Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ihmisen syöpien yli-ilmentävät

MDM2

kautta T G vaihtelu yhden nukleotidin polymorfismi asemassa 309 (

mdm2

SNP309), on toiminnallisesti inaktivoitu p53 että ei ole tosiasiallisesti huonontunut. Niillä on myös korkea ilmentymä vaihtoehtoisesti liitettyjä transkriptio,

MDM2-C

. Vaihtoehtoisesti liitettyjä

mdm2

selostukset ilmentyvät monissa muodoissa ihmisen syövän ja kun ne ovat ulkoisesti ilmaistaan ​​ne muuttavat ihmisen soluja. Kuitenkin mikään tutkimus on tähän mennessä havaittu endogeeninen MDM2-proteiinin isoformit. Tutkimukset eksogeeninen ilmaus silmukointivarianteista on toteutettu

MDM2-A

ja

MDM2-B

, mutta

MDM2-C

isoformi on pysynyt lähes tutkimaton. Me osoitettu solun vaikutuksesta eksogeenisesti ilmaistu MDM2-C, ja kysyi endogeenisen MDM2-C-proteiinia oli läsnä ihmisen syövissä. Havaitsemiseksi endogeeninen MDM2-C-proteiinin, loimme ihmisen MDM2-C-vasta-aine että liitoskohtaan epitooppi eksonien neljästä kymmeneen (MDM2 C410) ja validoitu vasta-aineen

in vitro

käännetty täyspitkä MDM2 verrattuna MDM2 -C. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että MDM2-C yhteistyössä vaeltaa kanssa MDM2-FL noin 98 kDa. Käyttämällä validoitu C410-vasta-aine, havaitsimme korkea endogeenistä MDM2-C ihmisen syövän solulinjoissa ja ihmisen syövän kudoksissa. Estrogeenireseptorin positiivinen (ER +)

mdm2

G /G SNP309 rintasyövän solulinjan, T47D, havaitsimme kasvu endogeenisen MDM2-C-proteiinin kanssa estrogeenihoito. MDM2-C tumassa ja sytoplasmassa. Olemme tutkineet biologinen aktiivisuus MDM2-C eksogeenisesti proteiinia ilmentävien ja havaittiin, että MDM2-C ei tehokkaasti kohdistaa p53 hajoamista tai vähentämään p53 transkriptionaalista aktiivisuutta. Eksogeeninen ilmentyminen MDM2-C

p53

-null ihmisen syöpäsoluja kasvoi pesäkkeiden muodostumista, mikä osoittaa p53-riippumattoman tuumorigeenisiä ominaisuuksia. Meidän tiedot osoittavat rooli MDM2-C, joka ei edellytä inhibition p53 lisäämiseksi syöpäsolujen proliferaatiota ja eloonjäämistä.

Citation: Okoro DR, Arva N, Gao C, Polotskaia A, Puente C, Rosso M , et ai. (2013) Endogeeninen ihmisen MDM2-C ilmennetään runsaasti ihmisen syövissä ja toiminnot kuin p53-riippumattoman Growth Activator. PLoS ONE 8 (10): e77643. doi: 10,1371 /journal.pone.0077643

Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 marraskuu 2012; Hyväksytty: 12 syyskuu 2013; Julkaistu: 11 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Okoro et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Science Foundation (MCB- 0744316), apurahan Breast Cancer Research Foundation, ja avustusta Clinical Translational Science Center (CTSC) TR000457 National Center for edistäminen Tranlsational laitos National Institutes terveys- J. Bargonetti. Se oli myös mahdollista osittain infrastruktuuria palkinnon Hunter College, lupanumeroon MD007599 National Institute on Vähem- terveys- ja terveys erot, osa National Institutes of Health (NIH). Sen sisältö ovat yksin vastuussa kirjoittajien eivätkä välttämättä edusta näkemyksiä NIMHD tai NIH. TEHDÄ. oli osittain tukee CUNY Magnet Award ja M. R. tukivat MBRs-RISE Program Hunter College 3R25-GM060665. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kasvaimia synnyttävän aktiivisuuden MDM2 liittyy yli-ilmentyminen MDM2-proteiinin ihmisen syövissä [1-3]. Vaikka jotkut MDM2 isoformit voivat muodostaa suoran fyysisen yhdessä p53 toiset eivät [3,4]. MDM2 säätelee p53-proteiini kautta proteasomaalisten välittämää hajoaminen [5-10] ja transkription tukahduttaminen [5,11-14]. Tämä p53-välitteinen onkogeenisiä aktiivisuus MDM2 on parasta kutsutaan MDM2 kanoninen toimintoja. Kuitenkin MDM2 on myös tiedetään olevan p53-riippumattoman toiminnot [15-19], joka parhaiten kutsutaan MDM2 ei-kanoninen toimintoja.

yli-ilmentyminen MDM2 johtuu yhden nukleotidin polymorfismin tymiinin ja guaniinin (T G) asemassa 309

MDM2

geenin (

mdm2

SNP309) liittyy lisääntynyt syövän ilmaantuvuus ja aggressiivisuus [20-23]. Tämä

MDM2

SNP309 nukleotidin muutos lisää sitoutumisaffiniteetti konstitutiivinen transkriptiotekijän, Sp1 [21]. Solut homotsygoottinen G /G

mdm2

SNP309 ovat parantaneet

MDM2

transkription ja korkeat MDM2-proteiinin tasoja. MDM2 yli-ilmentyminen syövät usein mukana yli-ilmentyminen vaihtoehtoisesti liitettyjä

mdm2

selostukset [3,24-28]. Yli 40 vaihtoehtoisesti ja poikkeavasti saumattu ihmisen

mdm2

selostukset on raportoitu, mutta kaikki eivät luun mielessä seurausta vaihtoehtoisen silmukoinnin tapahtumia [29]. Ei kestä,

mdm2

silmukointivarianteista edustavat mahdollisia monimuotoisuus yhtyy havainnot Encyclopedia of DNA Elements (KOODAAMISEEN) Project Consortium. ENCODE esiin aiemmin tunnistamattomia ehdokas säätelyelementtejä, ja koodattuja viestejä, ihmisen perimässä [30]. Monimuotoisuus

mdm2

saumattu viestit koodataan kahdesta itsenäisestä promoottorit on kyky lisätä ihmisen syövän proteomiin [31]. Siksi ei ole yllättävää, että

mdm2

SNP309 solut, osoittavat lisääntynyt moninaisuutta vaihtoehtoisesti liitettyjä

MDM2

selostukset merkittäviä ilmaus

MDM2-C

transkriptio [32].

Vaikka yli 40

mdm2

vaihtoehtoisesti liitettyjä selostukset on havaittu [29], vain viisi, (

MDM2-A

kautta

MDM2-E

) on osoitettu ilmentävän proteiinia

in vitro

[3]. Ilmaisu Näiden viiden

mdm2

transkriptien aiheuttaa NIH3T3-solut muodostavat kasvaimeen liittyvien pesäkkeitä [3]. Kuitenkin vain kaksi proteiini-isoformit, MDM2-A ja B, on tutkittu laajasti niiden biologisia toimintoja. Eksogeeninen ekspressio MDM2-A [33,34], tai MDM2-B hiirissä [35], lisää kasvainten muodostumista

p53

-null, tai p53-vaarantunut tausta aiheuttaa muuttunut kasvaimen spektri. Kuitenkin biologisen toiminnan MDM2-C edelleen määrittelemätön.

kysytään syöpäsolut ilmentävät korkeita

MDM2-C

mRNA: n endogeenisen MDM2-C-proteiini. Oletimme, että korkea

MDM2-C

transkriptipitoisuuksissa koodattu G-alleelin

mdm2

SNP309 ihmisen syövissä johtaisi korkeita endogeenisten MDM2-C-proteiini ja antaisi onkogeenisten toimintoja. Solut, joissa MDM2 yli-ilmentyminen kautta G /G

mdm2

SNP309 on vakaa p53-proteiini, joka on co-paikallistaa p53 kromatiinin [14]. Niinpä hypoteesi, että MDM2 yliekspressio kautta G /G SNP309 saattaa tuottaa MDM2-C-proteiini-isoformi, joka ei hajoa p53. Siksi ryhdyimme määrittää solujen toimintaa ulkoisesti ilmaistaan ​​MDM2-C. Pyysimme myös, jos syöpäsolut ilmentävät korkeita

MDM2-C

mRNA, ilmaisi myös endogeenisen MDM2-C-proteiini.

endogeeninen ilmentyminen MDM2-C-proteiinin ei ole koskaan havaittu, koska ei ole vasta-aineita, jotka spesifisesti tunnistaa MDM2 isoformien valmistettu vaihtoehtoisesti liitettyjä mRNA: t.

MDM2-C

transkriptin ei sisällä eksonien 5 kautta 9, joka koodaa osaa p53-sitova domeeni. Loimme spesifinen vasta-aine on suunniteltu havaitsemaan koodaamien aminohappojen MDM2-C reunustavat eksonit 4 ja 10, jota nimettiin C410. Käyttämällä tätä MDM2-vasta havaitsimme korkeita pohjapinta tasot endogeenisen MDM2-C-proteiinin eri MDM2 yli-ilmentävien syöpäsolujen linjojen ja kudoksissa. Havaitsimme myös, että läsnä ollessa tai puuttuessa p53, eksogeenisesti ilmaistuna MDM2-C edistävää kasvoi pesäkemuodostusta. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että endogeeniset MDM2-C ilmentyy syövissä ja että MDM2-C toimii itsenäisesti p53 edistää kasvaimien syntyyn.

Tulokset

MDM2 yli-ilmentäviä soluja on korkea MDM2-C transkriptien

Monet ihmisen syövän solulinjoissa yliekspressoivat MDM2-proteiinin ja niitä on käytetty edellisten MDM2 tutkimuksiin [14,21,32,36,37]. Käytimme näitä solulinjoja tutkia suhde

mdm2-C

selostukset täyspitkän

mdm2

selostukset. Tutkitut solulinjat sisältävät kaksi korkea MDM2 ilmentäjät: SJSA-1-soluissa villityypin

p53

ja yli-ilmentyminen MDM2 vuoksi

mdm2

geenimonistus (ja

MDM2

SNP309 T /T alleelit) ja MANCA solut villityypin

p53

ja yli-ilmentyminen MDM2 päässä

mdm2

SNP309 G /G-alleelit. Ne sisältävät myös kaksi alhainen MDM2 ekspressöijiksi: K562-solulinja, joka on

p53

-null ja on

mdm2

SNP309 T /G-alleelien ja ML-1-soluissa villityypin p53 ja

mdm2

SNP309 T /T-alleelien.

transkriptio

mdm2-C

arvioitiin kvantitatiivisella RT-PCR (qRT-PCR) ja Northern blot-analyysi (katso kuvio 1 ja kuvio S1). Kvantitointi yhteensä

MDM2

selostukset, Northern blot-analyysi osoitti korkeimman

mdm2

transkriptien SJSA-1-soluissa, jotka sisältävät 25 kappaletta

MDM2

geeni [37]. Korkea

MDM2

transkription havaittiin myös MANCA soluissa. Nimenomaan määrällisesti selostukset sisältää eksonit 6 ja 7, toteutimme qRT-PCR määrällinen koetin eksonin 6-7 risteykseen (kuvio 1 B katso anturi vihreä ja kuviossa 1C mustat palkit). Nimenomaan määrittää

mdm2-C

transkriptien, käytimme eteenpäin PCR-aluke on suunniteltu tunnistamaan eksonin 4 ja eksonin 10, risteykseen (kutsutaan 04:10) ja reverse-aluke eksonia 12 (kuvio 1 B, ks alukkeita punaisella, ja kuvio 1C harmaat palkit). Vuonna MANCA soluissa, havaitsimme alhaisen tason ilmentymistä

mdm2

transkriptio sisältää eksonit 6 ja 7, tästä eteenpäin nimitystä

mdm2

täyspitkä transkripti (kuvio 1 C). Tärkeää on, MANCA solut oli korkean tason ilmentymisen

MDM2-C

transkriptin mistä seuraa alhaisempi suhteessa täyspitkän osoitteeseen

MDM2-C

transkripti (kuvio 1 C, MANCA verrata musta harmaaseen baari). Tämä oli toisin kuin

mdm2

transkriptio in SJSA-1-solut, jotka tuottivat saman määrän

MDM2-C

ja

mdm2

täyspitkä transkriptien (kuvio 1 C, SJSA -1 verrata mustasta harmaat palkit). Alhainen

mdm2

transkriptit valmistettiin K562-soluja ja näin ollen näitä soluja käytettiin normalisoija solulinja. ML-1-solut osoittivat samankaltaisia ​​

mdm2

transkriptipitoisuuksissa K562. Tämä osoitti, että yli-ilmentyminen MDM2-proteiinin SJSA-1-soluissa ja MANCA solut korreloivat korkea

MDM2-C

transkriptio. Lisäksi MANCA solut oli korkein suhde

MDM2-C

täyspitkän transkripti. Tämä tulos saattaa johtua siitä, että

mdm2

SNP309 G /G genotyyppi, joka ajaa transkriptiota indusoituvan P2-promoottorin

.

. Kvantitointi käyttäen Image J jälkeen Northern blot-analyysi RNA: n käsittelemättömän MANCA, SJSA-1, ML-1 ja K562 solujen näytteitä.

mdm2

DNA-koetin eksonia 12 PCR tuotettu ja radioleimattu α

32P dCTP. Transkriptipitoisuuksissa verrattiin K562 pohjapinta ilmaisun ja normalisoitiin RNA tasojen

GAPDH

. Keskimäärin neljä itsenäistä kokeesta. Virhe palkit esittävät keskivirhettä.

B. Kaavio

mdm2

viestit havaitaan käyttäen Taqman koetinta eksonit 6 ja 7 (6-7 koetin) tai eteenpäin pohjamaali 04:10 ja käänteisaluke- 12 (4: 10-12 primer) ja

MDM2-C

.

C. qRT-PCR 04:10 eteenpäin ja eksonin 12 taakse vs. Taqman koetinta eksonia 6 ja 7

mdm2

tehtiin havaitsemiseksi

MDM2-C

ja

MDM2

(jossa eksonit 6 ja 7) selostukset.

mdm2-C

transkriptit havaittiin kautta Syber Green ja

mdm2

(jossa eksonit 6 ja 7) todettiin kopioiden kautta Taqman-tekniikkaa. Transkriptipitoisuuksissa verrattiin K562 pohjapinta ilmaisun ja normalisoitiin RNA tasojen

GAPDH

. Keskimäärin kolme itsenäistä kokeesta. Virhe palkit esittävät keskivirhettä.

D. qRT-PCR RNA käyttäen Taqman teknologiaa p53 kohdegeenien,

p21

ja

puma

jälkeen DNA-vaurioita hoidon 8 um etaposidia 3 tuntia. Tiedot kustakin solulinjasta esitetään normalisoida oman käsittelemätön kontrolli näytteen kertaiseksi aktivointia ja normalisoitiin RNA tasojen

GAPDH

. Keskimäärin kolme itsenäistä kokeesta. Virhe palkit esittävät keskivirhettä.

Jotta onko

mdm2

täyspitkä ja

MDM2-C

transkripti suhde vaikutti p53 vastaus vertasimme aktivoituminen kaksi p53 kohdegeenien,

p21

ja

puma

. Käsittelimme K562, ML-1, SJSA-1 ja MANCA solujen etoposidin aloittaa DNA-vaurioita vastaus, ja seurataan

p21

ja

puma

aktivaation qRT-PCR (Kuva 1 D). Kuten odotettua,

p21

ja

puma

geenejä ei aktivoida

p53

-null K562-solut. Vuonna SJSA-1 ja MANCA soluja, joilla on villin tyypin p53: n ja korkean MDM2,

p21

ja

puma

geenien osoitettu heikentynyt geenin aktivaatio verrattuna aktivointi havaitaan ML-1-soluissa , jossa MANCA solut osoittavat vähiten p53 aktiivisuutta (kuvio 1 D).

MDM2

vaihtoehtoisesti liitettyjä tuotteita, kuten

MDM2-B

lisääntyä DNA-vaurioita [38-40]. Sen määrittämiseksi, oliko

MDM2-C

transkripti aiheutettiin p53, solut käsiteltiin etoposidia analysoitiin qRT-PCR

MDM2-C

. ML-1 solut reagoivat etoposidiksi hoidon vankka kasvu

MDM2-C

transkriptipitoisuuksissa (kuva S2, punainen palkki). Vaarantunut p53-välitteisen aktivaation

mdm2-C

havaittiin SJSA-1 ja MANCA solujen samanlaisia ​​vaarantunut aktivaatio havaittiin

puma

(Kuva S2 ja kuvio 1 D). Nämä tiedot osoittavat, että p53: n transkriptionaalista aktiivisuutta on vaarantunut MDM2 yli-ilmentävien solujen ja niiden korkea pohjapinta tasot

mdm2-C

(erityisesti MANCA solut) oli p53-riippumaton.

validointi MDM2-C spesifisen vasta

Voit selvittää, korkeatasoista

MDM2-C

transkriptien MDM2 yli-ilmentävien solujen käännettiin proteiiniin, me tuotti MDM2-C polyklonaalisia vasta-ainetta. Olemme immunisoitiin kaneja peptidisekvenssin kanssa, joka sisältää aminohapposekvenssin ihmisen eksoni 4-10 liitoskohtaan (kuvio 2A). Peptidi oli erittäin immunogeenisiä ja vasta-validoitiin spesifisyys käyttämällä

in vitro

käännetty MDM2-proteiinien vehnänalkiouute. Sekä MDM2-C, ja MDM2-FL, voidaan kääntää

in vitro

proteiiniin [3,41]. Lisäämällä

35S metioniini järjestelmään meille mahdollisuuden nopeasti havaita erikseen merkitty MDM2-proteiinien avulla autoradiografialla (kuvio 2B). Olevaa

35S metioniinia leimatun MDM2-C ja MDM2-FL proteiinien liikkui SDS-PAGE koot aiemmin määritetty (kuvattu korkeampi kuin ennustettu koot 36 kDa: n ja 55 kDa, vastaavasti) [41,42]. Hitaampi liikkuvuus MDM2 SDS-PAGE on aiemmin katsottu johtuvan suuren hapan domeeni [42].

. Kaavio täyspitkä MDM2 (MDM2-FL) ja MDM2-C. Säilytetyt proteiinien biokemiallisia toimintakykyyn esitetään värikoodit. Peptidisekvenssin käyttää immunogeeninä, joka sisältää liitoskohtaan ihmisen MDM2-C on esitetty. Glysiini (G) ja kysteiini (C) tähteet lisättiin N-päähän peptidin helpottaa konjugointi immunoreaktiivisen proteiinin, keyhole limpet hemosyaniini (KLH).

B.

35S metioniinia käytettiin radioaktiivisuuden lähde merkitä

vitro

käännetty proteiineja.

vitro

käännöksiä pcDNA3-MDM2-FL ja pcDNA3-P2mdm2-C käyttäen TNT kytketty vehnänalkiouute järjestelmään. Saatu MDM2-FL ja MDM2-C-proteiini ajettiin elektroforeesissa a10% SDS-PAGE: ssa, 5: 1: 1-suhteessa. Geeli siirrettiin nitroselluloosamembraanille ja valotettiin filmille merkittäviä MDM2-C-proteiini tuotteen havaitsemiseen. Vehnänalkioita lysaattia ilman DNA: ta käytettiin negatiivisena kontrollina.

C. Immunosaostus

35S metioniinia radioaktiivisen leimatun

vitro

käännetty MDM2-FL ja MDM2-C-proteiineja käyttäen MDM2 C410 ja esi-immuuni polyklonaalisia seerumin vasta-aineita. Proteiini suhdelukuja esitetty B käytettiin vetää alas määrityksessä. Näytteet ajettiin elektroforeesissa 10% SDS-PAGE-geelillä siirrettiin nitroselluloosakalvolle ja valotettiin filmille proteiinin havaitsemiseen. Tämä on tyypillinen kolmen erillisen kokeen.

D.

vitro

käännetty proteiini tehdään kanin retikulosyyttilysaattia (RRL kaistat 1 ja 2) verrattiin proteiinin käännetty vehnänalkiouute (WGE kaistat 3 ja 4). Nämä proteiinit havaittiin joko vasta-4B11 (yläpaneeli) tai 2A9 (alapaneeli). HRP-konjugoitua anti-hiiri ja anti-kaniini käytettiin johdetun vasta-aineita.

edelleen vahvistaa spesifisyys MDM2-C-vasta-aine, suoritimme immunosaostuskokeesta on vehnänalkiouute

in vitro

käännetty

35S radioleimattua MDM2-C ja MDM2-FL proteiinituote. MDM2 C410 polyklonaalista vasta-ainetta vedetään alas MDM2-C (kuvio 2C, vertaa kaistoja 3 ja 8), mutta ei MDM2-FL (kuvio 2C, vertaa kaistat 4 ja 9). Lisäksi MDM2-C ja MDM2-FL

in vitro

käännetty proteiinit immunosaostettiin käyttäen MDM2 C410 polyklonaalinen vasta-aine, ja analysoitiin Western blotilla MDM2 monoklonaalinen vasta-aine sekoitetaan. Vain MDM2-C-proteiini havaittiin (kuvio S3, vertaa kaistat 2 ja 3).

Jotta tarkemmin käsitellä ero migraation MDM2-C ja MDM2-FL, vertasimme Immuunireaktiivisuuden on

in vitro

käännetty valkuaisaineita, niin kanin retikulosyyttilysaattia (RRL) ja vehnänalkiouute (WGE) järjestelmiin. Kun proteiinit käännetty

in vitro

, ne ovat posttranslationaalisesti modifioitu tekijät edusti solussa -uuttojärjestelmää. Ennustetusti, C-terminaalin monoklonaalinen vasta 4B11 havaitaan MDM2-C ja MDM2-FL isoformit kun taas vasta-aine 2A9, kohdistaminen keskialue, havaitaan vain MDM2-FL (kuvio 2D, vertaa ylhäältä ja alhaalta levyt kaistat 1 ja 3 vs. kaistaa 2 ja 4). On mielenkiintoista, että MDM2-C tuotetaan nisäkkään RRL järjestelmä johti korkea ilmentyminen kolmessa eri tavoin muuttavien lajien SDS-PAGE-elektroforeesilla yhden lomakkeen yhteistyössä liikkuen MDM2-FL noin 98 kDa (kuvio 2D, vertaa kaista 1 kaistaa 2 ). Olemme edelleen tutki mahdollisia translaation jälkeisiä modifikaatioita MDM2-C ihmisen soluissa (ja migraatio MDM2-C noin 98 kDa) hyödyntämällä HeLa

in vitro

käännös järjestelmän Pierce (kuvio 3A ja 3B ). Tärkeää on, tässä järjestelmässä, myös havaittu muoto MDM2-C noin 98 kDa. Tuloksemme osoittavat selvästi, että jotkut MDM2-C-proteiini-isoformi valmistettu tällä ihmisen järjestelmässä yhteistyössä vaeltaa kanssa MDM2-FL. Mikä antaa näyttöä siitä, että havaitseminen MDM2 vasta-aineilla, jotka voivat olla vuorovaikutuksessa täyspitkä ja saumattu variantti isoformit johtaa ainakin joissakin kanssa rinnakkain liikkuvasta polypeptidejä on western blot. Mielenkiintoista on, käyttäen HeLa, meidän ensimmäistä kertaa, havaittiin joitakin MDM2-C-proteiinin on ennustettu molekyylipaino on 36 kDa (kuvio 3B kaista 1).

immunosaostus käyttäen MDM2 C410 ja esi-immuuni polyklonaalisia seerumin vasta-aineiden kanssa HeLa

vitro

käännetty MDM2-C otteita käyttäen valmiiksi immunoseerumeilla, MDM2 C410 ja N-20 polyklonaalinen vasta-aineita. Näytteet elektroforeesi 10% SDS-PAGE-geelissä kahtena kappaleena. A. Puolet värjättiin Coomassie-sinisellä proteiinin havaitsemiseen. B. näytteitä puolet geelistä siirrettiin nitroselluloosakalvolle ja MDM2 havaittiin 4B11 monoklonaalinen vasta-aine. HRP-konjugoitua anti-hiiri käytettiin sekundaarisena vasta-aineena. Nuolet kuvaavat MDM2-C-proteiini.

MDM2-C-proteiini ilmentyy endogeenisesti

Vaikka vaihtoehtoisesti liitettyjä

mdm2

viestejä on havaittu syövät, ei ole asiakirjat tuotetaan endogeenisesti polypeptidit tällaisista viesteistä . Vertasimme yhteistyössä siirtyvät luonne MDM2-C ja MDM2-FL käyttäen vaihtelevan immunoreaktiivisuus ihmisen syövän solu-uutteita tutkittiin MDM2 C410 polyklonaalisella vasta-aineella (havaitsemista varten MDM2-C) samaan uutteet koettimena MDM2 yleisesti reagoiva hiiren monoklonaalinen 4B11-vasta-aineen (havaitsemista varten MDM2-C ja MDM2-FL). Korkeita MDM2 ilmentymisen havaittiin MANCA ja SJSA-1 solu-uutteiden kanssa 4B11-vasta-aineen (kuvio 4A, kaistat 9 ja 10). MANCA solut tuottivat korkein ilmentymä MDM2-C, kun havaitaan C410 (kuvio 4A, kaista 1). MDM2 C410 polyklonaalista vasta tuskin havaitaan MDM2-C ML-1-soluissa (kuvio 4A, kaista 3). On kuitenkin tunnustettu MDM2-C-proteiinin solun otteita K562-solut, jotka ovat G /T-genotyyppi-soluja, samoin kuin SJSA-1-soluissa, jotka on geenien monistuminen (kuvio 4A, kaistat 2 ja 4). Ekspression MDM2-C ML-1-soluissa ja MANCA solut korreloivat pohjapinta transkription

mdm2

täyspitkä ja

mdm2-C

(vertaa kuvio 1C kuvioon 4A). Syistä, ovat epäselviä tietty korrelaatio

MDM2

selostukset ja MDM2-proteiinin isoformit ollut ilmeistä SJSA-1-solut ja K562-solut. Tämä saattaa johtua sen suhde MDM2-FL proteiinin saumattu variantti, ja sen jälkeen E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla-välitteinen hajoaminen MDM2-proteiinien joka vähensi proteiinin stabiilisuuteen.

. Western blot-analyysi kokosolu otteita: MANCA, SJSA-1, ML-1 ja K562-solujen. MDM2-C-proteiinin tasot analysoitiin kautta MDM2 C410 polyklonaalisia seerumin vasta-aineita (C410, kaistat 1-4), ja kokonais-MDM2 havaittiin monoklonaalisella 4B11 (kaistat 9-12 ja pitkä altistuminen kaista 12). Aktiini käytettiin latauskontrollina. Pre immuuni polyklonaalista seerumia käytettiin negatiivisena kontrollina. HRP-konjugoitu anti-hiiri, ja anti-kaniini käytettiin sekundäärisiä vasta-aineita. Tämä on tyypillinen kolmen erillisen kokeen.

Bi. MANCA solut hajotettiin joko kokosoluekstraktien (WCE) tai osaksi cellular compartments- soluliman (cyto) ja Kromatiini (CHR). Proteiinit havaitaan A. MDM2-C-proteiinin tasot analysoitiin kautta MDM2 C410 polyklonaalisia seerumin vasta-aineita (C410, kaistat 1-3), ja kokonais-MDM2 havaittiin monoklonaalisella 4B11 (kaistat 1-9 ja pitkä altistuminen kaista 9).

BII. Tubuliinia ja Fibrillarin käytettiin osoittamaan tehokas solu fraktioinnin uutetta.

C. Spinning levy konfokaalimikroskopia of MANCA soluja. Solut kiinnitettiin, permeabilisoitiin ja inkuboitiin p53, MDM2 C410 ja esi-immuuni polyklonaalisia seerumin vasta-aineita. Laseja inkuboitiin johdetun Alexa-konjugoitua vuohen anti-kani ja FITC-konjugoitua vuohen anti-hiiri. DAPI käytettiin värjäämään solutumien. Kuvat otettiin 60X suurennus. Nuolet osoittavat alueet MDM2-C-proteiinin tumaanohjaussignaali.

korkea ilmentyminen MDM2-C MANCA soluja viittasi siihen, että proteiini olisi selkeästi havaittavissa solun osastoihin. Olemme tutkineet lokalisointi endogeenisen MDM2-C käyttäen solufraktioinnin menetelmiä (kuvio 4B) ja linkous levyn konfokaalimikroskopialla (kuvio 4C). Käyttämällä Kromatiini fraktiointimenetelmiä, havaitsimme MDM2-C sytoplasmassa ja kromatiinin (Fig. 4Bi, kaistat 1-3), ja suurin osa MDM2 isoformien havaita 4B11 oli sytoplasmassa (Fig. 4Bi, kaistat 7-9 ). Eksogeenisesti ilmaistuna MDM2-A ja MDM2-B-isoformien on aikaisemmin osoitettu olevan tumaanohjaussignaali [43] huolimatta siitä, että alueet, jotka koodaavat MDM2 ydinvoiman lokalisointi ja vienti signaalit saumattu ulos. Samoin, MDM2-C, jossa on myös näiden alueiden silmukoineet, lokalisoitu sytoplasmaan ja tumaan näistä hematopoieettisten solujen (vertaa DAPI ja vasta värjätään alue kuviossa. 4Ci-iii tutkittiin C410 ja kuviossa 4Cvi-viii tutkittiin esi-immuuni kanin seerumia). MANCA solut ilmentävät korkeita villityyppisen p53-proteiini [14], ja havaitsimme joitakin kolokalisaation p53 ja MDM2-C-proteiinien sytoplasmassa ja tumassa osoittamalla tavalla keltaisena yhdistäminen väriä (Kuva. 4CV). Vaikka yhteistyön tärkeyttä lokalisointi ei heti ymmärtänyt, uskomme, että se on tärkeä havainto. Punaiset nuolet osoittavat vahvan vasta-värjäys, joka edustaa johdonmukainen havainto proteiinia lokalisoitu huomaamaton ydin- alueilla (kuviot. 4Ciii ja 4CV). Koska MANCA hematopoieettiset solut ovat pieniä ja eivät ole paljon sytoplasmassa, oli mahdollista, että mikä näytti sytoplasmisen oli kehälle ytimen. Siksi tutkimme MDM2-C lokalisointi rintasyövän epiteelisoluissa ja havaittiin myös ydin- ja sytoplasman MDM2-C lokalisointi (kuvio 5C).

. MCF-7 ja T47D-solut kasvatettiin ja käsiteltiin 10 nM estrogeenin (E2) viiden päivän ajan. Solut hajotettiin ja proteiinit analysoitiin Western blotilla. MDM2 C410 polyklonaalisen seerumin anti-kani-vasta-ainetta käytettiin proteiinin havaitsemiseksi. Pre-immuuni polyklonaalista seerumia käytettiin havaitsemaan tausta signaalin. HRP-konjugoitu anti-hiiri, ja anti-kaniini käytettiin sekundäärisiä vasta-aineita. Aktiini käytettiin latauskontrollina. Tämä on tyypillinen kolmen erillisen kokeen.

Bi. MCF-7 ja T47D solut hajotettiin kokonaisten solujen tai kromatiinin fraktiointi otteita. 50 ug näytteitä erotettiin käyttämällä 10% SDS-PAGE: n ja MDM2-C410 polyklonaalisen seerumin (kaistat 1-6) ja MDM2 monoklonaalinen vasta-aine, 4B11 (kaistat 13-18) käytettiin proteiinin havaitsemiseksi. Pre immuuni käytettiin havaitsemaan taustan signaali (kaistat 7-12). Toissijaiset vasta käytettiin samoja kuin A.

BII. Tubuliinia ja Fibrillarin käytettiin määrittämään fraktiointi puhtaus.

C. Spinning levy mikroskopia MCF-7 ja T47D-soluissa. Soluja kasvatettiin peitinlaseilla ja käsiteltiin 10 nM E2 viisi päivää. Solut kiinnitettiin ja inkuboitiin p53-vasta-aineen ja MDM2-C410 polyklonaalista vasta-ainetta proteiinin havaitsemiseen. Immuniteettia edeltävä seerumi käytettiin negatiivisena kontrollina värjäystä varten. Laseja inkuboitiin johdetun Alexa-konjugoitua vuohen anti-kani ja FITC-konjugoitua vuohen anti-hiiri. DAPI käytettiin värjäämään ytimet. Soluja tarkasteltiin klo 60X suurennus. Nuolet kuvaavat MDM2-C lokalisointi alueilla.

MDM2-C kasvaa estrogeenihoito ja paikantuu erilliseen pistekeratopatiaa pesäkkeitä sytoplasmassa ja tumassa ER + rintasyövän solujen

MDM2 on koholla jälkeen estrogeenihoito estrogeenireseptoripositiivisten (ER + ) rintasyövän soluja [36]. Lisäksi

mdm2

Knockdown estrogeenin käsitelty rintasyövän solujen johtaa laskun proliferaatiossa, mikä antaa näyttöä, että on tärkeää MDM2 rintasyövän solujen kasvua. Yli-ilmentyminen MDM2 liittyy lisääntynyt

mdm2

saumattu variantti selostukset [3,24-28]. Siksi tutkimme ilmaus MDM2-C-proteiinin kaksi ER + rintasyövän solulinjoissa, MCF-7 ja T47D, jolla on erilaisia ​​genotyyppejä varten

mdm2

SNP30

9

(T /G versus G /G vastaavasti) ja

p53

(villin tyypin vs. mutantti vastaavasti). Havaitsimme hieman enemmän MDM2-C-proteiini jälkeen estrogeenihoito MCF-7 ja T47D-solut (kuvio 5A kaistat 2 ja 4). Syynä ero molekyylipainon MDM2-C isoformit saattavat johtua eroista translaation jälkeisiä muunnoksia kokosolulysaateista. Ennen immuunijärjestelmän polyklonaalista vasta-ainetta seerumia käyttää tausta kontrollina MDM2 C410-vasta-aineen ja tuloksena käytännössä ole proteiinin tunnistus (kuvio 5A kaistat 5-8). Lisäksi T47D-soluissa,

mdm2-C

viesti noussut kaksinkertaiseksi, kun estrogeenihoito (tuloksia ei ole esitetty). Fraktioimme solut ja tutkittiin soluliman ja chromatin jakeet MDM2-C-proteiinia (kuvio. 5Bi for C410, kanin esi immuuni ja hiiren monoklonaalinen 4B11 reaktiivisuus ja Fig. 5Bii merkkiaineista murto puhtaus). Sytoplasminen osa ei sisällä kromatiinin niin selviä puuttuminen fibrillarin värjäystä ja jokainen osa oli joitakin MDM2-C reaktiivinen proteiini (Fig. 5Bi kaistat 2 ja 5). Mielenkiintoista on, että kromatiinin fraktio MCF-7-solut osoittivat voimakasta MDM2-C reaktiivisia lajeja ja vähemmän 4B11 reaktiivisen proteiinin (Fig. 5Bi, vertaa kaistoja 3 ja 15).

määrittää, onko estrogeeni hoito vaikutti lokalisoinnin MDM2-C MCF-7 ja T47D solut, suoritimme immunoflouresence. MDM2-C MCF-7 havaittiin rakenteessa hajanainen ja pistekeratopatiaa sytoplasman ja ydinvoiman lokalisointi ennen ja jälkeen estrogeenihoito (kuviot. 5Cii ja 5Cvii). Vaikka hyvin vähän havaittavissa p53: MCF-7-solujen (kuviot. 5Civ ja 5Cix), sytoplasminen p53 näytti kolokalisoituvat kanssa MDM2-C, kuten co-värjäytyminen havaittiin keltaisena yhdistämisen signaali (kuviot. 5Cv ja 5Cx ).

visualisointi MDM2-C immunoflouresence on T47D-soluissa, ennen ja jälkeen estrogeenihoito, näkyy samanlainen värjäys ja MCF-7-solut (Fig. 5Cxii ja 5Cxvii). Kuitenkin T47D solut eivät osoittaneet kolokalisaation mutantti p53 ja MDM2-C (Fig. 5Cxv ja 5Cxx). Syynä tähän ero kolokalisaation MCF-7-solut ja T47D solut saattavat liittyä siihen, että näillä solulinjoilla ovat villityyppisen versus mutantti p53-proteiinien vastaavasti. Monet eksogeenisesti ilmaisi MDM2 saumattu isoformit eivät vuorovaikutuksessa p53 [43,44] ja tiedetään liitos pois suurin osa p53-sitova alue [29]. Havaitsimme, että T47D solut ilmensivät pääasiassa ydinvoiman mutantti p53 (Fig. 5Cxiv ja 5Cxix), kun taas MCF-7-solut ilmentävät alhaisia ​​soluliman ja ydinvoiman villityypin p53 [45].

MDM2-C ilmentyy vahvasti liposarkooman ja rintasyöpä kudoksiin

Korkea MDM2 ilmentymistä havaitaan usein liposarkooma ja on tällä hetkellä käytetään syövän diagnostiikkaan biomarkkereiden [46-49]. Olimme kiinnostuneita tutkii jos C410-vasta-aine olisi hyödyllistä tarkastella MDM2-C kuin liposarkooman biomarkkereiden potilasnäytteistä. Käytimme immunohistokemia (IHC) testaamiseksi MDM2-C ilmentymistä ihmisen liposarkooma kudoksen ihmisen potilaiden näytteistä. Kahdelle kolmesta näytteestä sarjaa analysoitiin, positiivinen värjäytymistä MDM2-C havaittiin (edustaja kuva kuvassa 6A). Ennalta immuuni seerumi havaittu alhainen taustavärjäyksen ja kun tutkitaan lipoma kudoksissa, vain pieni positiivinen MDM2-C värjäys havaittiin. Olemme alkaneet vastaavissa tutkimuksissa käytetään rintasyövän kudosta mikroriveissä ja havainneet MDM2-C invasiivisessa duktaalisessa karsinoomia (kuvio 6B). Käyttämällä immunohistokemia, havaitsimme samanlainen värjäysrintamaan positiivisten kudosten kanssa MDM2 C410 ja MDM2 4B11-aineella (Fig. 6Bii ja 6Bii), kun taas hiiren IgG ei aiheuttanut kudosvärjäyksellä (Fig. 6Biii).

. Immunohistokemialla lipoma ja liposarkooma kudoksiin käyttämällä MDM2 C410 ja esi-immuuni polyklonaalisia seerumin vasta-aineita. Biotinyloitu sekundäärinen vasta-aine, ABC Reagent ja DAB Vector Labs käytettiin. Kuvia otettiin klo 20X ja 40x suurennos. H & E tarkoittaa hematoksyliinillä ja eosiini counterstaining.

C.

tukeminen Information

Kuva S1.