Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

muutosta arvioidaan ydin- tekijä-kappa B (NF-KB ) aikana radiojodin 131 (

131I) hoito ja onko NF-KB esto voisi tehostaa

131I aiheuttaman apoptoosin kilpirauhassyöpäpotilailla (DTC) solujen synergistinen tavalla.

Methods

kolme ihmisen DTC solulinjoja käytettiin. NF-KB: n inhibitio saavutettiin käyttämällä NF-KB-inhibiittori (Bay 11-7082) tai p65: n siRNA transfektiota. Metyyli-tiatsolyyli-tetratsolium määritys suoritettiin solujen elinkelpoisuuden arviointi. DNA-sitoutumismääritys, lusiferaasireportteri määritys, ja Western blot hyväksyttiin määrittää funktion ja ilmentyminen muuttuu NF-KB. Sitten NF-KB: n säädellään anti-apoptoottisia tekijöitä XIAP, cIAP1, ja Bcl-x L mitattiin. Apoptoosi analysoitiin Western blot kaspaasi 3 ja PARP, ja virtaussytometrialla samoin. Jodidi sisäänoton koe suoritettiin sen määrittämiseksi, onko NF-KB: n inhibitio voi vaikuttaa radioaktiivista jodidia ottoa.

Tulokset

metyyli-tiatsolyyli-tetratsolium-määritys osoitti merkittävää vähenemistä elinkykyisten solujen yhdistelmähoidon kuin mono-hoitoja. DNA-sitoutumismääritys ja lusiferaasireportterigeenin määritys osoitti parannettu NF-KB: n toimintaa ja reportterigeenin toiminnan vuoksi

131I, mutta merkittävä suppressio saavutettiin NF-KB: n eston. Western blot osoitti

131I voi lisätä ydinaseiden NF-KB pitoisuus, kun taas NF-KB esto vähensi NF-KB pitoisuus. Western blot osoitti myös merkittäviä lisäävä säätely XIAP, cIAP1, ja Bcl-xL jälkeen

131I terapiassa. Ja NF-KB voisi merkittävästi alas-säädellä näitä tekijöitä. Lopuksi synergiaetuja aiheuttama yhdistelmähoidon näkyi merkittäviä parannuksia pilkkoa kaspaasi 3 ja PARP Western blot, ja anneksiini V positiivisesti värjäyksen virtaussytometrialla. Jodia oton määritystä eivät osoittaneet merkittäviä muutoksia, kun NF-KB estyi.

Johtopäätös

osoitti, että

131I voisi aiheuttaa NF-KB: n aktivoitumisen, mikä vaimentaa

131l teho DTC soluissa. NF-KB esto Bay 11-7082 tai p65 siRNA transfektion tehosi tukahduttaa NF-KB säänneltyjen antiapoptooppinen muutoksia ja yhdistetty hoito apoptoosin saavutettiin synergistisesti.

Citation: Meng Z, Lou S, Tan J, Xu K, Jia Q, Zheng W (2012) Nuclear Factor-Kappa B estäminen voi parantaa apoptoosi kilpirauhassyöpäpotilailla indusoiman

131l. PLoS ONE 7 (3): e33597. doi: 10,1371 /journal.pone.0033597

Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia

vastaanotettu: 07 lokakuu 2011; Hyväksytty: 12 helmikuu 2012; Julkaistu: 16 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Meng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat China National Natural Science Foundation avustuksen 30900376, Key projekti Tianjin tieteen ja teknologian säätiö myöntää 10JCZDJC19000, Tianjin Medical University Scientific Research myöntää 2008KY20, ja Tianjin Medical University New Century Excellent Talent Program (myönnetään ZM). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kilpirauhasen kyhmy on hyvin yleinen kliininen ongelma, ja kilpirauhasen syöpä on yhä yleisempää nykyään [1]. Kilpirauhassyöpäpotilailla (DTC), mukaan lukien papillaarinen ja follikulaarinen kilpirauhassyöpä, käsittää suurimman osan kaikista kilpirauhasen syövistä. Vaikka yleinen ennuste DTC on hyvä, jos koko kilpirauhanen ja radiojodin 131 (

131I) hoitojen sovelletaan [2], potilailla, joilla

131I tulenkestävä etäpesäkkeitä voi saavuttaa vain 10% 10 vuoden pysyvyys [3] [4]. Ja joissakin tapauksissa jopa

131I-innokas vaurioita ei onnistunut ohjata

131I hoito yksinään [5]. Siksi uudenlaisten syöpälääkkeen menetelmiä tarvitaan kiireesti varten kilpirauhassyöpä.

Viime vuosina useat syyllinen molekyylikohteista on tunnistettu DTC karsinogeneesissä [6], [7], [8]. Näistä syntymässä todistusaineisto osoittaa, että tumatekijä-kappa B (NF-KB) on keskeinen rooli kilpirauhassyöpä, kuten syövän kehittymisen ja etenemisen [6], [7], [9], [10], [ ,,,0],11], [12], [13], [14]. On myös osoitettu, että NF-KB: n induktio kemoterapia tai sädehoito voi lieventää terapeuttinen efficacies. Ja NF-KB esto voisi edistää kilpirauhassyöpä solujen apoptoosin, ja saavuttaa synergiavaikutuksia [8], [9], [10], [11], [12]. Kuitenkin tietojemme mukaan ei ole tutkimuksessa, jossa suhde NF-KB ja

131I hoidon DTC huolimatta tärkeyttä

131I hoitoa DTC hallintaan.

Näin ollen tarkoitus tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida muutoksia NF-KB: n aikana

131I terapiassa. Ja me myös haluttiin selvittää, onko yhdessä NF-KB-estäjän tai pieniä häiriöitä RNA (siRNA) transfektio voitaisiin tehostaa

131I aiheuttaman apoptoosin DTC synergistinen tavalla.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

ihmisen papillaarinen kilpirauhassyövän sinoomasolulinjoja KTC-1, TPC-1 ja follikulaarisen kilpirauhassyövän solulinjaa WRO ystävällisesti tri Shunichi Yamashita ja tohtori Norisato Mitsutake (molekyylilääketieteen osasto , Atomic Bomb Disease Institute, Nagasakin yliopiston Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki, Japani). DTC-soluja kasvatettiin Dulbeccon vähintään essential medium (GIBCO BRL, NY, USA) täydennettynä 5% naudan sikiön seerumia (GIBCO BRL, NY, USA), 1% (w /v) penisilliiniä /streptomysiiniä (Sigma-Aldrich, MO, USA) ja 1 mU /ml tyreotropiini (Sigma-Aldrich, MO, USA) 5% CO

2 kostutetussa atmosfäärissä 37 ° C: ssa.

transfektio siRNA

SMARTpool NF -κB p65 siRNA kaupallisesti suunnitellut Dharmacon (Dallas, TX, USA). Allas siRNA: iden sisälsi p65-spesifisiä sekvenssejä. Salatut oligonukleotidejä (sekvenssi AATTCTCCGAACGTGTCACGT) syntetisoitiin kemiallisesti SBS Genetech (Peking, Kiina) ja se analysoitiin BLAST-haussa jättää homologiaa p65 tai muiden geenien [15]. Kun DTC-solut olivat 50% -60% konfluenssiin, transfektio p65 SMARTpool siRNA: iden (100 nmol /l), salattu oligonukleotidit (100 nmol /L) tai ei oligonukleotidi (kontrolli) suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 6 tunnin ajan 37 ° C: ssa 6-kuoppaisille levyille. Transfektion jälkeen soluja kasvatettiin uusia väliaineet ja käsitelty tai talteen kuten on osoitettu.

metyyli-tiatsolyyli-tetratsolium (MTT)

DTC-soluja (100 ui, 6000 solua per kuoppa) ympättiin 96-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin 48 tuntia ennen käsittelyä. Sitten uusi medioissa muutettiin, ja

131I (Beijing Atom HighTech, Peking, Kiina) tai Bay 11-7082 (Sigma-Aldrich, MO, USA) lisättiin, jotta saavutetaan lopullinen

131I aktiivisuus pitoisuuksia 5, 10, 20, 50, 100 ja 200 MBq /ml tai lopullinen Bay 11-7082 pitoisuudet 1, 2, 5, 10 ja 20 umol /l kuhunkin kuoppaan. Solut altistettiin hoitoja 48 tuntia, ja 6 rinnakkaista käytettiin kullakin pitoisuudella joko lääkeaineen. Kontrollikuopissa DMSO: ssa, ja DMSO: n loppupitoisuus ei ylittänyt 0,2% missään hyvin. Inkuboinnin jälkeen soluja käsiteltiin MTT (50 ug /kuoppa, Sigma-Aldrich, MO, USA) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Luotu formatsaani liuotettiin 150 ul /kuoppa DMSO, ja optiset tiheydet kuoppien mitattiin 450 nm: ssä Multiskan MS Plate Reader (Labsystems, Helsinki, Suomi).

leviämisen DTC solulinjojen jälkeen siRNA transfektion mitattiin myös MTT: llä. Transfektion jälkeen p65-siRNA, salattu oligonukleotidit tai ei oligonukleotidi ohjaus, solut siirrettiin kuin 6 replikoituu 96-kuoppaisille levyille konsentraationa 6000 solua per kuoppa. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 48 tuntia, solut käsiteltiin tai ei 20 MBq /ml,

131I 48 tuntia. Sitten MTT suoritettiin kuten edellä.

valmistaminen solu-uutteiden

Kun erilaisia ​​hoitoja, solut hajotettiin korkean suolan puskurissa [9]. Sillä solun kokonaisproteiinista, Kerätyt solut suspensoitiin 100 ul: aan lyysipuskuria (20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5% Triton-X, 50 mM NaF, 10 mM natriumpyrofosfaatti, 1 mM natrium- vanadaatti ja 2 mM phenylmethyisulfonylfluoride) 20 minuuttia jäillä. Sitten lysaattia sentrifugoitiin 15 minuutin ajan 14000 rpm, ja supernatantti säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Ydin- proteiinin Kerätyt solut suspendoitiin 400 ul: aan lyysipuskuria (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 0,5 mM ditiotreitolia, 0,5 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridi ja 0,1% Nonidet P-40) 20 minuuttia jäällä. Sitten lysaattia sentrifugoitiin 5 minuuttia nopeudella 14000 rpm. Pelletit suspendoitiin uudelleen 40 ui tumauutetta-puskuria (20 mM HEPES, pH 7,9, 420 mM NaCl, 1,5 mM MgCl

2, 1 mM ditiotreitolia, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridi ja 20% glyserolia) 20 minuuttia jäätä. Sentrifugin jälkeen 15 minuuttia 14000 rpm, supernatantti otettiin talteen ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Proteiinikonsentraatiot määritettiin bikinkoniini- hapon määritystä reagenssipakkauksen (Sigma-Aldrich, MO, USA).

DNA-sitoutumismääritys

multi-ja kolorimetristä määritystä varten aktiivinen NF-KB suoritettiin [9]. Lyhyesti, yhtä suuri määrä tumauutteita inkuboitiin 96-kuoppalevyillä päällystetty immobilisoidun oligonukleotidin, joka sisältää NF-KB: n konsensus sitoutumiskohdan. NF-KB: n sitoutumisen oligonukleotidituotteelle havaittiin primaarisen vasta-aineen spesifinen p65-alayksikköä ja HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen. Kvantifiointiin toiminta, optiset tiheydet mitattiin 450 nm: ssä Multiskan MS Plate Reader.

lusiferaasianalyysissä

DTC-solut ympättiin 24-kuoppalevyille 1 x 10

5 solua kuoppaa kohti. Solut kotransfektoitiin 400 ng PNF-KB-luc (Clontech, Mountain View, CA, USA) ja 4 ng PRL-SV40 (Promega, Madison, WI, USA) käyttäen Lipofectamine 2000 PRL-SV40 plasmidin jossa on cDNA, joka koodaa

Renilla

lusiferaasia käytettiin sisäisenä kontrollina kussakin kokeessa [16]. Solut levätä 12 tuntia transfektion jälkeen, sitten inkuboitiin kanssa tai ilman

131I, tai yhdistetyn terapiassa

131I plus Bay 11-7082 6 tuntia. Toiminta tulikärpäsen ja

Renillaa

lusiferaaseista määritettiin peräkkäin yhdestä näytteestä Dual-lusiferaasi Reporter Assay (Promega, Madison, WI, USA) käyttäen Lumat LB 9507 luminometrillä (Bethold Technologies, Bad Wildbad, Saksa ).

DTC-solut ko-transfektoitiin PNF-KB-luc ja PRL-SV40 24 tunnin jälkeen p65: n siRNA tai sekoituskoodin transfektio [15]. 12 tunnin kuluttua solut käsiteltiin tai ilman 20 MBq /ml,

131I 6 tuntia. Sitten reportterigeenin toiminnan analysoitiin kuten edellä on kuvattu.

Western blot

Yhtä suuret määrät proteiinia suoritettiin elektroforeesi SDS-PAGE 10% tai 15% polyakryyliamidigeeleillä. Proteiinit siirrettiin nitroselluloosamembraanille (Amersham Biosciences, NJ, USA) puolikuiva blottaus. Membraanit blokattiin Tris-puskuroidulla suolaliuoksella /0,1% Tween 20: tä (TBST), joka sisälsi 5% maitoa 60 minuuttia huoneenlämpötilassa, ja sitten immuuni-blotattiin sopivasti laimennettua primaaristen vasta-aineiden 4 ° C: ssa yön yli. Kun oli pesty kolme kertaa TBST-liuoksella, blotteja inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 60 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sitten kompleksit visualisoitiin iChemi XR kuvantamisjärjestelmä (Syngene, MD, USA) käyttäen kemiluminesenssi reagensseja (Millipore, MA, USA). Semi-kvantifiointi suoritettiin Määrä One Software Version 4.6.2 (Bio-Rad, CA, USA). Vasta-aineita NF-KB: n p65: n, X-kytketty apoptoosi-inhibiittori (XIAP), B-solulymfooma suurikokoisen (Bcl-x), pilkottiin kaspaasi 3, poly-ADP-riboosi-polymeraasi (PARP) ja β-aktiini olivat Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Vasta-aine solujen apoptoosi-inhibiittori 1 (cIAP1) oli peräisin R 0,01). Ja LSD paljasti merkittävän vähenemisen elinkykyisten solujen yhdistelmähoidon kuin joko mono-terapia (

P

0,01).

altistuksen jälkeen konsentraatiot Bay 11-7082 (A), aktiivisuus pitoisuudet

131I (B) tai yhdistettyjä terapioita (C) 48 tunnin ajan, elinvoimaisten solujen määritettiin MTT-määrityksellä. Sen jälkeen kun DTC-soluja käsiteltiin ilman oligonukleotidilla ohjattu, salattu oligonukleotidit tai p65 siRNA transfektion jälkeen solut siirrettiin 96-kuoppaisille levyille. Sitten soluja käsiteltiin kanssa tai ilman

131I (20 MBq /ml) 48 tunnin ajan, ja MTT suoritettiin (D). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Kuva 1D osoitti, että salattu oligonukleotidit transfektion ei estänyt DTC-solujen lisääntymisen, kun taas siRNA transfektio voidaan saavuttaa selvä estovaikutus (

P

0,05). Lisäksi yhdistelmähoito voisi merkittävästi indusoi voimakkaammin solukuoleman kuin joko

131I terapia tai siRNA transfektiolla (

P

0,01).

Vaikutukset eri hoitomuotojen NF-KB

vaikutusten tutkimiseksi

131I NF-KB, suoritimme DNA-sitoutumismääritys käyttäen ydinvoiman otteita

131I-käsiteltyjen DTC soluja 6, 24 ja 48 tuntia käsittelemättömien solujen kontrolli. NF-KB-toiminto kasvoi ajan kuluessa

131I mono-hoidon saavuttaen piikit 24 tunnin pisteen KTC-1 ja WRO soluja. Kuitenkin yhdessä Bay 11-7082 voisi merkittävästi vähentää NF-KB: n toimintaa (kuvio 2A). Kolmen edellä ajankohtina merkittävää NF-KB: n eston on osoitettu

T

-testissä yhdistettyyn hoitojen

131I mono-hoitoja kaikissa kolmessa solulinjoissa (

P

0,01) .

(A) DTC soluja käsiteltiin joko

131I (20 MBq /ml) tai yhdessä Bay 11-7082 (5 mikromol /l) 6, 24 ja 48 tuntia. Valmistettiin tumauutteita ja DNA-sitoutumisen määritys tehtiin. (B) DTC-soluja käsiteltiin ilman oligonukleotidilla ohjattu, salattu oligonukleotidit tai p65 siRNA transfektiota. Sitten solut altistettiin

131I 24 tunnin ajan, ja DNA: ta sitova määritys suoritettiin. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa.

NF-KB: n reagoivan promoottorin aktiivisuutta suoritettiin sekä (kuva 3). Huomasimme, että

131I tehosti merkittävästi NF-KB-reportterigeenin toiminnan, noin 2,5, 1,7 ja 3,0 taittuu KTC-1, TPC-1 ja WRO solulinjoissa (

P

0,05). Kuitenkin yhdessä Bay 11-7082 voivat estää NF-KB toimintoja noin 0,16, 0,14 ja 0,24 poimuihin aiheuttamaa tasoa KTC-1, TPC-1 ja WRO solulinjoissa (

P

0,01) . Ja p65 siRNA transfektio voi vähentää NF-KB: n toiminnot lähes 0,14, 0,14 ja 0,26 taittuu indusoi n tasolla (

P

0,01).

(A) DTC-solut transfektoitiin PNF-KB-luc, ja PRL-SV40 toimi sisäisenä kontrollina. 12 tunnin kuluttua solut jätettiin käsittelemättä tai niitä inkuboitiin

131I (20 MBq /ml), tai yhdessä Bay 11-7082 (5 umol /l) 6 tuntia. NF-KB: n aktivaation havaittiin lusiferaasireportterigeenin määritys. (B) 24 tuntia transfektion jälkeen, jossa salattu oligonukleotidien tai p65 siRNA, solut ko-transfektoitiin PNF-KB-luc ja PRL-SV40. 12 tunnin kuluttua solut jätettiin käsittelemättä tai niitä käsiteltiin

131I (20 MBq /ml) 6 tuntia. Sitten lusiferaasireportterigeenin määritys suoritettiin. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Seuraavaksi tutkittiin ydin- NF-KB-proteiinin tasot 6 tuntia erilaisten käsittelyjen jälkeen Western blot (kuvio 4). Määrät p65 kasvoi

131I ryhmät kaikissa solulinjoissa, mutta vaimentaa ilmeisesti, kun Bay 11-7082 lisättiin yhdistelmähoidossa. Samanlainen tulokset saatiin p65 siRNA transfektiolla, kun salattu oligonukleotidit transfektion voinut saavuttaa tällaisia ​​vaikutuksia.

DTC-solut jätettiin käsittelemättä kontrolleiksi (A), tai hoidettiin 20 MBq /ml

131l (B ) tai yhdessä 5 umol /l Bay 11-7082 (C) 6 tunnin ajan. Sitten tumaproteiiniuutteet tutkittiin NF-KB p65 Western blotilla. Toisessa koesarjassa, ohjaus solut jätettiin käsittelemättä (D). Sen jälkeen kun ei-oligonukleotidi (E), salattu oligonukleotidit (F) tai p65: n siRNA (G) transfektion, DTC-soluja käsiteltiin

131I (20 MBq /ml) 6 tuntia. Sitten ydinaseiden proteiini tasoilla NF-KB p65 analysoitiin. PCNA käytettiin latauskontrollina ydinvoiman proteiineja. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa.

vaikutukset eri hoitoja on NF-KB: n säänneltyjen anti-apoptoottisten tekijöiden

Kuten on voimakas apoptoosin estäjät, XIAP, cIAP1 ja Bcl-xL ovat kohdegeenien positiivisesti säätelee NF-KB: n [7], [18]. Testasimme mitä vaikutteita erilaisia ​​hoitoja voisi aiheuttaa heille Western blot käyttäen KTC-1 edustajana solulinja (kuvio 5). Vaikka tietyt pohjapinta tasoja XIAP, cIAP1 ja Bcl-x L,

131I kasvoi XIAP on 5,5-5,7 taittuu, cIAP1 on 4,8-6,7 taittuu ja Bcl-x L ja 3,6-5,1 taittuu, vastaavasti. Kuitenkin, kun yhdessä Bay 11-7082, XIAP, cIAP1 ja Bcl-x L-proteiinia ilmaisuja olivat merkittävästi pienentyneet 0,09, 0,10 ja 0,17 poimuihin kohonneelta vastaavasti. Sen jälkeen p65 siRNA transfektion, nämä proteiini ilmaisuja merkittävästi estyy 0,07, 0,06 ja 0,10 taittuu vastaavasti. ANOVA ja LSD paljasti merkittävään kasvuun Näiden tekijöiden

131I ryhmissä kuin kontrolliryhmissä (

P

0,01), ja pienensi merkitsevästi niiden yhdistelmänä ryhmissä kuin

131I ryhmät (

P

0,01).

KTC-1-solut jätettiin käsittelemättä kontrolleiksi (A), tai hoidettiin 20 MBq /ml

131I (B) tai yhdessä 5 umol /L Bay 11-7082 (C) 24 tuntia. Sitten kokosolulysaateille tutkittiin Western blot varten XIAP, cIAP1 ja Bcl-x L. Toisessa koesarjassa, ohjaus solut jätettiin käsittelemättä (D). Sen jälkeen kun ei-oligonukleotidi (E), salattu oligonukleotidit (F) tai p65: n siRNA (G) transfektion KTC-1-soluja käsiteltiin

131I (20 MBq /ml) 24 tuntia. Sitten proteiini tasoilla XIAP, cIAP1 ja Bcl-x L tutkittiin. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa.

synergistisiä vaikutuksia havaittiin yhdistelmäterapioissa

Ensinnäkin, Western blot levitettiin havaita muutoksia kaspaasi 3 (a key apoptoosin teloittajana) ja PARP (pääasiallinen tavoite kaspaasi 3). Osoitimme, että vaikka puuttumisella voisi aiheuttaa pilkkoutuminen kaspaasi 3 (alayksiköt P19 ja p17) ja PARP (P89), niiden nousivat merkittävästi edelleen yhdistettynä hoitoihin (kuva 6). Taulukossa 1, ANOVA ja LSD osoitti merkittäviä parannuksia yhdistettynä hoitoihin kuin mono-hoitoja (

P

0,05). Sitten, edelleen vahvistaa vaikutuksia apoptoosiin, kaksinkertainen värjäys virtaussytometrillä suoritettiin. Tulokset osoittivat, että vaikka mikä tahansa terapia voi indusoida apoptoosia, yhdistetyt hoidot lisääntynyttä apoptoosia synergistisesti, koska merkittäviä parannuksia anneksiini V positiivisesti värjäytyneitä soluja (kuvio 7 ja taulukko 1).

KTC-1-solut jätettiin käsittelemättä kontrolleiksi (A ), tai niitä käsiteltiin 20 MBq /ml

131I (B), 5 umol /l Bay 11-7082 (C) tai niiden yhdistelmä (D) 24 tuntia. Sitten kokosolulysaateille tutkittiin Western blot kaspaasi 3 ja PARP. Toisessa koesarjassa, KTC-1-soluja käsiteltiin ilman oligonukleotidi-ohjattu (E), salattu oligonukleotidit (F) tai p65: n siRNA transfektio (G) ensin. Sitten nämä kolme ryhmää solut altistettiin

131I (20 MBq /ml) 24 tuntia (H-J). Kaspaasi 3 ja PARP-proteiinin tasot tutkittiin Western blot. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Ensimmäiset kokeet sisältyvät neljään ryhmään: KTC-1-solut eivät saaneet mitään hoitoa (A), 20 MBq /ml

131I (B), 5 mikromol /l Bay 11-7082 (C) tai yhdistelmä (D) 24 tuntia. Sitten solut kerättiin trypsinoimalla, kaksinkertainen värjättiin FITC: hen konjugoidulla anneksiini-V: n ja propidiumjodidi, ja sitten altistaa virtaussytometrialla. Toisessa koesarjassa, KTC-1-soluja käsiteltiin ensin ilman oligonukleotidi-ohjattu (E), salattu oligonukleotidit (F) tai p65: n siRNA transfektio (G). Sitten nämä kolme ryhmää solut altistettiin

131I (20 MBq /ml) 24 tuntia (H-J). Ja virtaussytometria tehtiin. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Iodide kertymä DTC soluilla NF-KB esto

Voit selvittää NF-KB-reitin estäminen vaikutteita jodia, me testattu radioaktiivista jodia muuttuu tai ilman NF-KB esto Bay 11-7082 tai p65 siRNA transfektiota. Kuva 8 osoittaa, että oli vain vähäisiä muutoksia sen jälkeen, kun hoitomuotojen ei havaittu merkittäviä eroja (

P

0,05), mikä osoitti, että NF-KB ei kontrolloida jodia in KTC-1-soluissa.

(A) KTC-1-solut jätettiin käsittelemättä tai niitä käsiteltiin Bay 11-7082 (5 umol /l) 24 tunnin ajan. Sitten soluja viljeltiin esillä Na

125, (37 kBq /ml) 1 tunnin ajan. Tämän jälkeen solut pestiin ja solujen määrä laskettiin. Sitten radioaktiivisuus mitattiin. (B) KTC-1-soluja käsiteltiin ilman oligonukleotidilla ohjattu, salattu oligonukleotidit tai p65 siRNA transfektion ensin. Sitten solut altistettiin Na

125I, ja radioaktiivisuus mitattiin. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Keskustelu

Tehokkain jälkeinen kirurginen hoito DTC vaurioiden on

131I hoidon takia luontainen kyky kilpirauhassyövän solut keskittyä jodia.

131I lähettää lyhyt kulkumatka (0,5-2,2 mm) β-säteilyä, joka on sytotoksinen soluille, joka on luonnostaan ​​hyvin samanlainen kuin ulkoisen sädehoidon. Kuitenkin tämä menetelmä on tehoton potilailla, joiden kasvaimet eivät enää keskittyä

131I tehokkaasti [4], [19], [20]. Testasimme hypoteesia tässä tutkimuksessa, että NF-KB voisi olla tärkeä tekijä säätelevä apoptoosin vastaisen prosessin aikana

131I terapiassa. NF-KB: n on osoitettu olevan tärkeä rooli monissa syöpätyypeissä [14] mukaan lukien kilpirauhasen syöpä [7], [8], [13], [21], [22], joka ennakoi etsii lääkkeitä, jotka kykenevät tukahduttamaan NF-KB: n aktiivisuus [7], [18]. Tähän asti useita NF-KB: n estäjien on osoitettu aiheuttavan kilpirauhassyöpä-solujen apoptoosin, esimerkiksi SN50, DHMEQ bortetsomibi ja Bay 11-7082. Ja kun niitä käytettiin yhdessä kemoterapian tai sädehoidon, synergia voidaan saavuttaa [9], [10], [11], [12]. Toinen lähestymistapa p65 siRNA transfektion on kokeiltu monenlaisia ​​syöpiä [15], [23], [24], [25], ja parannettu kemosensitiivisyys osoitettiin samoin [15], [23]. Silti yhdistelmähoito mukaan lukien p65 siRNA transfektion ei ole testattu kilpirauhassyöpä toistaiseksi.

Nykyisessä tutkimuksessa vaikutuksista

131I NF-KB-toiminto ja ilmaisun DTC solut analysoitiin ensin. DNA-sitoutumisen määritys osoitti, että NF-KB: n aktivaatio on kasvanut dramaattisesti 6-tunnin kohdalla ja oli piikit 24 tunnin ajan pisteen KTC-1 ja WRO soluja. Lisääntynyt NF-KB: n toimittaja aktivoitumisen myös todistaa lusiferaasianalyysissä. Nämä aktivoinnit voidaan merkittävästi tukahdutti NF-KB estäjä tai p65 siRNA transfektiolla. Sitten käytetään Western blot tietoja, jotka osoittavat, että

131I voisi lisätä tumaproteiinin tasoja NF-KB: n, kun taas Bay 11-7082 tai p65 siRNA transfektio voi dramaattisesti inhiboida NF-KB-proteiinin tasot.

NF-KB välittämää antiapoptoosi olennaisesti riippuvainen sen kykyyn parantaa transkriptioiden solukuoleman ehkäisevästä geenit [7], [18], [26]. Kaikkein edustaja NF-KB kontrolloi anti-apoptoottisia tekijöitä ovat XIAP, cIAP1 ja Bcl-x L, joka voi estää kasvainsolujen tappaminen vaikutuksia [7], [18]. XIAP voi estää kaspaasi 3 ja 7, ja se on myös mukana tukahduttaminen proapoptoottisten JNK aktiivisuutta. cIAP1 on toinen estäjä apoptoosin, joka voi sitoa ja inhiboida kaspaasi 3 ja 8. ja Bcl-x L: n tiedetään estävän sytokromi C vapautumisen mitokondrioista. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että XIAP, cIAP1 ja Bcl-x L olivat merkittävästi säädelty altistumisen jälkeen

131l. NF-KB by Bay 11-7082 tai p65 siRNA transfektion aikana

131I altistus voi muuttaa tasapainoa kohti merkittäviä säätely alaspäin näistä tekijöistä.

Sitten, jotta voidaan vahvistaa mahdollisuus synergistisen aiheuttamia vaikutuksia yhdistettynä hoitoihin, teimme Western blot keskeisiin apoptoottisia proteiineja ja johdetaan virtaussytometria arvioimiseksi apoptoosin. Tuloksemme osoittivat merkittävää synergiaa, jos NF-KB estyi aikana

131I terapiassa. Tutkimuksemme osoitti myös, että NF-KB-reitin estäminen ei kontrolloida jodia, joka osoittaa niiden pro-apoptoottinen vaikutus on tärkein mekanismi synergistisiä tuloksia.

Apoptoosi on olennainen prosessi poistaa tarkoitettu solujen kehityksen aikana tai vaurion jälkeen kemoterapiaa tai sädehoitoa. On tunnettua, että

131I-solukuolema voi olla sekä apoptoosin ja nekroosia, joiden luonne on annoksesta riippuvainen [27]. Marx et al. [27] osoitti, että B-CPAP-soluja (toinen DTC-solulinja), apoptoosia oli havaittavissa sen jälkeen, kun oli inkuboitu 1 MBq /ml

131I varten 2 päivää. Keskisuuri

131I aktiivisuuskonsentraation (1-10 MBq /ml) apoptoosin oli hallitseva, kun taas paljon suurempi

131I aktiivisuuskonsentraation (erityisesti yli 100 MBq /ml) kuolion tuli hallitseva. Meidän tutkimuksessa käytimme

131I aktiivisuuspitoisuus 20 MBq /ml, joka voisi tuottaa tarpeeksi apoptoosin eri kokeita. Lievä annos erotus voi olla eri solulinjoista ja eri laboratorio-olosuhteissa.

tuhoaminen proapoptoottisten tai antiapoptooppinen tasapaino osoittautunut aiheuttavan syövän synnyn. Syövän hoidossa asetuksia, poikkeava apoptoottinen signalointi voisi aiheuttaa resistenssiä kemoterapiaa tai sädehoitoa. Siksi palauttaminen toiminnallisten apoptoosin syöpäsoluissa voisi olla hyödyllinen tapa parantaa terapeuttisen efficacies. NF-KB-reitin hypoteesi on testattu totta kilpirauhassyöpä jo [9], [10]. Lisääntynyt NF-KB aktiivisuus vahvistaa luontainen terapia-resistenssifenotyyppi kilpirauhasen syöpäsoluja, ja sen estäminen on osoittaa lupaavia tuloksia yhdessä kemoterapian tai sädehoidon [9], [10]. Esillä data lisää hypoteesin, että

131I voisi aiheuttaa NF-KB: n aktivoitumista, joka vaimentaa

131I tehon kilpirauhasen syöpäsoluja. NF-KB esto on tehokas tukahduttamaan

131I liittyvät NF-KB: n induktion ja anti-apoptoottisia muutoksia. Yhdistettyjen hoito apoptoosia, voidaan saavuttaa synergistisesti.