Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä on hyvin yleinen syöpä miehillä. Perinteiset hoidot eturauhasen syöpä on rajoitettu tehoa; Siksi, uusia terapeuttisia strategioita ja /tai uusi adjuvantti lääkkeitä on tutkittava. Punainen riisi (RYR) on perinteinen ruoka mauste valmistettu Aasiassa käymisen valkoista riisiä

Monascus purpureus

Meni hiiva. Kertyvät todisteet osoittavat, että RYR on antituumorivaikutus. Tässä tutkimuksessa, PC-3-solut (ihmisen eturauhasen syöpäsolujen) käytettiin tutkimaan syövän ionisoivan säteilyn (IR) yhdistettynä monascuspiloin (MP, keltainen pigmentti eristetty

Monascus pilosus M93

– fermentoitu riisi) ja määrittämään mekanismit näiden vaikutusten

in vitro

ja

in vivo

. Huomasimme, että IR yhdistettynä MP osoitti lisääntynyt terapeuttinen teho verrattuna jompikumpi hoito yksinään PC-3-solut. Lisäksi, yhdistetty hoito tehostaa DNA-vaurioita ja solulimakalvostoon (ER) stressiä. Yhdistetyt indusoi ensisijaisesti autophagy PC-3-soluja, ja solukuolemaa, joka on saatu aikaan yhdistetty hoito oli pääasiassa seurausta inhibition Akt /mTOR signalointireittejä. Eräässä

in vivo

tutkimuksessa yhdistelmähoito osoitti suurempaa anti-kasvaimen kasvua vaikutuksia. Nämä uudet havainnot osoittavat, että yhdistetty hoito voisi olla mahdollinen terapeuttinen strategia eturauhassyöpään.

Citation: Chiu H-W, Fang W-H, Chen Y-L, Wu M-D, Yuan G-F, Ho S-Y, et ai. (2012) Monascuspiloin Parantaa säteilyherkkyys ihmisen eturauhassyöpäsolujen stimuloimalla Endoplasmakalvosto Stressi ja aiheuttaminen Autophagy. PLoS ONE 7 (7): e40462. doi: 10,1371 /journal.pone.0040462

Editor: Kevin Camphausen, NIH, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 18 toukokuu 2012; Julkaistu: 3. heinäkuuta 2012

Copyright: © 2012 Chiu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Elintarviketeollisuus tutkimuksen ja kehittämisen instituutin ja taloudellisen tuen (101-EY-17-A-01-04-0525) ja talousministeriön, National Science neuvosto, Taiwan (NSC 100-2314-B- 006 -055), The Sinlau Christian Hospital, Tainan, Taiwan, Food and Drug Administration, Department, Executive Yuan (DOH101-FDA-41301) ja Tavoite Top yliopiston Project. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

punainen riisi (RYR), joka tunnetaan myös nimellä punainen Koji tai ”Hongqu”, käsittää pääasiassa nonglutinous riisi, punainen hiiva, ja sivutuotteet käymisen. RYR on perinteinen ruoka mauste kulutetaan Aasiassa [1]. Se valmistetaan käymisen ruoka sieni,

Monascus

lajeja, riisin kanssa ja sitä on käytetty yli 600 vuotta tuottaa viinejä ja muita käymisteitse elintarvikkeita. Useita lajeja sieni

Monascus

on laajalti käytetään tekemään punaviiniä ja punainen soija juusto [2].

Monascus

-fermented tuotteilla on monia toiminnallisia sekundäärimetaboliitteja, kuten olevalla tuotteella, sitriniini, ankaflavin, ja monascin. Useissa viimeaikaisissa tutkimuksissa, nämä sekundäärimetaboliitteja ovat osoittaneet tulehdusta, anti-oksidatiivisen, ja antituumoriaktiivisuuksia [3], [4]. Monet tutkimukset ovat myös tutkineet syövän kyky RYR, kuten paksusuoli-, rinta-, keuhko-, ja eturauhassyövän [3]. Luokat polyketide rakenteita, jotka johtuvat käymisen kutsutaan monacolins, ja suurin monakoliini löytyy RYR on monakoliini K [5]. Kuitenkin RYR osoitti voimakkaampi inhibitio syöpäsolun kasvua verrattuna monakoliini K [6], [7]. Kuitenkin muut polyketidit vuonna RYR voi antaa kasvitieteellinen lähestymistapa syövän hoito, joka ansaitsee lisätutkimuksia.

Eturauhassyöpä on maailman yleisin maligniteetti ja toiseksi yleisin kuolinsyy syöpään [8]. Aikaisen vaiheen eturauhassyöpä androgeeniriippuvaisissa ja voidaan hoitaa tehokkaasti androgeeniablaatio hoito, säteily, ja /tai leikkaus. Kuitenkin eturauhasen syöpäsolujen etukäteen androgeenista riippumaton valtio, jossa he voivat edetä ja johtaa etäpesäkkeiden ja kuolema [9]. Koska kemoterapiaa ja sädehoitoa ovat varsin tehoton ja metastasoitunut tautien usein kehittää vielä leikkauksen jälkeen, on rajallisesti hoitomahdollisuuksia eturauhassyövän [10]. Näin ollen uusia menetelmiä eturauhassyövän hoitamiseksi on kehitettävä. Kertyvät näyttö on osoittanut, että hankittu resistenssi sädehoitoa voidaan voittaa käyttämällä pienimolekyylisiä yhdisteitä, jotka kohdistuvat keskeiset osallistuvien proteiinien säteilyn kestävyys [11]. Syövän vastaisia ​​hoitomenetelmät, kuten ionisoiva säteily (IR), voi aktivoida solujen apoptoottisen koneiston androgeeni-riippumaton eturauhassyöpä solujen [12]. Kuitenkin osti säteilyn kestävyys voi kehittyä hormoni tulenkestävät eturauhassyöpä, joka liittyy apoptoosin vastus [13]. Aikaisemmat tutkimukset ovat myös osoittaneet, että puutteet apoptoottisen koneiston korreloivat vastus syöpäsolujen nykyisten hoitomuotojen kuten IR [14].

Autophagy on tärkeä catabolic prosessin syyllistyneet halventavaan ja kierrätys pitkäikäinen proteiinit, soluaggregaateiksi ja vaurioituneet organelles. Sen lisäksi, että hyvin dokumentoitu rooli autophagy solujen selviytymisen, toiminto autophagy solukuolemaan on jo pitkään ollut ehdotettu [15]. Viime vuosina rooli autophagy vaihtoehtona solukuoleman mekanismi on ollut keskusteltu. Tutkimukset ovat käynnissä määritellä optimaalinen strategioita moduloida autophagy syövän ennaltaehkäisyyn ja hoitoon sekä hyödyntää autophagy kuin kohteena syöpälääkettä löytö [16]. Aktivointi PI3-kinaasi /AKT, tunnettu menetelmää estää apoptoosin, myös estää autophagy [17]. Akt fosforyloi nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR), joka on raportoitu estävän induktion autophagy [18]. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että endoplasmakalvostoon (ER) stressivasteen, yhdessä autophagy edustaa adaptiivisen tukimekanismi solujen eloonjäämistä vasteena hyvin erilaisia ​​haitallisia olosuhteissa [19]. ER stressi aktivoi joukko signalointi polkuja, jotka ovat kollektiivisesti kutsutaan taitettuna Protein Response (UPR). Tyypillisesti UPR signalointi edistää solujen eloonjäämistä parantamalla tasapaino proteiinin kuorman ja taitto kapasiteettia ER [20]. Kuitenkin, jos solut altistetaan pitkäaikaisen tai selkeää ER stressiä, solut kuolevat apoptoosin [21]. Lisääntyvä todistusaineisto on osoittanut, että ER stressi on myös voimakas liipaisinta autophagy [22]. Siten ymmärtää paremmin signalointi polkuja, jotka ohjaavat ER stressin aiheuttama autophagy ja solujen kohtalo toivottavasti avaa uusia mahdollisuuksia syövän hoidossa.

(A) kemiallinen rakenne MP. (B) Pitoisuus riippuvia vaikutuksia MP elinkelpoisuudesta PC-3-solut. Soluja käsiteltiin 5, 15, 25, 35 tai 45 uM MP 48 tuntia. *,

p

0,05, MP vs. kontrolli. (C) sytotoksiset vaikutukset soluissa, joita käsiteltiin IR (4 Gy) ja /tai MP (25 uM). #,

p

0,05, IR vs. yhdistetty hoito. *,

p

0,05, MP vs. yhdistetty hoito. (D) säteilyannos-vaste eloonjäämiskäyrien PC-3-solujen kanssa tai ilman MP. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Monascuspiloin (MP), keltainen pigmentti eristettiin ensin meidän ryhmä

Monascus pilosus M93

-fermented riisi, on rakenteellisesti samanlainen kuin tunnettu

Monascus

pigmenttiä monascin. Kuitenkin mekanismit vaikutukset MP yhdistettynä IR eturauhassyöpään ovat suurelta osin tuntemattomia. Esillä olevassa tutkimuksessa, PC-3-soluja (androgeenistä riippumaton ihmisen eturauhasen syöpäsolujen) käytettiin tutkimaan syövän vaikutukset IR yhdistettynä MP

in vitro

ja

in vivo

. Tyypit indusoimaa solukuolemaa IR yhdistettynä MP tutkittiin. Tutkimme myös mahdollisia mekanismeista solukuolema IR- ja /tai MP PC-3-solut.

Gy) ja MP (25 uM). Hännät osoittavat DNA-vaurioita. (B) vaikutus MP tai IR yksinään tai yhdessä 48 tuntia keskimäärin hännän DNA. #,

p

0,05, IR vs. yhdistetty hoito. *,

p

0,05, MP versus yhdistelmähoito.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen eturauhassyöpäsolulinja PC-3 (ATCC CRL-1435) saatiin the American Type Culture Collection (ATCC). Soluja viljeltiin RPMI 1640-väliaineessa (Gibco BRL, Grand Island, NY), jota on täydennetty antibiooteilla, joka sisälsi 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä (Gibco BRL, Grand Island, NY) ja 10% naudan sikiön seerumia (HyClone, South Logan, UT, USA). Soluja inkuboitiin kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa. Eksponentiaalisesti kasvavat solut irrotettiin käyttäen 0,05% trypsiini-EDTA (Gibco BRL, Grand Island, NY) RPMI 1640 -alustassa.

(A) Early apoptoosin, havaita käyttämällä anneksiini V apoptoosin havaitseminen pakki, mitattiin virtauksen cytometry. Soluja käsiteltiin IR (4 Gy) ja MP (25 uM) 48 tunnin ajan. (B) kehittäminen Avós PC-3-solut. Havaitseminen vihreä ja punainen fluoresenssi in AO-värjättyjen solujen avulla virtaussytometrialla. (C) kvantifiointi Avós AO-värjättyjen solujen käsiteltiin IR (4 Gy) tai MP (25 uM) yksin tai yhdessä virtaussytometriaa käyttämällä. #,

p

0,05, IR vs. yhdistetty hoito. *,

p

0,05, MP vs. yhdistetty hoito. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta kolmesta itsenäisestä kokeesta. (D) EM mikrovalokuvia PC-3-soluja käsiteltiin IR (4 Gy) ja MP (25 uM) 48 tunnin ajan.

valkoiset nuolet

valitse autophagic vacuoles ja autolysosomes. (E) Western blotting varten LC3-I, LC3-II, P62 /SQSTM1 ja Atg5-12 PC-3-solut. Soluja käsiteltiin IR (4 Gy) ja MP (25 uM) 48 tunnin ajan.

Mikro-organismi ja valmistelu monascuspiloin (MP) B

Monascus pilosus M93

saatiin BCRC, FIRDI (Hsinchu, Taiwan) ja säilytetty peruna dekstroosiagarille (PDA, Difco). Kanta levitettiin PDA-levyillä ja viljeltiin 25 ° C: ssa 7 päivää. Itiöt pestiin sitten pois PDA-levyyn steriiliä vettä ja pitoisuus Itiösuspensiota säädettiin 1 x 10

6 /ml. Sen jälkeen itiöt rikastamiseen vaihe, 1 ml itiösuspensiota ympättiin 250 ml: n ravistelupulloissa, jotka sisälsivät 50 ml RGY väliaineen (3% riisitärkkelys, 7% glyserolia, 1,2% polypeptoni, 3% soijajauhoa, 0,1% MgSO

4 ja 0,2 % NaNO

3) ja viljeltiin ravistellen (150 rpm) 25 ° C: ssa 3 päivää saada rihmasto liemi M93. Tuotantoon RYR, viidenkymmenen 450 ml: n lasipulloihin, joista kukin sisältää 75 g riisiä ja 75 ml D.I. vettä, steriloitiin 20 minuuttia 121 ° C: ssa. M93 rihmasto liemi (7,5 ml) ja RGY väliainetta (7,5 ml) lisättiin jokaiseen pulloon. Bottltes inkuboitiin sitten 25 ° C: ssa 21 päivää (7,5 ml RGY väliainetta lisättiin jokaiseen pulloon on 10

päivänä inkubaation), ja sisältöä lyofilisoitiin sitten veden poistamiseksi. RYR (1 kg) uutettiin käyttäen 95%: ista etanolia (3 I) 25 ° C: ssa 24 tunnin ajan, ja etanoli poistettiin vakuumissa kuivaamalla, jolloin saatiin raaka RYR uutetta. Määrä MP on raakauutteista mitattiin käyttäen HPLC kanssa purospher® tähti RP-18-pylvästä (Merck). Liikkuva faasi käsitti 60% asetonitriiliä, joka sisälsi 0,1% fosfaattia virtausnopeudella 1,0 ml /min. RYR (1 kg) uutettiin sitten 70% etanolia (3 I) 25 ° C: ssa. Suodatuksen jälkeen etanoli Uute konsentroitiin ja etyyliasetaattia (EA), lisättiin, jolloin saatiin EA-liukoinen fraktio. EA-liukoinen fraktio oli injektiona silikageelipylväällä (70-230, 230-400 mesh, Merck) ja eluoitiin käyttäen n-heksaani /etyyliasetaatti (02:01). Saada MP, eluoitu fraktio konsentroitiin alennetussa paineessa ja puhdistettiin käyttäen preparatiivista ohutlevykromatografialla (silikageeli 60 F-254, Merck), jossa

n

-heksaani /EtOAc: tä (02:01).

Gy) ja /tai MP (25 uM) 48 tunnin ajan.

Optiset rotaatiot mitattiin Jasco P-1020 digitaalinen polarimetrillä. UV-spektrit saatiin MeOH: ssa käyttämällä Jasco UV-240 spektrofotometrillä, ja IR-spektrit (KBr tai laimentamaton) saatiin käyttämällä Perkin-Elmer System 2000 FT-IR -spektrometriä. 1D (

1H,

13C, DEPT) ja 2D (COSY, NOESY, HSQC, HMBC) NMR-spektri käyttäen CDCI

3 ja CD

3OD liuottimina, rekisteröitiin käyttäen Varian Unity Plus 400 (400 MHz

1H-NMR, 100 MHz

13C-NMR) ja Varian INOVA-500 (500 MHz

1H-NMR, 125 MHz

13C-NMR) spektrometri. Kemiallisten siirtymien viitattu sisäiseen liuotin signaalien CDCI

3 (

1H, δ 7,26;

13C, δ 77,0), ja TMS: ää käytettiin sisäisenä standardina. Matalan resoluution ESI-MS-spektrit saatiin käyttämällä API 3000 (Applied Biosystems), ja korkean resoluution ESI-MS-spektrit obstained käyttäen Bruker Daltonics APEX II 30e spektrometri.

Gy) tai MP (1 mg /kg x 6) yksin tai yhdessä. (A) Paino nude-hiirissä, mitataan kerran viikossa. (B) Kasvaimen tilavuus nude-hiirissä, mitattiin joka toinen päivä. Data esitetään suhteellinen kasvaimen tilavuus (keskiarvo ± keskivirhe) normalisoitu alkuperäiseen kasvaimen tilavuus mitattiin vuorokautena 0. (C) Suora havaintoja hiirten kasvaimia. Seuraavissa kokeissa, hiiret tapettiin ja tuumorit poistettiin. (D) Mittaus kasvaimen painoa nude-hiirten lopettamisen jälkeen. (E) immunohistokemiallinen (IHC) ja hematoksyliinillä ja eosiinilla (H anti-GAPDH saatiin Abcam (Cambridge, MA, USA); anti-LC3 ja anti-Atg5-12 saatiin Abgent (San Diego, CA, USA); anti-p62 /SQSTM1 vasta-aine saatiin MBL (Nagoya, Japani), ja anti-mTOR ja anti-p70S6K saatiin Epitomics (Burlingame, CA, USA).

In vivo kasvaimen kasvua, joissa käytetään PC- -3 kasvain malli nude-hiirissä

Kaikki kokeet hiirillä suoritettiin ohjeiden mukaan meidän instituutti (oppaasta hoito ja käyttö Laboratory Animals, National Cheng Kung yliopisto). Eläinten käyttö protokollan alla on tarkistanut ja hyväksynyt Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) (Hyväksyntä nro: 99138). Kuudesta kahdeksaan viikkoa vanhoja nude-hiirten (BALB /cAnN.Cg-Foxn1

nu /CrlNarl) hankittiin National Laboratory Animal Center (Taiwan). Eläimiä pidettiin viisi häkkiä kohti 24 ± 2 ° C: ssa ja 50% ± 10% suhteellinen kosteus ja altistettiin 12 tunnin valo /12 tunnin pimeä jakso. Eläimiä sopeutettiin 1 viikko ennen alkua kokeiluja ja syötetään Purina kuivamuonadieetillä ja vettä halun. Kasvaimia indusoitiin ihonalaisella (s.c.) injektio PC-3-soluja (2 x 10

6 solua 0,1 ml: ssa PBS: ää) yhdessä kohtaa oikeaan kylkeen. Kasvaimet (visualisoida pieniä kyhmyjä klo injektiopaikoilla) esiintyi noin 7 päivää injektion jälkeen, ja eläimet jaettiin satunnaisesti kuhunkin ryhmään. Hiiriä käsiteltiin: (1) ajoneuvon (maissiöljy), (2) 1 mg /kg MP kolme kertaa viikossa kahden viikon ajan, (3) kerta-annos 6 Gy IR, tai (4) yhdistelmä, joka käsittää 1 mg /kg MP kolme kertaa viikossa kahden viikon ajan aloitetaan välittömästi kerta-annoksen jälkeen 6 Gy IR. Hiiren ruumiinpainot mitattiin kerran viikossa ja käytettiin indikaattorina systeemisen toksisuuden hoidossa. Kasvaimen kasvu mitattiin joka toinen päivä, ja tuumorin tilavuus laskettiin alla olevan kaavan [25]:

Kasvaimen tilavuus (mm

3) = suurempi halkaisija (mm) x on pieni halkaisija (mm )

2/2

Data ilmaistaan ​​kasvaimen suhteellisen tilavuuden verrattuna esikäsittely tilavuus mitattiin vuorokautena 0. kasvaimen nelinkertaistaa ajan (TVQT, päivinä) määritettiin best-fit regression analyysi. Kasvaimen kasvun viivästyminen (TGD) aika määritellään erotus TVQT käsitellyn kasvainten verrattiin käsittelemättömään kontrolliin kasvaimia. TVQT ja TGD aika laskettiin kunkin yksittäisen hiiren, ja sitten keinot kertyi kullekin ryhmälle. Tuumorin kasvun inhibitio laskettiin seuraavasti: Esto (%) = (kasvaimen tilavuus käsittelemättömien kontrollihiirten – kasvaimen käsitellyt hiiret) /kasvaimen tilavuus käsittelemättömien kontrollihiirten x 100.

immunohistokemiallinen (IHC) värjäystä analyysi

parafinoidut kudosleikkeiden (4 pm) kuivattiin, poistettiin parafiini, ja nesteytyksestä. Seuraavat mikro esikäsittely sitraattipuskurissa (pH 6,0; antigeeniin haku), levyt upotettiin 3% vetyperoksidia 20 min estää endogeenisen peroksidaasin. Intensiivisen PBS: llä pesun jälkeen levyt inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa anti-LC3 ja anti-p62 /SQSTM1 (MBL, Japani) vasta-aineita. Sitten leikkeitä inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja levyt kehitettiin käyttäen STARR TREK Universal HRP detektioreagenssipakkaus (biocare Medical, Concord, CA). Lopuksi objektilasit vastavärjättiin käyttäen hematoksyliinillä. Kukin dia skannattiin alhaisella teholla (x 200).

Tilastollinen

Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Tilastollinen merkittävyys määritettiin Studentin t-testi vertailu keinoja tai yksisuuntaisen varianssianalyysin kanssa post-hoc Dunnettin testi [26]. Erot katsottiin olevan merkittäviä, kun p 0,05.

Tulokset

sytotoksiset vaikutukset ja eloonjäämiskäyristä MP ja IR käsitelty yksin tai yhdessä PC-3-solujen

solujen elinkelpoisuus havaittiin eri pitoisuuksilla MP (0-45 uM) 48 tunnin ajan (Fig. 1 B). MP yksinään vähensi elinkelpoisuuden solujen pitoisuudesta riippuvalla tavalla. Hoidon jälkeen 25 uM MP 48 tunnin ajan, elinkelpoisuutta PC-3-solut laskettiin 60%. Kuvio 1C esittää elinkelpoisuuden MP ja IR käsitelty yksin tai yhdessä PC-3-solut. Merkittävästi lisääntynyt toksisuus todettiin kombinaatio verrattuna MP ja IR hoito yksin PC-3-solut. Lisäksi kuvio 1D esittää säteilyn annos-vaste eloonjäämiskäyriä PC-3-solujen kanssa tai ilman MP hoitoa. Eloonjäämiskäyrät dramaattisesti siirtynyt alaspäin. MP (15 tai 25 uM) lisäsi IR aiheuttama klonogeeniset solukuoleman PC-3-solut. MP vähensi hengissäsäilymisosuus annoksesta riippuvalla tavalla verrattuna IR yksinään.

DNA-vaurioita määritetään comet ja ilmentymistä ER stressiin liittyvien proteiinien PC-3-soluja käsiteltiin MP ja IR yksinään tai yhdistelmänä

IR avainasemassa syövän hoidossa johtuen sen kyvystä suoraan indusoida DNA-vaurioiden [27]. Komeetta määritys on herkkä väline arviointiin DNA-vaurion ja korjaus solutasolla, tarvitaan vain pieni määrä soluja [28]. Komeetan määrityksessä PC-3-soluja, vähän tai ei lainkaan häntää havaittiin käsittelemättömiin kontrolleihin, kun taas hännän kasvoi säteilytyksen jälkeen ja yhdistää hoitoon (Fig. 2A). Hännän pituus kasvoi merkittävästi jälkeen IR (4 Gy) verrattuna kontrolleihin (Kuva. 2B). Tehostaa merkittävästi DNA-vaurioita havaittiin kombinaatio verrattuna IR yksinään. Nämä tulokset viittaavat siihen, että DNA-vaurioita oli mukana anti-proliferatiiviset vaikutukset ja hoidon PC-3-soluja. Lisäksi viimeaikaiset todisteet osoittavat, että yksi niistä mekanismeista, jolloin IR aktivoi ER stressiä ja UPR on induktio DNA-vaurioita [29]. Siksi ekspression havaitsemiseksi ER stressiin liittyvät proteiinit, suoritimme western blotting lysaateilla PC-3-soluja, jotka saavat kukin eri hoitoja (Fig. 2C). Tuloksemme osoittivat, että IRE1α ja fosforylaatio eIF2α lisääntyi yhdistelmähoito verrattuna MP tai IR hoito yksinään, mikä vahvistaa, että yhdistetty hoito indusoi ER stressiä PC-3-solut.

Measurement apoptoosin ja autophagy in PC- 3-soluja käsiteltiin MP ja IR yksinään tai yhdistelmänä

Kuten kuviossa 3A on esitetty, varhaisen apoptoosin PC-3-soluissa mitattiin virtaussytometrialla kanssa anneksiini V apoptoosin havaitsemiseen kit. Kvantitatiiviset tulokset osoittivat, että esiintyminen varhaisen apoptoosin PC-3-solut käsiteltiin MP ja /tai IR oli alhainen. Niinpä vielä analysoitu, että tyypin II ohjelmoitua solukuolemaa (autophagy). Sille on tyypillistä muodostuminen lukuisten happamia rakkulat, joita kutsutaan hapan vesicular organelles (Avós) [30]. Akridiinioranssia (AO) värjäytyminen kvantitoitiin käyttäen virtaussytometrialla (kuviot. 3B, 3C). Merkittävä lisäys AO-positiivisten solujen havaittiin solujen vastaanottamiseksi yhdistettynä hoitoa verrattuna IR: llä käsitellyt tai MP yksin. Lisäksi ultrastructures PC-3-solut kussakin testiryhmässä havaittiin EM mikrovalokuvausta (Fig. 3d). Yhdistetyt käsittely johti myös suuri määrä autophagic ontelot ja autolysosomes sytoplasmassa. Lisäksi, ei ole kromatiinin kondensoitumista tai ydin- pyknosis, jotka ovat tunnusomaisia ​​apoptoosin, esiintyi tahansa käsiteltyjen solujen. Havaitsemiseksi ilmentymisen autophagy liittyviä proteiineja, suoritimme western blotting lysaateilla PC-3-soluja, jotka saavat kukin eri hoitoja (Fig. 3E). Ilmaisu tasot LC3-II, P62 ja Atg5-12 proteiinien lisääntynyt yhdistelmähoito, mikä viittaa siihen, että yhdistetty hoito indusoi autophagy PC-3-solut.

Akt /mTOR-signalointireitin on mukana yhteisessä hoidossa indusoimaan autophagy PC-3-solujen

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että Akt /mTOR reitin osallistuu säännellä autophagy [31]. Näin ollen, sen tutkimiseksi, Akt /mTOR signalointireitin oli mukana yhdistetyn hoidon aiheuttama autophagy, teimme Western blotting havaita proteiinin fosforylaatiotilaa (Fig. 4). Fosforyloitua proteiineja, jotka osallistuvat Akt /mTOR signalointireittejä tutkittiin myös. Fosforylaatiota Akt, mTOR ja p70S6K laski käsitellyissä soluissa yhdistetyn hoidon verrattuna MP tai IR hoito yksinään.

Kasvaimen kasvu nude-hiirissä tukahdutettiin IR ja MP

Seuraava arvioinut anti-kasvaimen kasvua vaikutus IR ja MP

in vivo

. Kasvaimia indusoitiin s.c. injektio PC-3-soluja nude-hiiriin. Mittasimme ruumiinpaino hiirien viikoittain, ja tuumorin tilavuus joka toinen päivä. Tulokset Tämän tutkimuksen tulokset osoittivat, että yksikään hoito-yhtään painon menetys, joka voi olla merkki myrkyllisyys (Fig. 5A). Yhdistetty hoito tukahdutti kasvaimen tilavuus ja tuumorin paino nude-hiirissä verrattiin MP tai IR hoitoja yksin (kuviot. 5B, 5C, 5D). Kuten taulukossa 1 on esitetty, tuumorin tilavuus nelinkertaistaa aikaa (TVQT) kontrolliryhmän mitattiin päivänä 10 (10,3 ± 2,4). Kasvaimen kasvun viivästyminen (TGD) aika 10 päivää kestävä hoito MP yksin oli 10,4 ± 4,2 päivää, mikä oli merkittävästi erilainen kuin kontrolliryhmän (

p

0,05). IR yksinään tuotti TGD aika oli 17,8 ± 6,2 päivää (

p

0,05 verrattuna kontrolliryhmään). Yhdistetty hoito johti TGD aikaan 52,3 ± 7,1 päivää (

p

0,05, verrattuna kontrolliryhmään tai MP yksin). Yhdistelmähoito IR ja MP johti kasvaimen kasvun inhibition 71% päivänä 10. Siten yhdistetty hoito jolla on anti-kasvaimen kasvun vaikutus

in vivo

.

Seuraava histologinen tutkimus analysoitiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H & E) värjäämällä (kuvio. 5E). Kasvain on yhdistetty hoito koostui solujen alemman ydin-to-sytoplasmaan suhteet kuin MP tai IR-hoito yksinään. Lisäksi LC3 ja p62 ilmaisun malleja PC-3 kasvaimet tutkittiin käyttäen IHC värjäystä. LC3 ja P62 korotettiin kasvaimet käsiteltyjen hiirien kombinaatio verrattuna MP tai IR hoito yksinään.

Keskustelu

Äskettäin raportoitiin, että RYR, perinteinen kiinalainen ruoka yrtti ja moderni ravintolisä, osoitti

in vitro

vaikutuksia, kuten proliferaation esto ja stimulaation apoptoosin ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa [6]. Lisäksi, RYR vähensi merkittävästi kasvainten eturauhasen ksenograftikasvaimissa [32]. Yhdistelmä IR muiden aineiden, joilla saavutetaan sädeherkistävä potentiaali on tullut tärkeä interventioiden potilaille, joilla on eturauhasen syöpä [33]. Aikaisemmat tutkimukset ovat myös osoittaneet, että luonnolliset tuotteet, kuten uuden säteilyherkistimet hoitoon hormoni-tulenkestävien eturauhassyöpä, joka on resistentti sädehoitoa [11], [34]. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme ensimmäistä kertaa, että MP herkistää ihmisen eturauhassyöpä PC-3 solujen IR sekä

in vitro

ja

in vivo

nude hiiren ksenograftimallissa (kuviot. 1, 5). Useimpien historian syöpähoidon, apoptoosin ajateltiin olevan ainoa mekanismi lääkkeen aiheuttamista solukuolemaa. Viime aikoina on raportoitu, että tyypin II ohjelmoidun solukuoleman, autophagy, voivat osallistua syövän hoidossa aiheuttama syöpäsolun kuoleman. Viimeaikaiset havainnot, mukaan lukien laboratoriossamme, ovat ehdottaneet, että aktivoitu autophagy on tuumorisuppressori [23], [24], [35]. Tässä PC-3-soluja käsiteltiin yhdistetty indusoi autophagy mahdollisesti tapahtui, kun apoptoottisen reitin PC-3-soluja blokattiin (Fig. 3).

in vivo

tutkimuksessa PC-3 ksenograftikasvaimissa, LC3 ja p62 lisättiin seuraava yhdistetyn hoidon (Fig. 5E).

säteily on keskeinen rooli terapiassa johtuen sen kyvystä suoraan aiheuttaa DNA-vaurioita, erityisesti DNA double-säikeen katkoksia, mikä johtaa solukuolemaan [27]. Meidän nykyisessä tutkimuksessa merkittävästi parannettu DNA-vaurioita havaittiin yhdistetyssä hoitoryhmässä verrattuna IR- tai MP yksin (kuviot. 2A, 2B). Kuitenkin yksityiskohta mekanismia ei vielä täysin ymmärretä. On mahdollista, että MP häiritsee käsittely ja korjaus IR aiheuttama DNA double-säikeen katkoksia. Vaihtoehtoisesti MP saattaa häiritä jälkeisen korjauksen vaiheessa mukana todellinen käänteinen γH2AX, kuten defosforyloinnilla tai hajoaminen ja /tai histoni vaihtoa γH2AX [36]. Viimeaikaiset todisteet osoittavat, että yksi niistä mekanismeista, joilla IR aktivoi ER stressi on induktio DNA-vaurioiden [29]. Siten kaksijuosteinen DNA taukoja voi olla yksi yhteys IR- ja ER stressiä aktivointi. Tuloksemme osoittivat, että IRE1α ja fosforylaatio eIF2α lisääntyi yhdistelmähoito, mikä osoittaa, että yhdistelmähoito aiheuttamaa ER stressiä PC-3-solut (Fig. 2C). ER-stressi voi aktivoida signalointireiteissä mukana apoptoosin ja autophagy [22]. Nisäkässoluissa, ER stressi on osoitettu muodostamisen helpottamiseksi autophagosomes, ja induktio autophagy mahdollistaa poistaminen myrkyllisten väärin laskostuneen proteiinien [37]. Ullman et ai.