Krooninen sairaus

tiivistelmä

Follistatin (FST), joka on follikulogeneesissä säätelevä proteiini, löytyy suhteellisen korkeina pitoisuuksina naisen munasarjojen kudoksiin. FST toimii antagonistina aktiviini, joka on usein koholla ihmisen munasarjasyövän, ja näin ollen voi toimia mahdollisena kohteena terapeuttiselle väliintulolle vastaan ​​munasarjasyöpä. Rintasyöpä alttius geenin 1

(BRCA1

) on tunnettu tuumorisuppressorigeeniä ihmisen rintasyöpä mutta sen rooli munasarjasyöpä ei ole hyvin ymmärretty. Me tehdään mikrosiruanalyysi ihmisen munasarjan masolulinjassa SKOV3 että vakaasti yli-ilmentävät villin tyypin BRCA1 ja verrataan vastaavaan tyhjän vektorin-transfektoidut kloonit. Huomasimme, että stabiili ilmentyminen BRCA1 paitsi stimuloi FST eritystä vaan myös samanaikaisesti estää Activin ilme. Määrittää fysiologisen merkityksen tämän ilmiön, olemme edelleen tutkineet vaikutusta solujen BRCA1 on FST erittymisen kuolemattomaksi munasarjojen pinnan epiteelisolujen (menettää tavallisesti) soluja, jotka ovat peräisin joko normaalista ihmisen munasarjat munasarjoissa tai munasarjojen syövän potilaan, joilla on mutaatio

BRCA1

geeni. Knock-down on

BRCA1

normaaleissa menettää tavallisesti soluissa osoittaa alas-säätely FST erityksen yhdessä samanaikaisen ylössäätöä aktiviinin ilmaisua. Lisäksi knock-down on

FST

in menettää tavallisesti solulinjoissa sekä SKOV3 solulinja osoitti merkittävästi vähentää solujen lisääntymistä ja laski solumigraatio verrattuna verrokkeihin nähden. Siten nämä havainnot viittaavat uusi toiminto BRCA1 säätelijänä FST ilmentymistä ja toimintaa ihmisen munasarjan soluissa.

Citation: Karve TM, Preet A, Sneed R, Salamanca C, Li X, Xu J, et al. (2012) BRCA1 Säätelee Follistatin Tehtävä Munasarjasyöpä ja Human Munasarjojen pintaepiteelisolujen. PLoS ONE 7 (6): e37697. doi: 10,1371 /journal.pone.0037697

Editor: Swati Palit Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 01 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 26 huhtikuu 2012; Julkaistu: 01 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Karve et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tapas Saha on kiitollinen American Cancer Society (IRG # 97-152-16-2), Fisher Center for Familial Cancer Center, Lombardi Kattava Cancer Center, Georgetown University taloudellista tukea. Tätä työtä tuki osittain National Institutes of Health Avustukset 1U56CA101429-01 (Dr. Peter Shield, Deepak Kumar ja tohtori Carolyn Cousin). Eliot M. Rosen on tuettu, osittain tutkimusmäärärahat päässä USPHS (R01-CA150646), Susan G. Komen varten Cure (KG110580), Living in Pink, ja World Class yliopiston rahoittaman opetusministeriö , Science and Technology kautta National Research Foundation of Korea (R31-10069). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on yksi johtavista gynekologisten syöpien Yhdysvalloissa 22280 arvioitu uutta tapausta ja 15500 kuolemantapausta vuonna 2012 (https://www.cancer.gov/cancertopics/types/ovarian; arvioima helmikuuta, 2012). Korkea kuolleisuus munasarjasyöpään syyksi on pääasiassa loppuvaiheessa sairauksien diagnosointiin; Lähes 60-65% munasarjasyövän tapauksista diagnosoidaan, kun syöpä on jo metastasized yli rajojen munasarjojen kudosta. Varhainen havaitseminen munasarjasyövän näkyy merkittävästi potilaan eliniän peräti 85% [1]. Näin ollen on olemassa tarve kehittää biomarkkereita, että voi olla hyödyllistä havaita munasarjasyövän alkuvaiheessa tauti. Useimmat munasarjasyöpiä esiintyy munasarjojen pinnan epiteeli (OSE) ja siten käyttävissä OSE johdetut solut sekä normaalin yksilön ja munasarjasyöpä potilaat ovat kriittisiä valaista etiologia ihmisen munasarjasyöpä. Mielenkiintoista, vain 5-10% naisista munasarjasyövän perineet geneettisiä mutaatioita tuumorisuppressorigeeneille kuten

BRCA1

ja

BRCA2

joka altistaa heidät rinta- ja munasarjasyöpään [2], [ ,,,0],3], [4]. Lisäksi geneettisen kytkennän kohorttitutkimuksessa koostuu 214 rintasyövän ja rintasyövän-munasarjasyövän perheet yhdistetään, paljasti, että 90% potilaista tunsivat mutaatiot niiden

BRCA1

geenin [5]. Lisäksi

BRCA1

mutaatio (t) kantoaallon naisilla on noin 15 kertaa suurempi riski kehittää munasarjasyöpä verrattuna niiden ei-operaattorin naisten kollegansa [6], [7].

Follistatin ( FST), autokriinisellä yksiketjuinen glykoproteiini, ilmentyy lähes kaikissa ihmisen kudoksissa, kuten munuaisten, aivojen, kohtu, ja rinnan korkein pitoisuus löydetty ihmisen munasarjan kudoksessa [8]. Mature, erittyvän muodon FST proteiini esiintyy kolmessa isoformeja; täyspitkä, väli- ja lyhin koostuu 315, 303 ja 288 aminohappoa vastaavasti [9]. FST, alun perin eristetty munarakkulanesteestä havaittiin vuorovaikutuksessa aktiviini, joka on transformoivan kasvutekijä-β (TGF-β) superperheen. Aktiviini on osoitettu säätelevän solujen proliferaatiota, erilaistumista, angiogeneesi, sekä apoptoosin, ja siten ne voivat olla mahdollisesti mukana säätelyssä munasarjojen kasvaimen kasvua [10]. Kohonneita aktiviinin havaitaan paitsi useimmissa epiteelin-alkuperää munasarjojen kasvaimia, mutta myös seeruminäytteistä kerätty munasarjan epiteelin syövän potilaille. Korkea aktiviinin arvellaan olevan tehtävänä on edistää taudin etenemistä ja ennustavat pahin taudin ennusteeseen munasarjasyöpä potilaille [10]. FST sitoutuu aktiviinin ristiriitoja herättävällä tavalla ja kohonnut ilmentyminen solun FST voi johtaa solun suojaamiseen rooli munasarjasyöpä potilaille. Tuore tutkimus on osoittanut, että lyhytaikaista transfektiota villin tyypin (wt)

FST

osoitettiin estävän etäpesäke pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat [11]. Sitä vastoin huomattavasti korkeampi (P 0,05) pitoisuuksia FST on raportoitu munasarjasyövän potilailla verrattuna samanikäisiin terveisiin vapaaehtoisiin.

jäsenet TGF-ß-superperheen on osoitettu moduloivan kasvua normaalin ihmisen munasarjaepiteelisoluilla

in vitro

[12], [13]. Siten mutaatiot TGF-ß-reseptoreita tai niiden solunsisäisen signaloinnin molekyylejä, kuten Smad proteiinit ovat sekaantuneet kehittämiseen useita syöpiä [14], [15], [16], [17], [18] ja ihmisen munasarjasyöpä [19], [20], [21]. Toinen jäsen TGF-ß-superperheen, inhibiini, on toiminnallinen antagonisti aktiviinin ja sen on osoitettu moduloivan kasvun normaalia ihmisen munasarjan epiteelin [22], [23]. Inhibiineille tuottama ihmisen sukurauhasten, pelata ratkaiseva rooli lieventäviä Activin-säännelty signalointi ihmisen gonodal järjestelmään [22]. Inhibiini aktivoidaan läsnäolo kofaktori, beeta-glykaanin, joka puolestaan ​​kilpailee activin sitoa kanssa activin reseptorien (Atria ja ActRIIB), mikä antagonisoivaa Activin säädelty signalointiryöpyn [24]. Lisäksi koko inhibiini on ehdotettu olevan mahdollinen seerumimarkkerina epiteelin peräisin ihmisen munasarjasyöpä. Lisäksi, follistatin liittyvät proteiiniin (FLRG), joka osoittaa vahvan homologian FST, ja sen on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa ja estää toiminnan TGF-ß-superperheen ligandeja, kuten aktiviini, luun morfogeneettinen proteiini (BMP) -2, BMP-6 , BMP-7, ja GDF-8. FLRG ensisijaisesti ilmaistaan ​​sydän-, keuhko-, munuais-, ja istukan ja voidaan stimuloida TGF-ß, Aktiviinilla ja Smad proteiinit [25]. FLRG ilmentymistä on raportoitu olevan erittäin vaihteleva useita syövän rivejä ja kudoksissa. Eräs tuore tutkimus osoitti, että alas-säätely FLRG estää ihmisen rinta- kasvaimen kasvua [26].

Useat tutkimukset ovat ehdottaneet, että kohdennetut hoitostrategioiden, erityisesti molekyyli välittäjiä että alas-säädellä endogeenisen Aktiviinilla ekspressiotasot voivat hidastaa tai estävät syövän etenemistä [27]. Siten mahdollinen rooli FST kuin aktiviinin antagonisti synnyssä munasarjasyövän vaatii lisätutkimuksia. Tässä tutkimuksessa käytimme ikuistettu munasarjojen pinnan epiteeli (menettää tavallisesti) soluja normaalista ihmisen munasarjan (menettää tavallisesti 7576 ja menettää tavallisesti 397) ja munasarjasyöpäsolu potilaalle

BRCA1

mutaatio, menettää tavallisesti 592F, tutkia rooli BRCA1 välittämisessä FST erityksen näissä soluissa. Olemme myös rakennettu useita vakaa BRCA1 kloonien SKOV3 munasarjan Adenokarsinoomasolulinja että ektooppisesti ilmaista BRCA1-proteiinia (

ts.

BRCA1-SKOV3). Alussa suoritettu mikrosiruanalyysi käyttäen BRCA1-SKOV3 kloonin ja hallita neo klooni tunnistaa varhain biomarkkereita munasarjojen syöpiä. Seuraavaksi validoitu meidän tuloksia käyttämällä reaaliaikaista-PCR-analyysi ja totesi, että

FST

ja

SMAD6

oli säädelty BRCA1-SKOV3 klooni # 19 sekä kaikissa menettää tavallisesti solun linjat. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että menetys tai vähentynyt tasoja FST erityksen munasarjojen soluissa saattavat toimia markkerina ihmisen munasarja- syövän syntymistä.

Methods

Ekspressiovektorit ja reagenssit

villityypin (wt) BRCA1 ekspressioplasmidin luotiin kloonaamalla BRCA1 cDNA pcDNA3-vektoriin (Invitrogen, Carlsbad, CA) käyttämällä keinotekoisesti muokattu 5 ’

Hind

III ja 3′

Ei

I sivustoja [28]. Dimetyylisulfoksidi (DMSO), ß-merkaptoetanolia, ja kaikki muut kemikaalit saatiin yhtiöltä Sigma (St. Louis, MO), ellei toisin mainita.

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

SKOV3-solulinja saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FCS), ei-välttämättömiä aminohappoja (100 mM), L-glutamiinia (5 mM), streptomysiiniä (100 mg /ml) ja penisilliiniä (100 U /ml) (kaikki Lonza, Inc., Walkersville, MD). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2 ja osa-viljeltiin kahdesti viikossa, käyttäen trypsiiniä (Lonza) [29]. Vakaa BRCA1-SKOV3 klooneja, kuten myös tyhjät vektori transfektoida (neo) vakaat klooneja transfektoimalla asiaa vektoreilla seurasi valinta genetisiinillä (Invitrogen).

Immortalized Munasarjojen pintaepiteelissä (menettää tavallisesti) solut

kuolemattomia solulinjoja (IOSE 7576, menettää tavallisesti 397 ja menettää tavallisesti 592F) oli ystävällinen lahjoitus Dr.Nelly Auersperg Kanadan Munasarjojen Tissue Bank (University of British Columbia, Vancouver, Kanada). Lyhyesti, munasarjojen pinnan epiteelisolujen kaavittiin ihmisen munasarjojen pinnan kudoksen ja viljeltiin 01:01 seokseen väliaineen 199 (Invitrogen) ja MCDB 105 (Sigma), jota oli täydennetty 10% FBS: ää, NaHCO3 (2,2 g /l), L-glutamiini ( 5 mM), penisilliiniä (100 U /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml) (kaikki Invitrogen). Matalan kulkua viljelmistä eristettyjä ihmisen munasarjan pintaepiteelin solut kuolemattomiksi transfektoimalla SV40 suuren T-antigeenin viruspartikkelien [30]. Morfologisiin ominaisuuksiin ja kasvu kuvio menettää tavallisesti solulinjojen havaittiin jäljittelemään munasarjojen pinnan epiteelisolujen matriiseina. Edelleen, menettää tavallisesti soluilla vahva morfologisia samankaltaisuus kanssa varhain neoplastisten munasarjojen solujen ihmisessä ja siten olla erinomainen malli

in vitro

tutkimukset keskittyivät ihmisen munasarjan syövän synnyn [30], [31].

Affymetrix oligonukleotidigeenisirumenetelmää

Affymetrix microarray-analyysit suoritettiin Georgetownin yliopiston Lombardi Cancer Center Genomics ja Epigenomics Shared Resources ydin laitokseen. RNA: n eristys, cDNA-synteesi, geeni siru hybridisaatiot, ja data-analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [32]. Tyhjän vektorin ja vakaa BRCA1 kloonin SKOV3- soluja, joita käytetään tuottamaan microarray tietojen perusteellisesti kuvattu aiemmassa käsikirjoitus [32]. Geeni siruja Näissä kokeissa käytetään olivat Human Genome U133 Plus 2.0 Array. Kaikki microarray data oli MIAME (Vähintään Information Noin Microarray Experiment) -yhteensopiva ja raakadataa on talletettu Gene Expression Omnibus-tietokanta (GEO) kuin kuvaavat aikaisemmassa käsikirjoitus [32]. Hakunumerolla Tälle esittämiselle on GSE30296. Hierarkkinen ryhmittely valitun geenin tehtiin kuten aiemmin [32].

Transient transfektiot

Lisääntyvät SKOV3- solut transfektoitiin yön yli osoitetun ekspressiovektoreilla (4-6 ug plasmidi-DNA: kuoppaa kohden 6-kuoppalevylle tai 20-25 ug per 100 mm: n malja) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen), kuten aiemmin on kuvattu [29], [33]. Seuraavana päivänä solut pestiin 1 x PBS: llä ja sen jälkeen inkuboimalla tuoreella viljelyalustalla jopa 24-48 tunnin geenin ilmentymisen.

pienet häiritsevät (si) RNA hoitoja

Asynkronisesti jakautuvat solut olivat esikäsitelty geenispesifistä siRNA (100 nM 72 tuntia) käyttäen SIPORT Amine (Ambion, Foster City, CA). Tehokkuutta knock-down vahvistettiin kautta immunoblottauksella kohdeproteiinille (s). Sen jälkeen siRNA: t käytettiin tässä tutkimuksessa: ohjaus siRNA [ON-TARGET

plus

Non-kohdistaminen siRNA (Cat # D-001810-01, Dharmacon, Chicago, IL)]; FST erityisiä siRNA saatiin Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA; BRCA1-erityisiä siRNA [altaan kahden mukautettuja syntetisoitu siRNA alkaen Dharmacon (sekvenssit 5 ’→ 3’ CAGCTACCCTTCCATCATA ja CTAGAAATCTGTTGCTATG)]. Sekä FST ja BRCA1 siRNA oli suunnattu vastaan ​​ORF vastaavien geenien.

Semikvantitatiivisilla käänteiskopioijaentsyymi- – polymeraasiketjureaktiota (RT-PCR) analyysi

Semi-kvantitatiivinen RT-PCR-määrityksissä olivat suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [29]. Lyhyesti, solut käsiteltiin kuten edellä on esitetty, ja kokonais-RNA uutettiin käyttäen RNaasi Easy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Alikvootit kokonais-RNA (50 ng) olivat käänteistranskriptio käyttäen 50 yksikköä Superscript III käänteistranskriptaasia (Invitrogen) reaktiossa tilavuuteen 20 ui. Semikvantitatiivinen PCR-monistus suoritettiin käyttäen 1 ul: n erä kustakin näytteestä puhtaaksi cDNA, kuumalla käynnistää Taq-polymeraasia (Denville, South Plainfield, NJ). DNA ensin denaturoidaan 5 minuutin ajan 95 ° C: ssa, ja sitten monistetaan käyttäen sykliä 30 s 95 ° C: ssa, 30 s erityisiä hehkutus lämpötila, ja 1 min 72 ° C: ssa, lopullinen 10 minuutin inkuboinnin 72 ° C: ssa . Syklin määrä säädettiin siten, että kaikki reaktiot olivat lineaarisella alueella PCR-tuotteen monistus. Eteenpäin ja reverse-alukkeita käytetään, hehkutuslämpötiloja, ja odotetun kokoisia PCR-tuotteiden esitetään taulukossa 1. Quantitative tarkoittaa analyysi vähintään kolmen itsenäisen kokeen edustaa yhdessä keskivirheen mittausten (± SEM).

Quantitative real-time-PCR (Q-PCR) analyysi

Q-PCR tehtiin ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) käyttäen SYBR Green PCR Master sekoita reagenssia (Applied Biosystems) on 25 ul: n reaktiotilavuudessa. 10 ng cDNA: ta näytteiden asianmukaisen geenin-spesifisiä alukkeita käytettiin kunkin PCR-analyysiin. Cycle raja-arvot automaattisesti, ja kansi muutokset kunkin parin geenin-spesifisiä alukkeita määritettiin. Q-PCR-alukkeet on lueteltu taulukossa 1 ja saatiin Real Time Primers, LLC., Elkin Parks, PA.

Western blotting

Soluja käsiteltiin kuten on esitetty ja kokosolulysaateille valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [34]. Lyhyesti, jälkikäsittely solut pestiin 1 x PBS: llä ja lyysattiin käyttäen radioimmunosaostuskokeella (RIPA) puskuria (Roche, Indianapolis, IN), jota oli täydennetty täydellinen Mini EDTA-vapaan proteaasi-inhibiittorin cocktail tabletti (Roche) jäillä 10 minuutin ajan. Lyysattuihin soluja ravisteltiin 4 ° C: ssa 20 min, mitä seurasi sentrifugointi 12,000 x g 20 min. Alikvootit proteiinia (50 ug) 4X MAP (litium kyylisulfaatti) näytepuskuria (Invitrogen) analysoitiin pre-cast 4-12% Bis-Tris (BT) geelejä (Invitrogen). Fraktioitu proteiinit siirrettiin sitten polyvinylideenifluoridia (PVDF) (Millipore, Billerica, MA) ja blokattiin varten tuntia 5% rasvatonta maitoa 1 x PBS-Tween 20. Sitten kalvot inkuboitiin osoitetun primaarisilla vasta-aineilla, ja sen jälkeen kanssa lajikohtaisia ​​(HRP) konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Santa Cruz). Pyyhittäisiin proteiinit visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssidetektiolla järjestelmä (Santa Cruz). Ensisijainen käytetyt vasta-aineet olivat: BRCA1 (C-20, Santa Cruz, 1:200); FST (K-19, Santa Cruz, 1:100); Actin (C-11, Santa Cruz, 1:400), ja Aktiviinilla (ab89307, Abcam, Cambridge MA, 1:1000).

Follistatin Pitoisuus

kvantitatiivinen havaitseminen solun FST tasoilla oli suoritettiin käyttäen Quantikine Human FST immunoassay kit (R hajotettiin käyttäen hajotuspuskuria koostuu fluoresoivista CyQuannt GR väriainetta ja koko fluoresenssi siirtynyt solujen kvantitoitiin käyttäen Victor 1420 fluoresenssin mikrolevylukijalla (Perkin-Elmer Wallac, Inc., Waltham, MA) kahta aallonpituutta (480-520 nm ). Havaittu fluoresenssi yksikköä (FU) on suoraan verrannollinen solujen siirtyneet; korkeampi havaittu fluoresenssi suurempi solujen vaeltamiseen. Standardikäyrä rakennettiin kustakin solulinjasta käyttäen lisäävä solutiheys kuin valmistajan ohjeiden, ja saadut tiedot standardikäyrältä kustakin solulinjasta (käsitelty /käsittelemätön) ovat edustettuina keskiarvoina ± SEM.

Cell lisääntymisen määritys

FITC BrdU virtaus kit BD Pharmingen (San Jose, CA) käytettiin suorittamaan soluproliferaatiomäärityksissä kanssa menettää tavallisesti solulinjojen kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 10 uM BrdU lisättiin asynkronisesti kasvavia soluja logaritmisessa varten tunti pulssi soluihin. Solut kiinnitettiin sitten ja permeabilisoitiin BD Cytofix /Cytoperm puskuri (annetaan Kit), ja joita käsitellään myöhemmin DNaasi paljastaa BrdU. FITC-vasta-ainetta käytettiin sitten havaitsemaan BrdU, ja sitten solut saatettiin virtaussytometrillä FACSort (Becton Dickinson, San Jose, CA), ja parametrit asetettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. FACS-analyysi tehtiin virtaussytometria ja Cell Sorting Shared Resources at Lombardi Cancer Center, Georgetown University. Saadut tiedot edustettuina tarkoittaa ± SEM prosentuaalisen BrdU merkityt solut.

Tilastollinen analyysi

Aineisto analysoitiin tilastollisesti mukaan ”Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) kautta Tukey Test”, joka on pareittain vertailu keskimääräisestä vastausten eri hoitoryhmään käyttäen SigmaStat tilasto-ohjelmalla (versio 3 Windowsille). Arvo P 0,05 tai vähemmän katsottiin merkitseväksi kaikissa kokeissa.

Tulokset

pysyvää ilmentymistä BRCA1 in SKOV3 solulinjassa

Toisin kuin rintasyöpä, ei ole hyvin -established suuntaviivat yhdistävät

BRCA1

mutaatioita ja yksilön alttiuden sairastua munasarjasyöpään. Täällä, käytimme ihmisen munasarjasyövän solulinja (SKOV3) vanhempana munasarjasyövän solulinja ja syntyy useita vakaita klooneja, että ektooppisesti ilmaisi wtBRCA1 (BRCA1-SKOV3) ja sen tyhjä tausta vektori, pcDNA3 (Neo). Kuten nähdään kuviosta 1A, # 4, # 18, ja # 19 kloonia BRCA1-SKOV3 osoitti merkittävää kasvua ilmentymisen BRCA1 (P 0,05) verrattuna emo-SKOV3- soluihin sekä vastaavat Neo klooneja. Densitometrinen analyysi kolmesta itsenäisestä Western blot on esitetty kuviossa 1B keskiarvoina ± keskivirhe mittausten (SEM). Siten sukupolven SKOV3 sub-solulinjoissa vakaa BRCA1 ilme entisestään auttaa ymmärtämään vaikutusta BRCA1 ihmisen munasarjakarsinooman.

(A) useita stabiileja linjoja luotiin käyttäen yli-ilmentyminen BRCA1 ja sen tausta vektori, pcDNA3 in SKOV3 munasarjakarsinoomasolut. Ekspressiotasot BRCA1 on esitetty kaikki solukloonit. Vanhempien ilmaisee ei-transfektoituja SKOV3- soluissa vain. Densitometrinen analyysi kolmesta itsenäisestä immunoblot on esitetty (B). Virhe palkit ovat hakukonemarkkinoijat. * Edustaa P 0,05 (verrattuna vanhempien).

Differential geenien ilmentymisen takia BRCA1 yli-ilmentymisen SKOV3- soluissa

Perustuu BRCA1 ilmaus # 19 kloonin BRCA1-SKOV3 ( jäljempänä kuten BRCA1-SKOV3 klooni # 19) valittiin ja pariksi # 3 Neo klooni (jäljempänä Neo klooni # 3) varten Affymetrix mikrosiruanalyysillä. RNA kolmesta eri kulttuurista kohtia BRCA1-SKOV3 klooni # 19 solujen ja Neo klooni # 3 solut eristettiin ja altistettiin mikrosiruanalyysi (katso menetelmät lisätietoja). Seuraavaksi rakensimme hierarkkinen klusterointi geenien ilmentymisen, jotka olivat merkitsevästi (P ​​ 0,05) poikkeava BRCA1-SKOV3 klooni # 19 soluihin ja verrattiin Neo klooni # 3-soluissa. Havaitsimme yli 10 kertaisesti sääntelyn 274 geenien ja yli 4 taitettava-sääntelyn 279 geenit BRCA1-SKOV3 klooni # 19 soluihin verrattuna Neo klooni # 3 (katso taulukko S1 sekä vastaavat lämmön kartan kuvassa S1 ). Käyttämällä tätä microarray data, kekseliäisyyttä Pathway analyysi paljasti, että BRCA1 yli-ilmentymisen SKOV3- soluissa (BRCA1-SKOV3 klooni # 19) moduloi useita ratkaisevan tärkeitä signalointi ja metaboliareitteihin (katso taulukko S2 ylös geenien ja taulukko S3 alas geenien BRCA1-SKOV3 klooni # 19). Luettelo geenien edelleen supistuu valittu 40 geenien perustuu noin 3 taittuva muutos ekspressiotasoja verrattuna kontrolliin, ja merkittäviä p-arvot (P 0,05). Valittujen ryhmien geenien havaittiin olevan enimmäkseen vastuussa solun kasvussa, solusyklin etenemiseen ja oksidatiivisen stressin vasteen, joka oli ensisijainen merkitys olevassa tutkimuksessa. Hierarkkinen klusterointi oli uusiksi näiden valittujen 40 geenit aineisto jopa säädelty (punainen) tai alassäädetty (vihreä) geenien vuoksi wtBRCA1 yli-ilmentymisen BRCA1-SKOV3 solun klooni # 19 (kuva 2). Tuloksena kaksi klustereita geenien sekä niiden kertamuutosta ja p-arvo annetaan oikeassa paneelissa kuvion 2

lämpö kartan merkittäviä muutoksia ryhmässä valittujen geenien johtuu yli-ilmentymisen wtBRCA1 vuonna SKOV3 munasarjakarsinoomasolut. Kolme riippumatonta mikrosirujen analyysit tehtiin. Kaksi klustereita havaittiin, yksi johtuen alas-geenien säätelystä (vihreä) ja muut johtuen ajan geenien säätelystä (punainen). Kertaluokkamuutos ja p arvot geenien klustereita annetaan oikealla.

FST, antagonisti aktiviinin vastaa varhaista munasarjojen kehitys; kuitenkaan ei paljon tiedetä solun säätelyyn FST ihmisen munasarjan kudoksessa. Kohonnut FST taso ihmisen munasarjan soluja ehdotettu olevan soluja suojaava vastaan ​​munasarjojen syövän synnyn. Olemme havainneet 51,6 kertaa korkeampi ilmentyminen FST BRCA1-SKOV3 klooni # 19 verrattuna Neo klooni # 3-soluissa. Inhibiini havaittiin myös olevan merkittävästi (P ​​ 0,05) sääteli (11,6-kertainen) BRCA1-SKOV3- soluissa. Useat tutkimukset ovat osoittaneet mahdollista roolia inhibiini biomarkkerina munasarjasyöpä epiteelin alkuperä [35]. Muutama tutkimukset ehdottaa inhibiiniä kuin seerumimarkkerin munasarjojen syövän synnyn paljasti, että inhibiini tasot ovat koholla noin 70-80% mucinous tyyppiä munasarjasyöpä potilaiden ja 15-35% ei-mucinous tyyppinen epiteelin munasarjasyöpä tapauksissa [36] , [37]. Tutkimukset ovat lisäksi osoittaneet, että postmenopausaalisilla naisilla, yhteensä inhibiini voidaan yhdistää CA-125 tehokkaaseen diagnosointiin munasarjojen epiteelin syövän synnyn [35].

Lisäksi olemme havainneet, että useat muut jäsenet TGF β perhe kuten TGF-SS2, TGF-ßR1, TGF-ßR3 ja estävä Smad, SMAD6, myös säädellään ylöspäin BRCA1-SKOV3 klooni # 19 (kuva 2). Siten hierarkkinen klusterointi lähestymistapa ei vain voi vahvistaa eräille aiemmin tunnettujen mahdollisten markkerien munasarjasyövän mutta myös paljastaa useita muita otaksuttu molekyylikohteista että saattavat kiinnostaa suunnittelussa kohdennettua hoitoa ihmisen munasarjasyöpä.

Validation Affymetrix microarray tuloksia semikvantitatiivinen RT-PCR

Olemme käyttäneet RT-PCR validoida saadut tulokset mikrosiruanalyysillä. Kolme yksittäistä stabiilien kloonien kunkin Neo ja BRCA1-SKOV3 solulinjoja käytetään suorittamaan semikvantitatiivinen RT-PCR: llä. Löysimme merkittävä korrelaatio (P 0,05) välillä microarray ja RT-PCR-tuloksiin. Kuviossa 3A esitetään edustavat mRNA ilmauksia ilmoitettu geenien kaikissa ryhmissä soluja. Kuvio 3B osoittaa, kvantitatiivinen arvio mRNA ilmaisuja kaikkien geenien tutkimuksen perusteella vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Kaikissa tapauksissa, mRNA: n ilmentyminen FST oli merkitsevästi (P ​​ 0,05) korkeammat BRCA1-SKOV3 kloonien verrattuna Neo klooneja, validointi havaitut tulokset mikrosiruanalyysi, vaikka on syytä huomata, että aste fold-muutos on muuttuja ; mahdollisesti johtuu ero herkkyydessä on nämä kaksi tekniikkaa. BRCA1-SKOV3 klooni # 19 osoittivat suurin lisäävä säätely BRCA1 keskuudessa vakaa solulinjojen; siten kaikkia tulevia kokeita suoritettiin käyttäen tätä kloonia, kuten edellä on esitetty, ja verrattiin Neo kloonin # 3. Lisäksi RT-PCR vahvisti myös säätely ylöspäin SMAD6 BRCA1-SKOV3 klooni # 19 (kuvio 3A). Lisäksi olemme tutkineet vaikutusta ohimenevän ilmentymisen BRCA1 on vanhempien SKOV3- soluja. Tulokset on esitetty kuviossa 3C ovat yhdenmukaisia ​​tuloksia havaittiin kuviossa 3A ja 3B. FST mRNA: n ilmentymisen havaittiin olevan huomattavasti (P ​​ 0,05) kohonneet BRCA1 yli-ilmennetään SKOV3- soluja verrattuna tausta vektori transfektoida (pcDNA3) sekä vanhempien SKOV3- soluja. Lisäksi mRNA: ta ilmauksia SMAD6 myös koholla wtBRCA1 yli-ilmentäviä soluja (kuvio 3C). Densitometrisesti geenien ilmentymistä kiinnostavia vähintään kolmen riippumattoman kokeen esitetään kuviossa 3D.

(A) Lisääntyvät stabiilien kloonien sekä Neo (pcDNA3-SKOV3) ja wtBRCA1 (BRCA1-SKOV3) kerättiin semi-kvantitatiivinen RT-PCR-määritys kuten kuvattu kohdassa ”menetelmät”. Vastaavat juovat vastaavat geenit on esitetty oikealla. (B) PCR bändejä kolmesta itsenäisestä kokeesta ja kukin osoitettu geenien kvantifioitiin densitometrialla ja mRNA-tasot normalisoitiin Actin. (C) Lisääntyvät SKOV3- soluja transfektoitiin ohimenevästi joko wtBRCA1 tai taustalla pcDNA3 vektori ja eristetyn RNA: t määritettiin semikvantitatiivinen RT-PCR. Tulokset kvantitoitiin kuten edellä ja edustaa bar kaavio (D). Virhe palkit ovat hakukonemarkkinoijat. * P 0,05 (suhteessa kuhunkin valvontaa).

BRCA1 säätelee FST eritystä SKOV3 munasarjakarsinoomasolut

FST erittyy munasarjojen follikulaarisen nestettä ekstrasellulaarisen alueen, ja on olennaista varhaisen munasarjojen kehitys [38].

In vitro

kokeessa viljellyillä munasarjojen soluista ilmentää erilaisia ​​tasoja FST eritys kasvualustaan ​​riippuen solu- hoitojen ja viljelyolosuhteet. Täten laimennetun väliaineen tarjolla hyvä lähde mitata eritystä ja ilmentymistä FST tietyssä solutyypissä. Kuvio 4A osoittaa saatu standardikäyrä puhdistetun FST-proteiinia, jota käytettiin määrän kvantitoimiseksi eritetyn FST näytteissä tutkittavana. Tuloksemme osoittavat, että BRCA1 ilmentyminen SKOV3- soluissa osoittaa noin 2 kertaa suurempia erittyvä FST verrattuna pCDNA3-transfektoiduissa soluissa (kuvio 4B). Lisäksi teimme samanlaisia ​​määrällisiä FST määrityksessä käytetään SKOV3- soluihin, joissa-BRCA1 oli tippuu alas by BRCA1-erityisiä siRNA. Kuva 4C osoittivat vähintään 50%: n lasku FST ilmaisun BRCA1 knock-down solujen verrattuna soluihin käsitelty ohjaus siRNA. Seuraavaksi suoritetaan sama FST määrityksessä vakaa BRCA1 soluklooneja SKOV3- soluissa, kuten on kuvattu aikaisemmin. BRCA1-SKOV3 klooni # 19 solut osoittivat lisääntynyttä FST eritys kuin neo klooni # 3, odotetusti (kuvio 4D). Lisäksi olemme myös tutkineet erittyvä tasot FST tallissa linjat seuraavat alas-säätely BRCA1 samassa. Down-regulation BRCA1 joko Neo klooni # 3 (kuvio 4E) tai BRCA1-SKOV3 klooni # 19 (kuvio 4F) merkitsevästi (P ​​ 0,05) esti eritystä FST soluviljelyelatusainetta verrattuna niiden valvontaa. Proteiinin ekspressiotasot BRCA1 kaikissa edellä näytteet on esitetty kuviossa 4G. Tiedot on saatu tämän määrällisen FST määrityksessä osoittaa, että induktio solujen BRCA1 tasoilla puolestaan ​​stimuloi ekstrasellulaarisen FST eritystä ihmisen munasarjasyöpäsoluja.

(A) Standardikäyrä muodostettiin puhdistetulla ihmisen FST esitettyjä ”Menetelmät” , jota käytettiin kvantifioimaan tuntematon FST pitoisuudet ilmoitetaan näytteissä. SKOV3–solut transfektoitiin kuten edellä, joko BRCA1 yli-ilmentymisen (B) tai BRCA1 ali (C), ja FST määritykset (katso menetelmät) suoritettiin laimennetun elatusaineeseen. Sama FST määritys suoritettiin vakaa kloonien kuten (D) sekä vakaan solujen jossa ilmentyminen BRCA1 pudotettiin by BRCA1-siRNA (E-F). Virhe palkit ovat hakukonemarkkinoijat. * P 0,05 (suhteessa kuhunkin ohjaus).