Krooninen sairaus

tiivistelmä

WAVE3 tukirangan proteiini edistää syövän eteneminen ja metastaasit. Olemme osoittaneet, että WAVE3 aktivaatiota syöpäsoluinvaasiota johtuu osittain sen sääntely ilmentymisen ja aktiivisuuden keskeisten (MMP), kuten MMP-9, joka on keskeisesti mukana invadopodia välittämän hajoamisen soluväliaineen ( ECM). MMP-9 on myös merkittävä NFKB kohdegeenin, mikä viittaa mahdollisen sidoksen WAVE3 tämän reitin, jota pyrkimyksistä. Mekanistisesti, olemme havainneet, että menetys WAVE3 syöpäsoluissa johtaa NFkB: n signaloinnin seurauksena lasku tumaansiirtymiseen NFKB ja näin ollen menetys aktivaation NFKB kohdegeenien. Toisaalta, yliekspressio WAVE3 oli riittävä parantamaan NFKB aktiivisuutta. Sekä farmakologinen ja geenimanipulaatiot NFKB efektorimolekyylien osoittavat, että biologinen seuraus menetys WAVE3 funktion NFKB koulutusjakson johtaa estyminen invadopodia muodostumisen ja ECM hajoamista syöpäsoluja, ja nämä muutokset ovat seurausta väheni MMP-9 ilmaisun ja toimintaa. Menetys WAVE3 myös herkistyneet syöpäsolujen apoptoosia ja solukuolemaa ohjaavat TNFa kautta estämällä AKT pro-selviytymisen kautta. Tuloksemme tunnistaa uusia toimia WAVE3 vuonna NFKB signalointi, jossa sen toiminta on olennaista sääntelyn invadopodia ja ECM hajoamista. Siksi kohdennettua terapeuttista esto WAVE3 tulee herkistää syöpäsolut apoptoosin ja solukuoleman, ja tukahduttaa syövän eteneminen ja metastaasit.

Citation: Davuluri G, Augoff K, Schiemann WP, Plow EF, Sossey-Alaoui K (2014 ) WAVE3-NFKB vuorovaikutus on olennaista Survival ja Invasion syöpäsolujen. PLoS ONE 9 (10): e110627. doi: 10,1371 /journal.pone.0110627

Editor: Chengfeng Yang, Michigan State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 16 syyskuu 2014; Julkaistu 16. lokakuuta 2014

Copyright: © 2014 Davuluri et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ sai tukea avustusten P01 HL073311 ja R01 HL096062, National Institute of Health, NIH.gov, EFP; ja avustus P30 CA43703, asia Kattava Cancer Center, Case.edu, KS-A ja WPS. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

etäpesäke on monimutkainen prosessi, joka vaatii syöpäsolujen paeta niiden ensisijainen sivuston hengissä veressä /imusuoniston ja sitten luoda uusi markkinarako kaukana olevan sivustolla [1]. Tämän prosessin aikana, jota kutsutaan myös hyökkäyksen-etäpesäkkeiden cascade, syöpäsolut käyttää erikoistunutta F-aktiini rikas ulkonemia kutsutaan invadopodia, keskittää entsymaattiseen aktiivisuuteen MMP hajottamaan ECM, jolloin syöpäsolut tunkeutuvat ja kulkeutua niiden mikroympäristön [2], [3]. Ampiaisen /WAVE proteiinien pelata keskeinen rooli useiden solun prosessien kuten solun muoto, liikkuvuuteen, sytokineesin sekä syöpäsoluinvaasiota [4] – [6]. WAVE3, erityisesti, on osoitettu olevan olennainen motiliteettia ja invaasion syöpäsolujen [7] – [9], edistämällä muodostumista lamellipodioihin laajennuksia etureuna invasiivisen soluihin [8], [10]. Ekspressiota WAVE3 on myös vahvasti rikastettu useita syöpiä, mukaan lukien rintasyöpä (BC) [11] – [14]. Itse asiassa, lisääntynyt ilmentyminen ja aktiivisuus WAVE3 osoitettiin osaltaan etäpesäkkeiden triple-negatiivisen rintasyövän (TNBC), aggressiivisin alatyyppi BC [14] – [16].

Nuclear tekijä NFKB aktivaation on tunnettu tekijä osallistuisi selviytymisen, invaasio, ja etäpesäkkeiden erilaisten syöpien [17], [18]. Aktivointi NFKB reitti on tarpeen erilaisiin fysiologisiin ja patologisiin vasteet vaihtelevat asennusta onnistuneen immuunivaste ja eloonjäämistä ja proliferaatiota syöpäsolujen [19] – [21]. NFKB perheen transkriptiotekijöitä on viisi jäsentä, p50, p52, RelA (p65), RelB ja c-Rel, jotka muodostavat homomeeriset tai heteromeerisiin dimeerejä aktivoimaan transkription kohdegeenien [22]. Leposoluissa, NFKB ylläpidetään transkriptionaalisesti lepotilassa olemalla erottautuvat sytoplasmaan proteiinin komplekseja jäsenten inhibiittorit IkappaB (IKB) perheen, mukaan lukien IκBα, IκBβ, IκBε. Vuonna klassisen reitin, TNFa voi aiheuttaa IKB kinaasi (IKK) välittämän fosforylaation ja proteasomaalisten hajoamista IκBα, jonka jälkeen fosforylaatio ja tumaansiirtymiseen että p50-p65-heterodimeeri transkription aktivoimiseksi NFKB kohdegeenien [23]. NFKB on osoitettu stimuloivan MMP, kuten MMP-1, MMP3, ja MMP-9 [24] – [26]. Kiinnostavaa kyllä, me ja muut ovat osoittaneet, että WAVE3 voi myös säätelemään ja aktiivisuus näiden MMP, mikä viittaa mahdolliseen rooliin WAVE3 /NFKB vuorovaikutus säätelyssä MMP-9 ja invadopodia aktiivisuutta syöpäsoluissa [8], [10].

Tässä esittelemme näyttöä siitä, että etäpesäke edistävää vaikutusta WAVE3 saavutetaan osittain kautta sääntelyn NFKB signaloinnin syöpäsoluissa. Osoitamme, että menetys WAVE3 Metastasoituneessa BC MDA-MB-231-solujen johtaa NFkB: n aktiivisuuden. Toisaalta, yliekspressio WAVE3 parantaa NFKB signalointia. Osoitamme, että WAVE3-välitteinen modulaatio NFKB tarvitaan invadopodia muodostumista sekä MMP-9 ilmaisun ja toiminnan, joita tarvitaan syöpäsolujen hajottamaan ECM. Lopuksi, me osoitamme, että kohdennettu-inhibitio WAVE3 herkistää syöpäsolut apoptoosia ja solukuolemaa inhibition kautta AKT ja kaspaasi selviytymisreittejä alavirtaan NFKB. Vastaavasti meidän data perustettava uusi toiminto WAVE3 kannalta tärkeä sääntelyn NFKB signalointi ja käytön tueksi WAVE3 estäjien yhdistelmäterapioissa nimenomaan kohdistaa syövän etäpesäkkeiden.

koemenettelytavat

Antibodies

kanin anti-WAVE3 (1:1000), kanin anti-MMP-9 (1:1000), kanin anti-MMP2 (1:1000), kanin anti-p38 (1:1000), jäniksen anti fosfo p38 (1:1000), kanin fosfori ERK (1:1000), kanin ERK (1:1000), jäniksen anti fosfo AKT (Ser473; 1:1000), jäniksen anti panAKT (1:1000), jäniksen anti Fosfospesifiset JNK (1 :1000), kanin anti-JNK (1:1000), hiiren anti-fosfo p65 (Ser536) (1:1000), kanin anti-Cortatcin ovat peräisin Cell Signaling Technologies. (Danvers, MA); Hiiren anti-GFP, hiiren anti-WAVE2 (1:3000), hiiren anti-Wave1 (1:3000) ovat Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA); kanin anti-NFKB p65 (1:5000) peräisin Biolegend (San Diego, CA), kanin anti NAP1 (1:2000), kanin anti ABI1 (1:5000), kanin anti CYFIP2 (1:3000), hiiren anti-aktiini (1:5000), kanin anti-Myc (1:1000) ovat yhtiöltä Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); vuohen piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua anti-hiiri-IgG (1:5000) ja vuohen piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua anti-kani-IgG (1:5000) Calbiochem; ja Alexa 488-konjugoitua anti-kani-IgG ja Alexa 568-konjugoitua anti-hiiri-IgG, Alexa 568-konjugoidun phalloidin ovat Invitrogen. VECTA-kilpi 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli oli Vector Laboratories (Burlingame, CA). Geelielektroforeesi reagenssit olivat Bio-Rad (Hercules, CA).

siRNA ja shRNA geeniekspression pudotus

Käytimme On-Targetplus SMARTpool (Thermo Scientific) siRNA L-012141-00- 0010, L-1012301-00-0010, CYFIP2HSS120271, ABI1HSS11589 (Invitrogen), ja SignalSilence IκBα siRNA (Cell Signaling Technology) ja ohimenevä pudotus ilmaisun WAVE2, WAVE3, CYFIP2 ja ABI1, vastaavasti, kuten aiemmin on kuvattu (14). Vakaa knockdovvn WAVE3 saavutettiin transfektio MDA-MB-231 ja BT549 BC solut joko ohjattu ei-kohdistuksen shRNA tai WAVE3 MISSION shRNA kloonia (Sigma), minkä jälkeen puromysiiniselektion Positiivisten kloonien kuten aiemmin on kuvattu (12).

Cell Culture

Ihmisen MDA-MB-231 BT549 ja MCF7-BC-solut hankittiin American Type Culture Collection (ATCC) ja niitä ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön naudan seerumia (FBS), 100 yksikköä penisilliiniä /ml, 100 ug streptomysiiniä /ml. Stimulaatioon TNFa: n kanssa, soluja altistetaan ensin seerumin nälkään yön yli DMEM: ssä ilman naudan sikiön seerumia, ja käsiteltiin sitten 50 ng /ml TNFa: aa tai laimennusainetta DMSO (perusolosuhteissa) negatiivinen kontrolli hoito 15 min. Proteiinisynteesin inhibition, solujen käsiteltiin sykloheksimidillä (CHX, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 50 ug /ml ja inkuboitiin 24 h. Sillä proteasomin esto, soluja käsiteltiin MG-132 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 20 uM ja inkuboitiin 24 tunnin ajan. Akt-inhibiittorin MK-2206 (Select Chemicals, Yorktown, TX) käytettiin lopullinen pitoisuus 10 uM hoitoon soluja 16 h, kun taas IKKβ-estäjä (EMD Millipore, Billerica, MA) käytettiin lopullisessa konsentraatiossa 10 uM hoitoon soluja 24 h.

Virtaussytometria

MDA-MB-231 tai BT549-soluja, jotka oli transfektoitu joko kontrolli ei-kohdistuksen shRNA tai shWAVE3, käsiteltiin TNFa: n ja 3 h ja kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja puromysiinin (5 ug /ml). Subkonfluentit soluviljelmät irrotettiin trypsinoinnilla ja pestiin Hankin tasapainotetulla suolaliuoksella, jossa Ca2 +, Mg2 +, ja 0,1% BSA: ta. Solut käsitellä virtaussytometrialla valmistaja on kuvannut (Roche In situ Cell Death Detection Kit, Fluoreseiini). Propidiumjodidia on käytetty havaitsemaan kuolleita soluja. Kaikki tiedot hankittiin BD LSRII väline ja analysoitiin FlowJo 7.6.3 (Treestar) ohjelmisto. Epäspesifinen sitoutuminen toissijaisen vasta-aineen yksin solujen vähennettiin kaikista virtaussytometria tiedot, jolloin tuloksena fluoresenssin intensiteetti arvot, jotka ovat näkyvissä.

immunoblot-analyysi

Koko solulysaateista, jotka sisältävät samanlaisia ​​määriä yhteensä proteiinia (-50 ug) erotettiin 10% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidi- geelillä, jonka jälkeen se siirretään nitroselluloosalle (Bio-Rad, Hercules, CA) tai Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA) membraanit käyttäen Bio-Rad geeli ja siirtolaitetta. Membraanit inkuboitiin 5% täysmaito tai naudan seerumin albumiinia 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), jonka jälkeen inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineen (määritelty) yön yli 4 ° C: ssa. Sitten membraanit pestiin ja inkuboitiin sopivan sekundaarisen vasta-aineen huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan, ja immunokompleksien visualisoitiin käyttäen Western valot kemiluminesenssidetektiolla kit Perkin-Elmer (Boston, MA). Signaalit mittaamaan ImageJ ohjelmiston parametrien mukaan kuvattu ImageJ käyttöohjeet (https://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146.html). Keskiarvoja 3 eri blotit on esitetty.

NFKB Luciferase Reporter Assay

Cignal NFKB reportterimääritys QIAGEN Inc (Valencia, CA) käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, MDA-MB 231 tai BT549-soluja kotransfektoitiin siWAVE3 tai siWAVE2 kanssa NFKB toimittaja, negatiiviset ja positiiviset kontrollit, sekä Renilla lusiferaasireportteri- rakentaa sisäisen normalisointi. 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin 50 ng /ml rekombinanttia ihmisen TNFa: ssa 30 minuutin ajan, ellei toisin mainita. Dual Lusiferaasimäärityksiä (Promega, Madison, WI) tehtiin 96-kuoppalevyllä käyttäen Veritas Microplate Luminometer (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA), ja promoottorin aktiivisuus arvot ilmaistaan ​​mielivaltaisina yksikköinä jälkeen normalisoinnin lusiferaasiaktiivisuus Renilla reportteri. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja keskihajonnan arvot näkyvät.

Immunofluoresenssimikroskopia

Soluja kasvatettiin lasipeitinlevyille ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 20 min PBS: ssä, huoneenlämpötilassa ja pestään PBS: llä. Sitten solut läpäiseviksi 0,2% Triton X-100 PBS: ssä 15 minuutin ajan, pestiin jälleen PBS: llä, ja inkuboitiin esto, joka sisälsi 5% naudan seerumin albumiinia (Sigma) PBS: ssä 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Ensisijainen ja toissijainen vasta-aineet laimennettiin suositeltuun pitoisuus 5% naudan seerumialbumiinia PBS: ssä. Soluja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen 1 h, pestiin PBS: llä, ja sitten inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen kanssa 1 tunti. Aktiinifilamenttien (F-aktiini) värjättiin rodamiinikonjugoitu phalloidin (Molecular Probes, Eugene, OR) PBS: ssä. Peitinlasit kiinnitettiin kohteen dioja Vectashield asennus väliaineessa, joka sisälsi 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Fluoresenssi kuvat otettiin käyttäen Nikon TE2000-E ylösalaisin mikroskoopilla. Signaalit mittaamaan ImageJ ohjelmiston parametrien mukaan kuvattu ImageJ käyttöohjeet (https://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146.html). Keskiarvot 5 eri kuvia piirrettiin.

gelatiinitsymografialla

gelatiinitsymografialla akryyliamidigeelejä (10%) valmistettiin yleisten menetelmien mukaan [8]. Gelatiinia lisättiin geeliliuokseen lopulliseen gelatiinin konsentraatio 1 mg /ml. Solujen supernatantti sekoitettiin 2 x näytepuskuria, inkuboitiin huoneen lämpötilassa 10 minuutin ajan, ja 25 ui seosta ladattiin geeleihin. Elektroforeesin jälkeen geeli inkuboitiin Tsymogrammi renaturaation puskurissa samalla varovasti sekoittaen 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, mitä seurasi inkubointi Tsymogrammi kehittää puskurissa 37 ° C: ssa vähintään neljä tuntia. Gelatinaasin aktiivisuus visualisoitiin värjäämällä geelit Coomassie Brilliant Blue G250 ja väri poistettiin etikkahappo-metanoli-dH

2O (01:03:06). Alueet proteaasiaktiviteetin valokuvattiin SLR kamera.

Invadopodia muodostumisen määritys

FITC-liivate hajoamisen määritykset suoritettiin kohti valmistajan menettelyä (Invitrogen). Lyhyesti, peitinlaseista (18 mm halkaisija) päällystettiin 50 ug /ml poly-L-lysiiniä 20 minuuttia huoneen lämpötilassa, pestiin PBS: llä, kiinnitettiin 0,5% glutaraldehydillä 15 minuutin ajan ja pestiin PBS: llä 3 kertaa. Pesun jälkeen peitinlasit ylösalaisin pisara 0,2% FITC konjugoitua gelatiinia PBS: ssä, joka sisälsi 2% sakkaroosia, inkuboitiin 10 minuuttia huoneenlämpötilassa, pestiin PBS: llä 3 kertaa, sammutettiin natriumboorihydridillä (5 mg /ml) 3 min ja lopuksi inkuboitiin 2 ml: ssa täydellistä alustaa 2 tuntia. -Soluja (2 x 10

5 kuhunkin kuoppaan) maljattiin FITC gelatiinilla päällystetyille peitinlaseille ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 12 tuntia. Invadopodia ja ECM hajoaminen dokumentoitiin fluoresenssi konfokaalimikroskopia kuvatulla [27], [28]. Signaalin analyysi ja jälleenrakentamiseen 3D-kuvien avulla on tehty ImageJ ohjelmistoa.

Tilastolliset analyysit

Tiedot esitetään keskiarvoina ± standardipoikkeamat vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Tulokset testattiin merkityksen käyttämällä paritonta Studentin

t

testiä.

p

arvo alle 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

WAVE3 tarvitaan NFKB aktiivisuuden

dokumentoivat vuorovaikutusta WAVE3 ja NFKB signalointi käytimme lusiferaasi-pohjainen NFKB reportterimääritys muutosten arvioimiseksi NFKB aktiivisuuden läsnä ollessa ja poissa ollessa WAVE3. Positiivisena kontrollina NFicB aktivointia, käytimme TNFa, tunnettu stimulaattori NFKB signalointia. Olemme havainneet, että TNFa hoito MDA-MB-231 tai BT549-solujen lisääntynyt NFKB: n aktiivisuus on vähintään 3-kertaisesti molemmissa solulinjoissa verrattuna stimuloimattomiin soluihin (kuvio. S1 File S1). Kuitenkin WAVE3-taintumisen (sh-W3) soluja (Kuva. 1A upotus), lusiferaasiaktiivisuuden, ja siksi NFKB aktiivisuus, väheni vähintään 4-kertainen verrattuna MDA-MB-231 transfektoitu ohjaus ei-kohdistaminen shRNA (Ctrl-sh) (Fig. 1A). Siten WAVE3 vaadittiin NFKB toimintaan. Tämä esto NFKB toiminta oli spesifinen menetys WAVE3 koska knockdovvn WAVE2 ilmaisun, toinen WAVE isoformi, ei ollut vaikutusta NFKB aktiivisuuden (kuvio. S2 File S1).

(A) Luciferase-pohjainen NFKB reportterianalyysi MDA-MB-231-soluja, joilla on stabiili transfektio ei-kohdistuksen shRNA (Ctrl-sh) tai WAVE3-trageting shRNA (sh-W3). (Inset) Western blot -analyysi proteiinin lysaatit soluista on kuvattu (A) anti-WAVE3 vasta-aine. p-Actin käytettiin latauskontrollina. (*, P 0,05). (B) Western blot -analyysi, jossa mainituilla vasta-aineilla proteiinia teissa Ctrl-sh MDA-MB-231 ja kaksi erilaista shWAVE3 johdettuja klooneja (sh-W3-1 ja sh-W3-2), ennen ja jälkeen TNFa hoidon (50 ng /ul 15 min). Alla oleva numerot p-p65 ja WAVE3 paneelit osoittavat kertainen muutos p-p65 ja WAVE3 tasolla, vastaavasti, verrattuna käsittelemättömiin Ctrl-sh-soluja. (C) kvantifiointi p-p65 tasot ilmoitettu olosuhteissa. (D) Western blot analyysi p65 vasta tumafraktios- lysaatit Ctrl-sh ja sh-W3 MDA-MB-231-solujen kanssa tai ilman TNFa hoitoa. H2b käytettiin latauskontrollina varten tumafraktios-. Numerot alla H2b paneelissa osoittavat kertaluokkamuutos p65 tasolle suhteessa käsittelemättömän Ctrl-sh soluissa. (E) Immuno-värjäytymisen tumaansiirtymiseen (valkoiset nuolet) p65-proteiinin (punainen) in Ctrl-sh ja shWAVE3 MDA-MB-231-soluja. Solut ytimet ovat vasta-värjättiin DAPI (Blue). (F) kvantifiointi p65 tumavärjäystä. Kaikki tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta, tai ovat keskiarvo ± SD (n = 3, *, p 0,05; Studentin t-testi)

fosforylaation NFKB p65-alayksikköä seriinin 536 ja sen tumaansiirtymiseen ovat vaaditut vaiheet NFKB aktivaation. Olemme löytäneet menetys WAVE3 MDA-MB-231-solujen estävän merkitsevästi (3- 8-kertainen pieneneminen) p65 fosforylaation tasoja (Fig. 1B ja 1C). Senkin jälkeen stimulaation TNFa, p65 fosforylaatio tasot WAVE3-pudotus soluja ei voitu palauttaa näille tasoille löytyy kuin kohdistaminen shRNA-transfektoiduissa soluissa (Kuva. 1 B ja 1 C). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin BT549-soluissa (kuvio. S3 File S1). Lisäksi tumaansiirtymiseen p65, joka on viime kädessä askel aktivaatioputouksen NFKB signalointi, oli myös merkitsevästi esti in WAVE3-pudotus MDA-MB-231-solujen, mitattuna tasot p65-proteiinin tumassa (10-kertainen vähennys) sekä immunoblottauksella ydin- osa solulysaateista (kuvio. 1 D) ja immunovärjäämällä analyysit (5-kertainen pieneneminen) kokonaisten solujen (Kuva. 1 E, 1F ja Fig. S4 File S1). Jälleen stimulaatio WAVE3-pudotus solujen TNFa ei lisätä p65 sisällä tumafraktios- tasolle löytyy ohjaus transfektoitujen solujen kontrolli ei-kohdistuksen shRNA (Fig. S4 File S1). Yhdessä nämä tiedot tukevat edelleen osallistumista WAVE3 vuonna aktivoinnin NFKB signalointireitin.

WAVE3 yliekspressio aktivoi NFKB signalointiaktiivisuuteen

ymmärtämään paremmin, miten WAVE3 moduloi NFKB signalointi, haimme yhdistelmä geneettisten ja farmakologisen keinot manipuloida efektorimolekyyleille että NFKB kautta. Ensin tutkittiin, yliekspressio eksogeenisten WAVE3 voi vaikuttaa NFKB aktiivisuutta. Voit tehdä niin, me yli-ilmentynyt joko GFP yksin tai GFP-WAVE3 fuusioproteiinin MDA-MB-231-solujen ja arvioitiin NFKB toimintaan. Käyttäen lusiferaasi-pohjainen NFKB toimittaja, joka on kuvattu kuviossa 1A, löydettiin yliekspressio WAVE3 (Fig. 2A) stimuloivat NFKB-aktiivisuuden 3-kertainen nousu (Fig. 2B). Tämän mukaisesti havainnon, WAVE3-overexpresion myös edistänyt ( 3-kertainen nousu) p65 fosforylaation vaikuttamatta yhteensä p65 ekspressiotasoja (Fig. 2C). Toisaalta, käsittelemällä spesifinen inhibiittori IKKβ (IKKβ-I), ylävirran aktivaattori NFKB signaloinnin, pyöristettyjä TNFa-välitteistä stimulaatiota fosfo-p65 on WAVE3-yli-ilmentävät MDA-MB-231-soluja (0,9-kertainen muutos TNFa ja IKKβ-I-käsiteltyjä soluja vs. 3,2-kertainen muutos TNFa vain käsitellyissä soluissa (Kuva. 2D)). Siten nämä tiedot tukevat edelleen roolia WAVE3 säätelyssä NFKB signalointi. Seuraavaksi tarkkaillaan p65-proteiinin fosforylaatiota ja liikevaihdon GFP ja WAVE3 yliekspressoivia MDA-MB-231-solujen hoidon jälkeen sykloheksamidi (CHX) estäjä on

de novo

proteiinisynteesiä. Vaikka fosforylaation tasoja p65 lisättiin (~3- 4-kertainen lisäys) että WAVE3 yli-ilmentäviä soluja, käsittely CHX ei vaikuttanut ekspressiotasot yhteensä p65 (Fig. 2E). Samoin hoidon MG-132, yhdiste, joka inhiboi proteasomin-välitteisen proteiinien hajoaminen, ei vaikuttanut WAVE3-välitteisen kasvu fosforyloidun p65 on WAVE3 yli-ilmentäviä soluja (kuvio. 2F), kun taas veren kokonaiskolesterolia p65 pysyi ennallaan ( kuva 2F). Siten nämä tiedot osoittavat, että WAVE3-välitteinen modulaatio NFKB signalointi ei edellytä osallistumista WAVE3 proteiinin neo-synteesiä (jäljempänä CHX tietoja, Fig. 2E) tai t proteasomi-välitteisen proteiinien hajoaminen (MG-132 data, kuvio . 2F).

(A) Western blot-analyysi WAVE3-GFP-proteiinia tasot GFP ja GFP-W3-ilmentäviä soluja. (B) lusiferaasi-pohjainen NFKB reportterimääritystä GFP ja GFP-WAVE3 ilmentävät solut (*, p 0,05). (C F) Western blot -analyysi, jossa on esitetty vasta-aineiden solulysaatteja GFP ja WAVE3-GFP ekspressoivien solujen käsittelyn jälkeen sykloheksamidi (CHX, E) ja proteasomin inhibiittoria MG132 (F). Numerot alla GFP paneelissa osoittavat kertaluokkamuutos p-p65 tasojen suhteen GFP soluihin. p-Actin käytettiin latauskontrollina. Kaikki tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta, tai ovat keskiarvo ± SD (n = 3, *, p 0,05; Studentin t-testi)

WAVE3 välittämää modulaatio NFKB signalointi ei edellyttää muiden jäsenten WAVE sääntelyn monimutkainen

WAVE3, kuten muut jäsenet WASP /WAVE perhe, tiedetään toimivan aktivaattori on Arp2 /3 kompleksi edistää aktiini polymerointi ja solun tukiranka remodeling. Aalto proteiinien suorittaa tämän solun tukirangan uudelleenjärjestelyn toiminnon, se on sisällytetty pentameerinen proteiini-kompleksin, jota kutsutaan myös WAVE sääntelyn kompleksi (WRC), että lisäksi Wave proteiineja, sisältää myös NAP1, ABI1 /2, CYFIP2 ja HSPC300 [29]. Niinpä me käsiteltiin kysymystä siitä, onko WAVE3 välittämää modulaatio NFKB signaloinnin edellyttää osallistumista muiden jäsenten WRC. Ensin osoitimme, että vaikka siRNA-välitteisen knockdovvn WAVE3 johti merkittävään eston ( 8-kertainen pieneneminen) ja WAVE3 ilmaisun, se ei vaikuttanut ekspressiotasot neljä muuta jäsentä WRC (Fig. 3A). Toisaalta, siRNA: t on suunnattu joko ABI1 tai CYFIP2, mikä johti selektiivisen menetyksen ilmentävät niiden tavoitteiden, ei vaikuttanut ekspressiotasot muiden jäsenten WRC (Fig. 3A). Toiminnallisesti, ja kuten odotettua, WAVE3-pudotus inhiboi NFKB signalointi (5-kertainen pieneneminen), mitattuna menetys fosforylaatio p65 (Fig. 3B). Kuitenkin, vähentynyt ilmentyminen tahansa muiden jäsenten WRC (ABI1 ja CYFIP2) ei vaikuta fosforylaation tasoja p65 (Fig. 3B). Lisäksi, vaikka stimulaatiolla TNF lisääntynyt p65-fosforylaation tasoja sekä ohjaus- ja pudotus solujen fosforylaatio tasot WAVE3-knockdown-soluja on enemmän kuin kaksi kertaa pienempi kuin kontrolliryhmässä siRNA solujen tai ABI tai CYFIP2 siRNA solut (Fig. 3B). Yhdessä nämä tulokset osoittavat selvästi, että WAVE3 välittämää modulaatio NFKB signalointi ei edellytä osallistumista jäsenten WRC, ja siksi edustaa aktiivisuus WAVE3 riippumaton sen perinteisestä aktiini polymerointi omaisuutta WRC.

(A) Western blot -analyysi, jossa on esitetty vasta-aineiden MDA-MB-231-soluja transfektoitiin ohimenevästi ei-suunnattu siRNA (Ctrl-si) tai siRNA kohdistaminen joko WAVE3 (si-W3), ABI1 si-ABI1), tai CYFIP2 (si-CYFIP2). (B) Western blot -analyysi, jossa p-p65 ja yhteensä p65-vasta-aineita solulysaateista kuvattu (A). Numerot alla β-Actin paneeli osoittaa kertaluokkamuutos p-p65 tasolle suhteessa käsittelemättömän Ctrl-si soluissa. Sekä (A) ja (B), β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

ilmentäminen ja aktiivisuuden MMP-9, joka on merkittävä NFKB kohdegeenin, estyvät menetys WAVE3

Olemme aiemmin osoittaneet, että vakaa knockdovvn WAVE3 johtaa menetykseen ilmaisun ja toimintaa useiden MMP, kuten MMP-1, 3 ja 9 [8]. Näistä MMP, MMP-9 on tärkeä tavoite NFKB reitin, nostaa sitä mahdollisuutta, että WAVE3 saattaa olla mukana NFKB-välitteisen sääntelyn MMP-9. Ensin käytettiin Western blotting osoittaa, että MMP-9: n ilmentyminen inhiboituu seurauksena vakaa knockdovvn WAVE3; lasku MMP-9-proteiinia oli -5-kertaisesti MDA-MB-231 (Fig. 4A) ja ~ 4-kertaisesti BT549-soluja (kuvio. S5 File S1). Huomattavaa on, että ekspressiotasot on Wave1 ja WAVE2 eivät vaikuttaneet menetys WAVE3, ja siksi ei ole vaikutusta muutoksiin MMP-9 tasojen aiheuttaman WAVE3-taintumisen (Fig. 4A). Seuraavaksi käytimme gelatinaasi tsymografialla määritys osoittaa MMP-9-aktiivisuus inhiboi myös (5-kertainen pieneneminen) WAVE3-knockdown-soluja (Fig. 4B). Lisäksi stimulaatio TNFa, joka on merkittävä aktivaattori NFKB-signalointireitin, parannettu (~ 3,5-kertainen lisäys) MMP-9 toimintaa kontrollisoluissa (Ctrl-sh). Kuitenkin WAVE3-pudotus-solujen stimulaatio TNFa kyennyt aktivoimaan MMP-9 tasolle nähdään kontrollisoluissa (Fig. 4C). Näin ollen, nämä tulokset viittaavat siihen, että WAVE3-välitteinen säätely MMP-9 voidaan kohdistaa moduloimalla NFKB signaloinnin. Näin ollen, ilmentyminen ja aktiivisuus tasot MMP-9 voidaan käyttää lukema on WAVE3-välitteisen modulaatio NFKB aktivaation tasoja.

(A) Western blot -analyysi, jossa on esitetty vasta-aineiden solulysaattien MDA-MB-231-soluja transfektoitiin ei-kohdistuksen shRNA (Ctrl-sh), ja kaksi erilaista sh-WAVE3 klooneja (sh-W3-1 ja sh-W3-2). Numerot alla WAVE3 ja MMP-9 paneelit osoittavat kertaluokkamuutos WAVE3 ja MMP-9 tasojen suhteen käsittelemättömän Ctrl-sh soluissa. p-Actin käytettiin latauskontrollina. (B) gelatiinitsymografialla aktivoitua MMP-9 ja MMP2 kunnostetussa tiedotusvälineissä Ctrl-sh kaksi sh-W3 klooneja. C) gelatiinitsymografialla aktivoitua MMP-9 ennen ja jälkeen hoidon TNFa elatusaine Ctrl-sh ja kaksi sh-W3 klooneja. Molemmissa (B) ja (C), Red-Ponceau-värjätyissä geeleissä näkyvät lastaus valvontaa. Numerot alla zymografian paneelit osoittavat kertainen muutos MMP-9 tasojen suhteen käsittelemättömän Ctrl-sh soluissa.

WAVE3 tarvitaan invadopodia muodostumiseen ja ECM hajoamisen kautta NFKB signalointi

biologinen merkitys menetys WAVE3 ja sen vaikutus NFKB signalointi tutkittiin kautta kyky syöpäsolujen muodostamiseksi invadopodia ja huonontaa ECM, jotka molemmat vaativat MMP9 aktivointia ohjaavat NFKB signalointi. MDA-MB-231-soluja, kuten useimmat erittäin invasiivinen syöpäsolulinjoissa, muodostavat invadopodia

in vitro

kun ympättiin komponentteja soluväliaineen. Seurata MMP-9 toimintaa invadopodia, MDA-MB-231-solut päällystettiin fluoresoiva gelatiinipäällystetyille peitinlasit. Värjäyksen jälkeen F-aktiini, invadopodia havaittiin pistemäisinä klustereita F-aktiini on ventraalinen solujen pinnalla, joka on suorassa kosketuksessa gelatiini kasvualusta (Fig. 5A paneeli a). Nämä invadopodia rakenteet päällekkäisiä sivustoja hajoamisen liivate matriisin (Fig. 5A, paneelit b ja c) ja voidaan visualisoida 3-ulotteinen (3-D) rekonstruoitu kuvia kohtiin, että liivate sängyssä (Kuva. 5A paneeli d) . Cortactin on tunnettu merkkiaine invadopodia (Fig. S6 File S1). Huomasimme, että TNFa hoito MDA-MB-231 johti kolokalisaation WAVE3 kanssa Cortactin at invadopodia rakenteita (kuvio. 5B), sopusoinnussa osallistumista WAVE3 in invadopodia muodostumiseen.

(A) konfokaali mikroskooppinen mikrokuvia MDA-MB-231-soluja kasvatettiin FITC-leimattua gelatiinia ja värjättiin (a) F-aktiini filamentit (punainen). Valkoisen nuolen-päät osoittavat invadopodia rakenteisiin (valkoiset täplät). (B) Alueet, ECM hajoamisen (musta nuoli-head) näkyvät mustina pilkkuja. Invadopodia rakenteet yhtyvät alueita ECM hajoamisen yhdistetyn kuvan (c). (D) 3-ulotteinen rekonstruoitu kuva mustan nuolet osoittavat invadopodia (punainen) tunkeutuu liivate sänky (vihreä). (B) konfokaali mikroskooppiset mikroskooppikuvia MDA-MB-231-soluja kasvatettiin kollageenilla päällystetyille peitinlaseille, käsiteltiin TNFa (50 ng /ul), 15 minuutin ajan, ja värjättiin WAVE3 (vasen paneeli) ja Cortactin (keskimmäinen paneeli). Nuoli-päät osoittavat alueita invadopodia joissa sekä Cortactin ja WAVE3 colocalize in yhdistetyn kuvan oikeassa paneelissa (keltainen sijoittelussa).

Käytimme tätä liivate-pohjainen invadopodia määrityksessä arvioimaan vaikutusta WAVE3 muodostumista invadopodia ja sen jälkeen hajoaminen ECM, jonka MDA-MB-231-soluja. Löysimme merkittävä väheneminen sekä lukumäärän invadopodia (Fig. 6A, vasen paneeli ja Fig. 6B), sekä kokonaispinta-ala on invadopodia välittämää hajoaminen gelatiinia WAVE3-Knockdown soluja verrattuna ei-kohdistaminen shRNA ohjaus (Ctrl-sh) MDA-MB-231-soluja (kuvio 6A, keskimmäinen paneeli ja Fig. 6C). Siellä oli yli 3-kertainen väheneminen (p 0,05) määrän invadopodia (Fig. 6B) ja yli 10-kertainen vähennys (p 0,05) alalla ECM heikkenemistä WAVE3-knockdown solujen verrattuna kontrollisoluja (Fig. 6C). Vaikka meidän tiedot osoittavat, että menetys WAVE3 estää sekä invadopodia muodostuminen ja hajoaminen ECM, tämä ilmiö näyttää vaikuttavan solujen pääosan havaittu mikroskoopilla, ja huolellinen analyysi meidän tiedot eivät löydä väheneminen on soluja, jotka muodostavat invadopodia ja huonontaa ECM, vaan menetys WAVE3 näyttää maailmanlaajuinen vaikutus. Hoidon TNFa, mikä johti merkittävään kasvuun määrän invadopodia kontrollisoluissa (p 0,01), ei pystynyt pelastamaan inhibition invadopodia aiheuttama menetys WAVE3 (Fig. 6D 6E). Sitä vastoin yli-ilmentyminen WAVE3 ei-invasiivisia MCF7 BC soluja (kuvio S7A in File S1), jota oli aikaisemmin osoitettu stimuloivan niiden invasiivisuus [30], johti selvään kasvuun sekä invadopodia muodostumiseen ja gelatiinia hajoaisi TNFa stimuloduista solut (Fig. S7b File S1).

(A) Konfokaalimikroskopia micrographs ohjaus shRNA- tai sh-WAVE3 ilmentävien MDA-MB-231-soluja kasvatettiin FITC-leimattua gelatiinia ja värjättiin F aktiini-säikeet (vasemmanpuoleiset paneelit). Valkoisen nuolen-päät osoittavat invadopodia rakenteisiin (valkoiset täplät). β-aktiini käytettiin latauskontrollina. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.