Krooninen sairaus

tiivistelmä

tehottomuus tuottaa aiheuttama pluripotenttien somaattisten solujen (iPS) synnyttänyt kaksi väittää mallia, nimittäin Stokastinen malli ja Elite malli. Vaikka entinen on suotuisampi selittää luontainen tehottomuutta, se voi olla erehtyväinen yleistää saman työpäivän mallia uudelleenohjelmointi syöpäsoluja. Todellakin, kasvaimen solujen tiedetään olevan luonnostaan ​​heterogeeninen suhteessa ominaispiirteitä, mikä tarjoaa sopivan alustan testata, onko uudelleenohjelmointi prosessi syöpäsolujen on esijännitetty. Täällä raportoimme havaintojen kaikki sattumanvaraisesti aiheuttama pluripotenttien syöpäsoluja (IPCS) perustettiin aiemmin ei ole omaa mutaatioita tunnetaan vanhempien väestöstä. Tämä ennakoimattomia havainto on eniten parsimoniously selittyy Elite mallin, jolloin otaksuttu kasvaimen varhaiseen jälkeläiset valittiin induktion aikana ja pluripotenttisuuden.

Citation: Lai J, Kong CM, Mahalingam D, Xie X, Wang X (2013) Elite Malli indusoitujen Pluripotentit Syöpäsolut (IPCS). PLoS ONE 8 (2): e56702. doi: 10,1371 /journal.pone.0056702

Editor: Rajasingh Johnson, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 syyskuu 2012; Hyväksytty: 14 tammikuu 2013; Julkaistu: 13 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Lai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoittajat: Ministry of Akateemisen Research Fund Taso 1 avustukset, R-183-000-259-112 ja R-183-000-295-112. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

aiheuttama Pluripotentit syöpäsolut (IPCS) B

induktio syöpäsolujen pluripotenssia (IPCS) on onnistuneesti saavutettu eri syöpäsolujen ja osoitti lupaavia tuloksia lieventävien niiden kasvainten muodostumiseen [1] – [5 ]. Koska kuitenkin jokainen perustettu pluripotenttien syöpäsolun siirtomaa oletetaan olevan klonaalisia yhdestä vanhempien syöpäsolun, ja että vanhempien syöpäsolu väestö todennäköisesti heterogeeninen, se tulee olemaan liikuttava kiinnostaa ymmärtää onko ydin- uudelleenohjelmointi prosessi on puolueellinen. Vaikka Yamanaka (2009) ehdotti, että sukupolven aiheuttama pluripotenttien kantasolujen (IPS) ei ole puolueellinen prosessi (stokastinen malli) [6], se on todellakin erehtyväinen ekstrapoloida tätä mallia sukupolven IPCS, koska heterogeenisyys syöpäsolujen .

kasvaimensisäisellä heterogeenisyys

Yksittäiset kasvaimia on yleisesti havaittu olevan morfologisesti ja karyotypically heterogeeninen [7] – [12], joskus peittää histopathologists tarkassa määrittämisessä kasvaimen kliiniseen diagnoosiin. Lisäksi klassinen subkloonauksessa suorittaman kokeen Fidler, I.J. ja Kripke, M. L. avulla on saatu näyttöä siitä, että heterogeenisuus sisällä kasvain olemassa suhteen metastaattista kykyä [13]. Lisäksi aggressiivinen eteneminen seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) on jo ohjattiin mahdollisuus yhden ydin sekvensointi, joka ehdotti välimerkein malli kasvainten kehittymistä [14].

Sen testaamiseksi, stokastinen malli pätee kyseeseen solujen erotettavissa heterogeeninen populaatio tulisi hyödyntää tarkkailla onko alaryhmästä on yliedustettuna ohjelmoida uudelleen siirtomaita. Todellakin, tämä ehto täyttyy syöpäsoluja, joka esittelee mielenkiintoisen koejärjestely. Hochedlinger

et al.

(2004) havaitsivat, että ohjelmoida hiiret melanoomasolujen jakaa homogeeninen karyotyyppi kokoonpano, toisin kuin sen vanhempien solupopulaatio, joka on heterogeeninen [15]. Todellakin, jos Stokastinen malli omistaa karyotyypin on ohjelmoida uudelleen melanooman väestö olisi heterogeeninen välillä klooneja. Kuitenkin kriittinen parametri täysin perustelemaan hylkäämisen satunnaismalli on määritettävä: osuus vanhempien soluja, jotka omaavat samat karyotyyppi konfiguraatio kuin ohjelmoidaan uudelleen soluja. Jos tämä osuus on suuri tekniikan, tilastollisesti, ei juurikaan perusta hylätä satunnaismalli tässä tapauksessa. Kuitenkin, jos osuus on riittävän pieni, se on todellakin havaittavissa hylätä Stokastinen malli.

Täällä raportoimme samansuuntaisia ​​havaintoja uudelleenohjelmointia kahden ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin – H358 ja H460 . Entinen ilmoitettiin olevan

TP53

homotsygoottista poistettu [16], jälkimmäinen harjoittaa homotsygoottinen Poistetaan

CDKN2A

[17] ja mutantti

CDKN2B

(julkaisematon data). Melko yllättäen havaitsimme, että IPC syntyy näistä syöpäsoluja, eli iPCH358 ja iPCH460, ei enää satama tahansa tunnetulla deleetioita tai mutaatioita. Lisäksi

TP53

havaittu iPCH358 ja

CDKN2A, CDKN2B

vuonna iPCH460 havaittiin olevan villityypin. Lisäksi edellä mainittu kriittinen parametri määritettiin ja ehdottaa hylkäämisen satunnaismalli; Meidän kokeelliset tulokset viittaavat siihen, että kyseeseen syöpäsolujen noudattaa Elite malli, joka on valinnut selvä solujen ala- populaation heterogeenisen vanhempien syöpäsolun väestöstä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kulttuuri

Solulinjat, joita käytetään tässä tutkimuksessa ihmisen sikiön keuhkon fibroblasti IMR90 (ATCC no. CCL-186), HeLa (ATCC no. CCL-2), adenokarsinooma NCI-H358 (ATCC no. CRL-5807), suuri solu karsinooma NCI-H460 (ATCC no. HTB-177), sekä ihmisen kantasolujen H1 (WiCell no. WA01). NCI-H460 saatu tri Koeffler laboratoriossa ostettiin myös ATCC. Kaikkia solulinjoja pidettiin kostutetussa inkubaattorissa pidettiin 5% CO

2 ja 37 ° C viljeltiin ATCC suositteli alusta täydennettynä 10% FBS. Sukupolven IPC on kuvattu aiemmin [18]. Lyhyesti, IPCS perustettiin kautta Yamanakan protokollan kanssa pienin muutoksin [19]. Lentivirus- ja retrovirus tuotettiin transfektoimalla 293T-soluihin ja Plat-E soluissa, vastaavasti. Ennen tartuttamisesta H358 ja H460-solut, virukset suodatettiin 0,45 um huokoskoon pinta-aktiivisia selluloosa-asetaattisuodattimen (Sartorius). IPC ja kantasoluja viljeltiin säteilytettyjen hiiren alkion fibroblasti (iMEFs) kylvetetään DMEM /F12 (Invitrogen), jota oli täydennetty 20% Knockout seerumi vaihto (Invitrogen), 1 mM L-glutamiinia (Invitrogen), 100 uM ei-välttämättömiä aminohappoja, 100 uM β merkaptoetanolia (Sigma-Aldrich) ja 4 ng /ul emäksinen fibroblastikasvutekijä (bFGF) (Invitrogen). Ennen suorittaa kokeita IPCS ja kantasoluja, solut ympättiin Matrigelillä (BD Bioscience) ja ylläpidetään mTeS®1 (StemCell Technologies).

RNA /DNA eristys ja käänteinen transkriptio-PCR (RT-PCR)

Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen) ja käänteiskopioitiin käyttäen käänteiskopioijaentsyymin (Promega) sekä oligo-dT-alukkeita (Promega), valmistajan ohjeiden opetusta. Yhteensä DNA eristettiin käyttäen DNeasy Veri Tissue Kit (Qiagen).

Microarray Analysis

Microarray tiedot geenin ilmentymisen ja DNA: n metylaatio saatiin GSE35913. Analyysit suoritettiin käyttäen R lumi ja methylumi ympäristöissä [20]. Lämpö kartta luotiin käyttäen gplots paketti.

PCR ja sekvensointi

TP53

,

CDKN2A

ja

CDKN2B

monistettiin cDNA ja genomi-DNA IMR90 (positiivinen kontrolli), H358, H460 ja 10 sattumanvaraisesti iPCH358 ja iPCH460 pesäkkeitä. Alukkeet monistuksiin löytyy taulukosta S1. PCR-tuotteet erotettiin geelielektroforeesilla ja puhdistettiin QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen), ja sekvensoitiin käyttämällä BigDye® Terminator v3.1 syklisekvensointireagenssipakkausta (Applied Biosystems). PCR-tuote

TP53

amplikonin 2 iPCH358 Col # 3 kloonattiin päälle pGEM®-T-vektoriin (Promega) ennen sekvensointia.

Western Blot

kokosolulysaateista H1, HeLa, H358, H460 ja 10 sattumanvaraisesti iPCH358 ja iPCH460 pesäkettä kutakin erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. TP53 primaarista vasta-ainetta (Cell Signaling # 9282), käytettiin koettimena läsnä TP53 H1, HeLa, H358 ja kaikki iPCH358 pesäkkeitä. CDKN2A primaarista vasta-ainetta (Cell Signaling # 4824), käytettiin koettimena läsnä CDKN2A H1, HeLa, H460 ja kaikki iPCH460 pesäkkeitä.

Serial Dilution Assay

30 ng /ul IMR90 genomisen DNA: laimennettiin peräkkäin 10-kertaiseksi 30 ng /ul H460 genomista DNA: ta. 1 ui keitos käytettiin sitten templaattina monistamiseen

CDKN2B

.

eksplantaatin kasvaimia

Noin 2 x 10

6 H358 ja H460-solut suspendoitiin uudelleen 30% Matrigel ja injektoitiin subkutaanisesti sekamuotoinen immuunivajavuustila (SCID) hiiriä tai nude-hiirissä (taulukko S2). Kasvainten annettiin kasvaa kolmesta neljään viikkoa. Hiiret lopetettiin ennen leikkaaminen kasvaimia. Eläin kokeet tehtiin hyväksyttyjen IACUC (National University of Singapore Institutional Animal Care ja käyttö komitea) protokollat ​​117/09.

Metaphase levinnyt

Metaphase leviää vanhempien ja post-iPC oli suoritettiin kuten on kuvannut Jeppesen [21]. Lyhyesti, soluja viljeltiin 70% konfluenssiin ja käsiteltiin 0,1 ug /ml demekolsiini liuosta (Sigma) 7 tunnin ajan. Sitten solut hajotettiin trypsiinillä ja käsiteltiin 75 mM KCI: a 37 ° C: ssa 10 minuutin ajan. 5 x 10

3-solut (noin 100-500 ui KCI) pyöritettiin 1000 rpm on cytocentrifuge diat 5 minuuttia. Objektilasit pestiin sitten KCM (120 mM KCI, 20 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100) 5 minuutin ajan, blokattiin 10% BSA: ta (laimennettu KCM) ja 45 minuuttia. Tätä seuraa inkubointi primaaristen vasta-aineiden kaksi tuntia ja sitten fluoresenssi-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita yhden tunnin ajan. Pesun jälkeen liukuu KCM, levitteet kiinnitettiin 4% formaldehydiä 15 minuuttia. Lopuksi levyt pestiin tislatulla vedellä, ilmakuivattiin ja asennettu asennus elatusainetta, joka sisälsi DAPI (Vector Laboratories). Kaikki kuvat otettiin käyttäen Olympus Fluoview FV1000 mikroskoopilla. Ensisijainen vasta käytettiin

CENPA

(Abcam) ja

TRF2

(BD Transduction Laboratories).

Liittyminen numerot

Kaikki sekvensointi tiedot

TP53

,

CDKN2A

ja

CDKN2B

oli ladattu GenBank alle hakunumeroilla JQ694043-51and JX391994.

tulokset

läsnäolo

TP53

havaittu iPCH358

perustamisen onnistuminen iPCH358 ja iPCH460 laboratoriossamme ilmoitettiin aiemmin [18]. Geenien ilmentyminen microarray data paljasti, että havaitseminen

TP53

ilmentymisen H358 oli samanlainen kuin taustamelun tasolle kaikkien kolmen biologisen rinnakkaista, mutta yläreguloituja iPCH358, mikä oli täysin odottamatonta (kuvio 1A). Poissulkemiseksi microarray artefakti,

TP53

10 sattumanvaraisesti iPCH358 pesäkkeitä kuulustelivat PCR ja Western Blot. Yllätykseksemme nämä määritykset yksimielisesti samaa mieltä microarray data (kuvio 1 B). Lisäksi sekvensoimme koodaava alue

TP53

ja totesi sen olevan villityypin kolmessa sattumanvaraisesti yhdyskuntia iPCH358 (GenBank: JQ694049-JQ694051).

(A) log muuttaneet intensiteetti lukemat peräisin Illumina HumanHT-12 osoittaa merkittävää (FDR-oikaistu P 0,05) voimistumista

TP53

nauhoituksen iPCH358 verrattuna H358. Tämä on odottamatonta, koska H358 tiedetään olevan

TP53

– /-. (B) PCR (ylempi paneeli) ja Western Blot (alempi paneeli) määritykset vahvistetaan ilmentymä

TP53

useita sattumanvaraisesti pesäkkeet iPCH358. Koodaava alue

TP53

Col ​​# 1, Col # 3 ja Col # 11 ovat villityyppisen (GenBank: JQ694049-JQ694051). (C) PCR (vasen paneeli) ja Western Blot (oikea paneeli) määrityksiä iPCH358 pesäkkeitä 20 kohtia paljasti, että jakolukuun on epäinformatiivisia tuloksista näiden määritysten. Tulokset kokeista suoritettiin eri kertaa tai rajataan samasta kuva on merkitty katkoviivalla; Alkuperäiset kuvat löytyvät Presentation S1, joka sisältää yksityiskohtaisen dokumentoinnin juoksunumerolla.

CDKN2A

ja

CDKN2B

ole mutatoitunut iPCH460

Tämä tulos motivoi meitä määrittämään onko vastaavia ilmiöitä havaittiin H460. Probe sarjaa (DNA: n metylaatio mikrosirulla) varten promoottori

CDKN2A

(

P16

) ja

CDKN2B

(

P15

) eivät kyenneet tuottamaan luotettavia signaalit kaikille biologisia näytteitä (n = 3) ja H460, mikä johtuu todennäköisesti mutaatiot kuulusteli loci. Kuitenkin, samaa ei voida sanoa iPCH460 (kuvio 2A). Validoida Tämän havainnon, alukeparit suunnitellut Shan,

et al.

(2004), joka ei tuota mitään PCR-tuotteiden H460 genomista DNA templaattina käytettiin [22]. Yllättäen sama alukeparia kykeni tuottamaan PCR-tuotteiden 10 sattumanvaraisesti pesäkkeitä iPCH460 genomista DNA: ta templaattina (kuvio 2B). Vastaavasti, alukeparit suunniteltiin monistamaan koodaavan alueen sekä

CDKN2A

ja

CDKN2B

mRNA ei saatu PCR-tuotteiden H460, mutta kaikki 10 iPCH460 pesäkettä tuotti PCR-tuotteita, samoin edellytyksin (kuvio 2B). Lisäksi sekvensointi tulokset koodaavien alueiden sekä

CDKN2A

ja

CDKN2B

mRNA kolme sattumanvaraisesti iPCH460 pesäkkeitä havaittiin olevan villityypin (GenBank: JQ694043-JQ694048). Lisäksi,

CDKN2A

, jonka tiedetään poistetaan H460 ilmaistaan ​​ja havaittavissa Western Blot on iPCH460 (kuvio 2B). Vaikka mitään PCR-tuotteiden monistamalla

CDKN2B

H460 havaittiin, CDKN2B proteiini aktiivisesti ilmaistaan ​​H460- ja pysyi niin iPCH460 (kuva S1). Laboratoriossamme huomasi, että sen sijaan, että koko geeni poistetaan, otaksuttu pieniä mutaatioita ympäröivä loci on

CDKN2B

H460 sulatettu perustettu PCR-menetelmillä epäonnistua. Tämä on todennettu riippumattomiin H460 soluja Dr. Koeffler laboratoriossa (kuva S2).

(A) Heat kartta osoittaa metylaatio array antureista (rivit) jättämällä hybridisoitua

CDKN2A

ja

CDKN2B

promoottorit H460 (tyhjä palkit), mutta ei niin iPCH460. (B) PCR (ylempi kuva) määrityksessä, joissa on näkyvissä

CDKN2A

ja

CDKN2B

ovat havaittavissa iPCH460 taas Western Blot (alempi paneeli) määritys osoittaa

CDKN2A

, joka on homotsygoottinen poistettu H460, on havaittavissa iPCH460. (C) PCR (ylempi paneeli) ja Western Blot (alempi paneeli) määrityksiä iPCH460 pesäkkeitä 20 kohtia paljasti, että jakolukuun on epäinformatiivisia tuloksista näiden määritysten. Tulokset kokeista suoritettiin eri kertaa tai rajataan samasta kuva on merkitty katkoviivalla; Alkuperäiset kuvat löytyvät Presentation S1, joka sisältää yksityiskohtaisen dokumentoinnin juoksunumerolla.

ilmentäminen poistetut geenit jatkuu viivästyneistä kohtia iPC pesäkkeiden

Chin ja kollegat raportoitu, että varhainen käytäviä ( ≤10 kohdat) iPS pesäkkeiden käyttäytyi eri tavalla niiden myöhään käytäviä ( 20 kohtia) kollegansa [23]. Aikaisemmassa määrityksissä (kuvio 1 B ja kuviossa 2B), meidän näytteet olivat pääasiassa ≤20 kohtia. Siksi me eteni luonnehtia jos kulku numero modifioida käyttäytymistä

TP53

vuonna iPCH358 sekä

CDKN2A

ja

CDKN2B

in iPCH460. Mielenkiintoista, emme noudata mitään muutosta ilme käyttäytymisen lopulla passage IPCS (kuvio 1 C, kuvio 2C ja esittely S1).

Mahdollinen sekoitin meidän havainto toistaiseksi on läsnäolo kontaminoivien normaalien fibroblastien näissä syöpä solulinjat. Siksi sulkea pois mahdollisuutta, että nämä tuloksena ipcs olivat peräisin saastuttamasta normaalien fibroblastien, metafaasissa leviäminen suoritettiin jälkeisestä iPC soluja (spontaanisti eriytetty iPC pesäkkeitä kautta embryonaalinen rykelmä muodostumista). Havaitsimme, että post iPC soluista on aneuploidi ja näin päätellä, että vakiintunut iPC pesäkkeet eivät peräisin kontaminoivaa normaalien fibroblastien (kuva S3). Olemme myös sulkea pois 293T solusta ja Plat-E solukontaminaatio koska sekä lentivirus- ja retrovirus suodatettiin 0,45 um huokoskoon suodatin ennen tartuttamisesta H358 ja H460. Lisäksi olemme havainneet, että GFP-kontrollivektoreihin ollut mitään osuutta ilmaisua mutatoidun geenien sekä H358 ja H460 (kuvio 1 B ja kuviossa 2B).

Yhdessä olemme täällä kaksi täydentävät hypoteesit miksi

TP53

null H358-soluista ilmensi TP53 upon uudelleenohjelmointi (samoin,

CDKN2A

null H460-soluista ilmensi CDKN2A upon uudelleenohjelmointi): 1) uudelleenohjelmointi indusoi geeni elpymistä mekanismi; 2) uudelleenohjelmointi, heterogeeninen väestö, rikastettu alapopulaation solujen eri mutaatiostatuksesta riippumatta kuin valtaväestöön. Nämä yritykset hypoteesi tarjoaa eniten parsimonious selitys (katso keskustelu).

Elite mallin uudelleenohjelmointi ennustaa havaintomme

Koska H358 ja H460 ovat heterogeeninen suhteessa geenin mutaatio asema, kysyimme ”Mikä on todennäköisyys, että kaikki sattumanvaraisesti ipcs pesäkkeet johdetaan pieniä alaryhmästä ilman tunnettua mutaatio, joka luonnehtii valtaväestöön, jos uudelleenohjelmointi noudattaa stokastinen malli?” Me ensin yksi parametri: arvioitu osuus vähäinen alapopulaatiolle (varten yksinkertaisuus, tämän alaryhmän kutsutaan nimellä ”mutaatio-free” alaryhmän). Arvioida sitä, IMR90 genomi laimennettiin peräkkäin H460- genomin ja arvioinut tehoa monistamiseen

CDKN2B

PCR. Päätimme täydentää

CDKN2B

ansiosta monistustehokkuudessa verrattuna

CDKN2A

tai

TP53

(kuva S4). Meidän määrityksessä, arvioimme, että suurin osa H460 soluja ilman mutantin

CDKN2B

on 1:5000 (kuvio 3A). Tämän arvion laskimme havaitsemisen todennäköisyys satunnaisesti poimittuja pesäkkeitä, jotka olivat peräisin ”mutaatio-vapaa” alaryhmästä. Sekä iPCH358 ja iPCH460, todennäköisyys, että kaikkia 10 sattumanvaraisesti pesäkettä olla ”mutaatio-free” on 1 x 10

-37 (kuvio 3B). Lisäksi pienin mahdollinen suhteessa johtaa todennäköisyys 0,05 tai enemmän tässä Todennäköisyysmallin on 0,75 (

10C

10 × 0,75

10 × 0.25

0 0,05), eli jos alkaen väestöstä oli peräti kolme ”mutaatio-vapaa” solujen jokaista neljää soluja. Tämä osuus ei ole lähelläkään 0,25, joka on köyhin arvioitu osuus vähiten tehokas vahvistus Sarjalaimennosten määrityksissä (kuvio S4A). Näin hylkäämme nollahypoteesin ja päättelevät, että uudelleenohjelmointi syöpäsolujen noudattaa Elite mallin.

(A) sarjalaimennoksiin määritys osoittaa, että 10

3,7 kertaa laimennus,

CDKN2B

vuonna IMR90 on havaittavissa pohjapinta tasoilla. Siksi korkeintaan 1 5000 H460-solut ovat ”mutaatio-vapaa”. (B) Todennäköisyysmallin testata nollahypoteesia: ”Generation of IPC seuraa stokastinen malli”. Myöhemmät tulon parametrien määritetty (A) esittää hylkäämistä Stokastinen malli uudelleenohjelmointi H358 ja H460.

määritteleminen ”mutaatio-free” subpopulaatio

Vaikka Elite malli tässä uudelleenohjelmointi kokeessa väittää, että prosessi on painottuu ”mutaatio-vapaa” subpopulaatio, rikastamista hankalasti alaryhmän sen natiivi tila on teknisesti haastavaa. Kuitenkin, Hochedlinger

et al.

(2004) on aiemmin osoittanut, että karyotyypin konfiguraatio ohjelmoida syöpäsolun on samanlainen kuin eksplantaatin kasvaimen [15], mikä viittaa siihen, että siirrostus syövän solulinja SCID-hiirissä on valittu kasvaimia alapopulaatio kanssa sytogeneettinen ominaisuus samanlainen kuin ohjelmoidaan uudelleen syöpäsolun. Lisäksi huomautettiin, että Chang

et al.

(2003) havaittiin, että kasvaimen solulinjojen olivat tyypillisesti heterogeeninen päinvastoin kuin johdannainen explant kasvaimia [24]. Näin ollen neljä explant kasvaimia H358 ja H460 kertyi kutakin (taulukko S2). Kuitenkin vain yksi explant kasvain H358 (H358-2) tuotti havaittavissa

TP53

sen genomista DNA: ta (kuvio 4A). Toisaalta yksikään eksplantaatin kasvainten H460 tuotti havaittavissa

CDKN2A

tai

CDKN2B

(kuvio 4B). Siksi rokotus syövän solulinja SCID-hiirissä heikosti jäljittelee valikoivuus ydinvoiman uudelleenohjelmointi.

(A) Yksi neljästä H358 explant kasvain syntyy osoittavat läsnäolo

TP53

genomissa, mikä osoittaa, rikastuminen vaikeasti ”mutaatio-vapaa” alaryhmästä. (B) Yksikään H460 explant kasvaimia havaittiin olevan rikastettu ”mutaatio-vapaa” alaryhmästä. Perimän DNA SCID-hiirten hännän käytettiin ohjaamaan hiirille DNA saastumisen eksplantaatilta kasvaimia. Tiedot explant kasvaimia löytyy taulukosta S2.

Keskustelu

uudelleenohjelmointi erottelee heterogeeninen syöpäsolun populaatio

Tässä esitetyt tiedot osoittavat, että geneettinen mutaatio asema poikkeaa välillä vanhempien syöpäsolun väestön ja ohjelmoida uudelleen vastine. Vaikka meillä ei ole kokeellista tietoa näyttää homogeenisuus tai heterogeenisuus H358 ja H460 syöpäsolun populaatiot suoraan, jotta selittää tätä kiehtova havainto ehdotimme kaksi täydentävät hypoteesia: 1) Aloitetaan väestö on homogeeninen ja siten ydin- uudelleenohjelmointi tahattomasti korjaavat tiettyjä mutaatiot; 2) Ensimmäinen väestö on heterogeeninen ja ydin- uudelleenohjelmointi rikastuttaa vähäinen alaryhmästä. Ensimmäinen hypoteesi saranat oletukseen jolloin solu pystyy palauttamaan mutatoitunut geeni. On kuitenkin selvää, että tällainen mekanismi ei ole olemassa, koska perustamista iPS alkaen

p53, kiksi tert

ja

Ink4 /Arf

knock-out hiiren alkion fibroblasteissa [25], [26], ei nähnyt elpyminen näiden geenien. Toisaalta, toinen hypoteesi olettaa skenaarioon, jonka uudelleenohjelmointi erottelee sisällä heterogeeninen syöpäsolun populaatio eriasteisia geneettinen loukkaus. Tämä oletus muistuttaa läheisesti tarkkailulistalle Hochedlinger ja työtovereiden tehnyt jolloin heterogeeninen karyotyyppi hiirten melanooma tulee homogeeninen jälkeisen uudelleenohjelmointi [15]. Näin ollen toinen hypoteesi suositaan selittää ristiriita mutaatiostatusta soluihin ennen ja jälkeen uudelleenohjelmointi.

Jos alkaa populaatiot H358 ja H460 ovat heterogeenisiä, ja on olemassa ”mutaatio-vapaa” alaryhmässä , miksi PCR tai Southern-blot [16] ei tunnista näitä geenejä? Ehdotamme, että osuus ”mutaatio-vapaa” subpopulaatio on liian pieni riittävän templaattina PCR monistuksia antamaan tuotteille riittävä etidiumbeomidin havaitsemiseen. Todellakin, osoitimme tämä laimennus IMR90 perimän DNA ainakin 5000 kertaa peittää havaitsemisen

CDKN2B

amplikonin. Perustuen tässä kokeessa, arvioimme, että on olemassa korkeintaan yksi ”mutaatio-vapaa” solu jokaista 5000 H358 tai H460-soluissa. Siksi saavuttamiseksi IPCS johdetut saavuttamaton ”mutaatio-vapaa” subpopulaatio on erittäin epätodennäköistä, jos uudelleenohjelmointi prosessi on stokastinen. Siksi ehdotamme, että kyseeseen syöpäsolujen noudattaa Elite mallin.

Early kasvain jälkeläiset voivat määritellä pätevyyden kohti uudelleenohjelmointi

Koska uudelleenohjelmointi prosessi erottelee heterogeeninen syöpäsolun väestö, yritimme rajata taustalla ominaisuudet syöpäsoluissa, joka määrittelee pätevyyden kohti uudelleenohjelmointi. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että uudelleenohjelmointi tekijät aktivoivat useita vanhenemista ja kasvaimen tukahduttava mekanismien (eli

TP53

ja

CDKN2A

), jotka toimivat esteinä kohti uudelleenohjelmointi [25] – [27]. Yllättäen huolimatta somaattisen geeni- poistot näiden esteiden useimmissa H358 ja H460-soluissa, yksikään sattumanvaraisesti pesäkkeet null näitä geenejä. Lisäksi havaitsimme, että Tuumorigeenisuustutkimuksissa (määräytyy SCID hiiriin oli istutettu) heikosti emuloi väkevöimisen uudelleenohjelmointi prosessi. Toisaalta, meidän tiedot viittaavat siihen, että näiden johdannaisia ​​IPC ovat otaksuttu varhainen jälkeläisistä kasvaimen väestöstä.

Mullerin Ratchet todetaan, että mutaatiot organismeihin, jotka toistavat suvuttomasti ovat peruuttamattomia ja kertyy yli sukupolvien [28]. Samoin syöpäsolut ”toistetaan” kautta mitoosin ja geneettiset vahingot ovat peruuttamattomia ja kertyvät usean solunjakautumissykliä. Toisin sanoen, tämä tarkoittaa, että johdannaiset iPCH358 ja iPCH460 ovat soluja varhaisemmissa vaiheissa kasvaimen. Kun lisäksi otetaan huomioon, että mutatoitunut geenien kyseessä (

TP53

,

CDKN2A

ja

CDKN2B

) ovat tärkeitä genomin eheyttä, on todennäköistä, että nämä ”mutaatio vapaa ”soluilla on pienempi laajuus geneettisen tason loukkauksia. Paradoksaalisesti vaikka nämä solut ovat aneuploidi ja näyttää laajemman leviämisen kromosomin laskee kuin niiden vanhempien soluja (kuvio S2), uskottavasti jotka vahvistavat teorian että aneuploidia- edistää perimän epävakaisuuden [29]. Mukaillen myös tämän teorian, Navin ja työtovereiden samoin havaittu, että kopion numero monistuminen

KRAS

, tärkeä onkogeeni, on ainutlaatuinen aneuploidi kasvain väestöstä [14]. Siksi ehdotamme ohjaava hypoteesia, että uudelleenohjelmointi valitsee syöpäsolujen aiemmasta jälkeläisten tumorigeneesin, jos geneettinen tason loukkauksia ovat alhaiset, mutta selvästi aneuploidi (kuva 5). Todellakin, geneettinen eheys ylläpitämä

TP53

ja

CDKN2A

mm voi olla tarpeen säilyttää tarkoin säädeltyä pluripotenttisuuden piiri varmistaa uudelleenohjelmointi menestykseen [30] – [32]. Sen lisäksi, miksi IPC tuotetaan H358 ja H460 eivät

TP53

null ja

CDKN2A

null, vastaavasti, tämä voi vastata kiehtova kysymykseen Zhang ja työtovereiden siitä, miten ohjelmoida uudelleen sarkoomasolulinja useita geneettisiä tason vahinko voi silti saavuttaa pluripotenttisuus [5]. Tulevaisuuden kokeiluja, kuten Flow-FISH (virtaussytometria fluoresenssi

in situ

-hybridisaatio) selvittämään ”mutaatio-free” subpopulaatio seuraa yksi tuma yhdistelmätila todisteita vahvistaa tai väärentää tämän hypoteesin. Lisäksi lisätutkimuksia genomissa explant kasvain H358-2 kiinnostaa käsiteltäessä tätä hypoteesia.

Meidän data, havaitsimme, että johdannaiset meidän IPCS: 1) puuttui keskeinen geneettinen mutaatio (t) ; 2) aneuploidi; 3) vähäiset alaryhmästä. Näiden havaittu ominaisuuksia, se on turvallista olettaa, että nämä johdannaiset ovat varhainen jälkeläisistä kasvaimen väestöstä (edustettuina vihreä). Siten aneuploidiaa on mahdollisesti ensin hankittu ennen kriittistä mutaatioita ajaa toisen edullisen mutaatioita (rajatut harmaa), sopusoinnussa havainnon Navin et al (2011). Yhdessä sovittu, että pluripotenttisuuden sääntelyn piiri on tiukasti säädeltyä ja monimutkainen, vähemmän geneettisen tason loukkauksia soluissa (ympyrät puuttuu punainen ’X’) varmistaa eheyden virtapiirejä ja sieltä perustamisen onnistuminen iPC (edustettuna violetti), jotka voivat eriytettävä useisiin suvusta (edustajat sinisellä).

Päätelmät

tässä tutkimuksessa olemme hyödynnetään syövän solulinjoja, jotka ovat luonnostaan ​​heterogeeninen, jotta voimme tarkkailla johon muuttuja ( s) harhat kohti onnistuneen sukupolven IPC. Todellakin, havaintomme, että ”mutaatio-free” osapopulaatioiden valittiin enemmistöä vastaan ​​osoittavat, että kyseeseen syöpäsolujen noudattaa Elite mallia. Tämä päätelmä ei väärentää edellinen ehdotus, että sukupolvi iPS seuraa stokastisen mallin nojalla, että normaali somaattisten solujen ja syöpäsolujen ovat erilaisia. Lisäksi tietomme johtaa ohjaava hypoteesi, että otaksuttu varhainen jälkeläisistä kasvaimen väestöstä valittiin aikana uudelleenohjelmointi prosessin. Tulevaisuuden selvittäminen liittyvien ominaisuuksien kannalta ”mutaatio-free” subpopulaatio ehdotti meidän data olisi suurta hyötyä edelleen ymmärtämään uudelleenohjelmointi syöpäsolujen prosessi purkaa taustalla olevista erilaisista meikkiä kasvaimia, jotka ovat avainasemassa syöpälääkkeen hoitostrategioita.

tukeminen Information

Kuva S1.

ilmentäminen CDKN2B proteiinin H460 ja iPCH460.

CDKN2B

on mutatoitunut H460, joka tekee kaikki PCR-määrityksissä epäonnistumaan, mutta ei häiritse sen proteiinin ilmentymisen.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0056702.s001

(TIF) B Kuva S2.

läsnäolo

CDKN2B

H460 solujen laboratoriossamme ja Dr. Koeffler laboratoriossa (Klab). (A) CDKN2B proteiini voidaan havaita H460-soluissa meidän laboratorio- ja Klab. (B) Vaihtoehtoinen alukeparit suunnittelimme (taulukko S1) pystyivät monistamaan

CDKN2B

sekä genomista DNA: ta ja cDNA: H460. Sekvensoimme koodausalueen tämän geenin ja totesi sen olevan villityypin (GenBank: JX391994).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0056702.s002

(TIF) B Kuva S3.

Metaphase leviäminen osoittaa, että post-IPCS (piPCs) ovat aneuploidi. (A) edustaja metafaasissa levitteet H358, H460, piPCH358 ja piPCH460. (B) Taulukko laskee kromosomeja vähintään kahdeksan itsenäistä leviää näytettä kohti. Sininen – DAPI värjätään kromosomien; vihreä – TRF2; red – CENPA.

doi: 10,1371 /journal.pone.0056702.s003

(TIF) B Kuva S4.

2-kertainen sarjalaimennokselle IMR90 genomin monistamisen

TP53

ja

CDKN2A

. (A) IMR90 genomista DNA oli 2-kertainen laimennussarja H358 genomista DNA: ta templaattina monistamiseen

TP53

. Havaitsimme, että 4-kertainen laimennus, PCR-vyöhyke, joka vastaa

TP53

on hieman näkyvissä. Tämä antaa meille arvion, että jokaista neljää H358-soluissa, yksi on ”mutaatio-vapaa”. (B) Samoin IMR90 genomista DNA oli 2-kertainen laimennossarja vaan kanssa H460 genomista DNA. Monistaminen tehokkuus

CDKN2A

niinikään vaarantaa epäspesifisten tuotteet; 32-kertainen laimennus, PCR bändi oli hieman tuntuva mikä antaa arvion, että jokaista 32 H460-soluissa, yksi on ”mutaatio-vapaa”. Riippumatta, jäsennys tahansa näistä parametreja todennäköisyys malliin kuviossa 3 johtaa todennäköisyys on paljon pienempi kuin 0,05.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0056702.s004

(TIF)

Presentation S1 .

Alkuperäiset kuvat, joita käytetään kuviossa 1 ja kuviossa 2.

doi: 10,1371 /journal.pone.0056702.s005

(PDF)

Taulukko S1.

alukesekvensseissä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0056702.s006

(XLSX) B Taulukko S2.

explant Kasvain tiedot.

doi: 10,1371 /journal.pone.0056702.s007

(XLSX) B

Kiitokset

Chiou Mee Kong on vastaanottaja tutkimuksen stipendejä Yong Loo Lin School of Medicine, NUHS, NUS, Singapore. Kiitämme tohtori Patrick Tan varten oivaltavia kommentteja sekä Dr. Phillip Koeffler hänen ystävällinen lahja H460 soluja.