Krooninen sairaus

tiivistelmä

Useat viimeaikaiset tutkimukset ovat tarkastelleet toiminta ja kehitys Drosophila homologi ihmisen rintasyövän alttius geenin

BRCA2

, nimeltään

dmbrca2

. Me aiemmin tunnistettu, mikä näytti olevan äskettäin laajeneminen RAD51 sitovan BRC-repeat array esi

Drosophila Yakuba

. Tässä tutkimuksessa tarkastellaan kuvioita vaihtelua ja kehityksestä

dmbrca2

BRC-repeat rivistä

D. Yakuba

ja sen lähisukulaisiin. Me kehittää malli siitä, miten epätasainen joka ylittää saattanut tuottanut laajennetussa muodossa, mutta myös tarkkailla toistojaksoihin muotoja, tyypillinen Muiden lajien

D. melanogaster

ryhmä, eristämällä sisällä

D. Yakuba

ja

D. santomea

. Nämä lyhyet muodot eivät näytä olevan identtisiä-by-laskeutuminen, mikä viittaa siihen, että historia

dmbrca2

D. melanogaster

alaryhmä on mukana toista yksikköä supistusten tuloksena homoplasious muodoissa. Olemme päätellä, että evoluutiohistoriasta

dmbrca2

in

D. Yakuba

ja ehkä muissakin Drosophila lajit voivat olla monimutkaisempia kuin mitä voidaan päätellä tutkiminen julkaistusta yhden genomin sekvenssejä lajia kohti.

Citation: Bennett SM, Mercer JM, Noor MAF (2010) lipsuminen Sliding Away: Serial muutokset ja Homoplasy in Toista numero

Drosophila Yakuba

homologi ihmisen syöpäalttiusgeeniksi

BRCA2

. PLoS ONE 5 (6): e11006. doi: 10,1371 /journal.pone.0011006

Toimittaja: William J. Murphy, Texas A M University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 huhtikuu 2010; Hyväksytty: 17 toukokuu 2010; Julkaistu: 08 kesäkuu 2010

Copyright: © 2010 Bennett et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus oli tarjoamia National Science Foundation palkintoja 0509780 ja 0715484, ja National Institutes of Health palkintoja GM076051 ja GM086445. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ihmisen rinta- syöpäalttiusgeeniksi

BRCA2

koodaa proteiinia laajalti tutkittu, koska sen merkitys DNA korjaukseen [1] – [3]. Mutaatiot ihmisen ituradan

BRCA2

johtaa eliniän lisääntynyt alttius rinta- ja munasarjasyövän syöpiä [4], [5], joka johtuu esimerkiksi tehoton korjaus DNA kaksinkertainen katkeamisen (DSB: t) aikana homologisen rekombinaation [6] – [8]. Vuonna toiminnalliset tutkimukset,

BRCA2

on osoitettu säätelevän RAD51 rekom- tärkeä nukleoproteiini- hehkulanka joka kiinnittyy vaurioitunut, yksijuosteisen DNA paikalla DSB ja on tärkeää aloittamisen korjausprosessin [9]. BRCA2 sitoutuu RAD51 yhdistämällä se jaksoryhmittymät, nimeltään ”BRC mallikertaa” [10], [11], jotka kukin koostuvat noin 30 aminohappoa ja esiintyy erittäin konservoitunut alue

BRCA2

geeni. Nämä konservoituneet toistot ovat olleet hyödyllisiä tunnistamisessa

BRCA2

homologeista monilla eukaryoottisten lajien, mukaan lukien

Arabidopsis thaliana

,

Caenorhabditis elegans

,

banaanikärpänen

, ja

Trypanosoma brucei

[12], [13]. Tutkijat kamppailevat vielä selvittää, kuinka

BRCA2

koordinoi RAD51 ja ssDNA-sitovia toimia, joilla helpotetaan siirtoa RAD51 proteiinin päälle DNA (mutta katso [14]), mutta Pellegrini ja Venkitaraman [9] ehdotti, että ”primitiivinen organismit kätkeminen yksinkertaisemman version

BRCA2

proteiini saadaan käyttökelpoista mallia järjestelmiä. ”

oletetusti yksinkertaisempi

BRCA2

homologi tunnistettiin malliorganismi

banaanikärpänen

käyttäen sekvenssin sormenjälkiä, jotka edustavat avaimen tähteitä

BRCA2-RAD51

vuorovaikutus locus

CG30169

, myöhemmin nimeltään ”

dmbrca2

” [15]. Funktionaaliset tutkimukset Tämän Drosophila-geenin on osoitettu, että se vaikuttaa

D. melanogaster Rad51

(

spnA

), ja sen häiriöt vaikuttavat hinnat mitoosi ja meioottisiin DNA: n korjaukseen ja homologista rekombinaatiota [15] – [17], joka johtaa Kløvstad

et. al.

[16] päätellä, että Drosophila

BRCA2

edustaa toiminnallinen homologi geenin, joka voidaan luonnehtia sen ihmisen vastine. Toisin kuin nisäkkäiden

BRCA, 2

joka on kahdeksan BRC toistoja,

D. melanogaster

homologin havaittiin sisältävän kolme toistoa [13]. Myöhemmin tutkimus tämän geenin koko julkaistun Drosophila genomit osoitti suurta vaihtelua määrä BRC toistojen, jossa

D. melanogaster

ja sen alaryhmä, jolla on kolme toistoa (kuva 1), kun taas muut, etäisemmin lajeja kuten

D. pseudoobscura

ja

D. persimilis

laakeri jopa yksitoista toistoja [18]. Tämä vaihtelevuus useissa BRC toistojen osoitettiin myös yksittäisten lajien samoin; kymmenen valitaan kantoja

D. pseudoobscura

havaittiin olevan seitsemän, yhdeksän tai yksitoista BRC toistoa, mikä osoittaa ehkä viimeaikaisesta kehityksestä tässä geenissä [18].

Tämä puu esittelee useita ”BRC” toistuu julkaistusta genomin jokaisen lajien suvun Drosophila. Sininen laatikko korostetaan melanogaster ryhmä, joka on rakenteessa näennäinen vakaus toistolukumäärä.

Vaikka suurta vaihtelua toista numero poikki phylogeny Drosophila, tämä vaihtelu ilmeisesti poissa sisällä melanogaster ryhmä, jossa laji jotka ovat julkaisseet geeniperimän kaikki sisältää 3 BRC toistoa. Poikkeuksena tästä kuviota melanogaster ryhmä on

D. Yakuba

, jonka julkaisi genomin sekvenssin

dmbrca2

kantaa viisi BRC toistoja. Havainnointi tässä vaihtoehtoisessa toista muotoa herättää useita kysymyksiä: onko tämä suurempi toistolukumäärä todellisia tai genomin mis-kokoonpano artefakti [19]? Jos se on todellinen, on tämä suurempi toistolukumäärä muodossa läsnä kaikissa

D. Yakuba

kantoja, tai on lyhyempi muoto läsnä luonnonpopulaatioissa? Voimmeko päätellä historiallisen muutoksen toistojen lukumäärä analysoimalla nukleotidisekvenssi? Ja lopuksi, jos on vaihtoehtoinen muotoja, voimme havaita todisteita liittyvien luonnonvalinnan leviämisessä suuren määrän toista muodossa? Tässä tutkimuksessa tutkimme sekvenssi ja määrän kehitys BRC toistuu Drosophila homologi

BRCA2

in

D. Yakuba

ja sen sisko lajit

D. santomea

ja aseta se evoluution yhteydessä. Ymmärtäminen kuvioita havaittu näistä lajeista saattavat auttaa meitä paremmin tietää geneettinen vaikuttavat prosessit tämä geeni, joka on tärkeä perustavanlaatuinen prosessi rekombinaation ja ihmisten terveyttä laajemmin.

Materiaalit ja menetelmät

Drosophila

Osakkeet

Drosophila Yakuba

ja

D. santomea

varastot käytetään esillä olevassa tutkimuksessa saatiin tri Jerry Coyne [20]. Kärpäset säilyivät absoluuttiseen etanoliin, kunnes DNA uutettiin meidän lab.

DNA eristäminen, PCR-monistuksella ja sekvensointi

Genominen DNA eristettiin aikuisten

D. Yakuba

ja

D. santomea

yhden lentää litistää protokolla [21]. Alukkeet PCR-monistukseen suunniteltiin julkaistusta

D. Yakuba

genomin kokoonpano [22]. Alukkeet suunniteltiin

dmbrca2 alue

käytettiin monistamiseen PCR segmenttejä geenin 25 ui reaktiossa määriä. Koot PCR-tuotteet vahvistettiin elektroforeesilla 1% agaroosigeelillä. PCR-tuotteet puhdistettiin käyttämällä ExoSAP-It (USB Corp) ja sekvensoitiin käyttäen ABI BigDye on Duke University IGSP sekvensointi laitokseen. Sekvenssit on talletettu GenBank /EMBL tietokantoihin hakunumeroilla HM146151-HM146174.

Data Analyysit

DNA-sekvenssit kohdakkain laskennallisesti käyttäen BioEdit 7.0.9 [23], ja sitten muokattu käsin linjaus . DNAsp [24] käytettiin arvioimaan nukleotidin monimuotoisuus (pii) ja Tajima n D [25], että

dmbrca2

alue. Saimme arvot Tajima n D samankaltaisia ​​loci in

D. Yakuba

ja

D. santomea myynnissä maassa Llopart

et. al.

[26] Vertailun.

Tutkimme sekvensoitiin alueet kullekin kannalle ja vertasi niitä täyteen koottu sekvenssi tällä alueella julkaistusta

D. Yakuba

genomi [22]. Julkaistussa genomin alueella, me luokitellaan viisi erillistä BRC-toistojen käyttäen diagnostisia aminohappoja ja kokoeroja, numeroinnin niitä numeerisesti 1 läpi 5 päässä 5′[18]. Olemme käännetty DNA-sekvenssi eksonien meidän kantojen ”sekvenssejä ja manuaalisesti verrattuna kunkin yksittäisen toista numeroidut genomiin toistot käyttämällä diagnostista aminohappoja ja kokoerot.

fylogeneettinen analyysi suoritettiin PAUP * 4.0b10 [27 ]. BRCA2 toista motiivit

D. melanogaster

(DME),

D. sechellia

(DSE),

D. simulans

(DSI),

D. erecta

(Der), ja

D. Yakuba

(dya) saatiin flybase viite genomeja, ja yhdessä

D. santomea

(DSA) ja lisää

D. Yakuba

sekvenssit kerätään tähän työhön.

D. Yakuba

käytettiin standardina numeroinnin toista aiheita: 1-5 amino–pää karboksyyli-päähän peptidin.

D. persimilis

toista 2 (Dpe2) käytettiin outgroup. Sekvenssijärjestystä tehtiin Seaview 4.0 [28] ylimääräisiä säätöjä silmämääräisesti. Sekvenssi motiivien rajaamalla 35 aminohappoa pitkän Pfam HMM malli (HMM) ja BRCA2 toistoja [29]. Johtuen lyhyitä jakson pituus ja vaatimaton taso sekvenssimuuntelun, naapuri-liittymällä korjaamaton p-etäisyydet valittiin puiden arviointi.

Tulokset ja keskustelu

Ennen fylogeneettiseen analyysi julkaistut

D. melanogaster

alaryhmä genomin sekvenssit toistoja paljasti kaksi suurta clades: kaikki parilliset toistoja ja kaikki parittomat toistoja [18].

D. Yakuba

toista 3 (Dya3) kuului parittomat kehityslinja mutta ollut epätavallinen ei clustering joko ensimmäisen tai kolmannen toistoa vaan jäljellä pohjapinta sekä (katso kuva 2). Silmämääräinen tarkastus aminohappo- ja nukleotidisekvenssit, paljasti, että 3′-pää Dya3 kantoi vahvaa sekvenssien samankaltaisuutta Dme1 ja der1, kun taas 5′-pää hallussaan muutaman diagnostisia aminohappoja, jotka muistuttivat Dme3 ja Der3 (kuvio 3). Tämä havainto viittaa siihen, että epätasa-arvoisessa ylitykseen yli tapahtuma (kuva 4) on saattanut tapahtua välillä toista 1 ja toista 3 synnyttäen toista laajennus peräisin esi 3 BRC toistuu joka on johdettu tilan 5 toistojen historiallisesti

D . Yakuba

linjaa. Vaikka Dya2 ja Dya4 toistaa klusterin fylogeneettisesti, 17%: n aminohapposekvenssi eroavaisuudet ja 18 aminohapon aukon julkaistu genomin sekvenssin Dya4 suhteessa Dya2, osoittaa, että tällainen tapahtuma, jos se tapahtui lainkaan, ei tapahtunut aivan lähimenneisyydessä.

Jaksot mukana on johdettu

banaanikärpänen

(DME),

D. Yakuba

(dya),

D. sechellia

(DSE),

D. erecta

(Der), ja

D. simulans

(DSI). Dya3c ja Dya3n osoittaa 5 ’ja 3’ alueiden toistoa 3, vastaavasti.

Nämä aminohappo käännöksiä julkaistuista genomin sekvenssit

banaanikärpänen

(DMEL),

D. Yakuba

(dya),

D. sechellia

(DSE),

D. erecta

, ja

D. simulans

(DSI) ovat linjassa ja värikoodattu korostaa yhtäläisyyksiä niiden välillä. D. Yakuba toista 3 (Dya3) on jaettu kahteen puoliskoon, jotka näyttävät ryhmään seuraavasti, 3 ’päättyy 1. toistoja ja 5’kanssa 3rd toistuu.

D. Yakuba

homologin

dmbrca2

julkaistussa genomin sisältää 5 BRC toistoja [18]; kuitenkin, kun visualisoidaan monistetut PCR-tuotteet tämän toistuvia alueen 43

D. Yakuba

ja 18

D. santomea

kantoja, löysimme kaksi selvästi erilaista kokoinen bändejä. Suurempi tuote, havaittiin 57 61 kantojen, vastasi odotettua kokoa 5 BRC toistoja. Näin ollen 5-repeat muodossa havaittiin julkaistu genomin ei ole kiinteä sisällä luonnonpopulaatioiden. Tämä toistolukumäärä vaihtelu varmistettiin sekvensoimalla 11 pitkän kantoja ja kaikki 4 lyhytmuotoja, joka osoittaa, että pitkät lomakkeet hallussaan odotettu 5 erillistä BRC toistoja kun taas lyhyet kannat oli vain 3.

kohdistettu ennustetut aminohapposekvenssit, kun ne yksittäisiin julkaistu genomin toistoja (ja erityisesti aminohappoja, jotka näyttivät ”diagnostisia” suhteessa Dya2 ja Dya4), ja havaitsivat, mitä näyttää olevan useita lyhyitä muotoja.

D. Yakuba

rasitusta Cascade 21 ja

D. santomea

kanta LAGO 1482 kullakin 3 yhteensä toistoa, joka sisältää 1

s ja 3

rd toistoja, jotka muistuttavat koko 1

st ja 5

th toistoa julkaistun

D . Yakuba

genomin sekvenssissä. Heidän 2

nd toista kuitenkin alkaa muistuttaa 2

nd genomin toistuvan perustuva diagnostinen aminohappo ja läsnäolo 18 aminohapon alueen spesifinen Dya2-vaan kääntää puolivälissä muistuttamaan Dya4 Yhteensä 4 diagnostisia aminohappoa (katso kuva 5).

D. Yakuba

rasitusta Cascade 24 ja

D. santomea

kanta STO 7 on myös vain 3 toistoa, mutta paljon enemmän toisen toista muistuttaa Dya4, mukaan lukien 18 aminohapon katkaisu (kuvio 5). Tämä ero viittaa siihen, että ainakin yksi katkaisu tapahtuma johti ulkonäön uuden lomakkeen 3 BRC repeats- ja nämä lyhyet muodot voivat olla riippumattomia poistoja pitkä, 5 toista muotoa.

Nämä aminohappo käännökset ovat peräisin Dya2, Dya4,

D. Yakuba

kantoja Cascade24 ja Cascade 21,

D. santomea

kannat STO7 ja LAGO1482, Der ja DME. Tähdet yläpuolella kohdistus osoittavat sivustoja, jotka ovat erot julkaistu genomin sekvenssit Dya2 ja Dya4, mutta eivät ole kiinteitä joukossa sekvensoitiin 5-repeat kantoja

D. Yakuba

(ikään kuin he eivät ole ”diagnostisia”).

Tämä havainto homoplasious 3 toista alleeli muotoja herättää kysymyksen, onko näennäinen vakaus tämän muodossa

D. melanogaster

ryhmä vääristelee piilossa laajennukset ja supistukset toista numero. Tämän hypoteesin testaamiseksi, me tiiviisti tutkinut julkaistu

dmbrca2

jono

D. erecta

(joka valitettavasti ei ole muita kantoja saatavilla myös suorana sekvensointi).

D. erecta

2

nd BRC toista aminohapposekvenssiä muistutti osat

D. Yakuba

2

nd ja 4

th BRC toistaa yhdenmukaisesti sen kanssa on johdettu poistetaan viiden toista muotoa (katso kuva 5). Erityisesti siinä on 18 aminohapot, jotka ovat läsnä Dya2 mutta ei Dya4, mutta on kolme aminohappoa diagnostinen Dya4 sen 3′-päähän. Näin ollen, toisin kuin fylogeneettiseen hypoteesin kuviossa 4,

D. erecta

3-repeat muodossa saattanut syntynyt toissijaisesti peräisin esi 5-toista muotoa.

dmbrca2

jono

D. melanogaster

osoittaa myös mahdollisesti samanlainen kuvio (kuvio 5), mutta päätelmät ovat vaikeampia, koska paljon suurempi sekvenssin eroavaisuudet ja mahdolliset useita evoluution muutoksia järjestyksessä kohti aminohappoa.

testaamiseksi allekirjoittamisen luonnollisen valinta on runsas 5-repeat muodossa, laskimme Tajima n D

D. Yakuba

(D = -0,68518) ja

D. santomea

(D = -0,27805). Emme pystyneet laskemaan Tajima n lyhyen muodon ansiosta erittäin matalien taajuuksien keskuudessa näytteitä (ja että jotkut lyhyen alleelien eivät myöskään ole identtisiä-by-lasku). Kuitenkin vertasimme 5-repeat lomakkeen Tajima n D arvot julkaistaan ​​Tajima n D-arvot

D. Yakuba

ja

D. santomea

muiden lokusten sijaitsevat samalla alueilla vähentyneen joka ylittää [26], koska asema

dmbrca2

lähellä telomere kromosomin 2 ja tunnettujen vaikutusten alhainen rekombinaation hinnat päällä taajuusspektreistä [ ,,,0],30]. Havaitut arvot

dmbrca2

olivat hyvin rajoissa näiden muiden julkaistu arvoja (

D. Yakuba

: keskiarvo = -0,34, alue -1,03-+1,05;

D. Santomea

: keskiarvo = -0,29, alue -1,27-+1,03), joten jotta voimme sulkea pois epätyypillinen valinta paineita tässä lokuksessa.

Olemme päätellä, että evoluutiohistoriasta

dmbrca2

in

D. Yakuba

, ja ehkä muissakin

banaanikärpänen

alaryhmä laji, on monimutkaisempi kuin mitä voidaan olettaa tutkittaessa yksittäisen julkaistu genomin sekvenssejä lajeittain, ja me varoittaa luonnehtia koko lajin tai evoluutioprosessien tällaisesta rajoitetusti tietoa (esim [13]). Esitämme malli ikivanha laajentamiseen

dmbrca2

BRC toista numero

D. Yakuba

(katso kuva 4) ja viittaavat siihen, että havaitut lyhyempi alleelien esiintymistiheys

D. Yakuba

,

D. santomea

, ja ehkä

D. erecta

ja muiden lajien syntyi supistukset esi pitkä muoto, tuottaa homoplasious alleelit. Tällaiset laajennukset ja supistukset olisivat yhdenmukaisia ​​malleja kehityksen peräkkäisen toiston sekvenssit, kuten microsatellites (esim. [31]). Meidän johtopäätöksemme on alustava, mutta koska emme pysty arvioimaan, millainen mahdollinen geeninsisäiset geenin muuntaminen osallistui toistoja (eli yhtenevät evolution) hankaloittaa meidän päätelmiä – nämä prosessit ovat vaikea täysin selvittää (esim [32]).

Vaikka testaus tarkkaa mekanismia ehdotetun historiallisen lisäykset ja vähennykset BRC toista numero ei kuulu tämän paperin, me väittävät, että havainnot väestön geneettisen ja phylogenetic analyysit Drosophila lajien [18], käsitellä mielenkiintoinen ilmiö ympäröivän tärkeä ominaisuus geenin olennaisia ​​ihmisten terveydelle. Ainakin yksi BRC toista on läsnä jokaisessa organismia, jonka homologia on havaittu, ja ne näyttävät olevan ehdottoman välttämätöntä sovittelu vuorovaikutusta RAD51. Voisi hypothesize että luonnollinen valinta saattaa suosia kasvaa toistojen lukumäärä, koska enemmän toistoja mahdollistaisi tiukemman vuorovaikutus näiden kahden proteiinin välttämättömiä DNA kaksijuosteisen tauon korjaus; kuitenkin, valinta pidempään alleelien saa ulottua jopa tiettyyn pisteeseen, koska Gudmundsdottir ja Ashworth [2] todettiin, että yli-ilmentävät yksi BRC toista nisäkässoluissa todella häiritsee RAD51 hehkulamppuja muodostumisen ja liuottaa esiasennettu säikeet luoda näin BRCA2-puutteellinen fenotyyppi. Pysyvyys Useiden lyhyempiä muotoja

dmbrca2

populaatioissa

D. Yakuba

ja

D. santomea

vastustavat johdonmukaisesti ja voimakkaasti suuntaava valinta pidempään alleelien. Kiehtova mahdollisuus tutkia, onko vaihtelu

dmbrca2

BRC toista numero liitetään vastaavat muutokset

Rad51

järjestyksessä. Jatkaminen tutkimus malleja BRC toista nousu ja lasku mahdollistaa lisävalaistusta huonosti ymmärretty mekanismi säätelevä syöpäalttiutta, tärkeä kysymys lääketieteen tänään.

Kiitokset

Kirjoittajat kiittää L . Bukovnik (IGSP sekvensointi keskus) teknistä apua, J. Coyne varten Drosophila kantoja, VL Roth ja L. Stevison apua lukuja, ja C. Smukowski, S. McDermott, R. Varney, ja kaksi nimettömänä arvioijat hyödyllisiä kommentteja käsikirjoituksen.