Krooninen sairaus

tiivistelmä

On yleisesti hyväksyttyä, että useimmat kolorektaalisyövissä (CRC) syntyvät peräsuolen adenoomien (luottoluokituslaitosten), mutta transcriptomic ominaista dataa etenemistä peräsuolen normaali limakalvo on adenooma, ja sitten adenokarsinooma ovat niukkoja. Nämä siirtyminen vaiheet tutkittiin käyttäen mikrosiruja, sekä tasolla geenin ilmentymisen ja vaihtoehtoisia pre-mRNA: n silmukoinnin. Monet geenit ja eksonit epätavallisen ilmaistu luottoluokituslaitosten, jopa enemmän kuin CRC, verrattuna normaaliin limakalvoille. Tunnetut biologisia reittejä mukana CRC muutettiin vuonna CRA, mutta useita uusia rikastettu reittejä myös tunnustettu, kuten komplementin ja hyytymisen porrastetusti. Havaitsimme myös neljä intersektionaalista transkription allekirjoituksia, jotka erottaisivat luottoluokituslaitokset normaaleista limakalvoja tai CRC, joka sisältää allekirjoituksen 40 geenien differentiaalisesti vapautettiin sekä CRA ja CRC näytteitä. Suurin osa näistä geeneistä oli kuvattu eri syöpiä, kuten

FBLN1

tai

INHBA

, mutta vain muutama CRC. Useat näistä muutoksista havaittiin myös proteiinitasolla. Lisäksi, 20% näistä geeneistä (

eli CFH

,

CRYAB

,

DPT

,

FBLN1

,

ITIH5

,

NR3C2

,

SLIT3

ja

TIMP1

) osoitti muuttunut ennalta mRNA in luottoluokituslaitokset. Koska maailmanlaajuinen vaihtelu esiintyvä koska CRA vaiheessa ja ylläpidetään CRC, ilmaisun ja silmukoinnin muutokset tämän 40-geeni joukko voi merkitä syöpäriskiä esiintymisen analyysistä CRA koepaloja.

Citation: Pesson M, Volant A, Uguen A Trillet K, De La Grange P, Aubry M, et al. (2014) geeniekspressiovektoria ja Pre-mRNA Signature joka merkitsee adenooma-adenokarsinooma Progression in peräsuolen syövän. PLoS ONE 9 (2): e87761. doi: 10,1371 /journal.pone.0087761

Editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 syyskuu 2013; Hyväksytty: 30 joulukuu 2013; Julkaistu: 06 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Pesson et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoittajat Inserm, Brest University, Brest University sairaala Cancéropole Grand Ouest, Ligue contre le Cancer, OSEO – BioIntelligence Program, ARC, ja Bretagne. MP oli vastaanottaja apurahan alueelta Bretagne. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmistä syövistä kehittyneissä maissa, ja on suuri johtava syy syövän liittyvän kuolleisuuden maailmanlaajuisesti. Yleisin tyyppi CRC on adenokarsinooma ( 95%), joka on invasiivinen kasvain rauhas epiteelin paksusuolen tai peräsuolen. On hyväksytty, että adenokarsinooman voi todennäköisesti aiheutua peräsuolen adenoomien (luottoluokituslaitosten), kuten päätellä tietyn fenotyypin ominaisuuksia, kuten kokoa ja histologia.

peräsuolileesiot luokitellaan tähystys ei-polypoid (flat) ja polypoid, jotka erotellaan putkimainen, tubulovillous tai villous, eri laatuja dysplasia. Luottoluokituslaitoksia usein kutsutaan adenomatoottisia polyyppejä, jotka edustavat leesiot useimmin liittyvät neoplastisten tuloksista, ja se osoittaa, että niiden poistaminen liittyi lasku ilmaantuvuus CRC [1]. Vaikka putkimainen adenoomia ovat yleisimpiä, villous adenoomia ovat vähiten usein, mutta ne voivat muuntua syövän suurella taajuudella [2]. Lisäksi potilaille, joilla useita polyyppien oli adenoomia kehittyneitä patologisia piirteitä [3].

Useat kuljettajan mutaatioita on todettu etenemistä CRA CRC [4], yhdessä muiden molekyylien tapahtumia, kuten microRNA modulaatio [5] tai pre-mRNA: n silmukoinnin muutoksiin [6]. Lisäksi useat geeniekspressioprofiilit on raportoitu CRC [7], [8]. Joissakin tutkimuksissa tutkittiin myös geeniekspression CRA, ja analysoitiin sukujuuret CRC [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Kuitenkin, useimmat analyysit suoritetaan rajoitetun määrän CRA näytteitä. Lisäksi vain harvat tutkimukset ovat tarkastelleet genominlaajuisia vaihtoehto pre-mRNA profiilit CRA näytteiden [15] ja niiden suhteesta CRC, vaikka vaihtoehtoisen silmukoinnin tapahtuu arviolta 90% geenien ihmisen genomin [16] kantavassa tutkimuksen tavoitteena oli analysoida, jossa mikrosiruja, geenien ilmentyminen ja vaihtoehtoisen silmukoinnin luottoluokituslaitosten, verrattuna normaaliin limakalvoja, mutta myös CRC. Raportoimme tässä kattavan kuvan muutokset tapahtuneet luottoluokituslaitosten, joista osa oli spesifinen luottoluokituslaitosten, kun taas toiset olivat jaettu CRC. Mikä tärkeintä, tunnistimme 40-geenin set (32 alas- ja 8 ylös geenien), peräisin intersektionaalista analyysin side-by-side vertailuja, kun otetaan huomioon normaali limakalvoille, luottoluokituslaitosten ja CRC, jotka voisivat merkitä tärkeimmät sääntelyyn tapahtumasarjasta, vaiheittainen eteneminen kolorektaalisyövässä.

Materiaalit ja menetelmät

kudosnäyte Processing

kirjallinen lupa muodossa laadittiin yhdessä eettisen komitean Brestin yliopistollisen sairaalan (johtama Pr . JM Boles). Potilaat allekirjoitettu lomake, joka palautettiin anatomia ja patologia osasto Brest University Hospital. Näin ollen tämä tutkimus hyväksyi eettinen komitea Brestin yliopistollisen sairaalan. Paksusuolen tai peräsuolen biopsia näytteet saatiin kirurgisen poiston jälkeen. Näytteet käsitellään sitten anonyymisti. Kudos-biotekniikan koepalat varastoitu RNAlater (Ambion, Ranska): 55 Luottoluokituslaitokset, 25 CRC ja 27 peräsuolen normaalin limakalvon (NOR; pariksi luottoluokituslaitosten tai CRC) kerättiin vuosien 2006 ja 2012, suurin vuodesta 2009. CRA tai CRC koepaloja, pinta-fragmentti kerättiin kasvaimen alueelle, joka käsittää keskimäärin 90% kasvainsoluja, 5% lymfosyyttejä ja 5% stroomasoluissa. Nämä prosenttiluvut olivat hyvin homogeeninen toisistaan ​​riippumattomien näytteiden. Kolme alaryhmää (A1, A2 ja A3) luottoluokituslaitosten voitaisiin erotella histologinen data. Yksityiskohtaiset potilastiedot on esitetty taulukossa 1 ja taulukossa S1. DNA ja kokonais-RNA uutettiin kanssa AllPrep DNA /RNA Mini Kit (Qiagen, COURTABOEUF, Ranska) homogenoidusta kudosnäytteistä (20 mg), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA puhtaus ja eheys määritettiin mittaamalla optinen tiheys suhde (A260 /A280) ja RNA eheyden numero (RIN) saatiin käyttäen RNA 6000 Nano LabChip (Agilent, Massy, ​​Ranska) ja 2100 Bioanalyzer (Agilent). Vain RNA-näytteet, joiden 28S /18S-suhde 1,0 ja RIN ≥7.0 käytettiin microarray analyyseja.

Whole-Genome Microarray

analyysi 55 RNA-näytteet ovat peräisin peräsuolen kudos, joka koostuu kolmesta näytteestä ryhmää (NOR, CRA ja CRC) vaihteleva määrä biologisia rinnakkaisnäytteiden suoritettiin 44k koko ihmisen genomista mikrosiruja (Agilent), jotka sisältävät 41093 antureista, joka tarjoaa täyden kattavuuden ihmisten selostukset. Kaksijuosteinen cDNA syntetisoitiin 500 ng kokonais-RNA: Quick Amp Labeling Kit, yksivärinen, kuten valmistajan ohjeiden mukaisesti (Agilent). Leimausta cyanine3-CTP, pirstoutuminen cRNA, hybridisaatio ja pesu suoritettiin mukaan valmistajan ohjeiden (Agilent). Mikrosiruissa skannattiin ja tiedot uutettiin Agilent Feature Extraction Software.

geeniekspressioanalyysissä

Raaka geenien ilmentyminen tietoja tuotiin GeneSpring GX 11.0.2 ohjelma (Agilent). Side-by-side vertailu tehtiin geenien ilmentymisen muutoksia: CRC

vs.

Pariksi NOR, CRA

vs.

NOR, ja CRC

vs.

CRA. Geenejä puuttuvat arvot yli 25% näytteistä jätettiin pois analyysistä. Nämä tiedot on talletettu NCBI: n Gene Expression Omnibus ja pääsee läpi GEO Sarja liittymisen numerot GSE50114, GSE50115 ja GSE50117. A2-kertainen cut-off ero levitettiin valita ylä- ja alas geenien (P-arvo ≤0.01 by

t

-testi kanssa Benjamini-Hochberg vääriä löytö korko, FDR). Hierarkkinen klusterointi ilmaisun tietojen suoritettiin käyttäen Euklidinen etäisyys keskimääräinen sidoksen.

Gene Set rikastus Analysis

julkisesti saatavilla ohjelmisto, tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery [17], käytettiin analysoida geeniperimä rikastumisen peräsuolen vaurioita. A2-kertainen cut-off ero levitettiin valita luettelon vapautettu geenien (P-arvo ≤0.01 by

t

-testi kanssa FDR). Vain polkuja Kioton Encyclopedia of Genes and Genomit (Kegg) kuvataan [18].

Alternative Jatkaminen Analysis

yhdistettiin RNA, analysoitiin kahtena kappaleena, 3 peräsuolen normaalista limakalvoja ja 24 CRA RNA-näytteet analysoitiin ihmisen eksoni 1.0 ST paneelit (Affymetrix, Pariisi, Ranska), joka mahdollisti analyysi sekä geenien ilmentymisen ja vaihtoehtoisen silmukoinnin. Microarray Hybridisaatio suoritettiin Curie Institute laitos (Pariisi, Ranska). Raakadata analysoitiin GenoSplice tekniikkaa. Nämä tiedot ovat käytettävissä GEO Sarjan hakunumero GSE50592. 1,5-kertainen cut-off ero levitettiin valita ylä- ja alas geenien ja eksonit (P-arvo ≤0.05).

reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio Validation

validointi askel mikrosi- tulosten kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin kolmeen ryhmään (NOR, CRA ja CRC) on vähintään 8 näytettä, joista osa näytteistä hybridisoitui päälle mikrosiruja, tai riippumaton sarja 14 luottoluokituslaitosten ja 8 pariksi kasvain Normaalissa CRC näytteitä. Kokonais-RNA (200 ng) käytettiin ensimmäisen juosteen cDNA-synteesin kanssa High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin käyttäen Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) mukaan valmistajan ohjeiden ABI 7000 tai 7300 reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Applied Biosystems). Kaikki määritykset suoritettiin kahtena kappaleena ja normalisoitu vastaan ​​

beta

-2-mikroglobuliini sisäisenä kontrollina geeni. Tulokset ilmaistiin suhteellisena geenin ilmentymisen käyttäen ΔΔCt menetelmällä [19]. Kaikilla testatuilla geeneistä valittiin perustuen microarray analyyseja, jotta vahvistaa biologisen reitin rikastamiseen ja geenin allekirjoituksen luottoluokituslaitokset ja CRC. Alukesekvenssejä ja reaktio-olosuhteet annetaan pyynnöstä. Lisäksi PCR array setup (Qiagen) käytettiin analysoimaan NOR ja CRC näytteiden geenien ilmentymistä alukkeilla läsnä joukossa PCR array monikuoppalevyihin (Apoptosis, Cancer Pathway Finder, Drug Metabolism, lipoproteiini Signaling ja kolesteroliaineenvaihduntaa,

Wnt

signalointireitin).

tulokset

vertailu suolen kasvainten Morfologiset Alaryhmät

Useat mutaatiostatuksesta maamerkkejä on kuvattu etenemisen peräsuolen syöpä, kuten kuten

KRAS

,

BRAF

ja

PI3K

mutaatioita [4], [20], ja analysoitiin meidän näytteitä (tukeminen Information). Lisäksi mikrosatelliittimerkki epävakaus tila (tukeminen Information) määritettiin 12 CRA näytteissä, mutta kaikki olivat negatiivisia. Wienin luokitus annettiin ryhmään adenoomia kahteen luokkaan: pieni ryhmä alemman luokan (3) 11 (22%) näytteistä ja merkittävä ryhmä 40 (78%) näytteistä korkeampiluokkaisiin ( 3) (taulukko S1) . Tämä luokitus ei täsmää putkimaisen /villous /tubulovillous vaurio tyyppejä, koska luottoluokituslaitokset sekä huono laatu ja korkealuokkaisesta dysplasia oli tasaisesti jakautunut osaksi tubullovillous ja putkimainen ryhmät (vain yksi CRA oli kotoisin villous tyyppi). Tällä erotuksella putki-, villous tai tubulovillous ei näin ollen hyväksytty. Päätimme luottaa tarkka morfologia analyysi ja soveltaa anatominen ryhmittymä, joka johti eron kolmen morfologiset alaryhmään: adenoomia alueet mikro-invasiivisen adenokarsinoomat (A1; 10 näytettä), degeneroitunut adenoomia,

eli

. adenoomia, joissa alueet

in situ

(sisäinen limakalvon) adenokarsinoomat (A2, 17 näytettä), ja adenoomia alueet dysplasian (A3, 24 näytettä). Sen määrittämiseksi, mikäli luottoluokituslaitosten voidaan myös erottaa molekyylipainon avulla, yksisuuntainen ANOVA suoritettiin vertaamaan CRA alaryhmiä CRC ja NOR ryhmät, jossa ”kudoksen tyyppi”, kuten ANOVA tekijä (tuloksia ei ole esitetty). Analyysi paljasti, että viestintävirasto alaryhmät olivat hyvin lähellä toisiaan. Ei ollut eroa alaryhmien A2 ja A3, ja enimmäismäärä vapautettu koettimia havaittiin alaryhmä A1

vs

. alaryhmä A2 vertailu (49 koettimia, jotka vastaavat 0,12% kokonaismäärästä koettimia, P-arvo ≤0.01). Lisäksi vaikka vertailuja CRA alaryhmien ja normaali limakalvojen osoitti Eniten erottuva antureista (jopa 4382 antureista alaryhmäanalyyseissa A2

vs

. NOR), väliset vertailut CRA alaryhmien ja CRC osoitti pienin (enintään 1424 koettimet CRC

vs

. alaryhmä A2). Luottoluokituslaitokset kokonaisuudessaan oli siis enemmän eroaa normaalista limakalvoille kuin maasta CRC. Kolme CRA alaryhmää verrattiin myös toisiinsa, ja eroa ei havaittu side-by-side vertailu (P-arvo ≤0.01 mukaan

t

-testi kanssa FDR). Sen vuoksi luottoluokituslaitokset katsottiin kollektiivisesti yhtenä ryhmänä edelleen side-by-side vertailu Studentin

t

-testissä.

geeniekspressioprofilointi in peräsuolileesiot verrattuna Normal limakalvoja

jotta voitaisiin tunnistaa geenejä, jotka voisivat osallistua etenemistä normaalista limakalvosta CRA, teimme CRA

vs

. NOR vertailua, ja havaitsi, että 2393 koettimet vapautettiin luottoluokituslaitokset (≥2.0 fold-muutos (FC), P-arvo ≤0.01 mukaan

t

-testi kanssa FDR), mikä vastaa 32%: ylä- ja 68 % alas-asetuksia. CRC

vs

. NOR vertailu osoitti, että 1805 koettimet vapautettiin CRC (≥2.0 FC, P-arvo ≤0.01 by pariksi

t

-testi kanssa FDR), mikä vastaa 46%: ylä- ja 54% alas-asetuksia. Lämpöä kartat vapailla koettimien kanssa kertamuutosta ≥3.0 ja P-arvo ≤0.001 on esitetty kuvioissa 1A (CRA

vs

. NOR) ja 1B (CRC

vs

. NOR), ja kuvio S1 (CRA

vs

. NOR, täysi kuva). Täydellinen luettelo niistä ilmentyvät eri koettimet CRA

vs

. NOR ja CRC

vs

. NOR esitetään taulukoissa S2 ja S3, vastaavasti. Joukko vapauttamisen tapahtumista CRA

vs

. NOR analysoitiin kvantitatiivisen RT-PCR, ja validointi nopeudella Agilent microarray tuloksesta oli 78% (50 ulos 64 selostukset; Taulukko S4). Lisäksi Qiagen PCR array kokeet suoritettiin riippumaton sarja 96 CRC ja 20 NOR näytettä (Brest kasvain pankki). Niistä vapautettiin koettimet CRC

vs

. NOR on mikrosirut, 41 alukeparit vastaavat samat geenit, jotka olivat läsnä PCR paneelit. Kaksikymmentäkahdeksan myös vapautettiin PCR paneelit (≥2.0 FC, P-arvo ≤0.01), mikä vastaa 68% rajat validointi (taulukko S5).

Lämpöä kartta ekspressiotietojen rakennettiin käyttäen Euklidinen matkan keskimääräinen sidos. Lämpöä kartta vapailla koettimien kanssa kertamuutosta ≥3.0 ja P-arvo ≤0.001 on esitetty CRA

vs

. NOR (A; täydellinen lämpö kartta kuviossa S1), CRC

vs

. NOR (B), ja CRC

vs

. CRA (C).

Luottoluokituslaitos

vs

. NOR vertailu osoitti enemmän eroja kuin CRC

vs

. NOR vertailua, ja siellä oli enemmän alas-asetukset (68% vuonna CRA

vs

. 54% vuonna CRC) kuin ylös-asetukset (32% vuonna CRA

vs

. 46% CRC) . Intersektionaalista analyysi koetin tason muutokset suoritettiin (kuvio 2A), mikä allekirjoitus 954 antureista vapautettiin sekä CRA ja CRC näytteitä verrattuna normaaliin limakalvoille (taulukko S6 ja kuvio S2), mikä vastaa 40% ja 53% vapautettiin koettimina CRA ja CRC, vastaavasti. Kaikki yleisesti vapautettu antureista seurasi samantyyppistä vaihtelua sekä vertailuja,

ts.

Oli ylä- tai alassäädetty samoin.

intersektionaalista analyysi koetin tason muutoksia tehtiin. Cut-off-arvot olivat P-arvo ≤0.01 ja kertamuutosta ≥2. CRA

vs

. NOR Vertailu osoitti eniten koetin tasoeroja (2393 vapautettu antureista), kun taas CRC

vs

. CRA vertailu osoitti pienin (669 vapautettu antureista). Koettimet, jotka osoittivat muutoksia kahdessa tai kolmessa vertailussa oli kiinnostava. (A) allekirjoitus 954 antureista vapautettiin sekä CRA ja CRC vaurioita verrattuna NOR. (B) allekirjoitus 172 antureista vapautettiin CRC verrattuna sekä CRA ja NOR. (C) allekirjoitus 265 antureista vapautettiin CRC verrattuna CRA, jotka tasot olivat jo epänormaalia CRA verrattuna NOR. (D) allekirjoitus 44 antureista osoittaa muutoksia kolmessa vertailuissa (CRA

vs

. NOR, CRC

vs

. CRA ja CRC

vs

. NOR). Lyhenteet: NOR: peräsuolen normaali limakalvo; CRA: suolen kasvainten; CRC: peräsuolen syövän.

Pathway Väkevöittäminen peräsuolileesiot verrattuna Normaali limakalvojen

Kegg koulutusjakson analyysi osoitti 25-geenin erilaista erottaa CRA päässä NOR, ja 20 erottaa CRC NOR ( P-arvo ≤0.05; taulukko 2), kun otetaan huomioon vapautettu antureista, joissa on 2-kertainen cut-off (P-arvo ≤0.01 by

t

-testi kanssa FDR). Komplementin ja hyytymistä kaskadeja, sytokiini-sytokiinireseptorin vuorovaikutus, ja kemokiinin signalointireitteihin olivat kärjessä rikastetun koulutusjaksojen CRA

vs

. NOR, kun taas solusyklin ja DNA-replikaatioon olivat reittejä eniten vaikuttaa CRC

vs

. NOR mukaan P-arvo. Seitsemän reittejä rikastuneet sekä CRA

vs

. NOR ja CRC

vs

. NOR vertailuja, joista p53 signalointireitille oli osa jo kuvattu rikastettua reittejä CRA [14]. Typpiaineenvaihdunnan oli myös yleisesti rikastettu reitin molempien analyysien, sisältäen karbonianhydraasien (

CA1

ja

CA4

), jotka olivat osa kaikkein alassäädetty koettimet CRA ja CRC.

Jos 1,1-kertainen cut-off ero sijasta 2,0 sovellettiin valita vapautuneilla koettimia (P-arvo ≤0.01),

eli

. jos kaikki vapautettu koettimet pidettiin (5 733 antureista), 18 geeni asetetaan sen sijaan 25 muutettiin vuonna CRA

vs

. NOR mukaan Kegg (P-arvo ≤0.05; taulukko S7). Vain täydennys ja hyytymistä laskeutuu polku oli yleistä välillä sekä 18 ja 25 geeniä luetteloita. Siksi 17 uusia polkuja rikastuneet viestintävirasto, kuten DNA: n kahdentuminen, solusyklin, silmukointiyksikkövälitteiseen tai yhteensopimattomuuden korjauksen.

geeniekspressioprofilointi peräsuolen adenokarsinooman Vertailu peräsuolen adenoomien

analyysi differentiaalisesti havaittu antureista välillä CRC ja CRA tunnistettu 669 vapautettu antureista (≥2.0 FC, P-arvo ≤0.01 mukaan

t

-testi kanssa FDR), mikä vastaa 55% ylä- ja 45% alas-asetuksia. Lämpöä kartta vapailla koettimien kanssa kertamuutosta ≥3.0 ja P-arvo ≤0.001 on esitetty kuvassa 1C. Täydellinen luettelo ero anturi signaalien CRC

vs

. CRA on esitetty taulukossa S8. CRC

vs

. CRA Vertailu osoitti vähemmän koetin tasoeroja paljon pienemmillä taitettava muutoksia kuin CRC

vs

. NOR ja CRA

vs

. NOR vertailuja. Leikkausviiva analyysi koetin signaaleja osoitti allekirjoitus 172 antureista vapautettiin CRC verrattuna sekä CRA ja NOR näytteet (kuvio 2B, taulukko S9 ja kuvio S3), mikä vastaa 26% vapautettiin koettimet CRC

vs

. CRA, ja alle 10% vapautuneilla koettimet CRC

vs

. NOR. Koska nämä muutokset eivät olleet läsnä viestintävirasto, ne voisivat olla markkereita CRC aggressiivisuus.

Pathway Väkevöittäminen Peräsuolen adenokarsinooman Vertailu peräsuolen adenoomien

Kegg koulutusjakson analyysi paljasti viisi geenin sarjaa erottaa CRC CRA (P-arvo ≤0.05; taulukko 2), harkitsee vapautettu antureista, joissa on 2-kertainen cut-off (P-arvo ≤0.01 by

t

-testi kanssa FDR). Kaksi rikastettua väyliä olivat spesifisiä CRC

vs

. CRA vertailu: arginiini ja proliini aineenvaihduntaa, ja TGF-

beta

signalointireitin, joka on jo kuvattu muuttuneessa polku välillä CRA ja CRC [9]. Lisäksi CRA

vs

. NOR ja CRC

vs

. CRA vertailuissa oli kolme yleisesti rikastettu reittejä, joista fokaalisen adheesion ja ECM-reseptori vuorovaikutus olivat osa jo raportoitu reittejä rikastunut paksusuolen syövän synnyn [21]. Nämä toteutustavat voisi olla tärkeä rooli etenemistä CRC, koska ne rikastettiin NOR CRA, ja sitten CRA CRC.

Intermediate allekirjoitus etenemistä suolen kasvainten ja peräsuolen adenokarsinooma

todisteet etenemistä NOR CRA, ja sitten CRC, tutkittiin jossa intersektionaalista analyysi koetin tason muutoksia. Allekirjoitus 265 antureista, jotka vastaavat 215 geenit, tunnistettiin (kuvio 2C, Taulukko S10 ja kuvio S4), joka oli sattumaa vuonna luettelot 2393 ja 669 vapautettu antureista, joka vastaa CRA

vs

. NOR ja CRC

vs

. CRA vertailuja, vastaavasti. Se sisältyy vapautuneilla koettimet CRC

vs

. CRA, jotka olivat jo erillisiä viestintävirasto

vs

. NOR-analyysi. Jakaumia ylä- ja alassäädetty tapahtumia CRC

vs

. CRA olivat 69% ja 31%, vastaavasti. Rikastuminen analyysi allekirjoittamisen 265 antureista suoritettiin käyttäen Kegg reittejä, ja kävi ilmi, että 41 geenit olivat osa kahdeksan rikastettua geenin sarjaa, kuten polttoväli tarttuvuus, ECM-reseptorin vuorovaikutus tai TGF

beta

signalointireittiin (taulukko S11). Lisäksi väli- geenien ilmentyminen allekirjoitus 44 antureista (vastaten 40 geenejä) tunnistettiin (kuvio 2D ja taulukko 3), joka oli sattumaa kolmessa luettelot vapautetuilla antureista, ja sitten oli osa kaikista allekirjoituksista, että me aiemmin on kuvattu (allekirjoitukset 954, 172 ja 265 antureista). Se vastasi 8 ylä- ja 32 alas geenien sekä CRA ja CRC näytteitä, verrattuna normaaliin limakalvoille. Kahdeksan antureista osoitti progressiivisesti lisääntynyt signaaleja NOR CRA, ja sitten CRC; 23 antureista paljasti alennetaan asteittain signaaleja. Lisäksi 13 koettimia vähemmän tukahdutettiin CRC kuin viestintävirasto, verrattuna NOR.

luokittelu peräsuolen adenoomia verrattuna Normal limakalvoja ja peräsuolen adenokarsinoomista

luokittelu paksusuolen ja peräsuolen kudoksiin suoritettiin käyttäen hierarkkinen ryhmittely koettimen signaalin muutoksia, jotka vastaavat neljää allekirjoitukset on aikaisemmin kuvattu. Vain kaksi ryhmää erottuivat harkitsee allekirjoitusta 954 antureista (kuva S2): yksi koostui normaalista limakalvojen ja toinen sisälsi sekoitus peräsuolen haavaumia. Sitä vastoin ryhmittely huomioon allekirjoitus 172 antureista saa erottaa kolmenlaisia ​​peräsuolen kudosten (kuva S3): yksi ryhmä koostunut vain CRC, ja toinen oli jaettu luottoluokituslaitos alaryhmä ja NOR alaryhmä. Samoin klustereiden kanssa allekirjoitus 265 antureista mahdollisuus erottaa kolme näytettä tyyppiä (kuva S4), mutta yksi ryhmä koostunut vain luottoluokituslaitosten ja muut ryhmitelty NOR ja CRC näytteitä, jotka jaettiin kahteen eri alaryhmään. Lopuksi, allekirjoitus 44 antureista osoitti, että suurin osa luottoluokituslaitokset ryhmittyneet kanssa CRC, muutaman luottoluokituslaitosten (näytetään vähiten vaikuttanut histologia) on ryhmitetty NOR näytettä (kuva 3). Suurimmalle osalle näytteistä, ole tiukkaa vastaavuutta välillä histologisia (morfologisia alaryhmiä tai lokalisointi) ja molekyylien tiedot kirjattiin jakelusta luottoluokituslaitosten alaryhmiin. Samoin yksityiskohtien CRC klustereiden eivät selittää kasvainpaikantumisen (taulukko S1). Molecular data voisi siis antaa lisätietoja luokitella peräsuolen haavaumia.

oksat edustavat yksittäisiä peräsuolen näytteitä. Eri värejä käytettiin tunnistamaan näytteen ryhmät: punainen, ryhmä normaalien limakalvojen (N: normaali); vihreä, ryhmä adenoomien (A: adenooma); sininen, ryhmä adenokarsinoomat (C: syöpä). Ensimmäinen näyte huomautusta vastaa näytteen ryhmään. Alaryhmien adenoomien on määritelty: A1, adenoomia alueet mikro-invasiivisen adenokarsinooman; A2, adenoomia alueet sisäisen limakalvon adenokarsinooman; A3, adenoomia alueiden kanssa dysplasia. Toinen näyte huomautusta vastaa näytteen numero.

eksoni-analyysien peräsuolen adenoomien

Luottoluokituslaitos

vs

. NOR vertailu suoritettiin Human eksoni 1.0 ST paneelit (Affymetrix), ja osoitti, että 1484-geenit vapautettiin CRA (590 ylä- ja 894 alas geenien; ≥1.5 FC, P-arvo ≤0.05; Taulukko S12). Vastaava lämpö kartta on esitetty kuviossa S5. Joukko vapautettiin transkriptien CRA

vs

. NOR analysoitiin kvantitatiivisen RT-PCR, ja validointi nopeudella Affymetrix microarray tuloksesta oli 83% (24 29: stä selostukset, myös validoitu Agilent analyysi). Lisäksi viestintävirasto

vs

. NOR vertailu osoitti laajoja muutoksia vaihtoehtoisen silmukoinnin profiilit: 1852 eksonit vapautui vuonna CRA (862 ylä- ja 990 alassäädetty eksonit, ≥1.5 FC, P-arvo ≤0.05; Taulukko S13). Julkisesti saatavilla mikrosiru ekspressiotietojen määrittää 10 pariksi kasvain-normaali CRC näytteet [6] on ladattu Affymetrix verkkosivuilla, jotta voidaan verrata vaihtoehtoisen silmukoinnin profiloinnin CRA ja CRC. CRA

vs

. NOR ja CRC

vs

. NOR vertailuissa oli 100 vapautettiin eksonien yhteistä. Kun taas 47 ylä- ja 47 alassäädetty silmukointitapahtumilla noudatti samaa tyyppiä vaihtelua kaksi vertailua, muutamia määräyksiä oli päinvastainen CRA ja CRC, joka vastaa 6%: yhteistä vapautettu eksonien (tuloksia ei ole esitetty). Olemme havainneet, että 296 vapautettu (102 ylä- ja 194 alassäädetty) koettimina CRA

vs

. NOR päässä Agilent analyysi osoitti vapautuneilla eksonien Affymetrix analyysi (tietoja ei esitetty). Paljon geenejä, jotka olivat osa muuttuneen polkuja oli vapautettu eksonit. Niistä 40 geenit Agilent transkription allekirjoitus 44 antureista, 8 (

CFH

,

CRYAB

,

DPT

,

FBLN1

,

ITIH5

,

NR3C2

,

SLIT3

ja

TIMP1

),

eli

. 20%, oli vapautettu eksonit (taulukko S14).

Keskustelu

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää, milloin koko-transcriptome tason laajuus vaihtelut, jotka tapahtuvat ihmisen peräsuolen adenoomien verrattuna adenokarsinoomat ottaen normaalin epiteelin referenssinä. Monet muutokset olivat nähtävissä CRA

vs

. NOR, jopa enemmän kuin CRC

vs

. NOR. Siten CRA, eräänlaisena välittäjänä vaurio, jo osoitti vahvaa merkkejä muutoksista. Vuodesta molekyylimuutokset osoituksena CRA, on selvää, että luottoluokituslaitokset eivät pelkästään kertyvät muutoksia, jotka kaikki löytyvät CRC. Mahdollisesti evoluution CRC noudattaa tiukemmin kloonilaajenemisen, mikä voi johtaa valita geenien muutosten tärkeää kloonikasvuun samalla poistaa vähemmän merkitystä muutoksia. Tämän hypoteesin, luottoluokituslaitosten voi olla erilaisia ​​tuloksia, jotkut kehittyvä kohti syöpä, kun taas toiset voivat olla alttiita katoaminen. Havaitsimme neljä allekirjoitukset erottaa tyyppisiä peräsuolen kudosten ja osoitti, että 40-geenin joukko voisi olla erityistä merkitystä, merkintä molekyylimuutokset jotka erottavat normaalin limakalvon CRA ja CRC. Tärkeää on useita vaihtoehtoisia pre-mRNA tapahtumat olivat myös ominaisuus CRA CRC etenemiseen.

Useat geenit CRC vapautui vuonna CRA

vs

. NOR. Korkeimmat nousu koetin tasoja

KIA1199

joka oli jo löydetty vapautettiin CRA [22], tai matriksimetalloproteinaasi

MMP7

joka yli-ilmentyminen on tiedetään vaikuttavan aikaisin peräsuolen syövän synnyn [23 ]. Viisitoista geeni asetetaan, kuten osallistuvien sytokiini-sytokiinireseptorien vuorovaikutus, kemokiini signalointireitistä tai soluadheesiomolekyylit, olivat spesifisiä CRA

vs

. NOR. Tärkeää on, useita uusia rikastettua biologisia polkuja tunnistettiin, joista täydennys ja hyytymistä kaskadeja polku oli kaikkein merkittävästi vaikuttanut Agilent analyysiin, ja määriteltiin myös muuttaa Affymetrix analyysi (tuloksia ei esitetty). Tämä sopii tuoreeseen raporttiin viittaa siihen, että komponentteja Hyytymisketjun voisi vaikuttaa syövän etenemiseen [24].

Useita geenejä myös differentiaalisesti ilmaistut CRC

vs

. CRA. Useimmat näistä geeneistä ei ole kuvattu aikaisemmissa microarray tutkimuksissa, vaikka useat muutokset sopivat Aiempien raporttien mukaan lukien vaihtelut ekspressiotasot AMN, THBS2, SPP1 tai TIMP1 [25], [26], [27]. Lisäksi 58 antureista (19 ylä- ja 39 alas-säännelty) päässä CRC

vs

. CRA vertailu olivat listan 248 antureista aiemmin havaittujen [11], mukaan lukien, että

AURKA

, joka koodaa solusykliä säädelty kinaasi mukana CRC [28], ja sen yli-ilmaistu CRC, kuten verrattuna CRA ja NOR. Lisäksi keskuudessa top vapautettu antureista,

SPON2

,

RGS16

,

SFRP4

ja

CTHRC1

on jo löydetty yksi sääteli koettimina CRC verrattuna CRA, ja

FAM55D

,

ATOH8

,

RETNLB

,

ID4

,

UGT1A6

, ja

VSIG2

, kaikkein alassäädetty koettimet [11]. Se oli jo osoittanut, että osa näistä geeneistä vapautui vuonna epiteelisyövissä tai liittyy, kuten

SFRP4

,

SPON2

[29],

RGS16

[30], tai

UGT1A6

[31].

Erityinen geenin ilmentymisen muutoksia joko tyyppi peräsuolileesiot tunnistettiin, kiitos intersektionaalista analyysejä (kuva 2). Ensinnäkin, 1218 (51%) vapautui koettimet olivat spesifisiä NOR CRA siirtyminen, ja sitten voisi merkitä alhaisen riskin viestintävirasto, koska ei ollut yhteyttä CRC. Toiseksi, 723 (40%) vapautui-koettimet olivat spesifisiä CRC

vs

. NOR, ja sitten voisi merkitä erikseen CRC. Lopuksi, 276 (41%) vapautui koettimet olivat spesifisiä CRA CRC siirtyminen. Jälkimmäinen koetinsarjaa voisi olla mielenkiintoista määritellä tapahtumat spesifisiä viimeisiä vaiheita syövän etenemisen.

allekirjoitus 954 antureista vastasi geenien osoittaa ilmentymisen muutoksiin sekä CRA ja CRC näytteitä, verrattuna normaaliin limakalvoille. Koska nämä vapautettiin koettimet CRC myös epätavallisen ilmaistu viestintävirasto, ne todennäköisesti ehdokas markkereita etenemistä CRA CRC. Siten hierarkkinen klusterointi ei salli erottaa luottoluokituslaitokset alkaen CRC. Allekirjoitus 172 antureista, jotka vastaavat geenien vapautettiin CRC verrattuna sekä CRA ja NOR, voisi merkitä erikseen CRC ja tukemalla tämän hypoteesin, hierarkkinen klusterointi tunnistettu CRC: t yhtenä ryhmänä. Allekirjoitus 265 antureista vastaa geenien vapautettiin CRC

vs

. CRA, jotka oli jo epätavallisen ilmaistu CRA

vs

.