Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Haimasyöpä on yksi suora syövän syiden liittyvä kuolema. Korkea chemoresistance on yksi suurimmista esteistä kliinisen hoidon. Viime vuosina, syövän kantasoluja on laajalti tunnistettu ja merkitty alkuperä chemoresistance usean tyyppisiä kiinteitä kasvaimia. Lisääntyvä todisteita viittaavat siihen, että syövän kantasolut asuvat soluissa kykenee muodostamaan holoclones jatkuvasti. Kuitenkin haimasyövän, holoclone muodostavia soluja ei ole selvitetty vielä. Siksi päämäärä Tämän tutkimuksen oli indentify holoclone muodostava haimasyövän kantasoluja ja kehittää in vitro jatkuvassa pesäkemuodostusta järjestelmä, joka helpottaa suuresti tutkimusta haimasyövän kantasolujen.

Menetelmät /Principal havainnot

Haimasyöpä solulinja BxPC3 toimitettiin monoklonaalisiin viljely tuottaa pesäkkeitä. Perustuen morfologioita, pesäkkeet luokiteltiin ja analysoitiin niiden kapasiteetit johdetun pesäkkeen muodostumisen, pysyvyyttä i

n vitro

, kasvaimen muodostumisen

in vivo

, ja lääkeresistenssin. Virtaussytometrialla ja kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin ekspression havaitsemiseksi taso syövän kantasoluja liittyy solun pinnan markkereita, säätelygeenejä ja MikroRNA on eri tyyppiä pesäkkeitä. Kolmenlaisia ​​pesäkkeiden erillisiä morfologioita tunnistettiin ja ilmaisua kuin holografinen, mero-, ja paraclones, jossa vain holoclones syntyy jälkeläinen pesäkkeitä kaikkien kolmen edelleen kohtia. Verrattuna mero- ja paraclones, holoclones hallussaan suurempia valmiuksia pitkän aikavälin selviytyminen, kasvain aloittamista, ja chemoresistance. Ensisijaisen ilmentyminen syövän kantasoluja liittyvä markkeri (CXCR4), säätelygeenit (BMI1, GLI1, ja GLI2) ja MikroRNA (miR-214, miR-21, miR-221, miR-222 ja miR-155) in holoclones olivat myös korostettuna.

Johtopäätökset /merkitys

Tuloksemme osoittavat, että haiman kasvain-aloittavat solujen korkeatasoisen chemoresistance rikastuneet holoclones peräisin BxPC3 solulinjasta. Sukupolven holoclones voi toimia uutena mallina opiskeluun syövän kantasoluja, ja attribuutin uusien syöpälääkkeiden.

Citation: Tan L, Sui X, Deng H, Ding M (2011) Holoclone muodostavien solujen alkaen haimasyöpäsoluissa rikastuttaa Kasvain Käynnistetään Solut ja edustaa uutta malli Study of Cancer Stem Cells. PLoS ONE 6 (8): e23383. doi: 10,1371 /journal.pone.0023383

Editor: Hana Algul, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 20 maaliskuu 2011; Hyväksytty: 15 heinäkuu 2011; Julkaistu: 03 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Tan et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat opetusministeriön avustus (705001) (https://www.moe.edu.cn/), National Natural Science Foundation of China Luova Tutkimusryhmät (30421004) (https://www.nsfc.gov. cn), ja 111 Project HD. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on nykyisin neljänneksi yleisin syy syöpään liittyvän kuolleisuuden. Alle 5% potilaista hengissä 5 vuotta diagnoosin kanssa eloonjäämismediaani jakson 4-6 kuukautta [1], [2]. Vaikka kirurginen resektio pidetään tehokkain tapa hoidon, sen toteutettavuus on edelleen alhainen, koska paikallisten etenemistä ja varhaisen etäpesäke [3]. Lisäksi kemoterapiaa pidetään tärkeänä vaihtoehtona kliinisessä terapiassa, mutta se tuottaa yleensä huono vaikutus [4], [5] .Siksi on tarpeen tulkita mekanismeista korkea chemoresistance haiman syöpäsoluja.

viime vuosina syövän kantasoluja (tai kutsutaan kuin kasvain aloittamista soluja) on tunnistettu olennaiseksi osaksi monen tyyppisiä kiinteitä kasvaimia [6] – [11]. Syöpä kantasolut paitsi johtaa kasvaimen aloittamista ja kasvua, vaan myös toimia alkuperän syövän etäpesäkkeiden, uusiutumisen ja vastustuskyky kemo- tai sädehoidon [12] – [14]. Siten jatkokäsittelyä havaitsemiseen ja poistamiseen haimasyövän kantasolujen vielä halutaan onnistuneesti valloittaa esteitä kliinisessä.

Viimeaikaiset tutkimukset aikuisten ja syövän kantasoluja korreloi kantasolujen ominaisuuksia morfologian pesäkkeiden syntyy yksittäisistä soluista [15] – [20]. Mukaan kriteerit pesäkkeen koko ja rajatapauksia määritelty uraauurtava toimii keratinosyyttisolulinjoissa yhdyskunnat luokiteltiin ja ilmaisua kuin holoclones, meroclones, ja paraclones [21]. Samanlainen kantasolujen karvapusseissa [15], silmän [16], ja orvaskeden [17], syövän kantasolut eturauhasen [19] ja gliooman [20] osoitettiin oleskella holoclones. Holoclones johdettu eturauhassyöpäsolulinja PC3 aloitettiin kasvainten muodostumista NOD /SCID-hiirissä yksinomaan ja lisääntyneet in vitro voimakkaasti [19]. Solut holoclones peräisin glioomasolulinjaa U251 pystyivät tuottamaan kasvain palloja seerumittomassa kunnossa ja erilaistua suvusta neuronien, astrosyytit ja oligodendrocytes [20]. Mielenkiintoista on, että kantasolujen liittyvät geenit olivat erittäin ilmaistaan ​​holoclones peräisin sekä eturauhassyövän ja glioomasolulinjoja [19], [20]. Nämä vihjeet ehdotti, että eteneminen holoclones syöpään solulinjoista voisi toimia vaihtoehtona strategiaa rikastumista syövän kantasolujen [20]. Kuitenkin haimasyövän, holoclones ei ole tunnistettu ja sen korrelaatio ominaisuuksia syövän kantasoluja ei ole vielä määritetty.

Tässä tutkimuksessa selvitimme heterogeenisyys haimasyövän solulinjoissa BxPC3 [22] ja PC3 [23] perustuen morfologiaan saatujen pesäkkeiden yhden syöpäsolujen ja osoitti, että syöpä kantasolujen ominaisuuksia rikastuneet holoclones yksinomaan. Lisäksi työmme osoitti holoclone muodostavien solujen määrite chemoresistance, mikä osoitti sen mahdollisuuksia arvon kehittämiseksi kemoterapeuttisten.

Tulokset

Haimasyöpä soluilla heterogeeninen kyky luoda erilaisia ​​siirtomaa morfologioita in klonaalisen kulttuuri

ensimmäinen tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää monimuotoisuuden klonaalisen morfologioita olemassa haimasyövän solupopulaatiossa, joten monoklonaalinen viljely toteutettiin (Kuva. 1A) haimasyöpä solulinjan BxPC3. Tämä solulinja johdetut lokusten haiman adenokarsinooma ja tyypillisiä epiteelin morfologia. Sen jälkeen päällystetty, osa soluista kuoli, kun taas toiset pidettiin elinkelpoisia ja muodostivat pesäkkeitä 3 päivän kuluessa pinnoitus ja osoitti kirjo erotettavissa morfologioi- 5-7 päivän kuluttua. Erojen perusteella morfologia, pesäkkeet määriteltiin holoclones, meroclones ja paraclones (Fig. 1 B, C, D) [21]. Holoclones oli klustereita homogeenisia, pienten ja tiiviisti pakattu solujen säännöllisesti sileä pesäkkeitä rajanvetoa (Fig. 1 B). Paraclones koostui hajallaan ja suurempien solujen hajanainen rajojen (Fig. 1 D). Meroclones esillä välituote morfologioita (Fig. 1 C). Nämä mophologies säilyivät kun koko pesäkkeiden lisääntynyt. Rinnakkaisella määritykset suoritettiin PC3-solulinjassa, kolme pesäkkeet identifioitiin (Fig. S1A, B, C) ja morfologioita samanlaisia ​​kuin johdettu BxPC3 solulinjassa. Siirtomaa koostumus oli samanlainen näissä kahdessa solulinjoissa: lähes puolet yhdyskunnista olivat meroclones, kun taas holoclones ja paraclones osuus oli noin 20-30% muodostuneiden pesäkkeiden (Fig. 1 E, Fig. S1D). Näin ollen, nämä tulokset osoittivat, monimuotoisuuden klonaalisen morfologioita haimasyövän solupopulaatiossa.

(A) Kaavamainen kuvaa menettelyä, jossa johdetaan BxPC3 solujen klonaalinen viljelmiä ja funktionaalisissa määrityksissä. Alempi paneeli osoittaa edustaja holoclones (B), meroclones (C) ja paraclones (D) BxPC3 kulttuureista. Kaikki valokuvat otettiin 2 viikon kuluttua pinnoitus (Bar, 100 mikronia). Tänä ajankohtana, kunkin pesäkkeet laskettiin (E). Tulokset kokeiden toisto (n = 4) esitetään keskiarvoina ± sem pylväskaavion.

Erityyppiset pesäkkeiden hallussaan ero valmiuksia itseuudistumiseen ja pitkän aikavälin leviämisen

koska klonaalinen morfologiset monimuotoisuuden haimasyöpäsoluissa oli ilmoitettu, toissijainen pesäkkeiden muodostumista kapasiteetti olisi arvioitava. Tätä tarkoitusta varten soluja kaikki kolme pesäkkeet eristettiin ja maljattiin, joilla on alhainen tiheys (alle 200 solua per kuoppa 6-kuoppaiselle levylle) useita kohtia. Alkuperäisen kulkupaikka, holoclones syntyy samassa suhteessa johdetun holoclones ja meroclones (lähes 50% kutakin), jossa on rajoitettu määrä (vähemmän kuin 10%) ja paraclones (Fig. 2A, kuviossa. S2A). Samanaikaisesti määrityksissä, eristetyt solut meroclones tuotettu harvinaisen määrä sekundaarisia holoclones mutta paljon suurempi prosenttiosuus paraclones (Fig. 2C, kuvio. S2C). Kuitenkin harvinainen solut paraclones pidettiin elinkelpoinen jälkeen uudelleen pinnoitus ja se tuotti vain toissijainen paraclones matalilla taajuuksilla (tuloksia ei ole esitetty). Voit seurata kehitys- kohtalo pesäkkeiden tyypilliset pesäkkeet erillistä tyyppiä valittiin pitkäaikaiseen viljelyyn. Solut valitaan pesäkkeet siirrostettiin rutiininomaisesti kloonitiheydessä alle yleinen sairaus. Sillä saatujen pesäkkeiden BxPC3 solulinjasta, kaikki 12 holoclones olivat elinkelpoisia ja lisääntyneet voimakkaasti, kun taas 12 18 meroclones ja 13 15 paraclones vähitellen keskeytetty (Fig. 3) aikana rinnakkain kulttuuri 140 päivää. Samoin aikana 60 päivää kulkua saatujen pesäkkeiden PC3 solulinjasta, 8 9 holoclones olivat vankan kasvun, kun taas 4 8 meroclones ja 6 8 paraclones laski lyhyen ajan (Fig. S3). Mielenkiintoista, vain solut peräisin holoclones regeneroidusta kaikkia eversti morfologisia fenotyyppien ja palautti osuudet kunkin pesäkkeiden (Fig. 2B, kuvio. S2B) samanlainen mittasuhteet havaittu lajittelemattoman vanhempien solulinjoissa matalan tiheyden kulttuuri. Perustuen erillisten ulkonäköön näytteillä yläpuolella kapasiteetti pitkän aikavälin itseuudistumisen

in vitro

lähinnä asunut holoclones, mutta ei meroclones tai paraclones.

Solut eristettiin yksittäisiä pesäkkeitä maljattiin alhaisen tiheyden alle yleinen sairaus. (A) Ensimmäisessä passage, holoclones (n = 8) valmistetaan pääasiassa samanlainen taajuuksilla jälkeläinen holoclones ja meroclones, kun taas paljon pienempi prosenttiosuudet paraclones syntyi. (B) jälkeen kohdat yhden kuukauden, holoclones (n = 8) tuotti täyden valikoiman jälkeläisten pesäkkeiden taajuuksilla kaltaisia ​​säilytetään lajittelemattomina vanhempien solulinjoissa. (C) Meroclones (n = 8) tuottamaan paraclones ja meroclones, ja harvat holoclones syntyi.

Holoclones (n = 12, punainen viiva), meroclones (n = 18, vihreä viiva) ja paraclones (n = 15, sininen viiva) viljeltiin yleinen edellytys 20 viikon ajan ja elinkaarista kunkin pesäkkeen kirjattiin. Useimmat meroclones ja paraclones abortoitui vähitellen, kun taas kaikki holoclones pysyi elinkelpoinen (p 0,01).

Holoclones, mutta ei meroclones tai paraclones, aloittaa kasvaimen muodostumisen ja tukea kasvaimen sarjasiirteillä NOD /SCID-hiiriin

luotettavuutta holoclones oli osoitettu

in vitro

, oli tärkeää arvioida

in vivo

tumorgenecity kolmenlaisia ​​pesäkkeitä. Jotta arvioida kasvaimen muodostumisen kapasiteetti kunkin pesäkkeen, sarjasiirteillä määritykset suoritettiin. Ensinnäkin, lajittelemattoman BxPC3 soluja aloitettu kasvainten muodostumista annoksesta riippuvaisella tavalla. 100% hiiristä injektoitiin 10

6 tai 10

5 BxPC3 solujen kehitetty ksenograftikasvaimissa 14 päivän kuluttua, ja hiiret injektoitiin 10

4 tai 10

3-soluissa myös kehittänyt ksenograftikasvaimissa 21 päivän jälkeen kanssa 100%: n tehokkuutta (taulukko 1). Sen jälkeen kolme holoclones, kolme meroclones, ja kaksi paraclones poimittiin elinsiirtoihin. 10

4 holoclone solut muodostivat kouraantuntuva kasvaimia 100% hiiristä (15 15 hiirtä) 18 päivän kuluessa. Päinvastoin, ei näkyviä kasvaimia muodostettu soluja mero- tai paraclones (0 36 hiirillä, 10

4~10

5 solua per hiiri) 2 kuukauden kuluessa (taulukko 1). Seuraavassa vaiheessa, solut ksenograftikasvaimissa peräisin holoclones Sitten puhdistettuja ja uudelleen istuttaa NOD /SCID-hiirten (10

4 solua per hiiri). 18 päivää, kaikki saajahiiret (18 18 hiirtä) kehitti palpoitavissa kasvaimia (taulukko 1). Sarjasiirteillä määritykset suoritettiin myös PC3 solulinjassa. Lajittelemattomat emosolulinjassa, 3 holoclones, 2 meroclones, ja 2 paraclones käytettiin. Kaikki holoclones peräisin PC3-solulinjassa pystyivät kehittämään kasvaimen ainoastaan ​​lyhyen viiveen (taulukko S3).

Exnograft kasvaimia, jotka ovat peräisin lajittelemattoman BxPC3 solulinjan ja vastaavat holoclones analysoitiin H toinen ryhmä oli säädellä vähentävästi holoclones, kuten

Anna-7a

ja

miR-30c

,

miR-30b

,

miR-30a

(Fig. 5C). Ero ilmentyminen merkkejä ja säätävät viittaavat myös siihen taipumusta, että kantasolujen ominaisuudet hallussa holoclones parempi kuin muut kaksi pesäkettä.

Solut eristettiin holoclones, meroclones ja paraclones tutkittiin virtaussytometrialla, että solun pinnan markkereita syövän kantasoluja. CD133 (A) oli täysin negatiivinen kaikkien kolmen pesäkkeiden. CXCR4

+ soluja (B) oli havaittavissa kaikenlaisia ​​pesäkkeiden mutta merkittävästi rikastettu holoclones. CD44 (C) oli vahvasti positiivinen ja juurikaan eroa keskuudessa eri tyyppiä pesäkkeiden, kun taas CD24 (D) ilmaistiin korkeammalla tasolla paraclones kuin holoclones. mRNA taso

CD44

(E),

CD24

(F) ja

CXCR4

(G) in holografinen, mero-, ja paraclones oli myös määrällisesti kanssa reaali PCR (

GAPDH

sisäisenä viitteenä) ja vastaavat suuntaukset olivat osoitti (*, p 0,05).

BMI1

,

GLI1

ja

GLI2

olivat säädellään ylöspäin holoclones, kun taas ilmaus

Gli3

ei ollut merkittävää muutosta keskuudessa eri tyyppiä pesäkkeiden (A). MikroRNA olivat ryhmittyneet kahteen ryhmään, joista koholla (B) ja tukahdutettu (C) holoclones vastaavasti. Kaikki ilmaisu arvot eri tyyppiä pesäkkeistä normalisoitui vastaan ​​kuin paraclones (*, p 0,05).

Holoclones näytteille paljon suurempi chemoresistance kuin meroclones ja paraclones

On hyvin tiedossa, että chemoresistance on yksi tärkeimmistä ominaisuuksista syövän kantasoluja, joten tässä kysyimme, onko holocoloes hallussaan tämä kyky. Siten eristetyt solut näiden kolmen pesäkkeiden ja gemsitabiiniryhmässä ja 5-FU alle konsentraatio kasvaa. Niistä koko pitoisuusalueella testattu, eloonjäämislukuja peräisin olevien solujen holoclones olivat merkittävästi korkeammat kuin meroclones ja paraclones (Fig. 6A, B). IC

50 arvo 5-FU oli 2,59 x 10

3 nM holoclones, joka oli paljon suurempi kuin meroclones (1,24 x 10

2 nM) ja paraclones (15.10 nM). Analysoimaan geeni-ilmentymisen muutoksen aiheuttama lääkehoitoa, kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin solun lääkkeillä. Hoidon jälkeen 50 nM 5-FU 12 tuntia, ilmaus huumeiden saanti kuljettajat (

SLC28A1

,

SLC28A2

,

SLC28A3

,

SLC29A1

,

SLC29A2

,

SLC29A3

) olivat kaikki säädellään ylöspäin paraclones ilman vaikutusta holoclones enimmäkseen (vain

SLC28A1

oli alassäädetty noin 2-kertainen) (Fig. 6C) .Kun rinnakkaista hoitoa gemsitabiinin, samanlaisia ​​vasteita näiden geenien havaittiin (Fig. 6C). Yhdessä

SLC28A1 /A2

ja

SLC29A1 /A3

olivat yleisesti säädelty lisää dramaattisesti paraclones kuin holoclones käsittelyjen jälkeen gemsitabiinin tai 5-FU. Tämä ero vastaus voi olla, ainakin osittain, invovled vaihtelussa chemoresistance joukossa kolme pesäkettä.

Solut eristettiin holoclones, meroclones ja paraclones käsiteltiin kemoterapeuttisten lääkeaineiden, joiden pitoisuus: 1, 5, 10 , 50, 100 nM gemsitabiinin (A) tai 5, 10, 50, 100, 500 nM 5-FU: ta (B). Kullekin Pitoisuusarvo kolme kaivoja asetettu toista yhdessä kokeessa ja kolme kertaa edustavista kokeet tehtiin. Ilmaisu muutokset chemo-lääkkeen ottamisesta kuljettajat määrä määritettiin holoclones ja paraclones vastaavasti jälkeen käsiteltiin 50 nM kemiallis-lääke 12 tuntia. (C) (*, p 0,05).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme kantasolu ominaisuudet holoclones ja ilmoitti, että paneeli kantasolujen liittyvien geenien ja MikroRNA oli ensisijaisesti ilmaistuna holoclones. Lisäksi olemme paljasti korkean chemoresistance vuonna holoclones ja ehdotti mahdollinen arvo holoclones tutkimuksessa syövän kantasoluja.

Olemme ensimmäinen osoittaa heterogeenisyys clonoal morfologioita haiman syöpäsoluja. Samanlainen käyttäytyminen keratinosyyttien [21] ja useita syöpäsolulinjoissa [18] – [20], kun solut BxPC3 ja PC3-solulinjassa maljattiin monoklonaali-, järjestysnumero pesäkkeitä monipuolista morfologioita kehitettiin (Fig. 1A). Joka perustuu morfologisiin monimuotoisuutta, holoclones (Fig. 1 B, kuvio. S1A), meroclones (Fig. 1 C, kuvio. S1B) ja parclones (Fig. 1D, kuviossa. S1C) voidaan helposti tunnistaa.

Lisäksi tuloksemme osoittivat, että varsi kaltaisia ​​syöpäsoluja rikastuneet holoclones sijaan mero- tai paraclones. Aikana

in vitro

eteneminen, solut holoclones syntyy suuri prosenttiosuus jälkeläisten holoclones ensimmäisellä kierroksella passage (Fig. 2A, kuvio. S2A). Sen jälkeen lisää kohtia, soluja holoclones syntyy pesäkkeiden täyden valikoiman morfologiset ominaisuudet ovat samankaltaiset kuin johdettu lajittelematonta vanhempien solulinjoista (kuvio. 2B, kuvio. S2B). Kuitenkin meroclones tuottaa rajallinen määrä holoclones ja paljon suurempi prosenttiosuuksia paraclones (Fig. 2C, kuvio. S2C). Pitkäaikaisessa kohtia

in vitro

, holoclones osoitti enemmän kestävyyttä ja jatkuvaa lisääntymistä, kun taas mero- ja paraclones heikkeni nopeasti (Fig. 3, Fig. S3). Kun erot edellä on esitetty, eri tyyppiä pesäkkeiden hallussaan ero kapasiteetti itseuudistumisen ja leviämisen kapasiteettia. Vielä tärkeämpää on, holoclones sarjaan aloitettiin kasvaimen kehittymisen

in vivo

kun mero- ja paraclones ei (taulukko 1, taulukko S3), jota pidetään yleisesti käytetty kultainen standardi tunnistamiseksi syövän kantasoluja. Välttämättömänä täydentää, Ksenograftikudoksista kasvaimia, jotka ovat peräisin BxPC3 holoclones osoittivat samanlaisia ​​histologisia piirteitä kuin kasvainkudoksen peräisin lajittelemattoman BxPC3-solulinjassa (kuvio. S4). Eturauhassyövän solulinjoissa PC3 [19] ja DU145 [24], on samanlaiset ominaisuudet ja holoclones

in vitro

ja

in vivo

oli ilmoitettu ja toimi todisteet tukevat kantasolujen omaisuutta holoclones.

lisäksi ilmentyminen solun pinnan markkereita, geenien ja MikroRNA keskuudessa eri tyyppiä pesäkkeiden ehdotti myös kantasolujen omaisuutta holoclones. Ensinnäkin, solun pinnan markkereita haimasyövän kantasolujen, CD44, CD24, ja CD133, arvioitiin. Perustuu kahden riippumattoman raportteja, haimasyöpä kantasolut todettiin väestö CD44

+ CD24

+ ESA

+ tai CD133

+, mutta nämä kaksi populaatiot osoittivat vähän päällekkäisyyttä keskenään [10 ], [11]. Tulosten mukaan on virtaussytometrialla (Fig. 4A, C) ja kvantitatiivinen RT-PCR: llä (Fig. 4E) määritykset, ilmentyminen

CD133

(havaita) ja

CD44

(erittäin ilmaistuna) oli molemmat undistinguishable keskuudessa kolmenlaisia ​​pesäkkeitä. Ilmaisu on

CD24

säädeltiin vähentävästi vuonna holoclones kuin paraclones (Fig. 4F, Fig. S5), joka on mahdollisesti vaihdellut entisestä raportissa [10]. Samanlainen odottamattoman ilmentymisen tilan

CD133

[11], [25] ja

CD24

[10] haiman solulinjoissa BxPC3 ja PC3, erilaiset ilmaus

CD133

yhdessä tiettyjen solulinjassa kuvattiin munasarjasyövän solulinjoissa OVCAR3 ja SKOV3 [26] – [28], jotka voivat ainakin osittain joitakin määrittelemättömiä aiheuttamien muutosten aikana pitkäaikaisen viljelyn

in vitro

. Lisäksi CD133- syöpä kantasolut on tunnistettu gliooman ja ehdotettiin lisää ensiarvoisen ajetaan voimalla kasvaimen kehitystä kuin CD133 + solupopulaation [29]. Lisäarviointia kantasolujen ominaisuuksia holoclones, useita geenejä ja mciroRNAs liittyy syövän kantasoluja kvantitoitiin. Niistä geenit säädellään ylöspäin holoclones,

BMI1

(Kuva. 5A) on osoitettu olevan keskeinen säätelevä rooli itseuudistumisen hermo [30], rintarauhasen [31], verta muodostavan [32] kantasolut ja usean tyyppisiä syövän kantasoluja [31], [33], [34]. Mitä enemmän,

BMI1

promoottori on käytetty ajaa EGFP solunsisäinen merkki rikastaa hematopoieettisia kantasoluja [35]. Samanlaisia ​​tuloksemme,

BMI1

oli hiljattain raportoitu ensisijaisesti ilmaistuna holoclones peräisin glioomasolulinjaa [20]. Korkeus

GLI1

ja

GLI2

vuonna holoclones (Fig. 5A) ehdottaa korkeampi aktiivisuus Hedgehog signalointi, mikä oli sopusoinnussa korkeampaa

SHH

ilmentymistä CD44

+ CD24

+ ESA

+ syövän kantasoluja eristettiin ihmisen ensisijainen haimasyövän yksilöt [20]. The Hedgehog signaalireitin myös olennainen rooli ylläpitää syövän kantasoluja rintakasvainkudoksessa [31] ja aivoissa [36].

CXCR4

, keskeisen sovittelija etäpesäkkeiden, oli säädellään ylöspäin holoclones (Fig. 4B, G) too. Vuonna CD133

+ haimasyöpä kantasoluja, CXCR4

+ alaryhmästä on enemmän invasiivisia kuin autologisen CXCR4

– subpopulaatio [11]. Niistä MikroRNA säädellään ylöspäin holoclones,

miR-214

,

miR-221

,

miR-222

ja

miR-155

(Fig. 5B) olivat yleisesti yli-ilmentyy rintasyövän kantasoluja [37]. Kuitenkin

Anna-7a

(Fig. 5C), joka oli merkittävästi säädellä vähentävästi holoclones näyttelee kielteinen rooli itsensä revewal, tuumorigeenisyyteen, ja chemoresistance rintasyövän kantasolujen [12]. Samoin, miR-30a /b /c (Fig. 5C) on myös yli-ilmennetään paraclones. Rintasyövän, tämä microRNA perheen estää itse uusia kantasoluja, indusoi apoptoosia, ja vähentää etäpesäkkeiden keuhkojen [38].

Korkeampi chemoresistance on esitetty holoclones eikä meroclones ja paraclones (kuvio . 6A, B), joka on sopusoinnussa tukitehtävänsä syövän kantasolujen chemoresistance raportoitu aiemmin [11], [13]. Mukaisesti vankka chemoresistance vuonna holoclones, geenien ja MikroRNA ylläpitävää chemoresistance, kuten

BMI1

[39],

GLI1 /2

[40],

CXCR4

[41 ],

miR-214

[42],

miR-21

[43], ja

mir-155

[44] (Fig. 4G, Fig. 5A, B) säädellään ylöspäin holoclones. Vastauksena lääkehoidot, ilmentymisen lääkkeen saanti kuljettajat, jotka korkeampi ekspressiotaso korreloi elinajan pitenemiseen potilaista [45] – [48], indusoitiin paraclones edullisesti (Fig. 6C). Tämä tarkoittaa, että lääke-take tullaan kasvanut nopeammin paraclones kuin holoclones. Tämä voisi olla yksi mahdollinen alkuperä suosivista selviytymisen syövän kantasolut vs. ei kantasolujen syöpäsoluja kemoterapiaa.

Yhdessä pesäkkeet erillisiä morfologioita ja eri erilaistumisen vaiheissa voi toimia mahdollisena mallina analyysiä varten syövän kantasoluja (Fig. 7). Tällä mallilla geenit ja MikroRNA mahdollisesti korreloivat syövän kantasoluja voidaan tunnistaa. Vielä tärkeämpää on, rinnakkaisia ​​arviointi chemotheraputic lääkkeitä voidaan suorittaa syövän kantasoluja ja autologisia ei-kantasolujen syöpäsoluja. Tämä tarkoittaa klonaalisen morfologioita syöpäsairauksien kantasolujen malli on hyötyä johtaa uudempia ymmärrystä chemoresistance, jonka pitäisi olla aivan erilaiset kuin saatu heterogeeninen syöpäsolun väestö, ja on hyödyllistä voittaa chemoresistance syövän hoidossa.

haimasyövän kantasolut ja niiden jälkeläisten erilaistumisen voi kehittyä yksittäisiä pesäkkeitä eri morfologioita. Joka perustuu in vivo ja in vitro ominaisuudet, Holoclones vastaavat syövän kantasoluja /progenitorisolujen, kun taas paraclones vastaavat täysin erilaistuneet solut ja meroclones vastaavat solut välivaiheessa. Geenit ja MikroRNA jotka liittävät syövän kantasoluja sekä tukemaan chemoresistance, kuten

BMI1

,

GLI1 /2

,

CXCR4

,

mir-21/214 /221/222/155

, rikastetaan holoclones. Kuitenkin

Anna-7

ja

mir-30a /b /c

rikastuvat paraclones.

Materiaalit ja menetelmät

Cell linjat

Ihmisen haiman adenokarsinoomasolulinja BxPC3 (ostettu Cell Bank of China Academy of Sciences, Shanghai, Kiina) ja PC3 oli (ostettu Kiina unionin Medical Collage, Peking, Kiina) viljeltiin RPMI-1640 (Hyclone ) 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (Hyclone) ja siirrostettiin 1:10 0,25% trypsiiniä /EDTA: a (Hyclone). Nämä solulinja vakiinnutettiin ensisijainen haiman adenokarsinooma ja tyypillisiä epiteelin morfologia [22], [23]. BxPC3 [22] oli peräisin eurooppalaista syntyperää ja PC3 [23] oli peräisin Kiinan.

Kemialliset huumeet

lyofilisoituna jauheena gemsitabiinin (Lilly) liuotettiin Calsium /Magnesium vapaa PBS (Hyclone ) ja säilytettiin -20 ° C: ssa konsentraatiossa 4 mg /ml. 5-FU-liuosta (Roche) säilytettiin -20 ° C: ssa on 25 mg /ml. Ennen käyttöä, varastojen laimennettiin toimi pitoisuuksina (5, 10, 50, 100, ja 500 nM 5-FU, ja 1, 5, 10, 50, ja 100 nM Gemsitabiini) elatusaineella.

Eläimet

Kaikki kokeet hyväksynyt Animal Care ja käyttö komitean Pekingin yliopisto (hyväksymisnumero oli IRB00001052-09051). NOD /SCID-hiiriä ostettiin Experimental Animal Sciences Center of Pekingin yliopiston ja ylläpidetään vakio kunnossa mukaan institutionaalisten ohjeiden.

Yhden solun kloonaus

Solut kerättiin 70% -80% ja yhtymäkohdassa Accumax (Chemicon) ja resuspendoitiin väliaineessa ilman seerumia. Yhden solun ympättiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppalevyillä MOFLO virtaussytometrialla (DakoCytomation). Kaksi päivää sen jälkeen, kun pinnoitus, 96-kuoppaisia ​​levyjä tarkastetaan mikroskoopilla. Kuopat, jotka sisälsivät vain yhden elinkykyisten solujen oli merkitty. Ja sitten, väliaine päivittyy joka 3. päivä. Pesäkkeet luokiteltu holografinen, mero-, ja paraclones mukaan niiden morfologioita. 14 päivän kuluttua flow-metrimittausmenetelmille lajittelu tyypilliset pesäkkeet valittiin lisäkokeita varten.

Kasvain soluistutusryhmä

Valitut pesäkkeet laajennettiin ja kerättiin Accumax (Chemicon), laskettiin ja suspendoitiin uudelleen 01:01 seosta, jossa oli RPMI-1640 ja matrigeeliin (BD). Alikvootit solususpensiota ihonalaisesti dorsolateral osa NOD /SCID-hiirissä. Kasvaimen latenssi (eli aika injektiona havaitsemiseen kouraantuntuva kasvaimet) määritettiin. Kuluessa 9 viikkoa istutuksen jälkeen, tuumoreita kantavaa hiirtä tapettiin. Samaan aikaan ksenograftikasvaimissa irrotettiin kirurgisesti ja punnitaan. Hiiret ilman merkkejä kasvaintaakkaa pidettiin vähintään 9 viikkoa istutuksen jälkeen ja sen jälkeen tarkasteltiin Nekroskopiassa vahvistamaan, että ne olivat kasvaimettomina.

sarjasiirteillä, ksenograftikasvaimissa jauhettiin pieniksi paloiksi saksilla, keskeytetty M199, ja hajotettiin 37 ° C: ssa noin 3 tuntia 200units /ml ulturapure collagenas IV (Worthington Biochemicals). Lisäksi mekaaninen hajotus suoritettiin 25 ml: n pipetti 15 minuutin välein. Digestion jälkeen solususpensio suodatettiin 40 um: n nailonverkon ja varovasti lastataan pintakerros Histopaque-1077-gradientilla (Sigma-Aldrich) (1~3 x 10

6 solua /ml Histopaque käytetään kokonaistilavuudessa 3 ml), ja sitten sentrifugoitiin 400 x g 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Elinkelpoisia tumalliset solut kerättiin rajapinnalla, kun taas punaiset verisolut, kuolleet solut ja jäänteet poistetaan. Korjatut yksisoluiset suspensiota käyttää transplantaatioon, kuten edellä on kuvattu.

solunsalpaajaresistentti määrityksessä

Solut samantyyppistä pesäkkeet otettiin talteen, yhdistettiin ja ympättiin 96-kuoppalevyille tiheyteen 5000 solua /kuoppa. 24 tuntia myöhemmin väliaine päivitetään ja huumeiden (gemsitabiinia tai 5-FU) lisättiin.