Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka nopea kehitys kemoterapiaa ja kirurginen resektio strategioita, haimasyöpä jää neljänneksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa, jossa on 5 vuoden pysyvyys on alle 5%. Näin ollen uusia terapeuttisia aineita ehkäisyyn ja hoitoon haimasyövän kiireellisesti. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia vaikutusta pristimerin, joka on quinonemethide triterpenoidi eristetyn yhdisteen Kelaskasvit ja Hippocrateaceae, on soluproliferaation inhibointi ja apoptoosin induktio kolmessa haimasyövän soluja, BxPC-3, PANC-1 ja AsPC-1, sekä erikseen ja yhdessä gemsitabiinin kanssa. Hoito pristimerin vähensi solujen lisääntymisen kaikkien kolmen haimasyöpäsoluissa annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Hoito haimasyövän soluja pristimerin johti myös G1-vaiheen pysähtymisen joka oli vahvasti liittyä selvästi tason lasku Sykliinien (D1 ja E) ja sykliiniriippuvaisten kinaasien (cdk2, cdk4 ja CDK6) samanaikaisessa induktion WAF1 /p21 ja KIP1 /p27. Pristimerin käsittely johti myös apoptoottisen solukuoleman, pilkkominen kaspaasi-3, modulaatio ilmauksia Bcl-2-perheen proteiinit, inhibitio translokaatio ja DNA: ta sitova aktiivisuus NF-KB: n. Lisäksi, pristimerin voimisti kasvun esto ja apoptoosin indusoiva vaikutus gemsitabiinin kaikissa kolmessa haimasyövän soluja, ainakin osittain, estämällä konstitutiivisen sekä gemsitabiini-indusoidun NF-KB: n sekä sen DNA: ta sitovan aktiivisuuden ja transkriptionaalisen aktiivisuuden . Yhdessä nämä tiedot ovat ensimmäiset todisteet siitä, että pristimerin on vahva kehityspotentiaalia uutena aineena haimasyöpä.

Citation: Wang Y, Zhou Y, Zhou H, Jia G, Liu J, Han B, et ai. (2012) Pristimerin Syyt G1 pidättäminen, indusoi apoptoosia, ja Parantaa Kemosensitiivisyys on Gemsitabiinin haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 7 (8): e43826. doi: 10,1371 /journal.pone.0043826

Editor: Sharmila Shankar, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 30 heinäkuu 2012; Julkaistu: 28 elokuu 2012

Copyright: © Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustusta New Century Support Foundation for Elitist Kiinan opetusministeriö (NCET-07-0248), tieteellinen säätiö Tunnettuja Nuorten Heilongjiangin maakunnassa, Kiina (JC200717), tieteellistä ja teknologista Project Heilongjiangin maakunnassa , Kiina (GC09C407-2), tutkimus erityinen rahasto julkisen hyvinvoinnin alan terveyden (201202007) ja National Natural Tiedesäätiö of China (81170431, 81101799). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on yksi aggressiivinen ja tappava ihmisen syövissä, joka on kasvanut tasaisesti esiintyvyyttä viime vuosikymmeninä, ja on tällä hetkellä neljänneksi suurin syy syövän kuolemaan Yhdysvalloissa. Kollektiivinen 1 vuoden elinajan diagnoosivaiheessa missään vaiheessa on vain 26%, kun taas pitkän aikavälin yleistä (OS) putoaa alas 5% [1]. Vuonna 2010 arvioitiin, 43140 amerikkalaiset haimasyöpä ja 36800 kuoli tautiin [2]. Tärkein syy tällaisen huonon ennusteen haimasyövän johtuu pääasiassa puutteesta varhaisen diagnoosin, erittäin aggressiivinen biologisesta käyttäytymisestä kasvain ja köyhien vastaus useimmat hoidot, mukaan lukien kemoterapia, sädehoito, ja immunoterapia [3]. Tällä hetkellä gemsitabiini (2′-deoksi-2 ’, 2’-difluorocytidine) tiedetään olevan tukipilari hoidossa pitkälle ja metastasoituneen haimasyövän. Kuitenkin gemsitabiinihoidon johtaa vastausprosentti on alle 20% ja siihen liittyy useita haittavaikutuksia ja chemoresistance [4], [5]. Siksi kehittämällä vaihtoehtoisia chemopreventive ja kemoterapia-strategioita tarvitaan kipeästi hoitoon tätä tappavaa tautia.

Nuclear tekijä-KB (NF-KB), joka on keskeisessä säätelevä rooli geenien mukana tulehdus, solujen lisääntymistä, invaasiota, angiogeneesi, etäpesäke, tukahduttaminen apoptoosin, konstitutiivisesti aktivoitua erilaisissa syöpäsoluissa, mukaan lukien haiman syöpäsoluissa [6], [7], [8]. Lisäksi, useita rivejä todisteet viittaavat siihen, että NF-KB: n on keskeinen rooli kasvun ja chemoresistance haimasyövän. Ensimmäinen, NF-KB: n konstitutiivisesti aktivoitu haiman syöpäsoluissa, mutta ei normaaleissa haiman kudoksista tai ei tuumorigeeninen solulinjoissa [7], [9]. Toiseksi, NF-KB: n voisi edistää haiman syövän kasvua, koska sen kyky estää apoptoosia indusoivat mitogeeninen geenituotteita (c-Myc ja sykliini D1), lisäävät ilmentymistä proangiogeeninen tekijä, mukaan lukien verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF), ja edistää siirtymistä ja hyökkäys haimasyöpäsoluissa [10], [11], [12], [13], [14]. Lopuksi, NF-KB on keskeinen rooli välittämisessä chemoresistance haimasyövän [15]. Yhdessä nämä todisteet implicates rooli NF-KB: n haimasyövän ja ehdottaa, aineet, jotka voivat estää NF-KB: n aktivaatio on mahdollista torjua kasvua haimasyövän.

Pristimerin (Fig. 1), joka on luonnossa esiintyvä quinonemethide triterpenoid yhdiste eristettiin Kelaskasvit ja Hippocrateaceae, on viime aikoina herättänyt huomattavaa kiinnostusta johtuen sen potentiaali chemopreventive moterapeuttisista ominaisuuksia. Se on anti-inflammatorisia, antioksidantti, malarialääkkeitä, ja hyönteismyrkkynä toimintaa ja on osoitettu olevan kasvua estävä vaikutus joukon ihmisen syöpäsolulinjoissa, kuten rinta- ja keuhkosyövän, eturauhassyövän, kohdunkaulan syövän ja multippelin myelooman kasvaimista [16], [17], [18], [19], [20]. Kuitenkin mahdollinen teho pristimerin vastaan ​​haimasyövän on edelleen tuntematon.

Tässä tutkimuksessa käytimme kolme ihmisen haimasyövän solulinjoissa, BxPC-3, PANC-1 ja AsPC-1, arvioida potentiaalia pristimerin tehokkaana chemopreventive ja kemoterapeuttista ainetta vastaan ​​haimasyöpä. Osoitamme, että pristimerin voimakkaasti estää kasvun kaikissa kolmessa haimasyövän solulinjoissa indusoimalla G1-vaiheen solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin, ja herkistää ne gemsitabiinin solukuolema. Lisäksi Tuloksemme osoittavat, että vaikutukset ja molekyylitason toimintamekanismit pristimerin haiman syöpäsoluja liittyvät NF-KB: n aktivoitumisen.

Tulokset

Pristimerin indusoi solukasvuneston in Pancratic Cancer solut

vaikutuksen määrittämiseksi pristimerin solun kasvuun, ihmisen haimasyövän soluja (BxPC-3, PANC-1 ja AsPC-1) käsiteltiin kanssa vaihtelevina pitoisuuksina (0-1000 nM) pristimerin 24 h, 48 h ja 72 h, ja solujen eloonjäämistä arvioitiin CCK-8-määrityksessä. Kuten on esitetty kuviossa. 2, pristimerin hoito johti annoksesta ja ajasta riippuva solujen kasvun esto kaikissa kolmessa haimasyövän solulinjoissa testattu. Estävä pitoisuus (IC) 50-arvot olivat noin 652,71 nM, 283,78 nM ja 190,54 nM (vastaan ​​BxPC-3) ja 969,86 nM, 343,62 nM ja 261,05 nM (vastaan ​​PANC-1), ja 1261,6 nM, 378,46 nM ja 304,57 nM (vastaan AsPC-1) 24 tuntia, 48 tuntia ja 72 tuntia hoidon, vastaavasti. Nämä tulokset osoittavat, että pristimerin on voimakas antiproliferatiivinen vaikutus haiman syöpäsoluissa.

BxPC-3, PANC-1 ja AsPC-1-soluja kasvatettiin puuttuessa tai läsnä konsentraatio kasvaa ja pristimerin 24 h, 48 h ja 72 h ja sitten solujen elinkelpoisuus mitattiin CCK-8-analyysilla, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Esitetyt tiedot edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen. * P 0,05 verrattuna kontrolli. ** P 0,01 verrattuna kontrolli.

Pristimerin indusoi G1-vaiheen solusyklin pysähtymisen ja Muutokset G1-vaiheessa Cell Cycle liittyvät proteiinit haimasyöpäsoluissa

Perustuen alustavat analyysit jota arvioitiin vaikutus pristimerin kasvuun haimasyövän soluja, annokset 200, 400, ja 600 nM pristimerin valittiin edelleen in vitro mekanistisia tutkimuksia. Tutkia taustalla olevan mekanismin pristimerin aiheuttama kasvun esto solujen vaikutus pristimerin solusyklin jakautuminen tutkittiin virtaussytometrinen analyysi solun DNA-sisältöä. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, hoitoon haimasyövän soluja pristimerin 48 tuntia aiheutti merkittävää annos-riippuvainen pidätys soluja G1-vaiheessa solusyklin. G1-vaiheen solusyklin jakelu oli 48,73, 54,75, 63,29 ja 73,62% (vuonna BxPC-3) ja 67.23, 75.32, 79.41 ja 84.29% (in PANC-1) ja 70.79, 72.46, 74.95 ja 82.97% (vuonna AsPC- 1) 0, 200, 400 ja 600 nM pitoisuuksina pristimerin, vastaavasti. Tämä kasvu maksujen solujen G0-G1 faasi mukana kaventumiseen osuudet solujen S-vaiheen ja G2-M vaihe solusyklin kaikissa kolmessa testatuissa solulinjoissa. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että induktio G1 pidätys haiman syöpäsoluissa pristimerin voi olla vastuussa pristimerin-indusoidun solujen kasvun esto.

(A) vaikutus pristimerin solusyklin jakautuminen haiman syöpäsoluissa. BxPC-3, PANC-1 ja AsPC-1-soluja viljeltiin täydellisessä elatusaineessa ja käsiteltiin joko pristimerin (200, 400 tai 600 nM) tai DMSO (kontrolli) 48 tunnin ajan. Käsittelyn jälkeen solut kerättiin trypsinisaatiolla, pestiin jääkylmällä PBS: llä, ja pilkottiin RNaasi. Solujen DNA värjättiin propidiumjodidilla ja virtaussytometria-analyysi suoritettiin havaitsemiseksi solujen prosenttiosuus eri vaiheissa solusyklin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. * P 0,05 verrattuna kontrolli. ** P 0,01 verrattuna kontrolli. (B) vaikutus pristimerin proteiinitasolla sykliini D1, sykliini E, cdk 2, cdk 4, cdk 6, WAF1 /p21 ja KIP1 /p27 haiman syöpäsoluissa. Kuten yksityiskohtaisesti materiaalit ja menetelmät, haimasyövän soluja (BxPC-3, PANC-1 ja AsPC-1) käsiteltiin joko pristimerin (200, 400 tai 600 nM) tai DMSO (kontrolli) 48 tunnin ajan, ja sitten kerätään. Kokosoluliuotteista valmistettiin ja alistettiin SDS-PAGE ja sen jälkeen Western blot-analyysin G1 solusyklin säätelyproteiineja (sykliini D1, sykliini E, cdk2, cdk4, CDK6, WAF1 /p21 ja KIP1 /p27). β-aktiini havaittiin proteiinia latauskontrollina. Immunoblot kuvassa edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen tulokset olivat samanlaiset.

mekanismin ymmärtämiseksi taustalla G1-vaiheen pysähtymisen pristimerin-käsiteltyjen haimasyövän soluja, tutkimme seuraavaksi vaikutus pristimerin on tasot, jotka säätelevät etenemistä soluja G1-vaiheessa, mukaan lukien WAF1 /p21, KIP1 /p27, sykliini D1, sykliini E, cdk2, cdk4, ja CDK6. Kuten on esitetty kuviossa. 3B, hoitoon haimasyövän soluja pristimerin aiheutti merkittävän vähentämisen lasku proteiinin tasot Sykliinien D1 ja E pitoisuudesta riippuvalla tavalla kaikissa kolmessa haimasyövän solulinjoissa testattu. Vastaavasti, annoksesta riippuvainen väheneminen ilmentymisen cdk2, cdk4, ja CDK6 havaittiin (Fig. 3B). Lisäksi, altistuminen pristimerin aiheuttaa annoksesta riippuvan induktion p21 ja p27 kaikissa kolmessa haimasyövän testatuissa solulinjoissa (Fig. 3B). Ehdotamme, että modulaatio solusykliä säätelevien proteiinien pristimerin voi myötävaikuttaa pristimerin välittämää G1-vaiheen pysähtymisen haiman syöpäsoluja.

Pristimerin indusoi apoptoosia haimasyöpäsoluissa

Lisäksi soluun solusyklin pysähtymiseen, morfologisiin havainto pristimerin käsiteltyjen haimasyöpäsoluissa osoitti, että pristimerin aiheuttama kasvun esto voisi myös liittyä apoptoosin. Siksi arvioimme apoptoosia indusoiva vaikutus pristimerin haiman syöpäsoluja. Soluja käsiteltiin vaihtelevilla pitoisuus pristimerin (0-600 nM), värjättiin anneksiini V /PI, suoritettiin virtaussytometria määrittämiseksi apoptoosin määrä. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, hoitoon haimasyövän soluja pristimerin 48 tuntia aiheutti merkittävää annos-riippuvainen parantamiseksi sekä varhaisen ja myöhäisen vaiheen apoptoosin. Apoptoottiset indeksit olivat 6,3, 17,5, 38,6 ja 74,1% (vuonna BxPC-3) ja 8,1, 18,7, 29,3 ja 49,8% (in PANC-1) ja 11,2, 24,5, 34,7 ja 52,9% (in AsPC-1) 0 , 200, 400 ja 600 nM pitoisuuksina pristimerin, vastaavasti. Laserskannaus konfokaalimikroskopialla vahvistettiin annosriippuvainen apoptoottista vaikutusta, kuten on esitetty edustava valokuvia (Fig. 4C). Tutkimaan edelleen vaikutusta pristimerin solujen apoptoosiin, kaspaasi-3 kaikkien kolmen solulinjojen arvioitiin myös. pristimerin hoito tuotti annoksesta riippuvaisen parannusta kaspaasi-3-aktiivisuus kaikissa kolmessa testatuissa solulinjoissa verrattuna ohjaus 72 tunnin kuluttua käsittelystä (kuvio. 4D). Sen jälkeen, tutkimme ilmentymisen pro-kaspaasi-3 kaikissa kolmessa testatuissa solulinjoissa western-blottauksella. Pristimerin hoito myös alas-säädellä ilmentymistä pro-kaspaasi-3 annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 4E). Kaikkiaan tulokset viittaavat siihen, että pristimerin aiheuttama kasvun estyminen johtuu osittain sen induktion apoptoosin mekanismia.

(A) vaikutus pristimerin on apoptoosin induktioon arvioitiin anneksiini V /PI menetelmä virtaussytometriaa käyttämällä. BxPC-3, PANC-1 ja AsPC-1-soluja viljeltiin täydellisessä elatusaineessa ja käsiteltiin joko pristimerin (200, 400 tai 600 nM) tai DMSO (kontrolli) 48 tunnin ajan. Apoptoosi korko määritettiin virtaussytometrialla anneksiini V-FITC. (B) edustaja dot-tonteista cytometrically havainnollistaa apoptoottisten tilaansa BxPC-3 (ylempi paneeli), PANC-1 (keskimmäinen paneeli) ja AsPC-1 (alempi paneeli) soluja. (C) vaikutus pristimerin on apoptoosin arvioi fluoresenssimikroskopialla. Solut tarkastelivat myös alla fluoresenssimikroskopiaan. Edustavia valokuvia otettiin anneksiini V /PI-värjätty haimasyöpäsoluissa tietyin hoitoa. (D) vaikutus pristimerin on apoptoosin induktioon arvioitiin kaspaasi-3: n aktiivisuuden määritys. Solulysaatit analysoitiin kaspaasi-3: n aktiivisuuden, kuten kappaleessa ”Materiaalit ja menetelmät”. (E) vaikutus pristimerin lohkeamisreaktiossa kaspaasi-3. Kuten yksityiskohtaisesti materiaalit ja menetelmät, haimasyövän soluja (BxPC-3, PANC-1 ja AsPC-1) käsiteltiin joko pristimerin (200, 400 tai 600 nM) tai DMSO (kontrolli) 48 tunnin ajan, ja sitten kerätään. Kokosoluliuotteista valmistettiin ja alistettiin SDS-PAGE ja sen jälkeen Western blot-analyysi. β-aktiini havaittiin proteiinia latauskontrollina. Immunoblot kuvassa edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen tulokset olivat samanlaiset. * P 0,05 verrattuna kontrolli. ** P 0,01 verrattuna kontrolli.

Pristimerin moduloi tasot Bcl-2 Family proteiinit haimasyöpäsoluissa

Koska Bcl-2 Perhe proteiineja tärkeitä rooleja apoptoosin toimimalla promoottorit (esim Bax) tai estäjien (esim, Bcl-2: n tai Bcl-xL) solukuoleman prosessi, emme seuraavaksi tutkittiin muutokset tasojen Bax, Bcl-2 ja Bcl-x L haiman syöpäsoluissa . Western blot-analyysi osoitti, että hoito haimasyövän soluja 48 h kasvavilla pitoisuuksilla pristimerin johti annoksesta riippuva väheneminen tasot anti-apoptoottisten proteiinien Bcl-XL: n ja Bcl-2 (Fig. 5). Jyrkästi, taso pro-apoptoottisen proteiinin Bax on lisääntynyt merkittävästi käsittelemällä pristimerin annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 5). Siten pristimerin hoito voi moduloida tasot Bcl-2-perheen proteiinien tavalla, joka suosisi korotukset suhteet Bax /Bcl-2: n ja Bax /Bcl-x L, joka voi myötävaikuttaa havaittuun apoptoottista vaikutusta pristimerin.

Kuten yksityiskohtaisesti materiaalit ja menetelmät, haimasyövän soluja (BxPC-3, PANC-1 ja AsPC-1) käsiteltiin joko pristimerin (200, 400 tai 600 nM) tai DMSO (kontrolli) 48 tunnin ajan ja sitten korjattu. Kokosoluliuotteista valmistettiin ja alistettiin SDS-PAGE ja sen jälkeen Western blot-analyysi. β-aktiini havaittiin proteiinia latauskontrollina. Immunoblot kuvassa edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen tulokset olivat samanlaiset.

Pristimerin Estää translokaatio ja DNA: ta sitova aktiivisuus NF-KB: haimasyöpäsoluissa

NF-KB on osoitettu olevan konstitutiivisesti aktivoitua erilaisissa syöpäsoluissa, mukaan lukien haiman syöpäsoluissa ja jotka liittyvät sekä leviämisen ja apoptoottisten vastus. Siksi me tutkimme, pristimerin välittää sen vaikutuksia moduloimalla NF-KB: n aktiivisuutta. Käyttävät western blot-analyysi, tutkimme vaikutus pristimerin on konstitutiivista ilmentymistä NF-KB /p65 ja IKB-α haiman syöpäsoluja. Tuloksemme osoittivat, että pristimerin käsittely johti konsentraatiosta riippuvaisen laskun NF-KB /p65-proteiinin tasot tumafraktios-, mutta ei ollut muutosta, että proteiinin kokonaismäärän (Fig. 6A). Yhdenmukaisesti näiden havaintojen väheneminen NF-KB-proteiinin tason liittyi pitoisuudesta riippuvaa vähenemistä fosfori-IKB-α samanaikaisella pitoisuudesta riippuva kasvu sytosolin tasojen IKB-α-proteiinia (kuvio. 6A). Tukemiseksi edelleen tätä havaintoa, tutkimme vaikutus pristimerin DNA-sitoutumisaktiivisuutta NF-KB /p65 käyttämällä erityistä NF-KB /p65 ELISA ja löysi pristimerin hoito johti merkittävään annoksesta riippuvaa vähenemistä DNA-sitoutumisaktiivisuutta NF-KB /p65 kaikissa kolmessa haimasyöpäsoluissa (Fig. 6B). Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että hoito pristimerin johtaa merkittävään tukahduttaminen konstitutiivisen NF-KB: n aktivaation haiman syöpäsoluja.

(A) vaikutus pristimerin proteiinin tasot NF-KB /p65 ydinalan lysaateissa ja kokosoluliuotteista haimasyövän soluja. Kuten yksityiskohtaisesti materiaalit ja menetelmät, haimasyövän soluja (BxPC-3, PANC-1 ja AsPC-1) käsiteltiin joko pristimerin (200, 400 tai 600 nM) tai DMSO (kontrolli) 48 tunnin ajan, ja sitten kerätään. Nuclear lysaatit ja koko solulysaatit valmistettiin ja alistettiin SDS-PAGE ja sen jälkeen Western blot-analyysin proteiinin taso NF-KB: n /p65: n, p-IKB-α (S32 /36) ja IKB-α. β-aktiini havaittiin proteiinia latauskontrollina. Immunoblot kuvassa edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen tulokset olivat samanlaiset. (B) vaikutus pristimerin NF-KB /p65: n DNA: ta sitova aktiivisuus haiman syöpäsoluissa. Kuten yksityiskohtaisesti materiaalit ja menetelmät, haimasyövän soluja (BxPC-3, PANC-1 ja AsPC-1) käsiteltiin joko pristimerin (200, 400 tai 600 nM) tai DMSO (kontrolli) 48 tunnin ajan, ja sitten kerätään. Nuclear lysaatit valmistettiin ja NF-KB: n DNA: ta sitovan aktiivisuus määritettiin käyttämällä Trans-Am NF-KB: n ELISA Kit. * P 0,05 verrattuna kontrolli. ** P 0,01 verrattuna kontrolli.

Pristimerin Voimistaa gemsitabiinin sytotoksinen vaikutus vähentämällä elinkykyyn ja apoptoosin edistämiseksi

gemsitabiini paras kemoterapeuttinen aine käytettävissä hoitoon pitkälle haimasyöpä, yksin ei ole kovin tehokas ja siihen liittyy systeemisen toksisuuden ja chemoresistance. Koska NF-KB: n on osoitettu edistävän gemsitabiinin vastus haimasyövän, arvioimme onko pristimerin voi voimistaa gemsitabiinin näissä solulinjoissa.

CCK-8-määritys osoitti, että hoito joko pristimerin ( 200 nM) tai gemsitabiinia (500 nM) yksinään 48 tunnin ajan saatiin vain 31,5%: n tai 46,7% menetys elinkelpoisuuden BXPC-3, ja 27,2%: n tai 25,9% menetys elinkelpoisuuden PANC-1, ja 26,3%: n tai 23,6%: n menetykseen kannattavuusongelmaa AsPC-1, tässä järjestyksessä. Kuitenkin yhdistelmä pristimerin ja gemsitabiinin johti menetys 68,1%, 61,7% tai 57,8% elävien solujen joko solutyypissä tutkittu, vastaavasti (Fig. 7A). Luonne vuorovaikutuksen pristimerin ja gemsitabiinin kvantitoitiin käyttäen Chou /Talalay mediaani-vaikutus yhtälön menetelmä johtaa yhdistelmä-indeksi. CI 1 merkitsee synergististä vaikutusta, ja CI alue arvojen yhdistelmä pristimerin ja gemsitabiinin kaikissa kolmessa ihmisen haimasyövän solulinjoissa olivat 0,5 ja 0,9 murto vaikutus vastaa 0,3 ja 0,9 (kuvio 7A), mikä osoittaa, että yhdistelmä pristimerin ja gemsitabiinin on synergistisiä vaikutuksia estämällä solujen kasvua kaikissa testatuissa solulinjoissa.

(A) voimistuminen gemsitabiinin aiheuttaman solukasvun inhibitioon pristimerin. Soluja kasvatettiin puuttuessa tai läsnä ollessa pristimerin (200 nM), gemsitabiini (500 nM) tai niiden yhdistelmän: ssa 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus mitattiin CCK-8-analyysilla, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Yhdistelmä-indeksi (CI) vs. fraktion (Fa) tontteja saatu mediaani-vaikutus analyysin Chou-talalay. CI-arvot: 1, antagonismin; 1, additiivisuus; 1, synergiaa. (B) voimistuminen gemsitabiinin indusoiman apoptoosin pristimerin. Soluja kasvatettiin puuttuessa tai läsnä ollessa pristimerin (200 nM), gemsitabiini (500 nM) tai niiden yhdistelmän: ssa 48 tuntia. Apoptoosi korko määritettiin virtaussytometrialla anneksiini V-FITC. * P 0,05 verrattuna kontrolli. ** P 0,01 verrattuna kontrolli.

# P 0,05, verrattuna yhden gemsitabiinin ryhmään.

## P 0,01, verrattuna yhden gemsitabiinin ryhmään.

anneksiini V testi osoitti, että yksittäinen gemsitabiini (500 nM) kasvoi korko apoptoosin 6,3%: sta 26,9%: in BxPC-3 soluja ja 8,1%: sta 17,9%: in PANC-1-soluissa ja 11,2%: sta 20,8%: in AsPC-1-soluissa, kun taas yksi pristimerin (200 nM) korotettiin apoptoosin välillä 6,3%: sta 17,5%: in BxPC-3 soluja ja 8,1%: sta 18,7%: in PANC-1-soluissa ja 11,2%: sta 24,5%: in AsPC-1-soluissa. Lisäksi gemsitabiinin yhdistettynä pristimerin lisäsi apoptoosin verrattuna yhden aineella vastaavissa soluissa (46,8%, 40,5% ja 46,7%, tässä järjestyksessä) (Fig. 7B). Nämä tulokset yhdessä viittaavat siihen, että pristimerin augments gemsitabiinin sytotoksinen vaikutus haiman syöpäsoluja.

Seuraavaksi arvioimme vaikutusta pristimerin ja gemsitabiinin NF-KB toimintaa, onko tämä benificial vaikutusta pristimerin ja gemsitabiinin liittyy kanssa NF-KB: n aktivaation. Tuloksemme osoittivat, että BxPC-3, PANC-1 ja AsPC-1-soluissa ilmaistuna konstitutiivisesti aktiivinen NF-KB: n DNA: ta sitova aktiivisuus ja gemsitabiinin yksin edelleen indusoi NF-KB: n DNA: ta sitova aktiivisuus verrattuna kontrolliin (Fig. 8A ja B). Mielenkiintoista on, että kaikki kolme solua, pristimerin pystyi vähentämään NF-KB: n DNA-sitoutumisaktiivisuutta olipa kanssa tai ilman gemsitabiinia (Fig. 8A ja B). Nämä tulokset osoittavat, että pristimerin ei ainoastaan ​​vähennä konstitutiivisesti aktiivinen NF-KB: n DNA: ta sitova aktiivisuus stimuloimattomissa olosuhteissa, mutta inhiboi myös gemsitabiini-indusoidun NF-KB: n aktivaatio, joka voi olla vastuussa tehostava vaikutus pristimerin gemsitabiinin vastaan ​​haiman syöpäsoluja.

(A) vaikutus pristimerin ja gemsitabiinin proteiini tasoilla NF-KB /p65 ydin- lysaateissa ja kokosoluliuotteista haiman syöpäsoluja. Kuten yksityiskohtaisesti materiaalit ja menetelmät, haimasyövän soluja (BxPC-3, PANC-1 ja AsPC-1) kasvatettiin puuttuessa tai läsnä ollessa pristimerin (200 nM), gemsitabiini (500 nM) tai niiden yhdistelmän: ssa 48 tuntia ja sitten korjattu. Nuclear lysaatit ja koko solulysaatit valmistettiin ja alistettiin SDS-PAGE ja sen jälkeen Western blot-analyysin proteiinin taso NF-KB: n /p65: llä. β-aktiini havaittiin proteiinia latauskontrollina. Immunoblot kuvassa edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen tulokset olivat samanlaiset. (B) vaikutus pristimerin ja gemsitabiinin NF-KB /p65: n DNA: ta sitova aktiivisuus haiman syöpäsoluissa. Kuten yksityiskohtaisesti materiaalit ja menetelmät, haimasyövän soluja (BxPC-3, PANC-1 ja AsPC-1) kasvatettiin puuttuessa tai läsnä ollessa pristimerin (200 nM), gemsitabiini (500 nM) tai niiden yhdistelmän: ssa 48 tuntia ja sitten korjattu. Nuclear lysaatit valmistettiin ja NF-KB: n DNA: ta sitovan aktiivisuus määritettiin käyttämällä Trans-Am NF-KB: n ELISA Kit. * P 0,05 verrattuna kontrolli. ** P 0,01 verrattuna kontrolli.

# P 0,05, verrattuna yhden gemsitabiinin ryhmään.

## P 0,01, verrattuna yhden gemsitabiinin ryhmään.

Keskustelu

arviointi luonnossa esiintyviä ruokavalion yhdisteet voivat osoittaa uusia lähestymistapoja hoitoon haimasyöpä, joka edelleen yksi kaikkein vaarallisin syövät huolimatta valtavasti tieteellisiä toimia [2]. Meidän Tässä työssä olemme huomanneet, että pristimerin kohdistama merkittävää kasvua estäviä vaikutuksia haimasyöpäsoluissa (BxPC-3, PANC-1 ja AsPC-1) kautta induktion G1 pidätyksen ja apoptoottisen solukuoleman. Lisäksi pristimerin parannettu kemosensitiivisyys gemsitabiiniannokseen haiman syöpäsoluja. Meidän tiedot osoittivat, että anti-proliferatiivista ja Chemosensiti- vaikutus pristimerin haiman syöpäsoluissa voi välittää kautta NF-KB: n aktiivisuus ja muutokset solun cycle- ja apoptoosiin liittyviä proteiineja.

Modulation of solusyklin etenemisen syöpäsoluissa pidetään arvostettu kohde hoitoon ihmisen maligniteettien, koska useat tutkimukset ovat osoittaneet, että poikkeavuus solun lukiertosäätelijöistä on yhteinen piirre ihmisen syövän [23], [24], [25]. Meidän in vitro tulokset osoittivat, että hoito haimasyövän soluja pristimerin aiheutti annoksesta riippuvaa pidätys soluja G1 vaiheessa. Kulku solusyklin läpi, eukaryooteissa säätelee sisältävät kompleksit sykliinejä, sääntely yksiköt, joissa sykliiniriippuvainen kinaasien (CDK), katalyyttinen yksiköt [26]. Sykliinit D ja E yhdessä cdk2, cdk4 tai CDK6 on tärkeä rooli etenemistä solujen kautta G1 vaiheen solusyklin [27]. Vapautuminen G1 vaiheen solusyklin sääntelyviranomaisten uskotaan edistää poikkeavasta syöpäsolujen lisääntymistä. Yliekspressio sykliinit ja cdk: t voivat tarjota syöpäsolujen selektiivisen kasvuedun [28]. Näin ollen, kohdistaminen sykliini /cdk-kompleksien pidetään lupaavana tehokas strategia syövän hoitoon. Etenemisen aikana solusyklin, cdk-sykliini-kompleksien estyy sitoutumisen kautta CDK-inhibiittorit (ckis), kuten CIP /KIP ja INK4 perheiden proteiinien [29]. WAF1 /p21 ja KIP1 /p27, proteiinit Cip /Kip perhe, lohko solusyklin etenemistä inhiboimalla sykliini E-Cdk2 komplekseja, jotka normaalisti edistävät G1-S-vaiheessa etenemistä. Havaitut estovaikutus pristimerin on sykliini D1, sykliini E CDK2, CDK4 ja CDK6, sekä sen upregulating vaikutuksia WAF1 /p21 ja KIP1 /p27 haiman syöpäsoluissa ehdottaa sen potentiaali häiriöitä hallitsemattoman solusyklin etenemisen. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittavat, että pristimerin pidätetty haimasyövän soluja G1 vaiheeseen solusyklin kautta moduloimiseksi solussa lukiertosäätelijöistä viittaa yksi niistä mekanismeista, joilla pristimerin voivat toimia tukahduttaa syöpäsolujen kasvua ja indusoivat apoptoottista solukuolemaa.

G1 -vaihe solukierron pysähtymisen luo mahdollisuuden solujen joko suoritettava korjauksia tai anna apoptoottista polku ylläpitää kudosten homeostaasin ja poistaa mutatoitunut neoplastisia ja liikauudiskasvuisten neoplastiset solut järjestelmästä. Viime vuosina, käsite solusyklin säätelyssä-välitteistä apoptoosia on saanut yhä enemmän huomiota, ja on tullut ihanteellinen tapa solujen kasvun inhibition [30], [31]. Tässä suhteessa pristimerin näyttää olevan tehokas kemoterapeuttinen aine, koska se voi selektiivisesti /ensisijaisesti poistamaan syöpäsoluja aiheuttaa solusyklin pysähtymiseen ja /tai apoptoosin indusoimiseksi [20]. Esillä olevassa tutkimuksessa, virtaussytometrialla tiedot osoittivat, että hoito haimasyövän soluja pristimerin johti signifiant apoptoosin induktion, joka edelleen varmistettiin pilkkomalla kaspaasi-3, fluoresenssimikroskopia ja kaspaasi-3: n aktiivisuuden. Yhdessä nämä tulokset osoittavat selvästi, että sytotoksista vaikutusta pristimerin haiman syöpäsoluissa on välittyy solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin.

jäsenet Bcl-2-perheen proteiinien on keskeinen rooli säätelyssä apoptoottisen polku. Jotkin proteiinit tämän perheen, mukaan lukien Bcl-2 ja Bcl-XL, tukahduttaa apoptoosin, kun taas toiset, kuten Bax ja Bak edistää apoptoosia [32], [33], [34] pro-apoptoottiset proteiinit ja anti-apoptoottiset proteiinit Bcl-2-perheen voisivat muodostaa heterodimeerejä, jolloin keskinäinen neutralointi sidotun pro-ja anti-apoptoottisia vaikutuksia. Näin ollen tasojen muutokset anti ja pro-apoptoottisten Bcl-2-perheen proteiinit ovat kriittisiä apoptoosin. Olemme havainneet, että käsittely haimasyövän soluja pristimerin johti lisääntymiseen ekspression Bax-proteiinin ja vähentää ilmentymistä Bcl-2 ja Bcl-x L lisäten siten suhteet Bax /Bcl-2: n ja Bax /Bcl-xL hyväksi apoptoosin. Siksi on loogista olettaa, että säätelyä Bax ja downmodulation Bcl-2 ja Bcl-XL voi olla vastuussa havaittu apoptoottisen vaikutuksen pristimerin.

Tietyt luonnossa esiintyviä bioaktiivisia yhdisteitä chemopreventive ominaisuudet haimasyöpäsoluissa kuten bentsyyli-isotiosyanaattia, honokiol, kurkumiinin, dihydroartemisiniini ja fisetin on osoitettu estävän solujen proliferaatiota ja indusoivat apoptoosin kautta NF-KB – riippuvainen mekanismi [35], [36], [37], [38], [39]. Nuclear factor-KB: n (NF-KB), joka on ratkaiseva säätelytehtävä geenien mukana tulehdus, solujen lisääntymisen, invaasio, angiogeneesi, etäpesäke, tukahduttaminen apoptoosin, konstitutiivisesti aktivoitua erilaisissa syöpäsoluissa, mukaan lukien haimasyöpä solut [6], [7], [8]. NF-KB on homo- tai heterodimeerin koostuu jäsenistä NF-KB perheensä NF-κB1 (P50), NF-κB2 (P52), RelA (p65), RelB ja c-Rel [40]. Yleisin on himmennin RelA (p65) ja NF-κB1 (P50), ja on eristäytynyt sytoplasmassa inaktiivisessa tilassa vuorovaikutuksessa endogeeninen estäjän IKB [41]. Sen jälkeen solu stimulaatio, IKB läpikäy phosphorylation- ja ubikitinaatio riippuvaa hajoamista, jolloin aktiivinen NF-KB on translokoituvat tumaan, jossa se sitoutuu täsmällistä vastausta elementit DNA-sekvenssit kytketään päälle geenitranskription lukien antiapoptoottisten (surviviinia Bcl-x L, Bcl-2), proliferatiivinen (sykliini-D1), proinflammatoristen (COX-2), invaasiota [matriisimetalloproteinaasi 9 (MMP-9)], ja angiogeenisten [verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF)] geenit [7], [12], [14], [42], [43].