Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Syöpä kantasolut (CSCS) on tärkeä rooli kasvaimen aloittamista etenemisen ja etäpesäkkeiden ja vastaavat korkeat hoidon epäonnistumisen hinnat. Tunnistamiseen ja CSC ovat ratkaisevia valvonta helpottuisi, terapia, tai syövän ehkäisemiseen. Suuria ponnisteluja on maksettu kehittämään tehokkaampia menetelmiä. Kuitenkin ihanteellinen malli CSC tutkimus on vielä kesken. Tässä tutkimuksessa, loimme takertumattomana viljelyjärjestelmästä rikastuttaa CSCS ihmisen suun okasolusyöpä solulinjoissa pallo muodostumista ja kuvailla niiden CSC ominaisuuksia entisestään.

Methods

takertumattomana viljelysysteemin suunniteltu tuottamaan pallojen SAS ja OECM-1 solulinjoissa. Myöhempi tutkimus niiden CSC ominaisuuksista, kuten stemness, itseuudistumiseen, ja kemo- ja radioresistance

in vitro

sekä kasvaimen aloittamista kapasiteetti

in vivo

, suoritettiin myös.

tulokset

Kuulat muodostettiin kustannustehokkaasti ja aikaa tehokkaasti sisällä 5-7 päivää. Lisäksi olemme osoittaneet, että näillä aloilla ilmaisi otaksuttu kantasolujen merkkiaineita ja näytteillä chemoradiotherapeutic vastus, lisäksi kasvaimeen aloittamista ja itseuudistumisen ominaisuuksia.

Johtopäätökset

Tällä takertumattomana kulttuuri, meidän onnistuneesti perustettiin nopean ja kustannustehokkaan mallin, jolla on ominaisuuksia CSCS ja voidaan käyttää syöpätutkimuksessa.

Citation: Chen SF, Chang YC, Nieh S, Liu CL, Yang CY, Lin YS (2012) takertumattomana Culture -järjestelmään Rapid Sphere Formation syöpä Stem Cell Properties. PLoS ONE 7 (2): e31864. doi: 10,1371 /journal.pone.0031864

Editor: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu 15 joulukuuta 2011; Hyväksytty: 14 tammikuu 2012; Julkaistu: 16 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus osittain tukee Tri-Service General Hospital ja maanpuolustus Medical Centre: Grant No. TSGH-C100-007-009-10-S02, TSGH-C100-161, TSGH-C100-155 ja I-29; Department of Dental Hygiene, Kiina Medical University: Grant No. CMU99-N1-04-1; National Science Council, Kiina (Taiwan): Grants No. NSC 99-2320-B-039-028-MY3 ja NSC 100-2320-B-016-009; Department of Health, Executive Yuan, Kiina (Taiwan): DOH100-TD-PB-111-TM007-22. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Suun levyepiteelisyöpä (OSCC) on yksi yleisimmistä ja tappava pään ja kaulan pahanlaatuisia kasvaimia Taiwanissa ja maailmanlaajuisesti [1], [2]. OSCC on sairaus, joka on vaikea käsitellä, koska erilaisia ​​hoidon strategioita ja vaihteleva luonnollinen käyttäytyminen syöpä. Paikallinen hyökkäys ja usein alueellisia imusolmukemetastaaseja yhdessä suhteessa vastustuskyky kemoterapeuttisia lääkkeitä, johtaa arvaamaton tulos [2] – [4]. Huolimatta lisääntynyt kokemus kirurginen tekniikka ja adjuvantti hoitoja, yleinen ennusteet OSCC pysyvät rakentamatonta, jolloin pikaisesti uusi strategia OSCC hoitoon [3], [5].

Huomattava todisteita viimeaikaisista tutkimuksista osoittavat että kiinteiden kasvainten sisältävät alapopulaatio syövän kantasoluja (CSCS) [6] – [8]. On tunnettua, että CSCS tärkeä rooli kasvainten aloittamista, etenemistä, etäpesäkkeitä, ja terapeuttinen vastus [9] – [11]. Kuitenkin otaksuttu CSCS alkaen OSCC ei ole hyvin tunnettu. On arveltu, että CSCS hallussaan useita ominaisuuksia, jotka tekevät niistä vastustuskykyisiä tavanomaisen kemo- ja sädehoidon, kuten korkea ilmentymä lääkkeiden kantaja, suhteellinen solukierron liikkumattomuus, korkea toiminta DNA kuntoutuskoneet, ja kestävyys apoptoosin [12], [13] . Tunnistaminen ja luonnehdinta CSCS peräisin OSCC ovat ratkaisevia valvonta helpottuisi, hoidon ja taudin ehkäisyyn.

Eristäminen CSCS syöpäsoluista on saavutettu onnistuneesti kautta käyttämällä erilaisia ​​tekniikoita. Eristäminen CSCS suoritetaan käyttäen virtaussytometriaa, joka perustuu spesifisten solun pinnan merkkiaineiden, kuten CD133, CD44 ja ALDH1, jonka CSCS [14] – [20]. Koska terapeuttinen vastus CSCS, lajittelu puolella populaatiot syöpäsolujen kautta solunsisäisten Hoechst 33342 syrjäytymistä tai valitsemalla kemoterapeuttisen-lääkkeille vastustuskykyisiä soluja on käytetty myös tunnistamiseen ja luonnehdintaan CSCS [21] – [23]. Samanaikainen tutkimukset vahvistivat, että alalla kulttuurin järjestelmä on yhtä tehokas erottamaan CSCS monista kiinteitä kasvaimia tai syöpäsolujen linjat. Nämä tutkimukset ovat osoittaneet, että CSCS voidaan rikastaa aloilla silloin, kun nämä ovat viljellään seerumittomassa väliaineessa, johon oli lisätty riittävästi mitogeenien, kuten emäksinen fibroblastikasvutekijä (bFGF) ja epidermaalinen kasvutekijä (EGF) [11], [24] – [26]. Kuitenkin johtaminen CSCS kiinteiden kasvaimien ja syöpäsolulinjoja viljeltiin seerumittomassa väliaineessa, johon oli lisätty bFGF: n ja EGF on aikaa vievä prosessi, ja 2-6 viikkoa tarvitaan alalla muodostumisen [11], [24] – [26 ]. Lisäksi valittu kasvutekijät, kuten verihiutaleperäinen kasvutekijä, bFGF, ja EGF, ovat kalliita ja tehottomia. Ratkaisemaan nämä ongelmat ja rajoitukset, käytimme tarkoitukseen suunnitelluissa takertumattomana alalla kulttuurin järjestelmä tunnistaa ja rikastuttaa CSCS vakiintuneista ihmisen OSCC solulinjat, ja luonnehtia niiden CSC ominaisuuksien edelleen käyttämällä fenotyyppisiä /genotyyppisiä luonnehdinta.

Tulokset

pallo muodostuminen ihmisen OSCC solulinjojen

OSCC solulinjoja (SAS ja OECM-1) oli varovasti hajotettiin yksittäisiksi soluiksi ja ympättiin viljelmään muovia tavarat, jossa takertumattomana pinnoite, kuten on esitetty kuviossa 1. osa suspension solut voivat läpikäydä apoptoosin aikana 2 vrk: kun viljelty takertumattomana keskeytettiin ympäristö. Jotkut keskeytyneet soluja yhteen ja sitten yhdistettiin ja eriytetty kolmiulotteisiksi (3D) kuulia sferoidin kokoonpano. Myöhempi morfologinen muutos (~3-5 päivää) koostui kelluvia palloja. 5-7 päivän viljelyn aloilla pyöreä ja sileä ääriviivat havaittiin. Nämä pallot kasvoi vähitellen ajan myötä (kuvio 1A). Morfologisesti, pallot ilmestyi tiukemmin kiinnittynyt, klustereiden tai päällekkäisiä 3D-kokoonpanon, verrattuna havaittiin emosoluilta. Eräs edellinen tutkimus ehdotti, että johtaminen pallojen syöpään solulinjoja tai primääriviljelmässä soluja voidaan liittää muuttamista fenotyyppisten /genotyypin ominaisuudet, kuten epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) [27]. Edustaja EMT markkereita E-kadheriinin ja fibronektiiniä valittiin tunnistamaan, ja vertailla eroja, emosoluilta ja palloista OECM-1 ja SAS soluja. Mikroskooppinen tarkastelu immunohistokemialli- värjättyä vanhempien soluja ja pallojen osoitti läsnäolon yleistynyt ja hajanainen ilmentyminen E-kadheriinin ja harva ilmentymistä fibronektiinin vanhempien soluissa, kun taas aloilla näytteillä menetys ilmentyminen E-kadheriinin ja yli-ilmentyminen fibronektiiniä (kuvio 1 B).

(A) Phase-kontrasti pikuvat pallojen viljeltiin SAS (ylhäällä) ja OECM-1 (alhaalla) solulinjoissa käyttäen takertumattomana suunnittelu (neljä vasemmanpuoleisimman ylempään ja alempaan paneeliin: päivästä 0 päivään 7, suurennus , 200 x ja oikeanpuoleisin ylempi alempi paneelit: päivä 10, suurennus, 100 x). (B) immunohistokemia tulokset osoittavat monipuolista ilmaisua malleja edustavista epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) merkkiaineiden OECM1 vanhempien soluissa ja aloilla (suurennus, 200 x).

Expression oletettujen kantasolujen solunpintamarkkereiden

Valaistaan ​​onko aloilla voisi rikastuttaa soluja, jotka ilmentävät otaksuttu syövän kantasolujen markkereita, päätimme analysoida ilmaisun profiilin kahden edustavan kantasolujen pinnan markkereita OSCC, CD133 ja ALDH1 [11], [14] – [18]. Kuten kuviossa 2A ja B, emosoluilta ja pallojen (7 vuorokauden takertumattomana kulttuuri) positiivisesti värjättiin CD133 ja ALDH1. Expression of CD133 ja ALDH1 oli yleensä poissa tai hyvin alhainen vanhempien soluissa. Olemme havainneet 3-4% kasvu CD133 ilmaisun ja 20-30%: n lisäys ALDH1 ilmaisun aloilla verrattuna vanhempien soluihin. Tasot ilmentymisen CD133 ja ALDH1 olivat merkittävästi korkeammat aloilla kuin ne olivat emosoluista (kuvio 2C).

(A) Vanhempien solut ja palloset joko värjättiin negatiivisesti kontrolli-IgG-vasta-ainetta (avoimet space) tai anti-CD133 kokeellinen aineet (kiinteä tila). (B) Vertailu ilmentymisen ALDH1 emo solujen ja aloilla; DEAB, estäjä ALDH1, käytettiin negatiivisena kontrollina. (C) määrällinen ja tilastollisessa vertailussa prosenttiosuuden positiivisten signaalien CD133 ja ALDH1 emo solujen ja aloilla (*

P

0,05).

ilmentyminen syövän kantasoluja geenejä ja liittyvät proteiinit

ilmentymistä kantasolujen geenien ja siihen liittyvät proteiinit, kuten

Sox2

,

Oct4

, ja

Nanog

, tarkastettiin transkription ja translaation tasolla. Kokonais-RNA puhdistettiin emosoluista ja pallojen jälkeen 7 päivää sekä takertumattomana kulttuuriin. Tasot Sox2, Oct4, ja Nanog selostukset lisättiin merkittävästi aloilla verrattuna vanhempien soluihin, kuten arvioitiin käyttäen käänteistranskriptio-PCR-analyysi (kuvio 3A). Western blotting tiedot osoittivat, että ilmentyminen Sox2, Oct4, ja Nanog proteiinit myös yläreguloituja aloilla verrattuna emo-soluja (kuvio 3B). Lisäksi käytimme immunofluoresenssivärjäyksen arvioida solun tason CD133, ALDH1, Sox2, Oct4, ja Nanog vuonna aloilla. Havaitsimme erilaisia ​​ekspressiomalleja näitä proteiineja, kuten kuviossa 3C, joka osoittaa, heterogeenisyys OSCC. CD133: ää ilmennettiin solukalvon ja ALDH1 ilmaistiin solukalvon ja solulimassa, kun taas Sox2, Oct4, ja Nanog ilmennettiin tumassa.

(A) RT-PCR-analyysi osoitti, että ekspressio

Sox2, Oct4, ja Nanog

geenien yläreguloituja aloilla verrattuna vanhempien soluihin. (B) Western-blottaus-analyysi osoitti, että ekspressio Sox2, Oct4, ja Nanog on yliaktiivista aloilla verrattuna vanhempien soluja. (C) Immunofluoresenssianalyysi CSC merkkiaineiden aloilla osoitti läsnä CSCS vaihteleva ekspressiotasot CD133, ALDH1, Sox2, Oct4, ja Nanog, kuten nuolilla (suurennus 200 x).

Radio- ja kemosensitiivisyys

arvioimiseksi radioherkkyyttä että vanhempien solujen ja palloja, käsittelimme nämä solut ja pallojen kanssa säteilyannokset jopa 10 Gy arvioida solujen elinkelpoisuus, joka mitattiin käyttämällä MTS määritystä jälkeen 36 h säteilyllä. Kuulat olivat säteilyresistenteille kuin vanhempien soluja (kuvio 4A). Tutkimme myös kemosensitiivisyys että vanhempien solujen ja pallojen avulla sisplatiinia. Emosoluista ja palloja käsiteltiin sisplatiinin kanssa 48 tuntia ja solujen elinkyky mitattiin myöhemmin käyttämällä MTS-määritys (kuvio 4B). Spheres olivat vastustuskykyisempiä sisplatiinia kuin vanhempien soluja. Jäljitellä kliininen tila, me annetaan yhdistetty kemo- ja sädehoidon (CCRT) käsittely, jossa (1) alkuperäisen kemoterapia koostuu 20 uM sisplatiinia 24 h, mitä seurasi säteilyä (kuvio 4C) tai (2) alkuperäisen säteilyn jälkeen kemoterapiaa käyttämällä 20 uM sisplatiinia 24 h (kuvio 4D). Tulokset hoitoon käytetään näiden kahden CCRT hoito paljasti, että yhdistelmät olivat tehokkaita vähentämään eloonjäämisaste emosoluista ja aloilla kuin yhden hoitoon joko säteilyn tai kemoterapian. Lisäksi aloilla oli vastustuskykyisempi kuin vanhempien soluja (vaihteleva merkitys tasoa), kun käytetään yhdistettyä hoitoa.

Merkittävät erot (A) säteilyherkkyyttä ja (B) kemosensitiivisyys havaittiin emo solujen ja aloilla. (C) Yhdistetty kemo- ja sädehoidon (CCRT) alkuvaiheen kemoterapiaa 24 tuntia sen jälkeen säteily. (D) CCRT alkuvaiheen säteilyn jälkeen kemoterapiaa 24 tuntia. Kaksi CCRT hoito olivat tehokkaampia vähentämään eloonjäämisaste vanhempien solujen ja aloilla verrattuna kertahoitona joko säteilyllä tai kemoterapiaa (*

P

0,05).

in vivo

tuumorigeenisyystesti

vahvista rikastetun kasvainta aloittamista ominaisuuksia pallojen

in vivo

, sekä vanhempien solut ja palloja injektoitiin paljaisiin hiiriin, analysointiin siirrettyjen kasvainten muodostumiseen. Kuulat, jotka ovat peräisin SAS solujen aiheutti kasvaimia 1 x 10

5-soluja injektoidaan hiiriin (kaksi kolmesta hiirestä), ja pallojen johdettu OECM-11-soluja syntyy kasvaimia, kun vain 1 x 10

4 solut injektoitiin hiiriin (yksi kolmesta hiirestä). Sen sijaan, 1 x 10

6 vanhempien soluja tarvitaan tuottamaan kasvaimia, mikä viittaa siihen, että palloset rikastettu kasvaimen aloittamiseksi solut vähintään 10 100-kertainen verrattuna emo-solut (taulukko 1). Vertaileva analyysi brutto ulkonäkö välisen kasvainten vasta syntyvät vanhempien soluista ja pallojen paljasti merkittäviä eroja koossa ja ääriviivat. Spheres tuotti kasvaimet paljon suurempi kooltaan epäsäännöllinen, laajenevaa ääriviivat verrattuna kasvaimia tuottaman vanhempien soluja (kuvio 5A). Vertaileva analyysi vastaavien histologisia ja immunohistokemiallinen tulokset edustaja EMT markkereita osoitti, että kasvaimia peräisin aloilla näytti olevan aggressiivisempia ja on mesenkymaalisten ulkonäön ja näkyvästi strooman invaasio verrattuna kasvaimia peräisin vanhempien soluista. Havaitsimme epätasainen ilmentyminen E-kadheriinin kasvaimissa peräisin vanhempien soluista ja menetys E-kadheriinin ilmentyminen kasvaimissa johdettu aloilla. Oli selvä yliekspressio fibronektiinin kasvaimia, jotka ovat peräisin aloilla verrattuna kasvaimia, jotka ovat peräisin emosoluista (kuvio 5B). Ensisijainen viljelmiä valmistettu resektio kasvainten aiheuttamien palloja NOD /SCID-hiirissä osoittivat vähittäisen muutosta ensimmäisen ja toisen pallo muodostumista, mikä viittaa siihen, että pallot on voimakas kyky itseuudistumisen (kuvio 5C).

( a) Gross ulkonäkö edustavan kasvaimen muodostettu siirrostamalla vanhempien solujen ja liukenevat palloja osaksi NOD /SCID-hiirten (n = 3 kussakin ryhmässä). (B) Vastaavat histologisia havainnot ja immunohistokemiallinen tulokset edustaja EMT merkkiaineiden NOD /SCID-hiirissä (suurennus, 100 x). (C) primaariviljelmä erottaa soluja OECM-1 aiheuttama pallojen alunperin eristettiin NOD /SCID osoittivat vähittäisen muutoksen ensisijaisen (1

st) ja toisen (2

ND) aloilla (suurennus, 100 × ).

keskustelu

käsite CSCS ja niiden sovellukset on raportoitu viime vuosikymmeninä. Termi ”syöpä kantasolu” määriteltiin vuonna 2006 American Association for Cancer Research Workshop syöväntutkimuslaitos Kantasolut soluksi sisällä kasvain, joka on hallussaan kyky itse uudistaa ja tuottaa heterogeeninen suvusta syöpäsolut muodostavat kasvain [6]. Katsaus kirjallisuuteen osoitti, että CSCS ensin eristettiin Bonnet ja Dijk akuutti myelooinen leukemia, ja Al Hajj oli ensimmäinen tunnistaa ne kiinteissä kasvaimissa [28], [29]. Tähän mennessä CSCS on tunnistettu monia kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien aivot, rinta-, keuhko-, eturauhas-, ja paksusuolen syövissä [24], [25], [30] – [33] kantavassa CSC teoria selvennetään paitsi kysymys kasvaimen aloittamista, kehitys, etäpesäke, ja uusiutuminen, mutta myös tehottomuudesta tavanomaisten syövän hoitomuotoja. Nykytiedon mukaan, aloittamisen, toistumisen, ja etäpesäke syöpien voidaan selittää ainakin osittain läsnäolo CSCS [6] – [8], [34]. Näin ollen kehittää luotettava malli CSCS tulee ratkaiseva perus- ja syövän kliininen tutkimus.

Useita tekniikoita on käytetty eristämään CSCS syövistä (taulukko 2 ja kuvio S1). Aluksi kun spesifinen pinta markkereita CD34 ja CD38 oli validoitu laajasti tunnistamisessa normaalien Veren kantasolut, näiden molekyylien käytettiin markkereita alkuperäisessä tutkimuksessa leukemia kantasolujen [28]. Myöhemmin CD24 ja CD44 valittiin CSC merkkiaineiden rintojen kasvaimia [29]. Kuitenkin, tällä hetkellä ei ole selvää konsensus siitä, ”paras markkeri (t)”, jota käytetään tunnistamiseen CSCS tahansa erityisesti syöpä. On olemassa joitakin raportteja osoittivat, että CD44 on selektiivinen markkeri CSCS peräisin HNSCC [19], [20]. Kuitenkin meidän tiedot osoittivat, että CD24 ja CD44 olivat täysin läsnä sekä vanhempien soluissa ja aloilla (jopa 20-40%) (Kuva S2). Valitsimme kaksi muuta edustavaa kantasolujen pinnalla markkereita OSCC, CD133 ja ALDH1, havaitsemaan ilmaisu profiilia sekä vanhempien solujen ja aloilla [11], [14] – [18]. Ilmentyminen CD133 ja ALDH1 oli yleensä poissa tai hyvin alhainen vanhempien soluissa verrattuna korkeampi CD133 (3-4%) ja ALDH1 (20-30%) ilmaisun aloilla. Vaikka ilmaus CD133 ja ALDH1 oli merkitsevästi korkeampi aloilla kuin vanhempien soluissa, CD133 ja ALDH1 olivat suhteellisen riittävä CSC merkkiaineiden OSCC, mutta eivät sopineet eristämiseksi CSCS päässä syövän asianmukainen, koska kasvain heterogeenisyys ja arvaamaton toistettavuus (kuva S1A). Tunnistaminen erityisiä pintamerkkiaine (t) tunnistamiseksi CSCS ja terapeuttisten kohteiden edelleen haaste. Lajittelu puolella populaatiot syöpäsolujen kautta solunsisäisten Hoechst 33342 syrjäytymistä ja /tai valitsemalla kemoterapeuttisen-lääkkeille vastustuskykyisiä soluja on käytetty myös tunnistamiseen ja luonnehdintaan CSCS [21] – [23], [31]. Kuitenkin menetelmä lajittelu puolella populaatioiden kautta Hoechst 33342 syrjäytymisen tuotti vain pienen määrän CSCS (0,23-22,3%), joka ei riitä lisäkokeita [21], [22], [31]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että CSC valinta kautta eristäminen kemoterapeuttisen lääkkeille resistentit solut voivat tarjota rajoitetun määrän CSCS (20-40%); kuitenkin, tuotannon suurempia määriä CSCS oli kallista ja aikaa vievää (kuvio S1B) [17]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat myös ehdottaneet, että CSCS voidaan rikastaa aloilla silloin, kun niitä viljeltiin seerumittomassa elatusaineessa, jota oli täydennetty riittävän kasvutekijät [11], [24] – [26]. Tuotannon CSCS peräisin OSCC soluja viljeltiin seerumittomassa elatusaineessa, jota oli täydennetty bFGF ja EGF oli pitkä, aikaa vievää ja kustannuksia tehoton menettely alalla muodostumisen [11], kuten on esitetty ylempi Kuva S1C.

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että monen tyyppisiä soluja on kuvattu muodostamista koskevasta 3D-pallosia, kun viljeltiin suspensiossa tai takertumattomana ympäristössä [35], [36]. 3D-pallosia käytetään laajasti tutkimuksen malleina syövän etäpesäkkeiden ja invaasio ja terapeuttiseen seulonta; kuitenkin parhaan tietomme, mikään niistä mainituista ominaisuuksista CSCS [36] – [39]. Nykyisessä tutkimuksessa olemme ensin mallia nopea ja riittävän pallo muodostuminen ihmisen OSCC solulinjoista. Perustuu takertumattomana viljelyjärjestelmässä, tämä malli oli aika tehokasta, koska pallot muodostettiin sisällä 5-7 päivää (kuvio 1A). Lisäksi tämä muutettu takertumattomana kulttuuri järjestelmä on kustannustehokas eikä vaadi kasvutekijöitä edellisestä alalla kulttuurin järjestelmä. Se ei voi vain onnistuneesti rikastuttaa alalla muodostumista OSCC solulinjojen (SAS, OECM-1, Cal27, SCC25, ja Ca922), mutta tuottaa myös pallojen syöpäsolulinjasta muista osista pään ja kaulan (Fadu ja TW205), alkaen paksusuolen (HT29 ja Colo320), ja keuhkojen (NCI-H23 ja NCI-H661) (tuloksia ei ole esitetty). Tietyt näyttöä siitä, että pallo muodostumista pääsee 10-15 päivän seerumia täydennetty kasvutekijöillä [30], [40]. Nämä pallot ovat morfologisesti todennäköisemmin aggregaatteja rypäleen kaltaisia ​​elimiä epäsäännöllinen ääriviivat, eikä oikeastaan ​​aloilla, kuten ne nähdään tutkimuksessamme (taulukko 2 ja kuva S1). Meidän takertumattomana kulttuuri järjestelmä, pallot ilmestyi tiukemmin kiinnittynyt, pallomainen, pyöreä, ja sileä ääriviivat. Lisäksi ilmaisemaan edustavia syövän kantasolujen geenejä ja niihin liittyviä proteiineja, kuten

Sox2

,

Oct4

, ja

Nanog

oli yläreguloituja aloilla verrattuna havaitaan vanhempien solut, sekä RNA ja proteiini tasoilla (kuviot 3A ja B). Käyttäen immunofluoresenssianalyysillä, olemme osoittaneet, että aloilla esiintyy nimenomaisen histologinen heterogeenisyys sekä CSC ominaisuudet (kuvio 3C). Todisteet parempi terapeuttinen vastarinnan CSCS, joka on toinen tärkeä ominaisuus näiden solujen, on raportoitu. Ilmiö toistuu moniin syöpiin jälkeen kemo- tai sädehoitoa voi johtua eloonjäämistä ja ylläpito CSCS. Tutkimuksessamme osoitimme, että pallot olivat radio- ja solunsalpaajaresistentti verrattuna vanhempien soluja (kuvio 4A ja B). Koska eri alkuperää ja ominaisuudet SAS ja OECM-1-soluissa, oli erilainen hoitotuloksen näiden kahden tyyppisiä soluja. SAS solut olivat herkempiä kemoterapiaa, mutta kestävät paremmin säteilyä; sen sijaan, OECM-1-solut olivat herkempiä säteilylle, mutta kestävät paremmin kemoterapiaa. CCRT oli tehokkaampi vähentämään eloonjäämisaste sekä vanhempien solujen ja aloilla verrattuna yhden hoidon joko säteilyllä tai kemoterapiaa. Kuitenkin, pallot olivat vielä vastustuskykyisempiä kuin vanhempien soluja käytettäessä yhdistettyä hoitoa. Käyttämällä tätä takertumattomana kulttuurin järjestelmä voi tarjota uutta tietoa ja uutta mallia CSCS joka on sovellettavissa terapeuttista tutkimusta. Ksenotransplantaatio tutkimukset voivat myös auttaa tunnistamaan ja vahvistamaan peräkkäin tuumorigeenisen valmiudet takertumattomana viljelyjärjestelmiä. Inokulointi sekä vanhempien solujen ja pallojen NOD-SCID-hiirissä tuotettu uusi kasvain (t) 7 päivää istutuksen jälkeen ja johti kasvaimen kokoa ajan. Vertaileva analyysi osoitti, että pallo syntyvän kasvaimia esiintyi paljon suurempi kooltaan epäsäännöllinen, laajenevaa ääriviivat verrattuna syntyvät vanhempien soluja (kuvio 5A). Perustuen primaariviljelmää liuenneen solujen pallo syntyvän kasvaimia, jotka on käsitelty käyttäen samoja protokollia, ensisijainen ja toissijainen aloilla syntyi onnistuneesti, mikä osoittaa niiden kykyä itseuudistumisen (kuvio 5C). Mielenkiintoista on, että vastaava histologisia ja immunohistokemiallinen tulokset osoittivat, että kasvaimia, jotka ovat peräisin aloilla esillä menetys E-kadheriinin ja säätelyä fibronektiinin, näytti olevan aggressiivisia, ja oli mesenkymaaliset ulkonäkö verrattuna kasvaimia, jotka ovat peräisin emosoluista (kuvio 5B) .

Kuten aiemmin mainittiin, rikastettua pallojen viljeltiin OSCC solulinjoista kautta takertumattomana kulttuuri järjestelmä voi aluksi tulla keskeyttää ja irrottaa vanhempien soluista, ja muodostavat pieniä klustereita. Tällaisia ​​aloja kasvatetaan takertumattomana kunnossa myöhemmin aineilla vähensi solu-solu tai solu-matriisi vuorovaikutuksia, menettävät ankkurointi, ja tuli kodittomia. Tämä laukaisee ilmiötä kutsutaan ”anoikis” oletettavasti johtaen apoptoottisen vasteen [41]. Kelluvat pallot tilassa anoikis kasvualustaan ​​eristetään ja, vaikka he yrittävät noudattaa, eivät pysty kiinnittymään taustalla tai ympäröivään levyyn, joiden odotetaan kadota lopulta. Kuinka nämä syöpäsolut hengissä ja lisääntyä voittaa uhkaa anoikis? Mikä mekanismi osallistuu hankintaan eloonjääntisignaaleja jotka tarjoavat mahdollisuuden selviytyä ja lisääntyä kelluva kasvain väestö, josta puuttuu normaali kiinteän faasin rakennustelineet, joka muodostaa kyseenalaiseksi microenvironment? Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että vastoinkäymiset täyttää pallojen takertumattomana, keskeyttää ehto voidaan stimuloida EMT ja kannustaa myös ilmoittautuminen potentiaalin CSC ominaisuuksista [42], [43]. Kirjallisuudessa paljastaa myös, että jotkut signalointireittejä välittäjänä EMT ja CSC ominaisuuksia, kuten WNT, Sonic Hedgehog, Snail /Slug, ja NOTCH [44] – [46]. On yhä enemmän näyttöä siitä, että välillä on yhteys EMT ja CSCS, johon solun muotoon muuttamisen ja liikkuvuuteen. Nämä käsitteet miksi meidän takertumattomana kulttuuri järjestelmää voidaan rikastaa CSCS syöpään solulinjoista.

Yhteenvetona käyttäen muunneltua takertumattomana viljelyjärjestelmästä ja myöhemmin koesarjan, emme ainoastaan ​​validoitu CSC ominaisuuksia pallojen eristetty OSCC solulinjoista, mutta myös onnistunut nopea ja taloudellinen menetelmä, joka voi tarjota uusia oivalluksia ja hiljattain sovellettavissa malli CSC tutkimukseen.

Materiaalit ja menetelmät

Solut

ihmisen kielen syövän solulinja SAS, saatu japanilaisen Collection, viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa, kun läsnä oli 5% CO

2. Ihmisen ikenen levyepiteelikarsinoomasolu mukaisesti p53 missens OECM-1, viljeltiin RPMI1640 täydennettynä 10% FBS: ää 37 ° C: ssa kun läsnä oli 5% CO

2. Nämä kaksi vakiintunutta solulinjat ystävällisesti Dr. Yi-Shing Shieh osastolta Oral Diagnosis ja patologia, Tri-Service General Hospital, Taipei, Taiwan [47].

Sphere kulttuuri

kaksi solulinjoja viljeltiin kulttuuri muovi tavarat kanssa takertumattomana pintaan. 10 cm malja on valmistettu takertumattomana soluille päällystämällä agaroosilla ohutkalvojen. Solut maljattiin tiheydellä 5 x 10

4 elävää solua /10 cm malja, ja viljelyalusta vaihdettiin joka toinen päivä, kunnes pallo muodostumista.

immunohistokemia

Kudosleikkeet tai selliosasto poistui-vahattu ksyleenissä ja niihin lisätään alkoholiin. Antigeeni haku suoritettiin inkuboimalla 10 mM sitraattipuskurilla (pH 6,0) 95 ° C: ssa 40 min. Endogeeninen peroksidaasi salvattiin 0,3% vetyperoksidia 10 minuuttia, sitten inkuboitiin 5% normaalia hevosen seerumia fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa estää ei-spesifinen vasta-aine reaktiossa. Pesun jälkeen Tris-puskuroidulla suolaliuoksella plus 0,1% Tween 20: tä (TBST), laseja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden, E-kadheriinin (sc-8426, 1:800) ja fibronetin (sc-18825; 1: 500) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA. USA). Sen jälkeen, kun huuhdellaan TBST: ssä, laseja inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen ja sen jälkeen streptavidiini-biotinyloitu-entsyymin kompleksi (streptABComplexes kit; Dako, Glostrup, Tanska). Sen jälkeen ne värjättiin 0,003% 3,3-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla, vastavärjätään Mayerin hematoksyliinillä, kuivattu, ja asennettu.

Virtaussytometria

1 x 10

6 yksisoluisia jousitus alkaen trypsinoitiin soluista ja palloset vastasi 1 ml PBS: ssä ja värjättiin CD133 (klooni C24B9, 1:200) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ja aldehydidehydrogenaasin 1 (ALDH1) (ALDEFLUOR iinianalyysikitissä; StemCell Technologies, Durham, NC , USA). Leimauksen jälkeen solut pestiin PBS: llä kolme kertaa, ja sen jälkeen värjättiin FITC- tai PE-leimattua sekundaarista vasta-ainetta 30 minuutin ajan pimeässä. Solut analysoitiin virtaussytometrillä sen jälkeen, kun kolme pesua PBS: llä.

Käänteinen transkriptio-polymeraasi ketjureaktio (RT-PCR) B

Kokonais-RNA eristettiin TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, California , USA) ja kvantitoitiin spektrofotometrillä 260 nm: ssä. On GeneAmp® PCR System 9700 -PCR-(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 5 ug kutakin kokonais-RNA: ta käänteistranskriptio SuperScript III (Invitrogen) 55 ° C: ssa 1 tunnin kuluttua yhteensä komplementaarinen DNA, jota käytettiin templaattina myöhemmin PCR-reaktioiden ja analyysi. PCR-reaktiot mukana ensimmäisen denaturointi 94 ° C: ssa 5 minuuttia, jonka jälkeen 25 tai 30 sykliä 94 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, altistuminen sopivan hehkutus lämpötilassa (58-62 ° C) 30 sekunnin ajan, ja sitten lopullinen 72 ° C: ssa 45 sekunnin ajan. PCR-alukkeet analyysi mRNA olivat: glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), sense (5′-AGCCGCATCTTCTTTTGCGTC-3 ’) ja antisense (5′-TCATATTTGGCAGGTTTTTCT-3’);

Oct-4 sense (5′-CGCACCACTGGCATTGTCAT-3 ’) B

ja antisense (5′-TTCTCCTTGATGTCACGCAC-3′);

Nanog, sense (5′-AATACCTCAGCCTCCAGCAGATG-3 ’) B-

ja antisense (5′-CTGCGTCACACCATTGCTATTCT-3 ’);

Sox2, sense (5′-GGCAGCTACGCATGATGCAGGAGC-3′) B

ja antisense (5′-CTGGTCATGGAGTTGTACTGCACG-3 ’) . Amplified RT-PCR-tuotteet analysoitiin sitten 1% agaroosigeeleillä ja visualisoitiin käyttämällä etidiumbromidivärjäyksellä ja kamerajärjestelmän (Transilluminator /SPOT; Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, USA). Geelin kuvia RT-PCR-tuotteet suoraan skannattu (ONEDscan 1-D Gel Analysis Software; Scanalytic Inc. Fairfax, VA, USA), ja suhteelliset tiheydet saatiin määrittämällä suhde signaalin intensiteetin GAPDH-kaistalla. Geenin ilmentymisen välillä testin (syklosporiini A käsitelty) ja verrokkiryhmien verrattiin.

Western blotting

Koko solulysaatit erotettiin elektroforeesilla 12% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvo . Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa huoneen lämpötilassa 1 tunti. Ensisijainen vasta-aineita käytettiin: GAPDH (ab9482; 1:5000 laimennos) (Abcam, Cambridge, MA, USA), Oct-3/4 (sc-8630, 1:1000), Nanog (sc-81961; 1:1000) ja Sox2 (sc-17320; 1:500) (Santa Cruz Biotechnology) TBST-puskurissa, joka sisälsi 3% rasvatonta maitoa 4 ° C: ssa yön yli ja sen jälkeen anti-hiiri- ja anti-vuohi-sekundäärinen vasta-aine, joka oli konjugoitu peroksidaasiin (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology), 25 ° C: ssa 1 h. Immunoblottauksia kehitettiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin järjestelmä, ja luminesenssi tehtiin näkyväksi röntgenfilmille.

Immunofluoresenssikoe

elävät solut ja palloja kiinnitettiin 4% paraformaldehydi, läpäiseviksi 0,1% Triton X-100, ja blokattiin 5% normaalia vuohen serum- PBS. Soluja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla, Oct-3/4 (sc-8630, 1:200), Nanog (sc-81961,1:200), Sox2 (sc-17320; 1:500) (Santa Cruz Biotechnology), CD133 (klooni C24B9,1:200) (Cell Signaling Technology) ja ALDH1 (klooni 44, 1:200) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), pestiin kolme kertaa PBS: ssä, ja sen jälkeen inkuboitiin vuohen anti-hiiri tai sekundäärisiä vasta-aineita konjugoituna FITC: tä (vihreä) tai PE (punainen). DAPI käytettiin tumaväriä (sininen). Kuvat saatiin käyttäen fluoresenssimikroskopiaa ja digitaalikamera.

Kemosensitiivisyys ja radioherkkyyttä määritys

Solut kylvö 10 cm: n maljalla tiheydellä 1 x 10

6 solua /malja. Sillä kemosensitiivisyys määritystä soluja käsiteltiin 10-200 uM sisplatiinia (Sigma, St Louis, MO, USA) 48 tuntia. Sillä radioresistance määritystä, solut säteilytettiin käyttäen CyberKnife radiosurgery järjestelmä (Accuray, USA) antaa eri annoksina (2-10 Gy). Suhteellinen eloonjäämisen osa solujen määritettiin MTS-määrityksellä käyttämällä CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay -kittiä (Promega, Madison, WI, USA) sen jälkeen, kun 36 tunnin sädehoidon.

In vivo

tuumorigeenisyystesti tutkimus

in vivo kasvainten muodostumiseen tutkimus suoritettiin seuraava paikallinen eettinen komitea ohjeita, jotka oli täydellistä hyväksyntää myöntämiä Association for arviointi ja akkreditointi Laboratory Animal Care National Defense Medical Center. Hiiriä pidettiin 18-26 ° C: ssa, 30-70% kosteus, ja itsenäisesti ilmastoituja alle 12 h pimeä /12 tunnin valo sykli 7 päivää ennen ksenograftin injektiota. Vanhempien OSCC solut ja palloja injektoitiin BALB /c-nude-hiirissä (6 viikkoa). Solususpensio (100 ui) injektoitiin ihon alle kunkin hiiren eri solujen määrä 1 x 10

6, 1 x 10

5, 1 x 10

4 solut. Kasvaimet muodostettiin 7 päivää injektion jälkeen. Taso tilastollista merkitsevyyttä asetettiin 0,05 kaikissa testeissä.