Krooninen sairaus

tiivistelmä

Monet syöpälääkkeet tarkoituksena tappaa syöpäsoluja indusoimalla apoptoosin. Kuitenkin voimakkuuden määritysten käytetään mittaamaan bioaktiivisuutta nämä tuotteet ovat yleensä solujen elinkelpoisuuden määritykset, jotka eivät eroa solukuoleman ja kasvun esto. Ohessa kuvataan soluun perustuvan fluoresenssiresonanssienergiansiirto (FRET) biosensorin suunniteltu mittaamaan biologista aktiivisuutta apoptoosin indusoimiseksi syöpälääkkeiden. Bioanturin sisältää syaanin fluoresoiva proteiini (CFP) yhdistää toisiinsa kaspaasi 3 ja kaspaasi 8 katkaisureagenssilla tunnistussekvenssit keltaiseksi fluoresoiva proteiini (YFP). Kun kaspaasin aktivaatio, kuten tapauksessa apoptoosin induktio, linkkeri pilkotaan poistaa matkapuhelinverkon FRET-signaalin. Tämä määritys heijastaa tarkkaan vaikutusmekanismi syöpälääkkeet, tappaa syövän soluja ja näin ollen voi toimia tehotestissä eri syöpälääkkeitä. Me tiukasti osoittaa tätä kautta luonnehdinta luokan proteiineja kohdistaminen kuolemareseptorien. Yksivaiheisessa kokeessa näyttää olevan ylivoimainen muihin apoptoosin perustuvissa määrityksissä, koska sen yksinkertaisuus, mukavuus, ja kestävyyttä.

Citation: Bozza WP, Di X, Takeda K, Rivera Rosado LA, Pariser S, Zhang B (2014) käyttö pysyvästi ilmensivät FRET Biosensor määrittämiseksi Potency of Cancer Drugs. PLoS ONE 9 (9): e107010. doi: 10,1371 /journal.pone.0107010

Editor: Wei Xu, University of Wisconsin – Madison, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 10 elokuu 2014; Julkaistu: 04 syyskuu 2014

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Data Saatavuus: Kirjoittajat vahvistaa, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki tiedot sisältyvät paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Critical Path Initiative rahasto; ja Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Medical Vastatoimi- Initiative rahastoon. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Potency on aktiivisuuden mitta lääkkeen pitoisuutena tai määrä, joka tarvitaan tuottamaan määritelty biologinen vaikutus [1]. Siksi potenssitestissä olisi suunniteltu vastaamaan niin paljon kuin mahdollista vaikutusmekanismit lääkkeen. Onkogeenisten lääkkeitä, jotka on tarkoitettu tappamaan syöpäsoluja, tehon määritys olisi mitta lääkkeen sytotoksisuus syöpäsoluissa. Historiallisesti, monet kemoterapeuttiset aineet tunnistettiin suuren suoritustehon seulonnan yhdisteen kirjastojen avulla solujen elinkelpoisuuden määritykset MTT: n (3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi) tai muiden siihen liittyvien väriaineet [2], [3]. Tämä määritys formaatti on otettu laajalti käyttöön kuin tehotestissä kehittämisessä syöpälääkkeet. Kuitenkin solujen elävyyden määritykset voi erottaa solukuolemaa ja kasvun pysähtymisen vaikutukset jättäen varoitus arvioitaessa todellisen bioaktiivisuutta syöpälääkkeen. Koska tavoitteena on syövän hoito on tappaa syöpäsolut, on tärkeää arvioida kykyä lääkkeen indusoimaan syöpäsolun kuoleman. Lomake solukuoleman yleisimmin liittyy syövän hoidossa, sekä

in vivo

ja

in vitro

on apoptoosin tai ohjelmoidun solukuoleman.

Tunnusmerkki apoptoosin on kaspaasi proteaasien, jolloin lohkaisu rakenteellisia proteiineja ja apoptoottisten kehon muodostumista [4]. On olemassa kaksi erillistä polkuja, eli sisäiseen ja ulkoiseen, jotka johtavat kaspaasi aktivaatiota vasteena lääkehoitoa. Klassinen chemotherapies, kuten etoposidi, kompaktiini, fluorourasiili (5-FU), taksoli ja kamptotesiini indusoida kaspaasi 3: n aktivaatiota p53-riippuvaisella tavalla [5] – [7], joka liittyy usein mitokondrion muutoksia. Sitä vastoin, uuden luokan proteiinien kohdentamisessa syöttämällä reseptorit ilmentyvät solun pinnalla ovat kehitteillä [8] – [11]. Nämä proteiinit ovat rekombinantti ihmisen tuumorinekroositekijän (TNF) variantit, TNF-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) ja kuolema reseptoriagonisti- vasta-aineita. TRAIL sitoutuu kuoleman reseptori 4 ja /tai 5 (DR4 /5) ja tämän jälkeen indusoi kokoonpanon kuoleman aiheuttavia signalointikompleksiin (DISC), joka sisältää sovittimen proteiini Fas liittyvä proteiini Death Domain (FADD) ja pro-kaspaasi 8. Within DISC, pro-kaspaasi 8 aktivoituu itsenäisten lohkominen ja vapautuu sytosoliin, jossa se aktivoi kaspaasi 3. joissakin solutyypeissä, apoptoottisten signalointi monistetaan edelleen

kautta

mitokondriot seurauksena, että translokaatio kaspaasin 8 -välitteisen pilkkomisen Bid (BH3 vuorovaikutuksessa-meeniproteiinia). Näin ollen, teho syöpälääkkeen voidaan arvioida mittaamalla suuruus kaspaasiaktiivisuus käsitellyissä soluissa. Yksi tapa mitata kaspaasiaktiivisuus on ollut käytössä loisteputki koettimia sisältävien kaspaasi alustoille, näytetään muutokset fluoresenssin intensiteetin upon kaspaasin aktivaatio [12] – [16]. Vaihtoehtoisesti, aktiivinen kaspaasit voidaan havaita immunoblot-analyysillä käyttäen spesifisiä vasta-aineita lohkaistaan ​​niiden yksittäisten entsyymin [14], [17] – [19]. Kuitenkin nämä määritykset voidaan yhdistää suuri vaihtelu johtuu monimutkaisia ​​käyttöohjeita. Tässä tutkimuksessa olemme kehittäneet solupohjainen FRET-määritys testaamiseksi teho syövän tuotteita. FRET-koetin sisältää tunnistussekvenssit sekä kaspaasi 3 ja kaspaasin 8 ja sen havaittiin olevan herkkiä syöpälääkkeiden, jotka toimivat läpi luontaisia ​​tai ulkoisia reittejä. Varsinkin stabiilisti ilmaistu FRET koetin, lääkkeen aiheuttama vaste on suoraan seurataan käsiteltyjen solujen ilman ylimääräisiä käsittelyvaiheita. Lisäksi FRET määritys havaitsee apoptoosin alaisten solujen, joilla on merkittävä herkkyys ja kokeellinen yksinkertaisuus, joten se on lupaava potenssitestissä arviointia varten syöpälääkkeet.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja reagenssit

MDA-MB-231 ihmisen rintasyöpä-solulinja hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). PCMV6-AC plasmidiin ekspressiota varten fuusioproteiinin (552 aminohappoa), joka sisälsi täyspitkän syaani fluoresoiva proteiini (CFP) ja keltainen fluoresoiva proteiini (YFP), ja jotka on kytketty kaspaasi tunnistussekvenssi hankittiin Origene (Rockville, MD). Linkkerin välinen kalastuspolitiikan ja YFP sisältää kuusitoista aminohappoja, GSGDEVDGGIETDGSG, joka voi halkaista aktivoitu kaspaasi 3 G ↓ DEVD tai kaspaasin 8 G ↓ IETD, jossa ↓ osoittaa proteaasin leikkaus päällä. Koodaava cDNA-sekvenssi (1656 emäsparia), että CFP-linkkeri-YFP fuusioproteiini kloonattiin pCMV6-AC vektorin SGF I ja Mlul-restriktiokohdat, ja oikea konstrukti varmistettiin nukleotidisekvensoinnilla. Plasmidi transfektoitiin MB231-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000-reagenssia valmistajan ohjeiden (Invitrogen, Carlsbad, CA). Transfektoidut solut valittiin vastaan ​​neomysiiniä (G418) 1 mg /ml (Corning Cellgro, Manassas, VA). G418 resistentit kloonit poimittiin käyttäen kloonaamalla sylintereitä (Millipore, Temecula, CA), ja testattiin fluoresenssin intensiteetti ja proteiinin ekspressiotasot. Vakaa klooni, jolla on korkein ilmaus tasojen CFP-linkkeri-YFP koetin, nimitystä MB231_CFP-YFP, käytettiin seuraavissa kokeissa. Soluja ylläpidettiin DMEM /F-12 50/50 alusta täydennettynä 5% FBS: ää, 4 mM L-glutamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia ja 0,4 mg /ml G418 sulfaatin. Vanhempien MB231-soluja viljeltiin samassa media ei ole lisätty G418 sulfaatti. Sekä rekombinantti ihmisen TRAIL (rhTRAIL, Cat # 375-TEC) ja agonistinen monoklonaalinen vasta-aine (Cat # MAB631), spesifinen kuoleman reseptori 5, hankittiin R Tämä auttaa saavuttamaan parempi signaali-kohina-suhde ja vältetään korkean taustan vähennyslaskujen jotka voivat vaikeuttaa FRET laskelmia. Lisäksi työmme on tiukasti keskittynyt sopivuutta kuvattu määritys joka toimii tehotestissä monimutkaisten proteiinilääkeaineista että tavoite kuolemareseptorien taas muut työt olivat pääasiassa pienimolekyylisiä lääkekehityksen.

Yksi rajoitus meidän määritys liittyy saatavuuteen molekyylitasolla (t) MDA-MB-231-solujen tietyn lääkkeen molekyylin. Esimerkiksi, MDA-MB-231-solujen tiedetään olevan puutteellinen ilmaus Her2-reseptorin jolloin määrityksessä käyttökelvottomaksi arvioimiseksi anti-HER2-monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on hyväksytty käytettäväksi rintasyövän hoitamiseksi.