionarvoista, sillä T

reg torjumiseksi funktio sytotoksisten CD8

+ T-soluja [6, 28]. Lisäksi korkea verenkierrossa ehkäisevien immuunisolujen lukien T

reg tai luuytimen johdettujen vaimennin soluja (MDSC) on äskettäin osoitettu olevan prognostisia kasvaimen uusiutumisen jälkeen RFA ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilasta ja HCC potilaille [29, 30]. Kuitenkin Näiden tulosten vaikutuksia ovat pysyneet epäselvä, koska vaihtelut kiertävän immuunisolujen eivät välttämättä heijasta niiden taso kasvaimensisäisenä lokalisoinnin jälkeen RFA.

Voit selvittää ennalta resectional RFA vaikuttaa kasvaimensisäisenä tunkeutuminen erityisiä immuunijärjestelmän solualaryhmiä aikaan kirurgisen poiston, me määrällisesti CD8

+ T-solut 7 päivää sen jälkeen, kun ablaatio resektoidun CT26 kasvaimet sekä pernassa esimerkkinä reuna-imujärjestelmäelinten, joka on paikalla immuunijärjestelmän aktivointi. Immunohistokemiallista analyysiä oli minimaaliset lähtötilanteessa kasvaimensisäisenä tunkeutuminen endogeeninen CD8

+ T-solujen valekäsiteltiin hiirissä (kuvio 3B), linjassa raportit ryhmämme ja muut, jotka CT26 kasvaimia ei salliva voimakkaalle T-solujen kerääntyminen [21, 22 , 31]. Kuitenkin merkittävä kasvu kasvaimensisäisenä CD8

+ T-solujen tunkeutuminen havaittiin jälkeen RFA hoidon verrattuna laparotomiakontrolleihin (kuvio 3B). Virtaussytometria-analyysi osoitti myös, että tunkeutumisen CD8

+ T-solujen suhteen koko kasvaimeen solupopulaation parani merkittävästi 7 päivää sen jälkeen, RFA ottaa huomioon, että suhteellinen tiheys yhteensä CD4

+ T-solujen tai CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ T

reg alaryhmä pysyi ennallaan (kuvio 3C).

tutkittiin vaikutusta RFA CD8-

+ T-solu: t

reg suhdeluvut sisällä kasvaimen koska tämä on tiettävästi vahva prognostinen indikaattori myönteisen tuloksen metastaattisessa kolorektaalisyövässä [32]. RFA todettiin lisäävän yleistä suhdetta CD8

+ efektori (L-selektiinin

alhainen CD44

hi) T-solujen: T

reg sisällä RFA käsitellyt tuumorit (kuvio 3C). Merkittävä kasvu CD8

+ T-solu: Treg suhde havaittiin myös pernassa 7 päivää post-RFA (kuvio 3D); kuitenkin, tämä suotuisampi suhde oli seurausta kokonaismäärän vähentymiseen osuus T

reg sisällä pernan osaston sijaan kasvua CD8

+ T-solujen kuten havaittiin kasvaimen mikroympäristössä (kuvio 3C). Vähentynyt T

reg pernassa saattaa heijastaa alennettu kasvaintaakkaa joka aiheutuu Ablaatiohoitoa. Suhteellinen tiheys myeloidisolujen ilmentävien fenotyyppisiä markkereita CD11

+ Gr1

+ MDSC, CD11

+ Gr-1

-F4 /80

+ CD206

loMHCII

hi M1 makrofagien tai CD11

+ Gr-1

-F4 /80

+ CD206

hiMHCII

lo M2 makrofagit subsets oli muuttumattomana RFA hoitoon joko kasvaimia tai pernan. (Kuvio 3C ja 3D). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että RFA-aikaan muutoksia immuunijärjestelmän contexture suosimalla Th1 /CD8

+ T-solujen aktivaation sisällä kasvaimen mikroympäris- ja oheislaitteiden imukudoselinten parantavan paikallisia ja systeemisiä kasvaimen ohjaus jälkeen kirurgisen resektion.

antigeeni-riippuvaista laajennus CD8

+ T-solujen esiintyy kasvaimen tyhjennys imusolmukkeiden ja kasvaimen mikroympäris- ennalta resectional RFA

perusteltu, että lisäys CD8

+ T-soluja havaittu kasvaimia, kun RFA voisi johtaa sukupolven antigeenispesifisen adaptiivisen immuunivasteen, kuten on raportoitu aiemmin [11, 14, 15], tai vaihtoehtoisesti kasvu ei-antigeenin rajoitettu lokalisointi johtuen akuutin tulehduksen, että ensues jälkeen katastrofaalinen solukuoleman aiheuttama terminen ablaatio. Erottamaan näitä mahdollisuuksia, istutettiin s.c. hiiren CT26 paksusuolen adenokarsinooma muokattu ilmentämään korvike kasvaimeen liittyvän antigeenin, hemagglutiniini (CT26-HA), jotta voimme seurata kasvaimeen antigeeniä (HA) spesifisen CD8

+ T-soluvasteen. Toinen ryhmä hiiriä istutettiin vanhempien CT26 kasvainlinjaan puuttuu HA-antigeenin. *

P

0,001; *

P

0,001;