Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

CCN perhe, joka sisältää kuusi jäsentä (Cyr61, CTGF, marras, WISP-1, WISP-2, WISP-3), on mukana solujen lisääntymisen stimuloituminen, muuttoliike, tarttuvuus, angiogeneesi, ja kasvaimen kehittymisen. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että ilmaus Cyr61, CTGF ja WISP-1 vaikuttaa Tuumorigeenisuustutkimuksissa keuhkosyövän soluja in vitro. Kuitenkin korrelaatio ilmentymisen CCN perheen proteiinien ja kliinisiä piirteitä keuhkosyöpään on tuntematon.

Menetelmät ja tärkeimmät havainnot

Tässä työssä olemme määrällisesti mRNA tasot

Cyr61

,

CTGF

, ja

WISP-1

näytteissä 60 ensisijaisen keuhkosyövässä ja niiden vastaaviin normaaleihin keuhkokudokset kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR. Downregulation

Cyr61

ja

CTGF

geenejä ja säätelyä

WISP-1

geeni löydettiin ensisijainen keuhkosyövässä verrattuna pariksi normaalin keuhkojen kudoksia. Immunohistokemia-analyysi myös paljastaa samanlaisen ekspressiokuviota Cyr61, CTGF ja WISP-1-proteiinin pariksi keuhkosyöpä kudoksia. Tilastollinen analyysi paljasti merkitseviä välillä ilmentymistä joko

Cyr61

tai

CTGF

kasvaimen vaiheessa kasvainhistologiaa, etäpesäke, tupakointi ja suvussa diagnoosi. Merkittävä korrelaatio myös välillä oli WISP-1 ilmaisutapoja kasvainhistologiaa, ja potilaan ikä. Lisäksi ekspressiotasot

Cyr61

ja

CTGF

korreloi selviytymisen keuhkojen-syöpäpotilaille.

Johtopäätökset

Tuloksemme viittaavat siihen, että

Cyr61

,

CTGF

, ja

WISP-1

voidaan osallinen kehittymistä ja etenemistä ensisijaisen keuhkosyövässä, ja niiden tasot saattavat olla arvokkaita ennustetekijöitä markkereita, sekä mahdollisia kohteita terapeuttiselle interventiolle.

Citation: Chen PP, Li WJ, Wang Y, Zhao S, Li DY, Feng LY, et al. (2007) Expression of

Cyr61

,

CTGF

, ja

WISP-1

korreloi kliinisiä piirteitä keuhkosyöpään. PLoS ONE 2 (6): e534. doi: 10,1371 /journal.pone.0000534

Academic Editor: Anja-Katrin Bielinsky, University of Minnesota, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 maaliskuu 2007; Hyväksytty: 24. toukokuuta 2007; Julkaistu: 20 kesäkuu 2007

Copyright © 2007 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Science Foundation of China (nro 30370690, 30470847 ja 30528003 ja Xie, D .; nro 30200143 varten Tong, X), Kiinan tiedeakatemia (Sadan Talents ohjelma, Grant KSCX-YW-R -73 for Xie, D.), Science Teknologia komissio Shanghai kunta 04DZ14007 ja 05DJ14009 (Xie, D.); Kiina Postdoctoral Science Foundation (Wang, Y.), ja Kiinan tiedeakatemia K.C. Wong Post doc Yhteisöt (Wang, Y.).

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yleisin syy syövän kuoleman maailmassa [1]. Suurin osa keuhkojen syövät ovat ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), joka on jaettu adenokarsinooma (AC), squamous-cell carcinoma (SC), ja iso-cell carcinoma [2]. Korkea kuolleisuus liittyy NSCLC johtuu osittain etäpesäkkeiden ennen kirurgista poistoa primaarikasvaimen. Kasvaimen metastaasi liittyy irtoaminen kasvainsolujen primaarikasvaimen massa, microinvasion tuumorisolujen strooman kudokseen, intravasation tuumorisolujen verisuonia, ja ekstravasaatio ja kasvainsolujen kasvua toisen sivustoilta [3], [4]. Tullakseen metastaattinen, kasvainsolut on lisättävä ilmentymistä etäpesäkkeiden edistävien geenien ja /tai vähentää ilmentymistä etäpesäkkeiden-estävien geenien. Hyödyntämällä ihmisen keuhkosyövän solulinjat, kysteiiniä runsaasti proteiinia 61 (Cyr61) ja sidekudoksen kasvutekijä (CTGF) on osoitettu estävän metastaasin ja invaasion syöpäsolujen, ja siksi niitä on pidettävä mahdollisina vaimentimia etäpesäkkeiden [5], [6].

sekä CTGF ja Cyr61 kuuluvat CCN perhe, nimetty sen kolmen ensimmäisen kuvattu jäsentä – Cyr61 (CCN1), CTGF (CCN2), ja marraskuu (nefroblastooma yliekspressoituina CCN3) [7]. CCN perhe on kuusi jäsentä: Cyr61, CTGF, marras, WISP-1 (Wnt-1-indusoidun erittyvä proteiini 1) (CCN4), WISP-2 (CCN5) ja WISP-3 (CCN6) [8] – [11]. Nämä proteiinit ovat modulaarisia rakenne, joka koostuu N-terminaalista signaalisekvenssiä, jota seuraa domeeneja sekvenssin samankaltaisuus insuliinin kaltainen kasvutekijä-sitovan proteiinin, von Willebrand -tekijän C, trombospondiinin tyypin 1 ja kysteiini solmu C-pää, jossa on lukuun ottamatta WISP-2, josta puuttuu C-pää alueella [12]. Kaikki CCN molekyylit erittyvät, soluväliaineen liittyvien proteiinien ja mukana sisäiset ja ulkoiset solusignalointi säädellä solun tarttumisen, muuttoliike, mitogeneesi, erilaistuminen ja eloonjääminen [13]. Ne säätelevät myös angiogeneesiä [13] – [15]. Aiemmat tutkimukset ehdotti, että Cyr61 indusoi soluproliferaatiota, soluadheesion ja angiogeneesin aktivoimalla integriinin (a vp 3) endoteelisolujen [16]. CTGF on keskeinen rooli alavirtaan TGF-β ja Smad merkinanto- ja stimuloi fibronektiinin ja kollageenin, joka on tärkeä haavan paranemista [17], [18]. WISP-1 on voimakkaasti ilmaistu fibrovaskulaarisen strooman rintasyövistä kehittyvän Wnt-1 transgeenisten hiirten [10]. Pakko yli-ilmentymisen WISP-1 normaalissa rotan munuaisen fibroblastien (NRK-49F) oli riittävä indusoimaan muodonmuutosta [11]. Lisäksi yhä enemmän todisteita on ehdottanut, että CCN proteiinit ovat osallisena kasvainten synnyssä, ja vaihtelu näiden molekyylien ilmentyminen on havaittu useita erilaisia ​​syöpiä [8], [9].

Olemme osoittaneet, että Cyr61 toiminut tuumorisuppressorina kasvuun NSCLC-solujen. Cyr61 tukahdutti kasvua NSCLC-solujen laukaisemalla signaalinvälitysreitin kautta säätelyä p53 [6], [19]. CTGF ja WISP-1 vaikuttaa myös tuumorigeenisyyteen keuhkosyövän soluista [5], [20] – [22]. Kuitenkin korrelaatiot kolme molekyylien kliinisiä piirteitä keuhkosyöpään ovat tutkimaton. Meidän edellinen työ ehdotti, että ilmaisu CCN proteiinit on ennusteen arvioinnissa varten gliooman etenemiseen ja yleistä potilaan eloonjäämisen [23]. Esillä olevissa tutkimuksissa, suoritimme reaaliaikaiset kvantitatiiviset RT-PCR: llä ja immunohistokemia mitata mRNA ja proteiini tasoilla kolmen CCN geenien ensisijainen NSCLC näytteiden ja niiden vastaaviin normaaleihin keuhkojen kudoksiin. Lisäksi määritimme onko määriä näitä CCN geenit korreloivat kliinisiä piirteitä NSCLC näytteiden useiden tilastollisen analyysin malleja.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

Tutkimus analysoi ensisijainen syöpä ja vastaaviin normaaleihin kudoksiin 60 NSCLC saaneilla potilailla First Affiliated sairaala Zhengzhou University (Henan) 2002-2005 jälkeen kirjallinen suostumus. Syöpä näytteet resektoitiin kirurgisesti ilman neo-adjuvanttihoito ja vastaavat ei-syöpäkudokset, jotka olivat vähintään 3-4 cm päässä syöpään, saatiin myös. Kukin näyte jaettiin 2 osaan: yksi leikattiin ja tutkittiin histologisesti perinteisten H muut jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa analyysiin asti. Työmme hyväksyi Institutional Review Board of Institute for Nutritional Sciences, Kiinan tiedeakatemia.

RNA ja cDNA-synteesi

Kokonais-RNA eristettiin tuoreista pakastettujen NSCLC yksilöitä ja Hyväksytty normaalin keuhkojen kudoksiin TRIzol-reagenssia (Life Technologies, Inc.) mukaan valmistajan protokollaa. Laatu RNA-näytteet määritettiin elektroforeesilla agaroosigeeleillä ja värjäys etidiumbromidilla, 18S ja 28S-RNA-vyöhykkeiden tehtiin näkyviksi UV-valossa. 2 ug kokonais-RNA: ta käsiteltiin suoraan cDNA: käänteistranskriptio Superscript II (Life Technologies, Inc.) mukaan valmistajan protokollan kokonaistilavuudessa 50 ui.

Reaaliaikainen käänteistranskriptio-PCR (RT -PCR) B

RT-PCR karakterisoidaan vaiheessa pyöräily, kun monistaminen PCR-tuotteen havaittiin ensimmäisen kerran, eikä PCR-tuotteen määrä kertynyt jälkeen kiinteä määrä syklejä. Parametri Ct määriteltiin murto syklin, jossa fluoresenssi johtamalla kiinteän kynnyksen yli lähtötason. Taso kohdegeenin tuntemattomissa näytteissä kvantifioitiin mittaamalla Ct-arvo: Level (tavoite) = 2

Ct (kohde). Ct-arvo β-

aktiini

mitattiin myös kuten endogeeninen RNA ohjaus: Level (β-

aktiini

) = 2

Ct (β

aktiinin

). Tasot kohdegeenien kunkin näytteen normalisoitiin pohjalta sen β

aktiini

sisällön kautta kaavaa: normalisoitu taso (NL) = Level (kohde) /Level (β-

aktiini

) = 2

Ct (kohde) /2

Ct (β-

aktiini

) = 2

Ct (kohde) -Ct (β-

aktiini

) = 2

ACt. Lisäksi suhteelliset tasot (RL) kohdegeenien syöpänäytteissä verrattuna vastaaviin normaaleihin kudoksiin laskettiin seuraavan kaavan mukaisesti: RL = NL (syöpä) /NL (normaali) = 2

ACt (syöpä) /2

ACt (normaali) = 2

[ACt (syöpä) -ΔCt (normaali)] = 2

ΔΔCt. Koska sekä NL ja RL ovat edustettuina 2

Ct, siksi käytetään ACt ja ΔΔCt kuten NL ja RL vastaavasti kliiniseen tilastollista analyysiä.

pohjustajat reaaliaikaisen PCR

Cyr61

(5′-GAGTGGGTCTGTGACGAGGAT-3 ’ja 5′-GGTTGTATAGGATGCGAGGCT-3’),

CTGF

(5′-CGACTGGAAGACACGT TTGG-3 ’ja 5′-AGGCTTGGAGATTTTGGGAG-3’),

WISP -1

(5′-AGAGCCGC CTCTGCAACTT-3 ’ja 5′-GGAGAAGCCAAGCCCATCA-3’) ja β-

aktiini

(5′-G ATCATTGCTCCTCCTGAGC-3 ’ja 5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’ ) suunniteltiin ohjelmistojen avulla Primer3 ja ostetaan Shanghai Sangon Biological Engineering Palvelut CO., Ltd. Monistusreaktiot suoritettiin 20 ul: n tilavuus LightCyclerin-DNA Master SYBR Green Ι sekoitus (Roche Diagnostics Oy, Applied Science, Penzberg, Saksa) kanssa 10 pmol kutakin aluketta, MgCl

2 pitoisuus on optimoitu välillä 2 ja 5 mM, 200 μΜ kutakin dNTP: tä, 0,5 U Taq DNA-polymeraasia, ja 1 x puskuria. Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina käytettäessä iCycler iQ-järjestelmä (Bio-Rad, Hercules, CA), ja alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 3 min seurasi 40 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 30 s, joka on pariutumisvaiheen 55 ° C: ssa ja 58 ° C: ssa 20 s, ja pidennys 72 ° C ° C: ssa 30 s. Lopullinen pidennys 72 ° C ° C: ssa 7 min, lisättiin. Spesifisyyden varmistamiseksi ja monistuksen jälkeen PCR-tuotteet kunkin alukeparia alistettiin sulamiskäyräanalyysi ja sen jälkeen tarkastuksen jälkeen agaroosigeelielektroforeesilla.

Tilastollinen analyysi

T-testi ja ANOVA hyväksyttiin ja tutkia ilmaus 60 paria NSCLC ja normaali keuhkojen kudoksia kullekin CCN geeniä ja niiden yhdessä yksittäinen kliininen tekijöiden (suvussa, etäpesäke, tupakointi, kasvain vaiheessa histologia, tuberkuloosi, sukupuoli, kasvaimen koko ja potilaan iästä). Pearsonin korrelaatiota analyysiä käytettiin arvioimaan suhteellista jonka määrä ilmentymisen kolmen geenin. Pearsonin korrelaatio kuvastaa aste lineaarinen suhde kahden muuttujan. Se vaihtelee 1–1. Suhteelliset arvot (kasvain /kontrolli) olivat suhteessa aktiini piirretty. Jokaista geeniä, Kaplan-Meierin eloonjäämiskäyrissä potilaille, joilla on korkea geeniekspressiota

versus

alhainen geenin ilmentyminen piirrettiin ja log-rank testi käytettiin vertailtaessa tasa kahden eloonjäämiskäyrien. Monimuuttuja analyysit Coxin suhteellisten riskien mallia käytettiin arvioimaan vaikutuksia kliinisiä piirteitä ja ilmentymisen kolmen geenin eloonjäämiseen. Tulokset katsottiin merkitsevä P 0,05 tai erittäin merkitsevä P 0,01. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttämällä ohjelmaa SPSS for Windows (SPSS, Chicago, IL).

immunohistokemia

Immunohistokemiaa syöpä- ja vastaavat normaali keuhkojen kudoksia jäädytettiin kryostaattikammio ja 10 pm leikkeet kerättiin lasilevyille. Osat kiinnitettiin jääkylmässä asetonissa 30 minuuttia, pestiin 0,01 M PBS: ssä 3 x 5 min, blokattiin 1 tunnin ajan 0,01 M PBS: ssä, johon oli lisätty 0,3% Triton X-100 ja 5% normaalia seerumia, ja inkuboitiin sitten kanin anti-ihmisen Cyr61 (polyklonaalinen, 1:500; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), vuohen anti-ihmisen CTGF (polyklonaalinen, 1:500; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), tai vuohen anti-ihmisen WISP-1 (polyklonaalinen, 1:500; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), vastaavasti, 4 ° C: ssa yön yli. Lyhytaikaisessa pesun 0,01 M PBS: ssä, leikkeitä inkuboitiin 2 tunnin ajan 0,01 M PBS: ssä piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua vuohen anti-kani-IgG- tai kaniinin anti-vuohi lgG: llä (1:1000, Chemicon, Temecula, CA, USA), minkä jälkeen visualisointi 0,003% H

2O

2 ja 0,03% DAB 0,05 M Tris-HCI (pH 7,6). Negatiiviset kontrollit koostuivat vaihdosta primaarisen vasta-aineen kanssa normaalin seerumin samana laimennoksena. Immunohistokemia kunkin suoritettiin ainakin 3 kertaa, ja kaikki leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä. Pisteytys Immunohistokemian värjäys toteutettiin itsenäisesti kolme patologi sokkoutettu potilaan kliinisten parametrien. Kaikki värjätyt leikkeet sijoitettiin sekä kasvaimen ja viereisen ei-kasvain alueita ainakin 10 suuritehoisia kentän alueilla vähintään 300 säilynyt solujen arvioidaan kullakin alueella. Prosenttiosuuden soluja, jotka ilmentävät kohdeproteiinin arvioitiin jakamalla positiivisten solujen määrän että kokonaismäärän solua per suuritehoisia kentän alueella. Keuhkojen epiteelisolujen pitäen selvä ruskea signaali sytoplasmassa verrattuna negatiivisen kontrollin määriteltiin positiivisia soluja. Parilliset-näytteet t-testiä käytetään arvioimaan eroa proteiinin tasojen Cyr61, CTGF tai WISP-1 syöpänäytteissä verrattuna vastaaviin normaaleihin keuhkojen kudoksiin. Tulokset katsottiin tilastollisesti erittäin merkitsevä P 0,01. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttämällä ohjelmaa SPSS for Windows (SPSS, Chicago, IL).

Tulokset

ilmentäminen

Cyr61

,

CTGF

, ja

WISP-1

geenien NSCLC ja vastaaviin normaaleihin keuhkokudokset

tutkia ekspressiokuviota CCN geenien NSCLC, tasot

Cyr61

,

CTGF

ja

WISP-1

mRNA kvantitoitiin 60 paria kasvainten ja niiden vastaaviin normaaleihin keuhkokudokset reaaliaikaisella PCR: llä. Ilmentymistaso esitetty suhde

Cyr61

,

CTGF

tai

WISP-1

ja viite geeni β-

aktiini

korjaamiseen vaihtelu määriä RNA: ta. Downregulation

Cyr61

ja

CTGF

mRNA esiintyi 48 60 (80%) ja 39 60 (65%) NSCLC näytteistä verrattuna pariksi normaali keuhkojen kudoksia, vastaavasti. Sen sijaan, ylössäätely tasot

WISP-1

mRNA havaittiin 50 60 (83%) ei-pienisoluinen keuhkosyöpä näytteistä verrattuna niiden normaaleihin kudoksiin (Fig. 1). Univariate analyysi osoitti, että mRNA-taso joko

Cyr61

,

CTGF

tai

WISP-1

geenit olivat merkittävästi erilaiset eri syövän näytteiden ja pariksi terveisiin (taulukko 1) . Expression of

Cyr61

ja

CTGF

perusterveydenhuollossa keuhkosyövässä oli merkittävästi alhaisempi kuin vastaaviin normaaleihin keuhkojen kudoksia (P 0,001 ja P = 0,016, tässä järjestyksessä). Sen sijaan tasot

WISP-1

syövät olivat huomattavasti korkeammat kuin sovitetussa terveisiin (P 0,001) (taulukko 1). Pearsonin korrelaatio analyysi osoitti lisäksi, että ilmaus

Cyr61

ja

CTGF

oli hyvin korreloi positiivisesti (R = 0,604; P 0,001), kun taas ilmaus

WISP-1

ja

CTGF

osoittivat merkittävää negatiivista yhdistys (R = -0,299, p = 0,020). Expression of

WISP-1

ja

Cyr61

ei korreloi merkittävästi (R = -0,182, p = 0,164) (taulukko 2). Koska kolme geeniä ovat kaikki CCN perhe, on mahdollista, että niiden ilmaisua voidaan ohjata joitakin yhteisiä (esi-

Cyr61

ja

CTGF

) tai antagonisoida toisiaan (for

WISP-1

ja

CTGF

).

Suhteellinen mRNA ekspressiotasot

Cyr61

,

CTGF

, ja

WISP -1

esitetään 60 paria ensisijaisen NSCLC kudosten ja vastaaviin normaaleihin keuhkojen näytteitä. Expression näytetään suhde ilmentymisen CCN geenien syöpää

versus

vastaaviin normaaleihin kudoksiin. Jokainen palkki on log2 suhteen arvo CCN ekspressiotasoja välillä keuhkokasvaimia (T) ja vastaaviin normaaleihin kudoksiin (N) samasta potilaista. Alle 2-kertainen muutos: suhde kasvain ja normaali on 2. Koska loki2 2 = 1, bar arvo 1 edustaa 2-kertainen lisäys (T N), kun taas bar arvo -1 edustaa 2-kertainen pieneneminen (T N).

immunohistokemia tarkkailuun käytettiin proteiinin ilmentymistä Cyr61, CTGF ja WISP-1 60 paria keuhkojen kudoksia. Parilliset-näytteet t-testi osoitti, että proteiinin ilmentymisen Cyr61 (P 0,001) ja CTGF: n (P 0,001) oli dramaattisesti vaimentua syöpäkudoksiin verrattuna normaalia vastineet (kuvio 2). Lisäksi merkittävää säätelyä WISP-1 havaittiin syövän näytteistä (P 0,001) verrattuna vastaaviin normaaleihin kudoksiin (kuvio 2). Edustaja valokuvia osoitti, että Cyr61 on voimakkaasti ilmaistu sytoplasmassa keuhkojen epiteelisolujen normaalin keuhkojen kudoksiin potilailla, joilla on keuhkosyöpä (Fig. 3A), mutta tasot olivat merkittävästi vähentyneet syöpä kollegansa (Fig. 3B). Huomattavaa on, että downregulation Cyr61 johtuu pääasiassa suurista vähentämiseen Cyr61 ekspressiotason yksittäisissä soluissa sijaan vähentynyt määrä Cyr61-positiivisten keuhkon epiteelisolujen. CTGF näytetään suurempi värjäytymisen intensiteetti sytoplasmassa normaalien keuhkojen epiteelisolujen (Fig. 3d) kuin, että keuhkosyövän solut (Fig. 3E); suhde CTGF-positiivisesta -negatiivisilla solujen syövän kudoksissa oli selvästi pienempi verrattuna vastaavaan normaaliin keuhkojen kudoksia. Vaikka ekspressio WISP-1 oli alhainen sytoplasmassa epiteelisolujen, jotka ovat peräisin normaalista keuhkojen kudoksia (Fig. 3G), se on huomattavasti lisääntynyt täsmäsi keuhkojen terveisiin kudoksiin (kuvio. 3H). Yhdessä tulos Immunohistokemian vastaavuuksia kuin reaaliaikaisen RT-PCR.

Kuvaaja kuvaavat jakaumat näytteiden mukaan prosenttiosuuden positiivisten solujen Cyr61, CTGF ja WISP-1 60 paria NSCLC ja sovitettu ei-syöpä keuhkojen kudoksia. P-arvot (pariksi-otosten t-testi) on lueteltu viittaa eroa NSCLC näytteiden vs. vastaaviin normaaleihin kudoksiin.

ei-syöpä keuhkokudokset potilailta NSCLC, voimakas Cyr61 immunoreaktiivisuus (ruskea) on havaittu solujen sytoplasmassa sekä solunulkoiseen tilaan (A). Vastaaviin NSCLC kudoksissa, Cyr61 immunoreaktiivisuus on vähemmän (B) verrattuna normaaliin keuhkokudoksessa. Samanlaisia ​​Cyr61, monet CTGF-positiivisten solujen (ruskeat) näkyvät ei-kasvain keuhkojen kudoksia (D), ja positiiviset signaalit vain harvaan jaettu NSCLC kudoksissa (E). WISP-1 Immunohistokemian kuitenkin näyttää eri ilme kuvio. WISP-1 immunoreaktiivisuus (ruskea) on tuskin havaitaan normaalissa keuhkojen kudoksissa pienisoluista keuhkosyöpää (G), mutta lisääntyy selvästi NSCLC kudoksissa (H). C, F, ja minä ovat negatiivisia valvonta Cyr61, CTGF ja WISP-1, tässä järjestyksessä. Kaikki objektilasit vastavärjätään hematoksyliinillä (sininen). Asteikko bar = 60 pm.

väliset ilmentymistä Cyr61 vuonna keuhkosyövässä ja kliiniset ja patologiset ominaisuudet yksilöiden

Univariate analyysi osoitti, että merkittävää yhteyttä välillä oli ilmaus

Cyr61 versus

kasvaimen vaiheesta, etäpesäke, histologinen alatyyppi, tupakointi ja suvussa (taulukko 3). Taso

Cyr61

ilmentyminen väheni merkittävästi korkean vaiheessa kasvaimissa verrattuna alhainen vaiheessa kasvaimia (P = 0,014). Useita vertailu (LSD t-testi) analyysi osoitti, että ekspressio

Cyr61

välillä kasvainten vaiheiden I ja III oli merkitsevästi erilainen (P = 0,004); mutta mitään merkittävää eroa

Cyr61

ilmaisu tapahtunut NSCLC näytteissä verrattiin joko vaiheissa I ja II (P = 0,063) tai vaiheissa II ja III (P = 0,17). Histologinen analyysi osoitti, että merkittävää eroa olemassa keskuudessa SC, AC, adeno- levyepiteelisyöpä (ASC) ja muut patologiset kirjoita ilmentyvyys

Cyr61

(P = 0,001). Lisäksi useita vertailu (LSD t-testi) osoitti, että ilmentyminen

Cyr61

kohtaavat SC

versus

ASC (P = 0,009) tai SC

verrattuna

muu patologinen tyyppi (P = 0,001) oli merkittävästi erilainen. Samoin merkittäviä eroja

Cyr61

ilmaisu havaittiin myös AC

versus

ASC (P = 0,015) tai AC

verrattuna

muu patologinen tyyppi (P = 0,002). Tupakointi oli yhteydessä alhaiseen ilmaus

Cyr61

(P = 0,009). Sitä vastoin ilmaus

Cyr61

ei korreloi tuberkuloosi, sukupuoli, ikä, ja kasvaimen koko (taulukko 3).

väliset ilmaus

CTGF

in keuhkosyövässä ja kliiniset ja patologiset ominaisuudet yksilöiden

tilastollinen analyysi paljasti, että ilmaus

CTGF

oli voimakkaasti yhteydessä joitakin kliinisiä piirteitä NSCLC, mukaan lukien kasvain vaiheessa etäpesäke, histologia, tupakointi , ja suvussa (taulukko 3). Taso

CTGF

väheni merkittävästi korkean vaiheessa kasvaimia verrattuna matalan vaiheen kasvaimet (P = 0,040). Lisäksi merkittävä ero on

CTGF

ilmaisun välillä oli kasvaimia, vaiheen I

versus

vaiheen III (P = 0,013) ja vaiheen II

versus

vaiheen III (P = 0,024) ; kuitenkaan mitään merkittävää tilastollista eroa ei havaittu kasvaimia, vaiheen I ja II (P = 0,077). Sillä etäpesäke, ilmaus

CTGF

metastaattisessa NSCLC oli huomattavasti alhaisempi kuin muilla metastasoitunut NSCLC (P = 0,039); merkittävästi, tupakointi liittyi näkyvä tukahduttaminen

CTGF

ilmentymistä NSCLC (P = 0,017) (taulukko 3). Lisäksi merkittävä ero tapahtui kesken SC, AC, ASC ja muut patologiset tyypit tason CTGF (P = 0,005). Lisäksi taso

CTGF

potilailla oli huomattavasti pienempi kuin ne, joiden perheenjäsenet ei ollut syöpä (P = 0,038). Kuitenkin sukupuoli, kasvaimen koko, ikä ja histologia tuberkuloosin ei todettu merkitsevää korrelaatiota ilmentymisen

CTGF

(taulukko 3).

väliset ilmaus

WISP-1

in NSCLC ja kliiniset ja patologiset ominaisuudet yksilöiden

tilastollinen analyysi osoitti, että ilmentyminen

WISP-1

oli merkitsevästi yhteydessä kasvainhistologiaa sekä iästä NSCLC potilaiden diagnoosi ( taulukko 3). Yksisuuntainen ANOVA-analyysi osoitti, että merkittäviä eroja, joiden joukossa SC, AC, ASC ja muut histologinen tyyppi niiden ilmentyminen

WISP-1

(P = 0,017). Taso

WISP-1

ASC oli paljon suurempi kuin joko SC (P = 0,002) tai AC (P = 0,015). Lisäksi nuorille potilaille (ikä, 35-50) oli merkitsevästi korkeampi

WISP-1

niiden kasvaimia kuin vanhemmilla henkilöillä (ikä, 50-65 tai ≥65) (P = 0,018 ja P = 0,036 , vastaavasti). Sen sijaan muiden kliinisten parametrien (suvussa, etäpesäke, historia tupakoinnin, tuberkuloosi, sukupuoli, kasvaimen tyyppi, ja kasvaimen koko) eivät liittyneet ilmaus

WISP-1

.

Expression on

Cyr61

,

CTGF

,

WISP-1

geenien ja kliininen tulos NSCLC

univariate selviytyminen analyysi osoitti, että ilmaus

Cyr61

,

CTGF

, etäpesäke, ja tupakointi liittyivät merkittävästi eloonjäämisen (taulukko 4). Kaplan-Meier -käyrät ehdotti, että potilailla, joilla on korkea-ilmentymisen

Cyr61

osoitti huomattavasti laajennetussa keskimääräinen eloonjäämisaika verrattuna muihin potilaisiin (Fig. 4A) (P = 0,001). Vastaavasti korkea

CTGF

liittyivät pitkäaikaiseen säilymiseen (Fig. 4B) (P = 0,031). Sen sijaan mitään merkittävää yhdistyksen

WISP-1

ilmaisun ja eloonjäämisen todettiin (Fig. 4C) (P = 0,214). Sen jälkeen ohjaamalla kliiniset ja patologiset ominaisuudet (ikä, sukupuoli, etäpesäke, savu, kasvain vaiheessa tuberkuloosi, kasvaimen koko), monimuuttuja (Coxin regressio) eloonjääminen analyysi arvioitiin mahdollisia vaikutuksia kolmen CCN geenejä syövän ennusteeseen. Tulos osoitti, että sekä

Cyr61

ja

CTGF

olivat merkittävästi riippumattomia positiivisia ennustavat tekijät potilaiden selviytymiseen NSCLC, ja suhteellinen riski oli 0,047 ja

Cyr61

ja 0,0357 varten

CTGF

(taulukko 5). Kuitenkaan mitään merkittävää yhteyttä välillä ilmennyt

WISP-1

ilmaisua ja eloonjäämisen (taulukko 5).

Keskustelu

Cyr61, CTGF, ja WISP-1 on tärkeä rooli solujen lisääntymisen, vaeltamisen ja erilaistumisen. Niiden ekspressio näyttää säädellään eri tavoin eri kasvaimia. Tutkia korrelaatio ilmaus CCN geenien ja NSCLC, käytimme reaaliaikainen PCR ja immunohistokemia arvioida mRNA ja proteiini tasoilla näiden kolmen geenien NSCLC ja niiden vastaaviin normaaleihin keuhkojen kudoksia. Downregulation

Cyr61

ja

CTGF

ja ylössäätely WISP-1 esiintyi NSCLC näytteissä verrattuna niiden normaaliin kollegansa, mikä viittaa siihen, että nämä molekyylit saattavat liittyä kasvaimen muodostumisen ja etenemisen NSCLC.

Cyr61 on ensimmäinen kloonattu jäsen CCN perheen ja sen sääntelytehtävässä kasvainsoluissa on laajalti raportoitu monissa syöpiä. Vuonna rintasyöpiä, Cyr61 on ilmentynyt ja voi stimuloida kasvaimen etenemiseen [24] – [27]. Mahan adenokarsinooman solulinja tuli tuumorigeenisemmiksi kun solut geneettisesti ilmentämään suuria määriä Cyr61 [16]. Expression of Cyr61 oli korkea rabdomyosarkoomiin ja johdetut solulinjat pahanlaatuisten ihosyövän, paksusuolen adenokarsinoomien, ja virtsarakon papillomas [16], [28]. Pahanlaatuinen gliooma on usein korkea Cyr61 liittyvän tehostetun tuumorigeenisyystesti välittyvät integriinisitoutumismotiivin sitoutuvan kinaasin signalointireitin [29]. Voimistumista Cyr61 ilmaisun äskettäin tunnistettu vatsakalvon etäpesäkkeitä ihmisen haimasyövän [30]. Paradoksaalisesti Cyr61 näyttää olevan päinvastainen rooli keuhkosyövän. Olemme raportoineet, että Cyr61 on vaimentua neljässä 5 näytettä keuhkosyöpä, ja keuhkosyövän solut stabiilisti transfektoitu Cyr61 ekspressiovektorilla olivat vähemmän tuumorigeeninen kuin pelkällä vektorilla transfektoidut ohjaus soluihin [19]. Meidän lisätutkimukset osoittivat, että koneellinen ilmentymistä Cyr61 keuhkoissa syöpäsoluja johtanut niiden solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa välittämä p53 [6]. Täällä, huomasimme, että ilmaus

Cyr61

on vähentynyt NSCLC näytteissä verrattuna niiden verrokeilla, mikä tukee vahvasti entisen hypoteesia. Cyr61 on myös raportoitu estävän kasvua eturauhassyövän [31], kohdun limakalvon syöpä [32] ja leiomyoomien [33]. Yhdessä nämä tiedot osoittivat, että Cyr61 voisi käyttäytyä tuumorisuppressorina tietyissä olosuhteissa useissa kudostyypeissä, mukaan lukien NSCLC.

CTGF tunnistettiin mitogeeni löytyy väliaine ihmisen napalaskimon endoteelisolujen [34 ]. Se koodaa proteiinia, 349 aminohapon 43%: n sekvenssi-identtisyys Cyr61, ja kaikki 38 kysteiiniä CTGF ja Cyr61 ovat täysin konservoituneita. CTGF: n havaittiin yli-ilmentynyt nisäkasvaimia [26], [35], melanoomat [36], haiman syövät [37], sarkoomat, mukaan lukien kondrosarkoomissa [38], [39]; kun taas käänteinen korrelaatio on raportoitu välillä pahanlaatuinen fenotyyppi ja taso CTGF ilmentymistä fibroblasteissa ja endoteelisolujen kasvainten [40]. Meidän kokeissa olemme huomanneet, että ilmentymistaso on

CTGF

in NSCLCs oli pienempi kuin sovitetun normaalin keuhkokudoksen näytteitä, mikä sen mahdollinen kasvaimen estävä toiminto. Vastaa meidän havainnon, tuoreessa tutkimuksessa Chien

et al.

[20] osoittivat, että CTGF tukahdutti keuhkosyövän solujen kasvua induktion p53, sekä, estämällä insuliinin kaltaisen kasvutekijä I riippuvainen Akt-fosforylaation ja epidermaalisen kasvutekijän riippuvan ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinaasin 1/2 fosforylaatiota.

Toisaalta, huomasimme, että

WISP-1

yliekspressoitui NSCLC näytteissä verrattuna normaaliin keuhkokudoksen kollegansa, mikä viittaa siihen, että WISP-1 voisi toimia onkoproteiinia NSCLC. WISP-1 on tunnistettu geeni, joka on yliaktiivista Wnt-1 transformoitiin C57 MG hiiren maitorauhasen epiteelisolut; se on täydellinen säilyttäminen kaikkien 38 kysteiinitähteiden niiden kanssa Cyr61 ja CTGF [10]. WISP-1 on liittynyt joko parantaa tai inhiboiva kasvainten kasvua. Esimerkiksi se ilmentyy voimakkaasti ihmisen rinta- ja paksusuolen syöpiin [10]. Pakko yli-ilmentymisen WISP-1 normaalissa rotan munuaisen fibroblastien (NRK-49F) oli riittävä indusoimaan muodonmuutosta [11]. Sen sijaan, WISP-1-ekspressio korreloi käänteisesti leviämisen, metastaasin ja kasvun melanoomasolujen [41], [42]. Lisäksi tuloksemme että ylössäätely WISP-1 korreloi positiivisesti keuhkosyöpä etäpesäkkeitä vastasi havainnot hiirimallissa [21]. Paradoksaalisesti Pian

et al.

Todettu, että

in vitro

yli-ilmentymiseen WISP-1 väheni motiliteettiin keuhkosyöpään solujen [22]. Koska WISP-1 on erittyvä proteiini ja tehtävät pääasiassa vuorovaikutuksessa ECM, ero havainnoista saattaisi heijastaa eroa ECM

in vivo

ja

in vitro

.

univariate tilastollinen analyysi ilmoitti myös, että alhainen joko

Cyr61

tai

CTGF

liittyivät kanssa etenemistä NSCLC, ja downregulation

Cyr61

ja

CTGF

oli merkittävä potilailla, joilla on suvussa kuin ilman suvussa. Nämä tiedot ymmärtää, että Cyr61 ja CTGF ehkä tuumorisuppressorigeeneille keuhkosyövässä. Kautta moninkertaisen lineaarisen regression analyysien lisäksi olemme huomanneet, että kliiniset piirteet ovat tiiviisti mukana ekspressiotasot

Cyr61

,

CTGF

ja

WISP-1

. Ilmentymistaso

Cyr61

71% keuhkosyöpä näytteistä määritettiin kahdeksan itsenäistä muuttujia, pääasiassa AC, SC ja ikä. Tasot

CTGF

vuonna NSCLCs myös selvästi liittynyt kliinisiä piirteitä, mutta joitakin eroja. Sukupuoli näytti osansa ilmaus

CTGF

, mutta ei

Cyr61

.