Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Solun pinta sialyloituminen on nousemassa tärkeä osa syöpäsolumetastaasi. Sialyylitransferaasi ilmentyminen on raportoitu muuttaa kasvaimia ja voi selittää muodostumista sialyloitunut kasvaimen antigeenejä. Olemme keskittyneet vaikutuksesta alfa-2,3-sialyylitransferaasi- ST3Gal III keskeisissä vaiheissa haiman tuumorigeenisen prosessin.

Menetelmät /Principal Havainnot

ST3Gal III yliekspressoivien haiman adenokarsinooma solulinjoja Capan- 1 ja MDAPanc-28 luotiin. He osoittivat kasvua kasvaimen liittyvä antigeeni sialyyli-Lewis

x. Transfektantit ”E-selektiini sitomiskyky oli verrannollinen solun pinnan sialyyli-Lewis

x tasoilla. Cellular muuttoliike korreloi positiivisesti ST3Gal III ja sialyyli-Lewis

x tasoilla. Lisäksi pernansisäistä injektiota ST3Gal III transfektoidut solut kateenkorvattomiin nude-hiiret osoittivat vähenemistä selviytymisen ja korkeampi etäpesäkkeiden muodostumista verrattuna mock-solut.

Johtopäätös

Yhteenvetona yliekspressio ST3Gal III näissä haiman adenokarsinooma solulinjoista korostavat tämän entsyymin ja sen tuotteen keskeiset vaiheet syövän etenemisen kuten tarttuvuus, muuttoliike ja etäpesäkkeiden muodostumista.

Citation: Pérez-Garay M, Arteta B, Pagès L, de Llorens R, de Bolos C, Vidal-Vanaclocha F, et ai. (2010) α2,3-sialyylitransferaasi- ST3Gal III säätelee Haimasyöpä soluliikkuvuus ja Adhesion

In vitro

ja parantaa sen Metastaattinen Mahdolliset

In Vivo

. PLoS ONE 5 (9): e12524. doi: 10,1371 /journal.pone.0012524

Editor: Terence Lee, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 7. 2010 Hyväksytty: 31 heinäkuu 2010; Julkaistu: 1. syyskuuta 2010

Copyright: © 2010 Pérez-Garay et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat La Marato de TV3 Foundation (avustus 050932, myönnetty RP), Espanjan Ministerio de Ciencia e Innovacion (myöntää BIO 2007-61323, myönnetään RP), Katalonian aluehallituksen (avustus 2005SGR00065, myönnetty RL), Comisión Ministeriöiden de Ciencia y Tecnología (CICYT) Espanjan hallituksen Madridissa (no. SAF2006-09341, myönnetään FVV) ja Baskimaan hallitus (no. IT-487-07 myönnetty FVV). M.P.-G. kiitos Fundació La Marato ennalta tohtorin toveruuden ja University of Girona lyhyen aikavälin liikkuvuuteen apurahan. Rahoittajat ei ole roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

solun pinta sialyloituminen on nousemassa tärkeä osa syöpäsolumetastaasi. Sialihappojen ja niiden johdannaiset ovat läsnä liittimeen asemissa glykokonjugaattien. Ne happamia sokereita antaa negatiivinen kokonaisvaraus ja pystyvät moduloimaan erilaisia ​​tapahtumia solu-solu, solu-matriisi ja solu-molekyylin vuorovaikutusta [1]. Siirto sialihappo välillä cystidine-5-monophospho-N-asetyylineuramiinihappoa (CMP-NeuAc) liittimeen kantojen hiilihydraatti- ryhmien glykoproteiinin ja glykolipidit katalysoi sialyylitransferaasit [2].

Ihmisen sialyylitransferaasit ovat perheen 20 eri solunsisäisiä, Golgin membraaniin sitoutunutta glykosyylitransferaaseihin; ryhmitelty kolmeen subfamilies [3]. Alfa-2,6-sialyylitransferaasit välittää siirto siaalihapon alfa-2,6-sidos liittimeen Gal (ST6Gal I-II) [4], [5], tai GalNAc tähteet (ST6Gal NAc I-VI). Alfa-2,8-sialyylitransferaasit välittää siirto siaalihapon alfa 2,8-sidoksen (ST8 Sia I-IV). Alpha-2,3-sialyylitransferaasit välittävät siirtämistä siaalihapon alfa 2,3-sidos liittimeen Gal jäämiä. ST3Gal I-II ja IV katalysoivat siirrettäisiin Gal jäännös sijaitsee terminaali Galβ1-3GalNAc rakenteisiin; ST3Gal IV ja VI siirto siaalihappoa (alfa 2,3-sidos) Gal jäännös sijaitsee terminaali Galβ1-4GlcNAc rakenteisiin; ST3Gal V toimii Gal jäännös sijaitsee terminaali Galβ1-4Glc-Cer rakenteita ja lopuksi, ST3Gal III katalysoi siirto siaalihapon alfa 2,3-sidoksessa terminaali Gal tähteet sijaitsevat joko Galβ1-3GlcNAc tai Galβ1-4GlcNAc rakenteita [6].

muutokset erityisiä sialyylitransferaasi- ilmaisu on raportoitu muuttaa useassa kasvaimia ja voi selittää muodostumista sialyloitunut kasvaimen antigeenejä, kuten sialyyli-Lewis x sialyl- Lewis a, sialyyli-T ja sialyl- Tn. Vuonna ekstrahepaattisen sappitiehyen syöpä ST3Gal III tasot korreloivat kasvaimen etenemistä, erilaistumiseen ja etäpesäkkeiden [7]. Rintasyövän, kaikkein ilmaistuna sialyylitransferaasia oli ST3Gal III, joka korreloi positiivisesti kasvaimen koko ja lukumäärä axilary solmuja; ja lisäksi korkea ST3Gal III /ST6Gal I suhde korreloi lyhyempi eloonjäämiseen ja huono ennuste [8], [9]. Lisäksi, ST6GalNAc V on viime aikoina raportoitu välittävän aivometastaasi rintasyövän solujen [10]. Virtsarakon syöpä ST3Gal I näyttelee suurta roolia sialylaatiota T-antigeenin ja sen yliekspressio näyttää olevan osa alkuperäisen syövän syntyyn [11]. Vuonna kohdunkaula okasolusyöpä, ST6Gal I ja ST3Gal III ilmaisun tasot olivat merkitsevästi suurentunut potilailla, joilla imusolmuke etäpesäke verrattaessa ilman etäpesäkkeitä [12], [13] ja ST3Gal III, ST3Gal IV ja ST6Gal I korotettiin CIN-muutos . Ihmisen munuaissyöpä alas-säätely ST3Gal IV mRNA voi olla yksi niistä tekijöistä, jotka liittyvät sen maligni kehittyminen [14]. Paksusuolen syöpä ST6Gal I ja ST3Gal III kasvattivat ilmentymistä karsinooma yksilöt [15]. ST3Gal III oli näkyvästi lisääntynyt syövän kudoksissa verrattuna ei-pahanlaatuinen peräsuolen limakalvolla [16] ja korkeudessa ST6Gal I aktiivisuuden havaittiin pahanlaatuisten ja siirtymäkauden kudos [17]. Mahasyövän, korkea ST3Gal IIIa tuumorikudokseen korreloivat toissijainen kasvaimen uusiutumisen [18].

Vaikka alfa-2,3-sialyylitransferaasi- ST3Gal III ilmaisu korreloi kasvaimen pahanlaatuisuuden useissa karsinoomissa sen mekanistinen rooli ei ole täysin arvioitu. ST3Gal III on mukana biosynteesiin sialyyli-Lewis-antigeenit, jotka ovat yli-ilmentynyt haiman (PDAC) [19], [20], [21], [22], [23], [24], ja korreloi sen huono ennuste [25], [26], [27], [28]. Tässä työssä, tavoitteenamme on ollut tutkia erityisen vaikutuksen alfa-2,3-sialyylitransferaasi- ST3Gal III joitakin keskeisiä vaiheita PDAC etenemistä kuten tarttuvuus, muuttoliike ja etäpesäke. Siihen olemme valinneet kaksi haiman adenokarsinooma syöpäsolulinjoja Capan-1 ja MDAPanc-28, joilla on erilaiset ST3Gal III ja sialyyli-Lewis-antigeenin ekspressiotasot, ja syntyy ST3Gal III yli-ilmentävät kloonit. ST3Gal III lisääntynyt ilmentyminen liittyi kasvua sialyyli-Lewis

x pinnankorkeuden ja johdetaan tehostettu E-Selectin sitomiskyky ja solujen vaeltamiseen. Lisäksi pernansisäistä injektiota kateenkorvattomiin nude-hiiriin, että ST3Gal III overepressing solujen väheni hiirillä selviytymisen ja korkeampi etäpesäkkeiden muodostumista. Yhteenvetona lisääntynyt ilmentyminen ST3Gal III niissä haiman adenokarsinooma solulinjat Siinä korostetaan tämän entsyymin ja sen tuotteen keskeiset vaiheet syövän etenemisen kuten tarttuvuus, muuttoliike ja etäpesäkkeitä.

Tulokset

vakaa yliekspressio ST3Gal III Capan-1 ja MDAPanc-28 solujen

tutkia mekanistinen roolia ST3Gal III haiman adenokarsinooma etenemistä, rotan ST3Gal III geeniä, joka ilmentää käytännössä identtinen hyväksyjä spesifisyys ja entsyymiaktiivisuus kuin ihmisen ST3Gal III-geenin [29], on käytetty. Näin ollen, Capan-1 ja MDAPanc-28-soluja transfektoitiin pcDNA 3.1, joka koodaa rotan ST3Gal III-geenin. Vanhempien solut samanaikaisesti transfektoitiin tyhjällä pcDNA3.1 vektorin. Usean pysyvän solukloonit valittiin läsnä geneticine ja ST3Gal III mRNA: n yli-ilmentyminen analysoitiin semi-kvantitatiivisen PCR: (tietoja ei näytetty). ST3Gal III mRNA yli-ilmentävät kloonit, C31 ja C32 (varten Capan-1 malli) ja M33 ja M34 (varten MDAPanc-28 malli) valittiin jatkotutkimuksiin. Kuten valvonta, vanhempien solulinjoja (Capan-1 ja MDAPanc-28) ja valetransfektoidut kloonit (CP varten Capan-1 ja MP MDA-Pancin 28) käytettiin. ST3Gal III mRNA-ekspressio kvantitoitiin kvantitatiivista PCR: ää (qPCR) (kuvio 1). Capan-1 vanhempien soluilla oli 3-kertainen (

P 0,001

) ST3Gal III ilmaisu kuin MDAPanc-28 vanhempien soluissa. Mitä Capan-1 malli, ST3Gal III mRNA: n ekspressio oli 140 kertaa suurempi (

P 0,001

) in C31 klooni ja 100-kertainen (P 0,001) C32 klooni kuin Capan-1 ja CP kontrollisoluja. Sillä MDAPanc-28 malli, ST3Gal III mRNA: n ekspressio oli 7-kertainen (

P 0,001

) in M34 klooni ja 3,6-kertainen (P 0,001) M33 klooni kuin molemmissa ohjaus soluissa, MDAPanc -28 ja MP. Arviointi yleisten sialyylitransferaasivaikutus suoritettiin glykosylaatio immunologinen määritys (GISA), kuten aiemmin on kuvattu [24]. Kuten odotettua, yleinen sialyylitransferaasivaikutus kasvu havaittiin transfektoiduissa soluissa verrattuna niiden vastaavan valvonnan, on noin 3,2-kertaisesti suurempi Capan-1 ST3Gal III yli-ilmentävät kloonit

vs.

CP ja Capan-1 ja 1,3-kertainen suurempi MDAPanc-28 ST3Gal III yli-ilmentävät kloonit

vs.

MP ja MDAPanc-28.

MDAPanc-28 vanhempien solut, MP: MDAPanc-28 mock soluja, M34 ja M33: MDAPanc-28 solut, jotka on transfektoitu ST3Gal III-geenin. Capan-1: emosoluista, CP: Capan-1 mock-solut, C31 ja C32: Capan-1-solut, jotka on transfektoitu ST3Gal III-geenin. Data edustaa keskiarvoja ± SD 3 eri kokeesta, joista kukin kuudesta näytteitä (n = 18). * Merkittävästi erilainen (

P 0,001

).

ST3Gal III lisääntynyt de novo ilmentymistä sLex- entsymaattisella kilpailu

Solun pinta glykaanitähteen ekspressiokuviota molemmissa malleissa oli tutkittiin virtaussytometrillä käyttämällä spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita Lewis antigeenejä ja lektiinejä (tulokset on esitetty kuviossa 2). Analyysi tyypin II Lewis antigeenejä on Capan-1 malli (kuvio 2A) paljasti, että Capan-1 ja CP-soluissa oli korkea-keski tasot Le

x, SLE

x ja H2 antigeenejä ja korkea Le

y-antigeeni. Verrattuna kontrolleihin, C31 ja C32 klooneista suuri lisäys SLE

x ilmaisu kustannuksella kokonaan menettää ilmentymisen kuin sialyloiduissa antigeenejä (Le

x, H2 ja Le

y). Lisäksi mukana nousu SLE

x, väheneminen α2,6-siaalihapon havaittiin, havaita

mustaselja -agglutiniinista

(SNA).

Maackia amurensis agglutiniini

(MAA) ei ilmennyt eroja kloonien, mikä todennäköisesti johtuu siitä, että ei pysty sitoutumaan SLE

x rakenne (tuloksia ei ole esitetty). Tyyppi I Lewis antigeenejä SLE

a, Le

a, Le

b ja H1 ei havaittu Capan-1 malli (tuloksia ei ole esitetty). Näin ollen, nämä tulokset osoittavat useita entsymaattisia kilpailu tyypin II ketjut. Analyysi MDAPanc-28 (kuvio 2B) malli osoitti, että MDAPanc-28 ja MP ohjaus soluilla oli hyvin alhainen SLE

x ilme ja korkea α2,6-siaalihapon ilmaisun ja puuttui myös tyypin I Lewis antigeenejä. Kun M33 ja M34 klooneja kontrolleihin verrattuna, kasvua SLE

x vähenevät samanaikaisesti α2,6-siaalihapon havaittiin myös. Kuten edellä, MAA ei ilmennyt eroja kloonien todennäköisesti, koska se ei tunnista SLE

x (tuloksia ei ole esitetty). Koska ST3Gal III transfektoidut kloonit C31 ja C32 käyttäytyivät samankaltaisesti Capan-1 malli sekä M33 ja M34 ST3Gal III transfektoitujen kloonien MDAPanc-28 malli, seuraavat

in vitro

ja

in vivo

tutkimukset suoritettiin vasta korkeimman ST3Gal III ja SLE

x ilmentävien kloonien: C31 varten Capan-1 malli ja M34 varten MDAPanc-28 malli.

Kuva 2A. Capan-1 (jatkuva piste ääriviivat: ………), CP (välimatkan piste ääriviivat:…..), C31 (rohkea ääriviivat: _______), C32 (plain ääriviivat: ______). Kuvio 2B. MDAPanc-28 (jatkuva piste ääriviivat: ………), MP (välimatkan piste ääriviivat:…..), M34 (rohkea ääriviivat: _______), M33 (tavallinen ääriviivat: ______). Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Edustavia cytometry histogrammit näkyvät. Anti-Le

x MAb sitoutuu Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAc-; anti-SLE

x MAb sitoutuu NeuAcα2-3Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAc-; anti-H2 MAb sitoutuu [Fucα1,2] Galβ1,4GlcNAc-; anti-Le

y MAb sitoutuu [Fucα1,2] Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAc-; SNA lektiini (

mustaselja

agglutiniini) sitoutuu NeuAcα2-6Galβ- rakenteisiin.

ST3Gal III parannettu haiman adenokarsinoomasolua tarttuvuus rh-E-selektiini

E -selectin on adheesiomolekyyli ekspressoidaan aktivoiduissa endoteelisoluissa, joka tunnistaa ja sitoutuu spesifisiin hiilihydraatti- taustatekijät, kuten SLE

x ja SLE

läsnä pinnalla glycoconjugates [30]. Sitoutumisanalyysit rh-E-selektiinin suoritettiin analysoida, onko eri mallia Lewis-antigeenin ilmentyminen kykeni indusoimaan muutoksia tarttuvuus (tulokset on esitetty kuviossa 3). Molemmat mallit osoittivat eri tartunta kuvioita rh-E-selektiini. MDAPanc-28 emosoluilta näytetään alemmassa tartunta- ja rh-E-selektiinin kuin Capan-1 vanhempien soluja, jotka oli yhdenmukainen alemman ilmentymisen taso ST3Gal III ja SLE

x MDAPanc-28 verrattuna Capan-1-solut. Vuonna Capan-1 malli (kuvio 3 a) ST3Gal III yliekspressoivien klooni, C31, kolminkertaistui tarttuvuus (

P 0,001

) Rh-E-selektiinin verrattuna vastaaviin valvonnan Capan-1 ja CP. Sen vahvistamiseksi, että SLE

x ilmaisun aiheuttama ST3Gal III aiheutti up-säänneltyjen E-selektiinin sitovia soluja oli aikaisemmin inkuboitu anti-SLE

x monoklonaalinen vasta-aine (MAb) ja sitoutuminen E-selektiini estyi . Vuonna MDAPanc-28 mallin (kuvio 3B), The ST3Gal III yli-ilmentävät klooni, M34, nelinkertaiseksi (

P 0,001

) tartunta rh-E-selektiinin verrattuna vastaavan valvonnan MDAPanc-28 ja MP . Kun soluja oli aikaisemmin inkuboitu anti- SLE

x MAb sitoutumisen E-selektiini on kumosi kokonaan. Nämä tulokset osoittivat, että näissä malleissa, ST3Gal III tasot moduloitu

in vitro

sitoutumisesta rh-E-selektiinin kautta SLE

x ilmaisua.

Capan-1 variantti soluista (kuvio 3A) ja MDAPanc-28 variantin soluissa (kuvio 3B), joita oli aikaisemmin inkuboitu PBS-1% BSA: ta (valokeilat) tai anti-SLE

x MAb (tumma baaria), lisättiin 96-kuoppaisille mikrolevyille päällystetty rh E -selectin tai PBS-1% BSA: ta (negatiivinen kontrolli). Tarttuneet solut arvioitiin MTT-kolorimetristä määritystä. Tulokset ilmaistaan ​​Spesifinen sitoutuminen E-selektiini (OD 570 nm: ssä solujen rajoittuu E-selektiini – OD 570 nm solujen sidottu PBS-1% BSA)

versus

soluja oli aikaisemmin inkuboitu tai anti -SLe

x MAb. Data edustaa keskiarvoja ± SD 3 eri kokeesta, joista kukin viiden näytteitä (n = 15). * Merkittävästi erilainen (

P 0,001

).

vaikutus eri sytokiinien tarttumiseen haimasyövän soluja maksan sinimuotoista endoteelin (HSE) solut

koska ST3Gal III ja SLE

x ekspressiotasot olivat suoraan verrannollisia

in vitro

rh-E-selektiinin tarttuvuus, sitoutuminen haimasyövän soluja ensisijainen viljellyistä HSE soluja arvioitiin. Capan-1 malli valittiin tässä kokeessa johtuen korkeammasta tarttuvuus rh-E-selektiini. Ensin määritetään erityinen tarttuvuus Capan-1 vanhempien solujen HSEC stimuloitiin TNF-α, IL1-β tai lipopolysakkaridin (LPS) 16 tuntia ennen määritystä (tulokset esitetty kuviossa 4A). Hoito TNF-α ja IL1-β huomattavasti lisääntynyt Tarttuvien solujen lukumäärä, ja IL1-β osoittautui olevan paras virikkeitä mallimme. Kun inkubointi anti-E-selektiinin MAb, kasvu adheesio kumosi kokonaan. Nämä tiedot osoittivat, että HSE solu sytokiini esikäsittelyyn, erityisesti IL-1β, edistänyt niiden E-selektiinin ekspressiota, mikä aiheutti kasvua Capan-1 tarttumista.

HSE soluja inkuboitiin Sel = Anti-hiiri CD62 E (E-selektiini) MAb tai IgG = Isotyypin kontrollivasta-ainetta. Vanhempien Capan-1-solut leimattiin kalseiini ja lisättiin HSE kontrollisoluihin, TNF-α stimuloitujen HSE solujen LPS-stimuloitua HSE soluja tai IL-1β stimuloitujen HSE soluja. Tulokset ilmaistaan%: erityiset kiinnittyminen HSE soluihin [78]. Data edustaa keskiarvoja ± SD 3 eri kokeesta, joista kukin on kolme toistoa (n = 9). * Merkittävästi erilainen (

P 0,001

) verrattaessa anti-E-selektiinin inkuboidaan HSEC hallita soluihin. # Merkittävästi erilainen (

P 0,001

) verrattaessa hoitoja. Kasvaimen soluadheesioanalyysissä Ensisijainen Viljellyt HSE-soluja (kuvio 4B). Capan-1 variantti-solut leimattiin Calcein ja lisättiin IL-1β stimuloitujen HSE soluja tai (-) ei stimuloi HSE kontrollisoluihin. Sel = Anti-hiiri CD62 E (E-selektiini) MAb lisättiin IL-1β HSE soluja tai – HSE soluja ennen kasvainsolujen lisäksi. * Merkittävästi erilainen (

P 0,001

) verrattaessa Capan-1, CP, ja C31-solut. # Merkittävästi erilainen (

P 0,001

) vertailtaessa kunkin kloonin (Capan-1, CP ja C31) tarttuvuus eri HSE solun hoitoja.

ST3Gal III lisääntynyt kasvainsolujen tarttumista HSE: n soluihin

vieressä määritetään tarttumista eri ST3Gal III ja SLE

x tasoilla ilmentäviä Capan-1-solut IL-1β esikäsiteltyjä tai ohjata HSE-solut (tulokset on esitetty kuviossa 4B). Capan-1 ja CP ohjaus solut osoittivat pohjapinta kiinnittyminen HSE soluihin, mikä lisäsi merkittävästi IL-1β esikäsitelty HSE solujen ja palasi pohjapinta tasoilla anti-E-selektiini MAb esi-inkuboitiin HSE soluissa. C31 osoitti pohjapinta kiinnittyminen HSE soluihin (yli Capan-1 ja CP ohjaus solut), mikä lisäsi merkittävästi IL-1β esikäsitelty HSE soluja ja myös palasi pohjapinta tasoilla anti-E-selektiini MAb esi HSE soluja. Nämä tiedot osoittivat, että E-selektiini tärkeä rooli välittävien kiinnittyminen HSE soluihin, vaikka ei-E-selektiini riippuvainen pohjapinta tarttuvuus (korkeampi C31 kuin kontrolli soluja) olemassa. Lisäksi korkea ST3Gal III ja SLE

x ilmentävien C31 solut oli suurempi kiinnittyminen HSE soluja kuin keskipitkän ST3Gal III ja SLE

x ilmentävät ohjaus solua.

ST3Gal III ilmaisu lisääntynyt solujen vaeltamiseen

sen tutkimiseksi, ST3Gal III yli-ilmentävät kloonit saattavat johtaa hankinta useamman muuttavan solun fenotyyppiin, arvioimme solumigraatio kollageenilla tyyppi-I käyttäen transwell migraatiokokeessa (tulokset esitetty kuviossa 5). Molemmat solumalleja osoittivat eri muuttavien ominaisuuksia, jossa Capan-1 malli on yhdeksän kertaa enemmän vaeltavia kuin MDAPanc-28 mallia. Mitä Capan-1 malli (kuvio 5A), The ST3 Gal III ja SLE

x yli-ilmentävät klooni C31 näytteillä kaksinkertainen (

P 0,001

) muuttoliikkeen ominaisuudet kuin kontrolli solut Capan-1 ja CP. Sillä MDAPanc-28 malli (kuvio 5B), The ST3Gal III ja SLE

x yliekspressoivassa klooni M34 lisääntynyt maahanmuutto neljällä suhteessa kontrollisoluihin MDAPanc-28 ja MP. Tulokset osoittivat positiivinen korrelaatio ST3Gal III ja SLE

x tasoilla ja muuttavien valmiuksia.

Capan-1 variantti soluista (Capan-1, CP ja C31)

(

Kuva 5A

) B ja MDAPanc-28 variantin soluja (MDAPanc-28, MP ja M34)

(

Kuva 5B

) B ympättiin päälle 8 um huokosia-tyyppi I-kollageeni pinnoitettu insertit, asetetaan päälle, jotka sisälsivät DMEM-1% FBS ja inkuboitiin 37 ° C: ssa (6 h Capan-1 malli ja 18 h MDAPanc-28-malli). Non-Siirretyt solut poistetaan ja muuttivat solut värjäsimme ja laskettiin. Tulokset ilmaistaan ​​siirretty solua kuoppaa kohti. Data edustaa keskiarvoa ± SD arvoista, jotka saatiin 3 erilliselle kokeelle (n = 9). * Merkittävästi erilainen (

P 0,001

).

ST3Gal III yliekspressio lisää tuumorigeneesiä ja vähentää selviytymistä kateenkorvattomissa nude-hiirissä

Koska

in vitro

kuvatut tulokset ehdottivat tärkeä rooli ST3Gal III geenin syövän etenemiseen,

in vivo

analyysit suoritettiin tutkimaan onko ST3Gal III voisi olla tärkeä tuumorimetastaasissa. Ensimmäinen, muodostumista etäpesäkkeiden ja selviytymistä kateenkorvattomia nude-hiirissä pernansisäistä injektiota eri määriä Capan-1 ja MDAPanc-28 vanhempien solut testattiin. Meidän käsissämme, kun 1,5 x 10

6, 3 x 10

6 ja 5 x 10

6 Capan-1-solut injektoidaan karvattomia hiiriä kuoli veritulppien muodostumista, johtunee Capan-1 koko ja yhdistäminen kapasiteettia. Injektio 1 x 10

6 Capan-1-solut eivät muodostaneet emboli ja syntyy pernan kasvaimia, vaikka ilman metastaattisen keskittyy. Koska MDAPanc-28-solut ovat 4-5 kertaa pienempi kuin Capan-1-solut, 7 x 10

6 MDAPanc-28-soluja injektoitiin intrasplenically nude-hiiriin, mikä syntyy pieni makroskooppinen metastaattisen keskittyy 2/3 hiiristä, 20 -22 viikkoa myöhemmin. Siksi MP ja M34 soluja valittiin tutkimaan vaikutuksen ST3Gal III yli-ilmentymisen etäpesäkkeiden muodostumiseen ja paljaisiin hiiriin selviytymistä. Eksponentiaalisesti kasvavat 7 × 10

6 elinkelpoinen MP ja M34 soluja, jotka jakavat samat rakenteelliset ominaispiirteet, injektoitiin pernassa Kateenkorvattomien nude-hiirten (n = 8 /ryhmä) ja eloonjääminen analyysi suoritettiin käyttäen Kaplan-Meier-menetelmällä ( kuva 6). Hiiret injektoitiin ST3Gal III yliekspressoivat soluja (M34) osoitti suuren laskun eloonjäämisen (

P = 0,019

) verrattuna hiiriin ruiskutettiin ohjaus MP soluihin. Useimmat M34 injektoitu hiiriin (5/8) kuoli 103-110 päivää injektion jälkeen, kun taas MP injektoidaan hiiret selvisivät loppuun tutkimuksen (190 päivää). Kaikki M34 injektoitu hiiriin ruumiinavaus ja analyysi osoitti, perna kasvaimia 62,5% heistä (5/8) ja useita makroskooppinen metastaattinen keskittyy ja suolen, kalvo, munuais-, hermosolmuun tai lisämunuainen 75% hiiristä (6/8) . Kaikki MP pistetään hiiriä ruumiinavaus (päivinä 103, 138, 161 ja 190 injektion) ja yksikään niistä (8/8) ilmeni merkkejä joko pernan kasvaimia tai makroskooppinen etäpesäkkeitä. Siten yliekspressio ST3Gal III MDAPanc-28-solut, jotka johtavat korkeampaan ilmaus SLE

x ja suurempi tarttuvuus ja muuttoliike, voidaan suoraan korreloi lasku selviytymisen kun pistetään nude-hiirissä. Lisäksi se jolla solut suurempi kasvaimen muodostumisen valmiudet ja metastaattista potentiaalia intrasplenically pistetään.

Solut (7 x 10

6) on intrasplenically injektoitiin paljaisiin hiiriin päivänä 1 kokeen. Hiiriä päivittäin tutkittiin ja tapettiin, kun he näyttivät sairas. Erot ryhmien välillä arvioitiin pitkän rank-testiä (

P

= 0,019; n = 7-8 /ryhmä).

Keskustelu

aiemmin tutkimukset osoittivat, että alfa-2,3- sialyylitransferaasitoimintaa korreloi sialyyli-Lewis-antigeenin ilmentymisen haimasyöpä solujen pinnalla [24]. Olemme siinä laajentaneet tutkimuksia nimenomaan tutkia mekanistinen roolia ST3Gal III hankinnassa liiman, muuttavien ja metastaattisen valmiuksia haiman adenokarsinooma syöpäsolun linjat. Olemme havainneet, että: 1) ST3Gal III mRNA ekspressiotasoja korreloi SLE

x pinta ilmaisu; 2) ST3Gal III aiheuttama sialyloituminen lisääntynyt haimasyövän tarttuvuus rh-E-selektiini ja IL1-β pre stimuloimaa HSE solujen kautta SLE

x-E-selektiini vuorovaikutus; 3) positiivinen korrelaatio muuttoliikkeen ja ST3Gal III ja SLE

x ilmaisu; ja 4) pernansisäistä injektio ST3Gal III yliekspressoivien solulinjoja kateenkorvattomissa nude-hiirissä indusoi kasvua tuumorigeneesiä ja vähentää eloonjäämisen.

ST3Gal III yliekspressoivat klooneja (C31, C32, M33 ja M34) näkyvät kasvu SLE

x ilmentymisen verrattuna vastaavaan kontrolleihin (transfektoimattomat solut, Capan-1 ja MDAPanc-28, ja jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla, CP ja MP). Vaikka tyypin I substraattia pidetään ST3Gal III edullista akseptorin, tyypin II substraatti on myös hyvä vastaanottaja. Entsymaattinen suoritetut tutkimukset karakterisoimiseksi ST3Gal III aktiivisuus osoitti, että tyypin I ja tyypin II hyväksyjä alustoille johtivat melko samanlainen V

max arvot, kun taas K

m-arvot olivat paljon suuremmat tyypin II. Tämän seurauksena sisällyttäminen hinnat olivat noin kaksi kertaa I-tyypin kuin tyypin II rakenteissa [31]. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myöhemmissä teoksissa opiskelusta luonnollinen [32], [33] tai synteettisiä vastaanottajia erityispiirteet [34], [35], [36], [37], [38]. Kun otetaan huomioon, että solulinjat tässä tutkimuksessa käytetyt ei ilmaista tyypin I Lewis antigeenejä ja että ST3Gal III voi toimia sekä tyypin I ja II alustoille, yliekspressio ST3Gal III toimi tyypin II lähtöaineiden johtaa lisääntyneeseen ilmaus SLE

x. Äskettäin ja yhteisymmärryksessä tuloksemme, se on kuvattu, että yliekspressio ST3Gal III ruoansulatuskanavan karsinooman soluissa johti myös SLE

x tekijä kasvua [39]. Lisäksi nämä kirjoittajat kuvattu, että mRNA-tasot ST3Gal III korreloi lisääntyneeseen SLE

x ekspressiotasot konfluentteja soluja, mutta ei mRNA: n kanssa tasot ST3Gal IV ja ST3Gal VI, jotka ovat entsyymejä, jotka on raportoitu toimivan valikoivasti on tyypin II ketjuja. Yhdessä nämä tiedot vahvistavat asemaa ST3Gal III biosynteesissä SLE

x näissä karsinoomasoluja. Yhdessä SLE

x nousu, lasku α2,6-siaalihapon havaittiin molemmissa malleissa. Lisäksi C31 ja C32 oli täydellinen menetys kuin sialyloiduilla tyypin II Lewis antigeenejä (Le

x, H2 ja Le

y). Nämä tulokset ovat todennäköisesti selittää useita entsymaattisia kilpailu tyypin II ketjujen. Yhtäältä oli kilpailu alfa-1,2-fukosyylitransferaaseja, alfa-1,3 (4) fukosyylitransferaasit ja alfa-2,3-sialyylitransferaaseista [23], [40], [41], ja toisaalta välillä alfa-2,3-sialyylitransferaaseista ja alfa-2,6-sialyylitransferaaseista [6], [31], [42].

molekyylitason mekanismit säätelevät haiman tuumorietäpesäke tunnetaan edelleen huonosti. Yksi ratkaiseva askel on kiinnitys kasvainsolujen aktivoitu endoteelisoluihin, mikä edellyttää niiden tarttumisen endoteelisoluihin selektiinit, jotka tunnistavat oligosakkaridi determinantteja ilmentyy syöpäsoluissa pinnalle. SLE

x on raportoitu osallistua ensimmäisten vaiheiden ekstravasaation vuorovaikutuksessa E-Selectin helpottamalla liikkuvan ja kiinnitys syöpäsolujen endoteelisoluihin [27], [28], [43], [44 ], [45]. Suora korrelaatio ST3Gal III tasossa, SLE

x tasoilla ja paksusuolen syövän soluadheesiota IL-1β aktivoitujen ihmisen napalaskimon endoteelisolujen (HUVEC) on kuvattu [46]. SLE

x ilmentävien koolonkarsinoomasoluissa on myös raportoitu kiinni maksan sinimuotoista endoteelisolujen kautta E-selektiini-SLE

x vuorovaikutusta [47]. Lisäksi useita teoksia raportoitu korrelaatio SLE

x, ja tartunta sytokiinien stimuloi HUVEC H7721 maksasyöpä [48], [49], [50], [51] ja keuhkojen adenokarsinoomasolua [52]. Suostumuksella nämä tiedot, tuloksemme osoittivat suoraa korrelaatiota haiman adenokarsinooma tarttuvuus

in vitro

rh-E-selektiinin ja ST3Gal III tasot haimasyöpäkasvainsoluissa kautta SLE

x. Lisäksi tutkittaessa adheesion haiman adenokarsinooma solujen maksan sinimuotoista endoteelisolujen, ST3Gal III ja SLE

x yli-ilmentävät C31 solut osoittivat parannettu kyky kiinnittyä IL-1β stimuloitujen HSE soluissa verrattuna kontrolleihin. HSE solu esikäsittelyyn, jossa IL1-β: n ja TNF-α sytokiinien huomattavasti Capan-1 soluadheesion HSE soluihin ja palasi perustasoille anti-E-selektiinin esi-inkuboitiin HSE soluja. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiempien työn raportoivat, että E-selektiinin ilmentyminen on alhainen tai puuttuu HSE soluissa normaaliolosuhteissa, mutta voi olla jopa-säätelee sytokiinien [53], hepatosyyttien [54] tai vastauksena etäpesäkekasvainkudoksen soluihin [ ,,,0],55]. Tarttuvuus ST3Gal III ja SLE

x yli-ilmentävät C31-solujen ei-stimuloitujen HSE-soluissa oli merkittävästi suurempi verrattuna kontrollisoluihin Capan-1 ja CP. Tämä adheesio ei palautunut, kun esi-inkuboimalla HSE-solujen anti-E-selektiini, joka voidaan selittää ei-E-selektiinin riippuvainen, mutta SLE

x-välitteisen, haimasyöpä soluadheesiota ei-stimuloitujen HSE soluissa . Tämä vuorovaikutus voi välittää muiden SLE

x sitova soluadheesiomolekyylit, kuten P-selektiinin [55], [56], tai I-tyypin lektiinejä. Itse asiassa, aikaisemmassa tutkimuksessa raportoitiin sitoutumisen ST3Gal III yli-ilmentävät paksusuolen syövän soluja ei-aktivoidun HUVEC, mikä viittaa siihen, tämä ei-E-selektiinin riippuvainen SLE

x välittämä adheesio voi johtua I-tyypin lektiinien [46].

Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti positiivinen korrelaatio solujen vaeltamiseen ja ST3Gal III ja SLE

x ekspressiotasot haiman adenokarsinooma soluissa. Puuttumisesta huolimatta tutkimusten haimasyöpäsoluissa, jotkut tutkimukset tukevat havainnot. Kun kasvain solun pinnan α2,3-siaalihapon ilme MDA-MB-231 rintasyövän solulinjan masentunut (estämällä solujen α2,3-sialyylitransferaasitoimintaa kanssa soyasaponin I), solumigraation merkittävästi vähentynyt [57]. ST3Gal III yli-ilmentyminen on glioomasolulinjaa U-374 lisäsi α2,3 sidottu siaalihapon ilmentymisen solun pinnalla ja johti enemmän

in vitro

invasiivisia fenotyyppi [58]. Lisäksi H7721 maksasyöpä solut osoittivat suoraa korrelaatiota määrän pinta SLE

x ilmaisun ja muuttoliike [50], [51], [59]. Lisäksi SLE

x oli ratkaiseva H7721 muuttoliikettä, koska muuttoliike estyi anti-SLE

x MAb ja jälkeen sialihappotähteen poistamista [60]. Solumigraation on monivaiheinen prosessi, joka on keskeinen rooli etäpesäkkeitä. Alkuperäinen vastaus muuttavien solujen Siirron edistävää ainetta on polarisoituvan ja laajentamaan ulokkeita. Nämä ulokkeet stabiloidaan soluväliaineen adheesiomolekyylien, kuten integriinit, ja toimivat veto sivustoja maahanmuuton kuin solu liikkuu eteenpäin päälle [61]. On nopeasti kasvava määrä todisteita, jotka osoittavat, että sialyloituminen vaikutteita muuttoliike ominaisuuksia säätelemällä integriinifunktiota [58], [62], [63], [64]. Täten oletamme, että ST3Gal III voitaisiin vaikutetaan solujen muuttoliikettä muuttamalla integriinin sialylaatio-. Lisääntyminen α2,3-siaalihapon C31 ja M34 solun pinnan voisivat myös muuttaa sialylointia tasoja niiden integriinien, muuttaakseen niiden soluväliaineen tarttuvuus.