Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Radiotaajuisen ablaatio (RFA) on yksi parantava hoitoja maksasyövän (HCC), kuitenkin nopeutettu eteneminen jäljellä HCC jälkeen epätäydellinen RFA on raportoitu useammin. Taustalla molekyylitason mekanismia tämän ilmiön vielä selvittämättä. Tässä tutkimuksessa käytimme epätäydellinen RFA potilaalle tehdä HCC nude-hiirimallissa tutkia invasiivisen ja metastaattisen potentiaalin jäljellä syövän sekä korreloivien mekanismi.

Methods

epätäydellinen RFA potilaalle tehdä nude mouse mallit luotiin käyttäen korkean metastaattinen potentiaali HCC-solulinjassa HCCLM3 ja alhainen metastaattinen potentiaali HCC HepG2, vastaavasti. Muutokset solun morfologiassa, liikkuvuuteen, etäpesäke ja epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), ja HCC solu- molekyylimarkkereina jälkeen

in vitro

ja

in vivo

epätäydellinen RFA intervention havaittiin.

tulokset

Keuhkojen ja vatsaonteloon etäpesäke havaittiin käytettäessä

in vivo

tutkimuksessa. Taustalla pro-invasiivisia mekanismi epätäydellinen RFA näytti liittyvän edistämiseen EMT, kuten alas-säätely E-kadheriinin ja säätely ylöspäin N-kadheriinin ja vimentiinista. Nämä tulokset olivat mukaisesti

in vitro

vasteen HCC solujen lämmittää intervention. Lisätutkimukset osoittivat, että β-kateniinin oli ratkaiseva tekijä tämän kurssin aikana ja estää β-kateniinin pienentää etäpesäke ja EMT fenotyypin muutokset lämpökäsitellyn HCCLM3 soluissa

in vitro

.

Johtopäätös

epätäydellinen RFA parannettu invasiivisen ja metastaattisen potentiaalin jäljellä syöpä, mukana kanssa EMT kaltaisia ​​fenotyypin muutosten aktivoimalla β-kateniinin signalointi HCCLM3 soluissa.

Citation: Zhang N, Wang L, Chai ZT, Zhu ZM, Zhu XD, Ma DN, et ai. (2014) Puutteellinen Radiotaajuisen ablaatio Parantaa invasiivisuus ja metastaasin Jäljellä Cancer Maksasolusyövän Cell HCCLM3 kautta aktivointi β-kateniinin Signaling. PLoS ONE 9 (12): e115949. doi: 10,1371 /journal.pone.0115949

Editor: Terence Lee, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 14 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 27 marraskuu 2014; Julkaistu: 26 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Natural Science Foundation of China (lupanumeroon: 81372314); Shanghai Natural Science Fund for Youth Scholars (12ZR1442300); National Key Project Infectious Diseases (2012ZX10002012-004). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC) on viidenneksi yleisin syöpä maailmassa ja kolmanneksi yleisin syy syövän liittyvän kuoleman [1]. Vaikka kirurginen resektio on standardi hoitomodaliteetti HCC, sen käyttö on yleensä rajoitettu, koska suurimmalla osalla potilaista, pienilläkin HCC, ovat liittäneet vaikeaa maksan vajaatoimintaa [2], [3]. Maksansiirtoa tarjoaa vaihtoehtoisen hoidon pienten voida leikata HCC kuitenkin pula maksan köynnöksen rajoittaa sovellettavuutta tämän lähestymistavan [4]. Johtuen näissä olosuhteissa, useita ei-kirurgisia tekniikoita on otettu käyttöön HCC hoitoon, kuten radiotaajuisen ablaatio (RFA), ihon kautta etanolia ruiskutus (PEI) ja mikroaaltouuni hyytyminen terapian (MCT) [5], [6]. Näistä tekniikoista, RFA on tällä hetkellä laajimmin käytetty hoitovaihtoehto sen yksinkertaisuuden, turvallisuuden, minimaalinen invasiivisuus, toistettavuus ja lyhentämällä sairaalassaoloaikaa [4]. RFA pidetään paras vaihtoehto voida leikata HCC potilailla, joilla on enintään kolme maksakyhmyjen enintään 3 cm halkaisijaltaan kasvain, ja säilynyt maksan toiminta (Child-Pugh A ja B) [7], [8]. Kuitenkin yksi suurimmista haasteista RFA on jäljellä kasvainkudoksen ja paikallisen uusiutumisen jälkeen paikallinen hoito todettiin, että post RFA toistuvat hinnat vaihtelevat 49-74% [9] – [11]. Lisäksi paikalliset toistuva kasvain jälkeen RFA osoitti enemmän invasiivisia kasvua, lisää verisuonten invaasio ja vähemmän erilaistumista verrattuna kasvainten potilaista ilman RFA [12].

Wnt /β-kateniinin reitti on tärkeä signalointi väylän HCC [13], [14]. On raportoitu, että kolmasosa HCC liittyy poikkeava ilmentyminen β-kateniinin [15]. β-kateniinin (CTNNB1), on keskeinen molekyyli Wnt signalointireitin, ja on monitoiminen proteiini osallistuu solu- soluadheesiota, signaalitransduktion, solun erilaistumisen sääntelyä ja lisääntymistä. Tiimimme oli osoittautunut, että hypoksia voivat aiheuttaa β-kateniinin yliekspressio ja /tai kertymiseen solun neljässä HCC solulinjoissa läpi alaspäin säätäminen endogeenisen hajoamisen koneita, ja hypoksia voi myös parantaa invasiivisuus

in vitro

ja etäpesäkkeiden

in vivo

varten Hep3B ja MHCC97 soluihin [16]. Mutaatiot Wnt /β-kateniinin reitin jäsenet myös johtaa poikkeavaan aktivointi kohdegeenien, mukaan lukien koodaus aktivaattoreita epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) [17]. EMT on keskeinen rooli kriittisissä vaiheissa alkion kehitykseen vaikuttaa fysiologisiin prosesseihin, kuten kudosten korjaamiseen, uudistumista ja patologisten tilojen, kuten syövän synty ja fibroosia. Lisäksi se osallistuu myös intrahepaattisen levittämiseen ja etäpesäkkeiden aikana HCC etenemisen [18] – [21]. β-kateniinin on keskeinen rooli puhkeamisessa ja etenemisessä EMT. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että suhde β-kateniinin signalointi ja EMT [22]. Oh et ai. kertoi, että β-kateniinin aktivaation aiheuttama induktio Snail ja ZEB1 ilme, mesenkyymisolun merkki ilmaisun ja tukahduttaminen E-kadheriinin ilmentymisen joissakin epiteelisoluissa aikana synnyssä adenomyoosi [23]. Zhao et ai. edellyttäen todisteita siitä, että Wnt /β-kateniinin signalointireitin suoraan mukana EMT aiheuttama HIF-1α, ja estää Wnt /β-kateniinin signalointireitin aiheutti käänteinen EMT ja metastaattisen fenotyyppien muutokset [24]. Kuitenkin rooli β-kateniinin jäljellä syövän jälkeen epätäydellinen RFA on vielä epäselvä. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että epätäydellinen RFA tehostettu invasiivisen ja metastaattisen potentiaalin jäljellä syöpä, ja tutkitaan muutoksia β-kateniinin ilmentymistä epätäydellisessä RFA tuumorikudoksissa

in vivo

ja lämpökäsitellyn HCC-solujen

in vitro

. Lisäksi arvioimme sen merkitys metastaattisen fenotyypin muutosten aiheuttama kuumuus väliintulon.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja eläimet

HCCLM3 soluja korkea metastaattista potentiaalia ja HCCLM3-G solut, jotka olivat HCCLM3 transfektoitujen solujen vihreän fluoresenssin proteiini, HepG2-soluissa matalalla metastaattista potentiaalia ja HepG2-G-solut, jotka HepG2 solut transfektoitu vihreällä fluoresoivaa proteiinia, käytettiin

in vitro

ja

in vivo

kokeiluja, vastaavasti (perustettu maksan Cancer Institute, Zhongshan sairaala, Fudanin yliopiston Shanghai, Kiina) [25]. Soluja pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM, Gibco BRL, Rockville, MD, USA), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), 100 U /ml penisilliiniä, 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. BALB /c nu /nu hiirille, joiden paino 18-20 g 4-6 viikon iässä, saatiin SLAC Laboratory Animal Co., Ltd, Shanghai, Kiina. Kaikki hiiret pidettiin erityisissä taudinaiheuttajista vapaa olosuhteissa. Kaikki eläin protokollat ​​hyväksyttiin eettinen komitea eläinkokeet Animal Care komitean Fudanin yliopistossa. Kaikki pyrittiin minimoimaan kärsimyksen koe-eläimen (S1 tarkistuslista).

Laitteet ja perustaminen Puutteellinen RFA Orthotopic Nude Mouse Model

Tärkeimmät käytettävät laitteet olivat koostuu RITA lääketieteellisen järjestelmän malli 1500X RF-generaattori (RITA Medical Systems, Fremont, CA, USA), sisäänvedettävä useita koukku RFA neula (S1A Fig.) (RITA Star Burst XL, angioedeema Dynamics, Latham, NY, USA), ja RITA maadoitus tyynyt (angioedeema Dynamics) .

ihmisen HCC potilaalle tehdä nude hiiri malleja, joissa HCCLM3-G-solut ja HepG2-G-soluja perustettiin aikaisemmin kuvatulla [26]. Nude-hiiret jaettiin satunnaisesti epätäydellisen RFA ryhmä (n = 12) ja kontrolliryhmä (n = 12). Kahden viikon kuluttua potilaalle tehdä istutuksen, epätäydellinen RFA suoritettiin seuraavasti: jälkeen anestesian Pelltobarbitalum Natricum kanssa annetaan injektiona vatsaonteloon (50 mg /kg), eläin sijoitettiin johtavan metallilevylle raajoissa kiinteä ja RITA maadoitus tyynyt liimattiin taakse tämän metallilevy varmistaa hyvä sähkönjohtavuus. Seuraavaksi vatsan onkalo hiiren avattiin ja altistuvat potilaalle tehdä kasvain jäljellä koru maksan (S1B, C Fig.). Keskuksessa suoraan yksi RITA neula insertoitiin ksenograftissa ja normaalia suolaliuosta tiputettiin pistokohtaa pitää hyvän johtavuuden. Ottaen huomioon paino ja tilavuus nude-hiirten, RFA suoritettiin vähemmän energiaa protokollan kanssa ulos voimalla 5W ja kesto noin 30 sekuntia pitääkseen olemassaolon jäljellä syöpä. Jälkeen RFA, vatsan ontelon hiirten suljettiin käyttäen 5-0 ei-absorboituvia ompeleita. Hiiret kontrolliryhmässä oli valeleikataan päälle laittamalla RFA neula kasvaimeen suorittamatta ablaation.

Parametrit arvioituna

Kolmen viikon kuluttua RFA menettely, kuusi hiirtä kustakin ryhmästä uhrattiin arvioida kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden. Pisin (a) ja lyhin (b) kasvaimen halkaisija mitattiin ja kasvaimen tilavuus laskettiin seuraavasti: Tuumorin tilavuus (mm

3) = a (mm) x b (mm) x b (mm) /2 [ ,,,0],27]. Keuhkot irrotettiin ja kuvia vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) -positiivinen metastaasipesäkkeiden Saatiin (stereomikroskoopin, Leica, Wetzlar, Saksa). Keuhkojen kudokset leikattiin sarjoittain ja H Slug, 5′-GGTCAAGAAGCATTTCAAC-3 ’(eteenpäin), ja Slug, 5′-CTGAGCCACTGTGGTCCTTG-3′ (reverse); Twist, 5’-TGTCCGCGTCCCACTAGC-3 ’(eteenpäin), ja kierre, 5′-TGTCCATTTTCTCCTTCTCTGGA-3’ (reverse).

Western blot -määritys

western blot menettelyt on kuvattu muualla [31]. Ensisijainen vasta käytetyt kuten: anti-E-kadheriinin, anti-N-kadheriinin, anti-vimentiinistä, anti-β-kateniinin, anti-sykliini-D1 (Abcam) ja anti-β-aktiini (Boster, Wuhan, Kiina).

immunohistokemia

Tuumorikudos oli kiinteä, upotettu ja viipaloitu 5 um: n paksuisia leikkeitä. Immunohistokemia värjäys E-kadheriinin, N-kadheriinin, vimentiinistä ja β-kateniinin suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [30]. Värjäys Tulokset arvioitiin valomikroskoopilla suurennuksella × 200.

Tilastollinen analyysi

Tilastolliset vertailut tehtiin Studentin

t

testiä kun tietoja normaalijakautuneita tai paramerinen analyysit Mann-Whitneyn U-testi, kun tietoja ei normaalisti jakautunut. Laskelmat tehtiin SPSS 20,0 (SPSS Inc. Chicago, IL, USA). Tulokset katsottiin tilastollisesti merkitsevä

p

arvo 0,05.

Tulokset

Heat interventio edisti proliferaatiota, invaasion ja migraatio HCC solun

in vitro

in vitro

leviämisen määrityksessä osoitti, että lämpökäsitellyn HCC-soluissa oli merkittävästi korkeammat lisääntymistä kuin valvonta (Fig. 1A), erityisesti 45 ° C: ssa HCCLM3 solu- ja 47 ° C: HepG2-solu. Kun solujen vaeltamiseen määrityksessä kaikki lämpökäsitelty HCCLM3 solut osoittivat merkittävästi suurempi muuttopotentiaalia kuin kontrolliryhmässä. (33,40 ± 2,16, 45,00 ± 3,21, 86,20 ± 3,39

vs.

19.00 ± 2,00), HepG2 solut käsiteltiin 44 ° C ja 47 ° C: osoitti korkeampi muuttopotentiaalia kuin valvonta (18,00 ± 1,52, 33.80 ± 2,63

vs.

11,60 ± 1,07) (Fig. 1 B). Vuonna soluinvaasion määrityksessä HCCLM3 soluja käsiteltiin 42 ° C: ssa ja 45 ° C: ssa osoitti, että parannettu invasiivinen kyky (18,40 ± 0,87, 29,00 ± 1,82

vs.

5,60 ± 1,03), HepG2-soluja käsiteltiin 44 ° C ja 47 ° C esiintyi merkittävästi korkeampi invasiivisia kyky (12,20 ± 1,56, 19,40 ± 1,50

vs.

2,80 ± 0,67) (Fig. 1 B).

(A) HCCLM3 ja HepG2-soluissa viljeltiin tai ilman lämpöä väliintuloa. 24 h, 48 h ja 72 h solujen elinkelpoisuuden HCC-soluissa mitattiin käyttämällä CCK8 määritystä. Heat interventio merkittävästi edistänyt HCCLM3 ja HepG2-soluissa lisääntymistä. (B) toinen siirtokuoppaan määrityksessä osoitti, että lämpökäsitellyn HCCLM3 ja HepG2-soluissa osoitti lisätä maastamuuttoa ja invaasio kyky kontrolleihin verrattuna.

Heat interventio antaa mesenkymaalisten ominaisuudet HCC soluihin

in vitro

lämpökäsitelty HCC soluista voi saada EMT-kaltainen fenotyyppi, morfologisesti, The HCCLM3 solut ja HepG2-soluissa 48 tunnin kuluttua lämmön väliintulon 45 ° C ja 47 ° C, vastaavasti, osoitti epäsäännöllinen fibroblastien kaltainen muoto sijaan tyypillisen epiteelin mukulakivi ulkonäkö (Fig. 2A). Samaan aikaan, Western blot (kuvio. 2B) ja immunofluoresenssivärjäyksen (Fig. 2C) osoitti vähentäminen ekspression epiteelisolujen markkeri E-kadheriinin näissä lämpö- käsiteltyjä soluja, verrattuna kontrollisoluihin. Samaan aikaan parannettu ilmaus mesenkyymisolun markkereita N-kadheriinin ja vimentiinin myös havaittu. Lisäksi mRNA: n ilmentyminen EMT transkriptiotekijöiden (Snail, Slug ja Twist) havaittiin RT-PCR: llä. Monistamisen Snail mRNA lämpökäsitellyn HCCLM3 solujen ja Slug mRNA lämpökäsitellyn HepG2-soluissa olivat tilastollisesti suurempi kuin ohjaus (Fig. 2D).

(A) HCCLM3 soluja ja HepG2-soluja viljeltiin jälkeen 45 ° C: ssa ja 47 ° C: ssa lämpöä intervention, vastaavasti. Morfologisia muutoksia sopusoinnussa EMT (kara-muotoinen solujen menetyksen polariteetin ja lisääntynyt solujen väliset erottaminen) havaittiin lämpökäsitellyn HCC soluja 48 h, verrattuna hallinnassa. (B) Western blot analyysi paljasti ekspressiota E-kadheriinin, N-kadheriinin, vimentiinistä lämpökäsitellyn HCC-soluissa ja valvontaa. HCCLM3 soluja ja HepG2-soluja viljeltiin 48 h kuluttua 45 ° C: ssa ja 47 ° C: ssa lämpöä intervention, vastaavasti. Immunofluoresenssivärjäyksen (C) osoitti, että muutokset solujen EMT merkkiaineiden vastauksena lämmittää intervention ominaista alas-säätely E-kadheriinin ja säätely ylöspäin N-kadheriinin ja vimentiinista verrattuna kontrolleihin. RT-PCR (D) paljasti, että mRNA ilmaus EMT liittyvien transkriptiofaktoreiden Snail, Slug, ja Twist in HCC-soluissa.

Keskeneräinen RFA esti kasvaimen kasvua vaan edistetään invasiivisuus ja etäpesäkkeiden

vuonna vivo

Olemme kehittäneet turvallisen ja luotettava menetelmä perustaa epätäydellinen RFA potilaalle tehdä nude-hiirimallissa ja tässä eläinmallissa voi olla ensimmäinen raportoitu epätäydellinen RFA potilaalle tehdä nude-hiirimallissa mukaan kirjallisuudessa PubMed. Epätäydellisessä RFA ryhmässä kasvaimen kokoa HCCLM3-G ja HepG2-G malli oli 449,58 ± 143,19 mm

3 ja 299,83 ± 131,45 mm

3: lla, jotka olivat pienempiä kuin hallintalaitteiden (1788,75 ± 248,53 mm

3 HCCLM3-G ja 942,67 ± 144,16 mm

3 HepG2-G,

P

0,05) (Fig. 3A). Keuhkojen etäpesäke korko on epätäydellinen RFA ryhmä HCCLM3-G (6/6) oli korkeampi kuin verrokkiryhmässä (2/6) (Fig. 3B). Arvioitava edelleen metastaattisen potentiaalin jäljellä syöpä HCCLM3-G jälkeen epätäydellinen RFA, sarja keuhko parafiinileikkeillä käytettiin. Keuhkojen etäpesäkkeet epätäydellisessä RFA ryhmässä oli merkittävästi lisääntynyt, verrattuna kontrolliryhmään (29,67 ± 2,56

vs.

2,50 ± 1,58,

P

0,001) (Kuva. 3C). Toisaalta, keuhkojen etäpesäkkeiden ei havaittu HepG2-G malli, riippumatta vastaanottaa RFA vai ei (S2 kuvassa.), Mutta epätäydellinen RFA voivat aiheuttaa vatsakalvon etäpesäkkeiden (6/6), ja ei vatsakalvon etäpesäkkeiden havaittu ohjaus ryhmä (0/0) (Fig. 3d).

(A) Kun potilaalle tehdä HCC malli, kasvain koot epätäydellinen RFA ryhmässä olivat pienempiä kuin kontrolli (HCCLM-G: 449,58 ± 143,19

vs.

1788,75 ± 248,53,

P

= 0,002; HepG2-G: 299,83 ± 131,45

vs.

942,67 ± 144,16,

P

= 0,008) . (B) kvantifiointi bioluminenssin osoitti epätäydellistä RFA kiihtyi keuhkojen etäpesäke HCCLM3-G ksenografteissa verrattuna verrokkiin (nuolet osoittavat keuhkoihin etäpesäkkeitä). Kolme kasvaimia valvontaa ja kolme epätäydellinen RFA käsitellyt tuumorit verrattiin sekä Kirkas (b) ja fluoresenssi (f). Ilmaantuvuus keuhkojen etäpesäkkeiden (6/6) nostettiin epätäydellisen RFA ryhmässä verrattuna verrokkiryhmään (2/6). (C) H 0,001). (D) kvantifiointi bioluminenssin osoitti epätäydellistä RFA voivat aiheuttaa vatsaonteloon etäpesäke HepG2-G ksenografteissa (6/6) verrattuna verrokkiin (0/6) (nuolet osoittavat vatsaonteloon etäpesäkkeitä).

puutteellinen RFA aiheuttamien muutosten yhdenmukainen EMT HCC ksenografteissa

immunohistokemia osoitti tyypillisen membranous E-kadheriinin ilmentymisen solu-solu kontakteja kontrolliryhmässä HCCLM3-G sitä vastoin puutteellinen RFA-käsitellyt tuumorit osoittivat vähentäminen E-kadheriinin ilmentymisen, sekä säätely ylöspäin N-kadheriinin ja vimentiinista. HepG2-G malli, alas-säätely E-kadheriinin ilmentymisen ja säätely ylöspäin N-kadheriiniekspressiota havaittiin myös epätäydellinen RFA ryhmässä (Fig. 4A). Induktio EMT epätäydellisen RFA osoitettiin ksenograftikasvaimissa Molempien solulinjojen Western blot, ja leimasi menetys E-kadheriinin ja säätely ylöspäin N-kadheriinin ja vimentiinista kasvainkudoksessa epätäydellisen RFA ryhmän (Fig. 4B). Lisäksi parannettu mRNA: n ekspressio EMT transkriptiotekijän Snail ja Slug tutkittiin RT-PCR: llä HCCLM3-G-johdettu ja HepG2-G-johdettu ksenografteja, vastaavasti (Fig. 4C).

(A) Immunohistokemia paljasti, että E-kadheriinin ilmentyminen väheni epätäydellinen RFA ryhmässä sekä HCC-solu malleja, ilmentymisen taso N-kadheriinin kasvainkudoksissa olivat korkeampia puutteellisia RFA ryhmässä kuin verrokeilla, ja HCCLM3-G malli, lisääntyneen ekspression vimentiinista havaittiin myös epätäydellisessä RFA ryhmässä. (B) Western blot osoitti muutoksia jäljellä kasvaimet vastasivat EMT epätäydellisessä RFA ryhmässä (esimerkiksi alas-säätely E-kadheriinin ja säätely ylöspäin N-kadheriinin, vimentiinistä) sekä HCC solumalleja. (C) RT-PCR osoitti, että ilmentyminen transkriptiotekijöiden Snail, Slug, ja Twist mRNA-tasolla kasvainkudoksessa. Kuitenkin vain Snail mRNA HCCLM3-G malli ja Slug mRNA HepG2-G malli oli merkitsevästi säädellään ylöspäin epätäydellinen RFA ryhmässä, vastaavasti (

P

0,05).

Puutteellinen RFA aiheuttama β-kateniinin aktivoivan mukana EMT

in vivo

ja

in vitro

of HCCLM3

tutkia molekyylitason mekanismeja EMT lämpökäsitellyn HCC solut, yritimme testata onko β-kateniinin signalointi aktivoitiin. Vuonna HCCLM3-G malli, immunohistokemia värjäys paljasti merkittävästi parannettu solunsisäisen kertymisen β-kateniinin epätäydellisessä RFA-kasvaimen, mutta ei HepG2-G malli (Fig. 5A). Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​β-kateniinin proteiinin ilmentymistä epätäydellinen RFA ryhmän ja kontrolliryhmän Western blot (kuvio. 5B). Kertyminen soluliman ja ydinvoiman β-kateniinin on osoitus aktivoitua β-kateniinin riippuva signalointi, joten vielä tutkia, onko lisääntynyt β-kateniinin ilmentyminen vaikutti β-kateniinin signalointia. Immunofluoresenssivärjäyksen osoitti lisääntyneen ekspression β-kateniinin sekä sytoplasmassa ja tumassa lämpökäsitellyn HCCLM3 soluissa verrattuna kontrollisoluihin

in vitro

kuitenkin sama suuntaus lämpökäsitellyn HepG2-soluissa oli ei havaittu (kuvio. 5C). Lisäksi merkittävä solunsisäinen translokaatio β-kateniinin lämpökäsitellyn HCCLM3 soluissa varmistettiin western blot -analyysillä (kuvio. 5D). Jotta voidaan tutkia lämmön vaikutuksesta intervention indusoimaan tumaansiirtymiseen ja β-kateniinin geenien ilmentymisen, teimme huomiota β-kateniinin signalointireitin alavirran kohdegeenin sykliini-D1. Western blot osoitti, että ilmentyminen sykliini-D1 lisääntyi myös koko β-kateniinin yliekspressio lämpökäsitellyn HCCLM3 solut

in vitro

(Fig. 5E).

(A) Immunohistokemia paljasti, että β-kateniinin ekspressio lisääntyi epätäydellinen RFA ryhmässä HCCLM3-G ksenografteissa (

P

= 0,002); HepG2-G ksenografteissa, ei ollut merkitsevää eroa kahden ryhmän β-kateniinin lauseke (

P

= 0,843). (B) Western blot osoitti parannettu β-kateniinin ilmentymistä kasvainkudoksessa jälkeen epätäydellinen RFA verrattuna ohjaimissa HCCLM3-G ksenografteissa. (C) immunofluoresenssi osoitti vahvan sytoplasmisen ja ydinvoiman lokalisointi β-kateniinin lämpökäsitellyn HCCLM3 soluja, ja tyypillinen kalvomainen β-kateniinin ilmentymistä solu-solu-kontaktien HCCLM3 solujen valvontaa. Kuitenkin, ei ollut merkittävää eroa kahden ryhmän β-kateniinin ilmentymistä HepG2-soluissa. (D) Distribution of β-kateniinin sytoplasmassa ja tumassa HCCLM3 solujen havaittiin Western blot

in vitro

. (E) Western blot-analyysi osoitti ilmentymistä koko β-kateniinin ja sen loppupään kohdegeeni sykliini-D1 sekä kaksi HCC solua

in vitro

.

Parannettu hyökkäys potentiaali ja EMT kaltaisia ​​muutoksia lämpökäsitellyn HCCLM3 solut voidaan osittain vaimentaa hiljentäminen β-kateniinin

in vitro

edelleen selvittämiseksi, onko aktivointi β-kateniinin oli toiminnallisesti liittynyt parannettu invasiivisuus ja EMT kaltaisia ​​muutoksia lämpökäsitellyn HCCLM3 soluja, käytimme CTNNB1 siRNA transfektion ja tutkitaan sen vaikutuksia HCCLM3 soluihin. Sen tarkistamiseksi vaikutusten transfektion, immunofluoresenssivärjäyksen ja western blot käytettiin. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, tyypillinen solukalvon ilmentymisen β-kateniinin väheni transfektion jälkeen, ja yhteensä β-kateniinin proteiinin väheni HCCLM3-siCTNNB1 soluissa, verrattuna valvonta HCCLM3-mock-solut (Fig. 6B). Kuten on esitetty kuviossa. 6C, normaaliolosuhteissa, ero tunkeutumaan solujen lukumäärän välillä HCCLM3-mock-solut ja HCCLM3-siCTNNB1 solut eivät olleet tilastollisesti merkitseviä. Kuitenkin käyttöönoton jälkeen lämmön intervention määrä HCCLM3-siCTNNB1 solujen muuttoliikkeen array ja invaasion array olivat vähemmän kuin HCCLM3-mock-solut (Fig. 6C). Lisäksi hiljentämisen CTNNB1 voi vaikuttaa ilmentämiseen EMT transkriptiotekijän, RT-PCR osoitti, että ilmentyminen Snail mRNA lämpökäsitellyn HCCLM3-siCTNNB1 soluihin väheni verrattuna vastapuolen lämpökäsitellyn HCCLM3-mock-soluissa (kuvio . 6D). Western blot-analyysi vahvisti myös, että tukahduttamisen β-kateniinin vaikuttaa ilmentymistä β-kateniinin-välitteisen EMT markkereita lämpökäsitellyn HCCLM3 solut, ja ilmentyminen sykliini-D1 myös heikennetty (kuvio. 6E). Yhdessä edellä havainnot osoittivat, että aktivaatio β-kateniinin oli toiminnallisesti merkityksellisiä ja metastaasit ja HCCLM3 solujen välittämä lämpö intervention.

(A) immunofluoresenssi osoitti, että β-kateniinin ilmentymistä osittain vaimennettu hiljentäminen CTNNB1 in HCCLM3 soluissa. (B) proteiini tasot β-kateniinin mitattiin western blot-analyysi sen jälkeen, kun siCTNNB1 transfektion. (C) Kuvat ovat muuttoliikkeen ja hyökkäyksen HCCLM3-mock-solut ja HCCLM3-siCTNNB1 solujen Transvvell- määrityksessä. HCCLM3-mock-solut ja HCCLM3-siCTNNB1 soluja viljeltiin 48 h kuluttua 45 ° C: ssa lämpöä intervention ja normaali tila, vastaavasti, RT-PCR: ää (D), oli suhteellisen mRNA: n ilmentymisen transkription tekijöitä Snail, Slug, ja Twist. Western blot (E) paljasti ilmentymisen EMT liittyvien transkriptiotekijöiden ja sykliini-D1.

Keskustelu

Tällä hetkellä yhä useammat kliiniset tutkimukset ovat tunnistaneet nopeaa etenemistä jäljellä syöpä jälkeen epätäydellinen RFA hoidettaessa HCC [32], [33]. Edelliset tutkimukset oli antanut useita mahdollisia mekanismeja, jotka voivat auttaa selittämään näitä havaintoja. Lämmönnousua voi olla tärkeä rooli nopean kasvun jäljellä HCC jälkeen RFA edistämällä angiogeneesiä jäljellä HCC kautta HIF-1a /VEGFA [34]. Toinen tutkimus osoitti, että optimaalinen RFA nopeutettu HCC kasvua ja levitä ohimenevästi indusoi EMT kaltainen ja aggressiivisempi solujen fenotyyppiin [35]. Tässä tutkimuksessa, otimme käyttöön RFA osaksi potilaalle tehdä nude hiiren HCC malli ja osoitti merkityksen epätäydellinen RFA hoito kasvaimen kasvuun ja invasiivisuus. Vaikka ksenografti kasvainten tilavuudet pienenivät sen jälkeen, kun puutteellinen RFA hoidon, jäljellä kasvaimet osoittivat invasiivisia kyvyt epätäydellinen RFA-käsitellyillä hiirillä, kuten on esitetty lisääntynyt keuhko- tai vatsaonteloon etäpesäke. Toisaalta,

in vitro

lämpökäsitellyn HCC-soluissa ilmeni lisääntynyt liikkuvuus ja invasiivisuus. Nämä löydökset olivat yhdenmukaisia ​​tulosten kanssa aikaisempien tutkimusten avulla muun eläimen syövän malleja. Vuonna translaation hiirimallissa, Kroeze et al. havaittiin, että epätäydellinen terminen ablaatio stimuloi leviämisen jäljellä munuaissyöpä soluihin [36]. Ke et ai. löydetty jäljellä maksan VX2 kohdunkaulan jälkeen epätäydellinen RFA voisi helpottaa nopeaa etenemistä on VX2 karsinooma kani malli, ja polttoväli kasvaimen tilavuuden ja keuhkojen etäpesäkkeet RFA-käsiteltyjen kanien huomattavasti [37].

Asennus näyttöä oli tunnistanut merkittävä korrelaatio EMT ja invasiivisuus erilaisten kasvainten [38] – [40]. Tässä osoitimme, että lämpö väliintulon stimuloi transformaatio HCC solujen tyypillisestä epiteelin fenotyyppi on kara-muotoinen mesenkymaalisten fenotyyppi, mukana alas-säätely E-kadheriinin ja säätely ylöspäin N-kadheriinin ja vimentiinista. Lisätodisteita toimittamat nude-hiirissä jälkeen epätäydellinen RFA oli, että proteiini taso korjauksilla nämä EMT markkereita myös havaittu. Lisäksi olemme tutkineet sääteli EMT transkriptiotekijöitä epätäydellinen RFA kasvaimia ja lämpökäsitellyn HCC-soluissa. Nämä havainnot yhdistettynä tuloksiin aikaisempien tutkimusten Edellä mainittujen lisäksi tunnistettu, että ”kadheriinin kytkin” kasvainkudoksen mahdollisesti aiheuttamia puutteellinen RFA mikä johtaa tehostetun etäpesäkkeiden mahdollisia.

Ymmärtämiseksi molekyylitason mekanismi suhde lämmön intervention ja muutoksia solun fenotyypin, me keskittäneet huomiomme β-kateniinin. Koska keskeinen tekijä Wnt signaalireitin, β-kateniinin tärkeä rooli HCC etenemisessä, kehitys, fenotyypin muutoksia ja syövän. β-kateniinin mutaatio on yksi tekijä, joka voi olla kriittinen kehittämiseen HCC. Mutaatiot, joihin Wnt /β-kateniinin reitti näyttää olevan yksi yleisimmistä geneettisiä tapahtumia, jotka edistävät maksan karsinogeneesiin ja etenemiseen [41]. Häiriöstä β-kateniinin voi edistää syövän synnyn; hiiret heterotsygoottisia Lkb1 poistetaan osoitti nopeutettua etenemistä HCC kun pariutua adenovirus-indusoituva β-kateniinin mutanttihiirissä [42]. Samaan aikaan jotkut raportit olivat sekaantuneet että β-kateniinin mutaatio oli melko yleinen mekanismi hiiri hepatosellulaaristen kasvainten kuten adenoomien ja karsinoomien [43]. Toisaalta, korrelaatio β-kateniinin signalointireitin ja EMT on todennettu useissa tutkimuksissa. Yang et ai.