Krooninen sairaus

tiivistelmä

Type 1 jodityroniini deiodinase (DIO1) katalysoi prohormone tyroksiinia aktiivisen kilpirauhashormonin 3,3 ’, 5-trijodityroniini (T3), tärkeä säätelijä solujen lisääntymistä ja erilaistumista. DIO1 ilmentyminen pelkistetään yleisin munuaisten neoplasian, kirkas solu munuaissolukarsinooma (ccRCC). MikroRNA ovat pieniä, ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät geenin ilmentymistä posttranskriptionaalisella tasoilla. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia mahdollisia säätely DIO1 ilmentymisen MikroRNA in ccRCC. Bioinformatiikka-analyysi paljasti, että 3’UTR ihmisen

DIO1

Geenitranskriptikuvion sisältää miR-224 ja miR-383 kohdekohtia, jotka ovat säilyneet yli nisäkäslajeista. Semi-kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: ää käytettiin ekspression analysoimiseksi miR-224 ja miR-383 32 näytettä ccRCC kasvainten (T) ja 32 sovitettua kontrolli (C) näytteitä. Havaitsimme tilastollisesti merkitsevä (p = 0,0002), enemmän kuin neljä kertainen lisäys miR-224 ilmaisun ja lähes kaksi kertainen lisäys miR-383 ilmentymisen näytteissä T verrattuna näytteisiin, C. Kasvaimen erityisiä muutoksia ilmentymisessä miR-224 korreloi negatiivisesti muutokset in DIO1 ilmaisun ja solunsisäisen T3 pitoisuus. Transfektio HeLa-solulinja miR-224 ja miR-383 esti aktiivisuus lusiferaasireport- sisälsi 3’UTR

DIO1

. Tämä poistettiin, kun konstruktioita mutatoitua miR-224 ja miR-383 kohdesivustot käytettiin sen sijaan, mikä osoittaa, että miR-224 ja miR-383 sitoutua suoraan

DIO1

3’UTR. Lopuksi indusoima miR-224 Caki-2-soluissa johti merkittävään (p 0,01) vähentäminen

DIO1

mRNA. Tutkimus tarjoaa uuden miRNA-välitteinen sääntelyn mekanismi

DIO1

ilmaisun ccRCC.

Citation: Boguslawska J, Wojcicka A Piekielko-Witkowska A, Master A, Nauman A (2011) MiR -224 tavoitteet 3’UTR tyypin 1 5′-jodityroniini Deiodinase Mahdollisesti edistäminen Tissue kilpirauhasen munuaisten Cancer. PLoS ONE 6 (9): e24541. doi: 10,1371 /journal.pone.0024541

Editor: Marian Ludgate, Cardiff University, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: toukokuu 12, 2011; Hyväksytty: 12 elokuu 2011; Julkaistu: 02 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Boguslawska et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat Puolan valtion komitean tieteellisen tutkimuksen apurahat (NN 401 071 939, NN 401 0386 37), ja Medical Centre jatkokoulutuksen Grant (501-2-1-24-06 /08) (AN). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kilpirauhashormoneja: 3,5,3′-L-(T3) ja tyroksiinin (T4), tärkeä rooli kasvun, kehityksen, erilaistumisen ja sääntely metaboliareitit soluissa. Ihmisen tyypin 1 jodityroniini deiodinase (DIO1), tuote

DIO1

geeni katalysoi kahdenlaisia ​​dejodiointi reaktion, ulompi rengas (5′-jodin – 5’d) ja sisempi-rengas (5-dejodiointi – 5D). Nämä prosessit johtavat, vastaavasti, aktivaatio ja inaktivaatio kilpirauhashormonien (1). DIO1 on selenoenzyme ilmaistu lähinnä maksassa, munuaisissa, kilpirauhasen ja aivolisäkkeen. Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että ilmaus tämän entsyymin häiriintyy eri syöpätyyppien. Esimerkiksi

DIO1

mRNA ja aktiivisuus väheni papillaarinen kilpirauhassyövän (2-5) ja nousi follikulaarisen adenooman ja follikulaarisen kilpirauhassyövän (2). Aiemmissa teokset osoitimme vähentynyt ilmentyminen

DIO1

mRNA ja aktiivisuus (6), ja häiriintynyt vaihtoehtoinen silmukointi on

DIO1

pre-mRNA: n kirkas solussa munuaissyövän (ccRCC) (7).

DIO1

ilmentyminen on myös ehdotettu differentiaatiomarkkeri syöpäsolujen (8, 9).

ccRCC edustaa yleisin munuaissyöpä histologia, jotka edustavat 75% primaarimaligniteetti munuaisen ( 10, 11). Yleisesti käytetty hoito on kirurginen resektio taas kemo- ja sädehoidon pysyvät tehotonta. Mikään ehdotettu useita molekyylimarkkereiden on hyväksytty kliiniseen käyttöön (10).

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä, ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät geenien ilmentymistä kokonaan tai osittain toisiaan täydentäen ja sitoutumisen 3′- alue kohde-mRNA (12, 13) hajottava vaikutus mRNA tai yleisemmin, esto käännös (14-16). Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA tärkeä rooli olennaisia ​​prosesseissa, kuten erilaistumista, lisääntymistä ja apoptoosia (17, 18). Tällä hetkellä saatavat tulokset paljastivat, että miRNA ovat osallisina syövän synnyssä. Usein muutokset miRNA ilmaisun on todettu erilaisissa ihmisen maligniteettien, kuten kilpirauhasen (19), keuhkojen (20), haimassa (21), paksusuolen (22), rinta (23), maksassa (24), eturauhasen (25) tai muita kiinteitä kasvaimia (26, 27). Eri tutkimuksissa on todettu paneelit MikroRNA jotka ilmentyvät eri normaalin munuaisten kudosten ja kasvaimen välillä tai histologisia alatyyppejä munuaisten kasvain (28-33). MicroRNA ilmaisun profilointi on osoittanut monipuolinen kliinisiä sovelluksia diagnosointiin, ennusteen ja ennusteita varten (34, 35). Useat miRNA toimivat onkogeenien tai tuumorisuppressorien, ja useita geenejä, jotka koodaavat miRNA sijaitsevat genomialuetta mukana syöpien (36).

Aikaisemmat tulokset (6) ovat osoittaneet, että DIO1 toimintaa huonosti korreloi sen mRNA-tasolla terveillä munuaisten kudoksiin. Tämä havainto viittaa merkittävää posttranskriptionaalisella sääntely

DIO1

lauseke, joka voitaisiin välittämä miRNA. Siksi Työn tarkoituksena oli tutkia mahdollisuuksia

DIO1

sääntelyä miRNA ja onko vapautuminen DIO1 vuonna ccRCC voi johtua muuttunut toimista miRNA.

Tulokset

Computational ennustuksen miRNA sitoutumisen

DIO1

3’UTR

tunnistamiseksi oletetun miRNA kohdentamista 3’UTR

DIO1

mRNA, käytimme laskennallisia ohjelmia, TargetScan, PicTar, miRBase ja Miranda. 1087 nukleotidit 3’UTR

DIO1

seulottiin täydentävät siemeniin sekvenssejä tunnettujen miRNA. Vain miRNA tunnistetaan vähintään kaksi neljästä itsenäisestä bioinformatiikan lähestymistapoja pidetään lisäanalyysiä varten. Havaitsimme 7 potentiaali miRNA kohdistaminen 3’UTR ihmisen

DIO1

(taulukko 1): miR-224, miR-383, miR-610, miR-659, miR-637, miR-1202 ja asennuspalveli- 1266.

miR-224 ja miR-383 ovat yliekspressoituu ccRCC

Alustavissa tutkimuksissa käytettiin puoli kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (SQ-PCR), päätimme suhteellinen ilmaisu 7 ehdokas miRNA vuonna ccRCC ja pariksi ottelu kontrollinäytteiden 32 käyttävillä potilailla yleispohjamaaliksi UniAmpHindIII (37), jossa sekvenssin homologiaa ulokkeita alukkeiden käytettävien käänteistranskriptio ja miRNA alukkeilla (sekvenssit esitetään Supplemental tietojen taulukossa S2). Havaitsimme eri ilmentymistä miR-224 ja miR-383, kun taas ilmaus viisi muuta ehdokasta miRNA: miR-610, miR-637, miR-659, miR-1202 ja miR-1266 ei eronnut merkitsevästi ccRCC ja kontrollikudoksen (Kuva S1, Supplemental Data).

indusoima miR-224 ja miR-383 ccRCC vahvistettiin tietyllä TaqMan microRNA määrityksessä. Nämä tutkimukset paljastivat tilastollisesti merkitsevä (p = 0,0002) neljän kertaiseksi ekspression miR-224 ja lähes kaksi kertainen lisäys (p = 0,0236) ilmaus miR-383, näytteissä T kontrolliin verrattuna näytteiden C (kuvio 1 ). Mean kertainen muutos miR-224 ja miR-383 analysoitiin eri kasvaimen lajittelusta, mutta ei riipu erilaistumiseen luokan kasvaimen näytteen. Kuitenkin keskimääräinen kertainen muutos miR-224 oli taipumus vähentyä, kun erilaistumista laadut kasvoi G1 G3 (kuva 1).

. Lisääntynyt miR-224 ilmentymisen ccRCC tuumorinäytteessä (T) verrattuna kontrollinäytteitä (C). Ilmaisu on esitetty prosentteina kontrollista C. B. Mean kertaa T: C muutos ilmentymisen miR-224 224 näytteissä jaoteltu kasvaimen erilaistuminen laadut (G1, G2, G3). C. Lisääntynyt miR-383 ilmentymisen ccRCC tuumorinäytteessä (T) verrattuna kontrollinäytteisiin (C). Ilmaisu on esitetty prosentteina kontrollista C. D. Mean kertaa T: C muutos ilmentymisen miR-383 224 näytteissä jaoteltu kasvaimen erilaistuminen laadut (G1, G2, G3). Tiedot annetaan keskiarvona ± SEM n = 32 T, n = 32 C (A ja C), n = 11 G1, n = 11 G2, n = 10 G3 (B ja D). Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen pariksi

t

-testi vertailla C ja T näytettä (A ja C) tai ANOVA vertailla G1, G2, ja G3 näytteet (B ja D) * p 0,05, * ** p 0,001.

Näin häiriintynyt ilmentyminen miR-224 ja miR-383 ccRCC vahvistettiin kahdella eri analyyttisten lähestymistapojen.

miR-224 negatiivisesti korreloi DIO1 ja T3 tasot ccRCC

SQ-PCR-analyysi paljasti 2,7 kertaiseksi downregulation

DIO1

mRNA 32 pariksi kasvain ja ohjaus kudosnäytteistä (p = 0,0009), mikä on sopusoinnussa aiempien raporttien ( 6) (kuvio 2). Kuten kuviossa 2 on esitetty, tilastollisesti merkittäviä kielteisiä korrelaatiota ei havaittu miR-224 ja

DIO1

mRNA kasvain-spesifisen muutoksia ilmaisun (Spearman r

s = -0,556 p = 0,001). Sitä vastoin mitään korrelaatiota ei havaittu miR-383 ja

DIO1

. Lisäksi Western-blot-analyysi suoritettiin yksitoista pariksi näytteitä ccRCC ja normaalin munuaiskudosnäytteillä paljasti menetys DIO1-proteiinin (kuvio 2B).

. Expression of

DIO1

mRNA kudosnäytteistä. n = 32 T ja n = 32 C. Ilmaisu näkyy prosentteina ohjaus C. juoni näyttää mediaani arvot 95%: n luottamusväli koska tietoja ei normaalisti jakautunut. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Wilcoxonin pariksi testiä verrata C ja T näytteitä. *** P 0,001. B. Western-blotti DIO1 suoritetaan pari-sovitettua kontrolli-ccRCC näytteitä. p-aktiinin ilmentymistä käytettiin sisäisenä kontrollina. Neljän edustavan ohjaus (C) ja kasvaimen (T) näytteet on esitetty. C ja D. sirontakaavioissa T: C suhteet

DIO1

mRNA

versus

T: C miR-224 (C) ja T: C miR-383 (D) lauseke suhteet. Ei-parametriset Spearmanin listalla korrelaatio analyysi suoritettiin tietoihin 32 paria ohjaus ja kasvain kudosnäytteitä. p 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. E ja F. sirontakaavioissa T3 pitoisuus T: C-suhde versus T: C miR-224 (E) ja miR-383 (F) lauseke suhteet. Pearsonin korrelaatiota analyysi tehtiin tietoja 11 paria ohjaus ja kasvainkudoksen näytteitä. p 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

DIO1 on säätelijä kilpirauhashormonin hyötyosuuden. Meidän Tuoreessa tutkimuksessa havaitsimme, että T3 pitoisuus aleni ccRCC kasvaimissa verrattuna pari verrokkeihin. Voit tarkistaa, onko miR-224-välitteistä downregulation DIO1 vaikuttaa DIO1 aktiivisuuden tuote, T3, analysoimme korrelaation kasvaimen erityisiä muutoksia miR-224 ja T3 tasot. T3 tasot analysoitiin 11 parin-täsmäsi ccRCC ja kontrollinäytteiden että käytettiin DIO1 Western-blot-analyysi. T3 pitoisuus arvioitiin kuten aiemmin on kuvattu (37). Löysimme tilastollisesti merkitsevä (Pearson r = -0,624, p = 0,04) negatiivinen korrelaatio T: C suhteet miR-224 ja kasvaimensisäisenä T3 (Fig. 2). miR-383 muutoksista teki eikä korreloi T3.

laskenut kasvaimensisäisenä T3 pitoisuudet voivat johtua paitsi vähentynyt ilmentyminen DIO1 mutta myös lisääntynyt aktiivisuus tyypin 3 deiodinase (DIO3), joka on kilpirauhashormonin inaktivoimalla entsyymi. Käyttämällä Q-PCR, analysoimme ilmentyminen DIO3 mRNA 11 parin yhteensopivat ccRCC ja kontrollinäytteitä. DIO3 mRNA oli havaittavissa kaikissa tutkituissa näytteissä (tuloksia ei ole esitetty). Niinpä vahvistettiin, että vähentynyt kasvaimensisäisenä T3 pitoisuudet johtua alensi DIO1 ilme.

Transfektio miR-224 vähentää endogeenistä

DIO1

määrittämiseksi toiminnallinen vaikutus miR -224 ja miR-383 endogeenisen

DIO1

mRNA, Caki-2-solut transfektoitiin pre-miR-224, pre-miR-383 (microRNA esiasteita), anti-miR-224, anti-asennuspalveli- 383 (microRNA estäjät) tai sekoitettua kontrollipeptidiä. Onnistunut transfektio vahvistettiin SQ PCR-analyysiä suuri induktion miR-224 ja miR-383 transfektion jälkeen microRNA esiasteiden ja merkittävä väheneminen miRNA ilme, kun inhibiittoreita käytettiin (kuva 3).

. Expression of

DIO1

mRNA Caki-2 solulinjassa. Solut transfektoitiin 37,5 pmol pre-Mirs, anti-MIRS tai salattu ennalta miR (negatiivinen kontrolli); 48 tunnin kuluttua uutettiin kokonais-RNA myöhempää SQ-PCR-analyysi

DIO1

tasolla. Ilmaisu on esitetty prosentteina kontrollista (transfektoitujen solujen salattu microRNA). Tiedot annetaan keskiarvoina ± SEM. Data analysoitiin ANOVA seurasi Dunnettin monivertailukoetta. ** P 0,01. B ja C. taso miR-224 (B) ja miR-383 (C), jotka oli transfektoitu ennen MIRS tai anti-Mirs. Tulokset on esitetty prosentteina kontrollista (transfektoitujen solujen salattu microRNA). Data on esitetty keskiarvona ± SEM-arvot miRNA normalisoitiin U6 geenin. Data analysoitiin ANOVA seurasi Dunnettin monivertailukoetta. *** P 0,001.

mRNA tasot

DIO1

mitattiin SQ-PCR ja vähennetään merkittävästi (56%, p 0,01) ja

DIO1

transkripti taso jälkeen havaittiin käyttöönoton ennalta miR-224. pre-miR-383 ei ole tätä vaikutusta (kuvio 3). Transfektio Caki-2-solujen anti-miR-224 johti kasvu

DIO1

ilmaisua, 45%, p 0,01 verrattuna sekoitetun ohjaus. Emme havainneet tämän yli-ilmentyminen, kun solut transfektoitiin anti-miR-383 (kuvio 3).

Nämä tiedot osoittavat, että endogeeninen

DIO1

mRNA: n ekspression Caki-2-soluissa moduloidaan miR -224.

Euroopan 3’UTR

DIO1

on suora kohde miR-224 ja miR-383

Computational analyysi

DIO1

3 ’UTR kanssa TargetScan5.1 paljasti kahden mahdollisen sitoutumiskohtia miR-224 ja miR-383, joka sijaitsee nukleotidien 1788-1794 ja 898-904 on

DIO1

transkripti (NM_00792.5), vastaavasti (kuva S2 Supplemental Data). Nämä kaksi sivustot ovat konservoituneita nisäkäslajeista. Tutkia suoran vuorovaikutuksen miR-224, miR-383 ja

DIO1

transkriptio kloonasimme 3’UTR

DIO1

alavirtaan lusiferaasireportterigeenillä on pGL3-kontrollivektorin – (DIO1-3’UTR). Ohjaus plasmidi, jossa DIO1 3 ’UTR insertoitiin käänteinen orientaatio (DIO1-rev3’UTR) rakennettiin myös. Samanaikaisesti, loimme kaksi uutta toimittaja rakentaa, jossa konservoituneet kohdistamalla alueille oli erityisesti mutatoitu, poistaa sitoutumisen miRNA (kuvio 4). HeLa-solulinja, joka osoittaa alhaisen endogeenisen ilmentymisen

DIO1

käytettiin transfektiokokeissa. Solut kotransfektoitiin saatiin rakentaa ja esiasteiden MikroRNA: pre-miR-224, pre-miR-383 tai ohjaus (salattu miRNA). HeLa-soluissa ohimenevästi transfektoitu

DIO1

-3’UTR konstrukti ja miRNA esiasteita, merkittävä inhibitio lusiferaasiaktiivisuutta havaittu. Sekä miR-224 ja miR-383 aiheutti laskun lusiferaasiaktiivisuudessa noin 45% ja 25%, vastaavasti, verrattuna kontrolliryhmään salattu miRNA. Sekä pre-miRNA ei kohdista merkittävää vaikutusta

DIO1

-rev3’UTR ja tyhjä pGL3-Control-vektoriin (kuvio 4).

.

DIO1

3’UTR kloonattu alavirtaan lusiferaasin pGL3-Control vektori. Villityypin ja mutatoidun 3’UTR

DIO1

siemenellä alue (lihavoitu) ja pohja vaihdot (isolla ja alleviivattu) poistamalla sitova tietyn miRNA (todennettu

in silico

) on esitetty alla. Kahdenlaisia ​​3’UTR mutantteja rakennettiin:

DIO1

-3’UTR224mut ja

DIO1

-3’UTR383mut. B. Dual lusiferaasianalyysissä. Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus konstruktien kanssa 3’UTR

DIO1

:

DIO1

-3’UTR,

DIO1

-rev3’UTR,

DIO1

-3’UTR224mut,

DIO1

-3’UTR383mut ja pGL3-ohjaus, kun läsnä on ennalta miRNA tai salattu ennalta miRNA (negatiivinen kontrolli). Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM ja esitetään prosentteina kontrollista (transfektoitujen solujen salattu microRNA). Jokainen pylväs edustaa arvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta mitattuna kolmena rinnakkaisena. Suhteellinen aktiivisuus tulikärpäsen lusiferaasi ilmentymisen normalisoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Data analysoitiin ANOVA seurasi Dunnettin monivertailukoetta. ** P 0,01.

lusiferaasiaktiivisuus toimittaja konstruoi:

DIO1

-3’UTR224mut ja

DIO1

-3’UTR383mut, jossa kohde sivustoja tunnustettu microRNA mutatoitiin, ei ollut vaikutusta transfektion ennalta miR-224 tai pre-miR-383, vastaavasti (kuvio 4). Tämä havainto vahvisti toimintaspesifisyys molempien MikroRNA kuin mutaatio tunnistuskohdan pitäisi estää välillä miRNA sitoutumisen 3’UTR. Mikä on tärkeämpää, mutaatio tunnistuskohdan yhden mikroRNA ei vaikuttanut sitoutumiseen muiden analysoitu miRNA. Lusiferaasiaktiivisuus transfektoiduissa soluissa

DIO1

-3’UTR383mut estyi 40% sen jälkeen, kun ennalta miR-224 lisäksi, kun taas transfektio

DIO1

-3’UTR224mut ja pre-asennuspalveli- 383 johti ~23% lusiferaasiaktiivisuuden pienenemiseen (kuvio 4).

yhdessä nämä tiedot osoittavat, että 3’UTR

DIO1

sisältää erityisiä sitoutumiskohtia MikroRNA miR-224 ja miR-383.

keskustelu

tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet ensimmäistä kertaa, että tyypin 1 jodityroniini deiodinase transkriptio on välitön toiminnallinen tavoite microRNA miR-224. Sitoutuminen miR-224

DIO1

3’UTR tuloksia downregulation endogeenisen

DIO1

ilmentymistä munuaissyöpäsoluissa. Lisäksi

DIO1

3’UTR sisältää erityisiä konservoituneet sitoutumiskohdat miR-224 ja miR-383, kuten osoitti lusiferaasireportterilla määrityksissä. Molemmat MikroRNA ovat selvästi yliekspressoituvat selkeä solujen munuaisten syöpä ja mahdollisesti osuus menetys

DIO1

ilme kasvaimen. Tämä on tuettu negatiivinen korrelaatio kasvaimen-erityisiä muutoksia miR-224 ja

DIO1

mRNA-tasoja ja menetys DIO1 proteiinin ccRCC näytteissä. Lisäksi kasvain-spesifisen konsentraation muutoksia tuotteen DIO1 toiminnan, T3, korreloivat negatiivisesti muutokset miR-224 ilmentymistä. Nämä tulokset antavat vahvaa näyttöä uudella mekanismilla on

DIO1

sääntelyä.

sääntelymekanismeissa

DIO1

ilmaus tunnetaan huonosti. Aiemmissa tutkimuksissa havaitsimme välisen korrelaation puuttuminen DIO1 proteiinin ja mRNA tasolla ccRCC (6), joka ehdotti mahdollista osallistumista posttranskriptionaalisella mekanismeja, kuten microRNA riippuvaa asetusta. Esillä olevassa tutkimuksessa havaittiin lähes 3-kertaiseksi vähentäminen

DIO1

mRNA: n ilmentymisen, kun taas DIO1 proteiini hävisi tuumorinäytteissä. Mielenkiintoinen havainto tässä tutkimuksessa on, että ilmaus miR-224 on taipumus muuttua kasvaimen erilaistumiseen laadut ja on korkein G1 ja alhaisin G3 (Fig. 2). Vaikka nämä muutokset välillä vastaavien kasvain eriyttäminen laadut eivät ole tilastollisesti merkittäviä ne voivat mahdollisesti viittaavat siihen, että kun kasvain edetä vaikutus miR-224

DIO1

ilmaisun alentaa ja ehkä muitakin posttranskriptionaalisella mekanismit ovat mukana. Kuten olemme aikaisemmin osoittaneet, toinen mekanismi edistää heikentynyt DIO1 ilmentymisen ccRCC on sen häiriintynyt vaihtoehtoisen silmukoinnin seurauksena mahdollisesti ilmentymisen muutosten silmukoinnin tekijöiden (7, 38). Suoritetuissa kokeissa on Caki-2-soluissa, miR-383 ei vaikuttanut endogeenistä DIO1. Tämä saattaa viitata, että miR-383 säädökset on posttranskriptionaalisella tasolla, aiheuttaen käännös tukos sijaan hajoaminen

DIO1

mRNA. Toinen mahdollisuus on se, että muiden tekijöiden (mukaan lukien miR-224) voi kohdistaa voimakkaampi vaikutus DIO1 ilmaisun ccRCC. Tätä ajatusta tukee tulokset reita kokeista, joissa aiheuttama miR-383 ilmentyminen johti vain 25%: n vähennys lusiferaasiaktiivisuuden verrattuna vaikutus miR-224, joka aiheutti 45% downregulation ilmaisun. Luciferase kokeet vahvistavat oletusta, että sitoutuminen miR-383

DIO1

3’UTR tuloksia käännöksessä tukos, koska lusiferaasiaktiivisuutta on suoraa seurausta todellisista lusiferaasiproteiinin tasoilla.

Koska muuttunut ilmentyminen miR-224 ja miR-383 havaittiin kasvainten kudokset ilmentävät tyypin 1 jodityroniini deiodinase se viittaa siihen, että nämä kasvaimet voivat myös esittää häiriintynyt ilmaus

DIO1

. Itse asiassa papillaarinen kilpirauhassyövän, ilmentyminen miR-224 oli merkittävästi koholla (39) samalla kun tutkimukset paljastivat, että tämä syöpä, ilmaus

DIO1

vähenee (3). Toisaalta, rintasyövän, miR-383 on menetetty (40), kun taas

DIO1

ilmentyminen lisää merkittävästi (41). Olipa heikentynyt ilmentymä

DIO1

todella johtuu muuttunut miR-224 ja miR-383 tasot näistä syövistä on arvioitava erillisillä tutkimuksissa.

merkitys havaintomme tulee roolista DIO1 solujen fysiologiaa. DIO1 on säätelevä entsyymi hyötyosuus kilpirauhashormonien. Äskettäin esitettiin, että DIO1 ei edistä kiertävän T3 tasoa, vaan toimii raadonsyöjä entsyymi osallistuu jodidi kierrätys (42). Kuitenkin se mahdollisuus, että DIO1 edistää paikallisesti syntetisoitu T3 DIO1 ilmentävät kudoksissa ei voida sulkea pois, koska se oli aiemmin ehdottanut (43, 37). Siten MikroRNA säännellään DIO1 ilmentymistä ccRCC voi olla mahdollinen vaikutus kasvaimensisäisenä kilpirauhashormonien määrän. Kuten osoitamme tässä tutkimuksessa, kasvain-erityisiä muutoksia solunsisäisessä T3 pitoisuus korreloivat muutosten miR-224 ilme. Mielenkiintoista on, että meidän tuoreessa tutkimuksessa havaittiin, että transkriptio tyroidihormonireseptorin beeta-geenin (

THRB

) on myös tavoite microRNA riippuva asetus (37). miR-204 yliekspressoituu ccRCC ja johtaa samanaikaisen downregulation on

THRB

ilme. Nämä tulokset yhdessä havainnot toteamme, että MikroRNA saattaa osaltaan kudoksen kilpirauhasen ccRCC johtaen downregulation keskeisten geenien kilpirauhashormonin koulutusjakson,

THRB

ja

DIO1

ja tämän seurauksena , mikä johtaa lasku kasvaimeen T3 tasoilla. Tämä on tärkeä havainto, koska useat tutkimukset osoittivat, että THRB voi toimia tuumorisuppressorina ja että kilpirauhasen vajaatoiminta voi vaikuttaa kasvaimen kasvua (44-48). Siten microRNA riippuva sääntely solunsisäisten kilpirauhasen tila voi mahdollisesti olla potentiaalia vaikuttaa neoplastisia prosessi. Kiinnostavaa kyllä, tämä saattaa olla hieman yleisempi ilmiö kasvaimissa häiriintynyt ilmaus

DIO1

ja

THRB

. Meidän äskettäisessä tutkimuksessa useita MikroRNA jotka yläreguloituja papillaarinen kilpirauhasen kasvaimet (PTC) osoitettiin suoraan kohdistaa THRB transkriptio aiheuttaa merkittäviä downregulation sen ilmaisun (49). Olisi kiinnostavaa tarkistaa, onko ilmaus MikroRNA kohdistaminen

DIO1

myös häiriintyy PTC kasvaimia. Meidän aikaisemmat tutkimukset osoittivat, että menetys DIO1 ilmentymisen PTC mukana välisen korrelaation puuttuminen mRNA: n ja proteiinin ilmentymistä (3). Tämä viittaa mahdollista posttranskriptionaalisella asetuksen lukien microRNA osallistuminen. Kuitenkin myös alentunut

DIO1

ilmentymisen PTC tuloksia microRNA välittämää sääntelyn täytyy todentaa lisätutkimuksia.

Disturbed microRNA ilmaisun ccRCC on jo raportoitu muissa tutkimuksissa. Mielenkiintoista, joukossa MikroRNA eri ilmaistu ohjaus ja Tuumorinäytteissä miR-224 on toistuvasti todettu riippumattomissa tutkimuksissa (30, 33, 50). Tämä viittaa mahdolliseen käyttöön miR-224 markkerina erottaa ccRCC kasvaimia terveistä kudoksista. Mitä miR-383, se ilmoitettiin vaimentua maksasolukarsinoomassa (51), rinta- ja munasarjasyövän syöpiä, melanooma (40), akuutti myelooinen leukemia (52) ja keskushermoston kasvaimia (53). Näin työmme on ensimmäinen osoittaa ylössäätely miR-383 syövässä. Onko tämä erityinen piirre munuaisen kasvain vielä tarkastettava tulevien kokeita. Molemmat MikroRNA, miR-224 ja miR-383 uskotaan olevan osallisena valvonnassa leviämiseen tai apoptoosin. miR-224 on osoitettu lisäävän apoptoottista solukuolemaa ja lisääntymistä maksasolukarsinoomassa (54), kun taas yliekspressio miR-383 inhiboi proliferaatiota kivesten alkion karsinoomasolut (55). Kysymys siitä miR-224 ja miR-383 ovat mukana ccRCC leviämisen odottaa tulevissa tutkimuksissa.

Yhteenvetona osoitimme, että

DIO1

3’UTR on kohdistettu kaksi MikroRNA: miR-224 ja miR-383. miR-224 välittää menetys DIO1 munuaisten syöpä, mitä tuloksia alentuneeseen kasvaimensisäisenä T3 pitoisuus. Nämä tulokset antavat vahvaa näyttöä uuden mekanismin ekspressiota sääteleviä tyypin 1 jodityroniini deiodinase. Aiemmat kertomukset osoittivat, että häiriintynyt ilmentyminen THRB, toinen geeni kilpirauhashormonin koulutusjakson, havaittiin ccRCC, voi johtua myös microRNA riippuvaa sääntelyn purkaminen. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että uuden luokan pienten, ei-koodaavat RNA: t voivat mahdollisesti edistää solunsisäisen kilpirauhasen ccRCC.

Materiaalit ja menetelmät

kudosnäytteitä ja solulinjoissa

otettiin kudosnäytteet luvalla bioetiikan komitean Medical Centre jatkokoulutuksen Varsovassa potilailla, joilla on selkeät cell munuaissolukarsinooma (32 potilasta). Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta mukana tässä tutkimuksessa. Näytteet jaettiin kahteen ryhmään: kasvaimen näytteet (n = 32, T) ja kontrollinäytteitä (pariksi normaalin kudoksen vastakkaisesta napa pahanlaatuisten munuaisten ilman histologiset kasvaimen; n = 32, C). Tyhjennä solu munuaissyöpä oli diagnosoitu histologisesti mukaisesti WHO: n kriteerien (56). Kasvaimet jaettiin kolmeen ryhmään sen mukaan, luokka erilaistumisen: G1 (no eriytetty), G2 (väli-tason eriyttäminen), G3 (huonosti eriytetty syövät).

Kohdunkaulan syöpä (HeLa) ja selkeä solu munuaissyövän syöpä (Caki-2) solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa hankittiin American Type Culture Collection, (USA) ja niitä viljeltiin mukaisesti ATCC-protokollaa. Solut siirrostettiin 12-kuoppaisille viljelylevyille tiheydellä 5 x 10

4 (Caki-2) tai 1 x 10

5 (HeLa) solua /kuoppa 24 h ennen transfektiota.

Luciferase Reporter Constructs

1023 emäsparin fragmentti

DIO1

monistettiin käyttämällä cDNA HeLa-solulinjasta (alukkeet

DIO1

-3’UTR F ja R, taulukko S1, Supplemental data), kloonattiin Xbal-site välittömästi alavirtaan lopetuskodonista on pGL3-Control Firefly lusiferaasireporttiterilla vektorin (Promega, USA), sekvensoitiin ja nimettiin

DIO1

-3’UTR tai

DIO1

– rev3’UTR riippuen orientaation kloonatun insertin. Käänteisesti asetettu

DIO1

-rev3’UTR käytettiin negatiivisena kontrollina vektori. Kohdennettu mutageneesi on miR-224 ja miR-383 kohdesivustot: GTGACTT Mir-224 sisällä nt 1788-1794 ja TCTGATCT Mir-383 sisällä nt 898-904

DIO1

3’UTR oli suoritettiin käyttäen nopea vaihto-mutageneesin kittiä (Stratagene, Saksa). Primers Mut224 F /R ja Mut383 F /R (taulukko S1, Supplemental data) ja

DIO1

-3’UTR plasmidia templaattina käytettiin. Kaksi konstruktioita:

DIO1

-3’UTR224mut ja

DIO1

-3’UTR383mut saatiin.

Sekvensointi reaktio suoritettiin käyttämällä BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA).

solut transfektio ja lusiferaasin määritys

Caki-2-soluja ympättiin 0,5 x 10

5 solua per 12-kuoppaisten astia ja transfektoitujen 24 tuntia myöhemmin käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen, USA) valmistaja on kuvannut 37,5 pmol miRNA esiasteiden: pre-miR-224 ja pre-miR-383 (pre-miR

™ miRNA esivaihemolekyylin, Ambion, USA), miRNA estäjät: anti -miR-224 ja anti-miR-383 (anti-miR ™ miRNA Inhibitor Molecule, Ambion, USA) tai kontrolli salattu microRNA (Negative microRNA ohjaus, Ambion, USA). Solut kerättiin 48 tunnin jälkeen ja RNA.

miRNA esiasteita ovat synteettisiä RNA-dupleksit, jotka jäljittelevät endogeenisen miRNA, kun taas inhibiittorit on sekvenssi, joka on komplementaarinen kypsä miRNA ja toiminto pidättävää /hajottavien endogeenisen miRNA.

Jos reportterigeenin määritykset, HeLa-solut ympättiin 1 x 10

5 12-kuoppalevyille ja 24 tuntia myöhemmin, kotransfektoitiin Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen, USA). Jokainen kotransfektio reaktio sisälsi 100 ng PRL-TK vektorin (Promega, USA) ilmennetään Renilla lusiferaasi, 1 ug pGL-3 ’UTR vektoreita ja 37,5 pmol ennalta Mirs tai salattu microRNA. 48 tunnin jälkeen solut lyysattiin ja lusiferaasiaktiivisuus analysoitiin dual-lusiferaasi-määritys (Promega, USA) käyttäen Synergy2 luminometriä (BioTek, USA). Firefly lusiferaasiaktiivisuudeksi normalisoida Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Kaikissa kokeissa, transfektio ja lusiferaasin määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

RNA: n eristys ja käänteinen transkriptio

Solun kokonais-RNA eristettiin kuten aiemmin on kuvattu (37). Käänteistranskriptio suoritettiin käyttäen RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Liettua). Käänteistranskriptioon, 200 ng kokonais-RNA: ta käytettiin Random heksameerialukkeita tai erityisiä varsi-silmukka-alukkeita 5′-ulokkeita (taulukko S2, Supplemental data) varten MikroRNA.

cDNA miR-224 ja luki- 383 syntetisoitiin myös erityisiä miRNA alukkeita TaqMan MicroRNA määritykset (Applied Biosystems, USA) ja reagensseja TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems, USA).

SQ-PCR

DIO1

ilmentymisen analyysi Caki-2-soluissa tehtiin käyttämällä DNA SYBR Green I Master (Roche Diagnostics, Saksa) kolmena kappaleena mukaan valmistajien protokollia. SQ-PCR-reaktio suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: 95 ° C: ssa 10 min., 45 jaksoa: 95 ° C, 15 s; 57 ° C, 15 s; 72 ° C, 15 s, 68 ° C, 15 s; minkä jälkeen sulamiskäyräanalyysi: 95 ° C, 5 min .; 65 ° C, 1 min .; jatkuva lukeminen fluoresenssin 65 ° C: sta 97 ° C: 0,11 ° C /s muutosnopeus ja 5 yritysostojen jokaista ° C. Tulokset normalisoitiin esittämiseen 18sRNA isäntä-geenin

RN18S1

.

DIO1

ja

DIO3

ilmentymisen analyysi kudosnäytteistä suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu (37). Sekvenssit alukkeet esitetään taulukossa S1, (Supplemental data). A).