Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

onkogeeninen mutaatiot ovat voimakkaita ennustava biomarkkereita molecularly kohdennettuja syövän hoitomuotoja. Mutaation havaitseminen potilaiden tarvitse suorittaa invasiivisia kasvainbiopsioissa. Vaihtoehtoisesti arkistointi näytteitä käytetään joka ei voi enää vastaa todellista kasvain tila. Kiertävä kasvainsolujen (CTC) voisi olla vaihtoehtoinen jakelukanava havaitsemaan somaattisten mutaatioiden syöpäpotilailla. Olemme pyrkineet kehittämään herkkä ja spesifinen määritys havaitsemaan mutaatioita

EGFR

geenin CTC keuhkosyöpään potilailla.

Methods

Olemme kehittäneet uudenlaisen määritys perustuu todellisiin -aika polymeraasiketjureaktio (PCR) ja sulamiskäyräanalyysi havaitsemiseksi aktivoimalla

EGFR

mutaatioita verisolujen fraktioista rikastettu CTC. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) valittiin tauti malli kuulemma hyvin alhainen CTC laskee. Määritys prospektiivisesti validoitu näytteissä potilailta, joilla

EGFR

-mutant ja

EGFR

-wild tyyppi NSCLC käsitelty sisällä satunnaistetussa kliinisessä tutkimuksessa. Juokseva analyysit tehtiin seurata CTC signaaleja hoidon aikana ja korreloivat mutaation havaitseminen CTC kanssa hoitotulokseen.

Tulokset

Pitoisuus herkkyys optimoitiin mahdollistaa havaitsemisen yhden

EGFR

-mutant CTC /ml perifeeristä verta. CTC havaittiin esikäsittelyn verinäytteissä kaikki 8

EGFR

-mutant keuhkosyöpäpotilaita tutkittu. Menetys

EGFR

-mutant CTC signaalit korreloivat hoitovaste, ja sen uusiutumisen edeltää uusiutumisen.

Johtopäätökset

alhaisesta runsaasti CTC NSCLC onkogeeniset mutaatiot voidaan toistettavasti havaita soveltamalla puolueeton CTC rikastamiseen strategia ja erittäin herkkä PCR ja sulamiskäyräanalyysillä. Tämä strategia voi mahdollistaa ei-invasiivisia, erityisiä biomarkkereiden ja valvomista potilailla, joille suunnattu syövän hoitomuotoja.

Citation: Breitenbuecher F, Hoffarth S, Worm K, Cortes-Incio D, Gauler TC, Köhler J, et al . (2014) kehittäminen on erittäin herkkä ja erityiset Menetelmä havaitseminen verenkierrossa olevia kasvainsoluja kätkeminen Somaattiset mutaatiot Non-Small-Cell Lung Cancer Potilaat. PLoS ONE 9 (1): e85350. doi: 10,1371 /journal.pone.0085350

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 01 lokakuu 2013; Hyväksytty: 04 joulukuu 2013; Julkaistu: 21. 2014

Copyright: © 2014 Breitenbuecher et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain jota Oncology Center of Excellence myöntää Saksan Cancer Aid (Deutsche Krebshilfe, www.krebshilfe.de) länteen Saksan Cancer Center, sisäiset tutkimusrahoitusta lääketieteellisen tiedekunnan yliopiston Duisburg-Essenin (IFORES MS ), ja institutionaalisen tutkimus avustusta Boehringer Ingelheim (www.boehringer-ingelheim.com) FB ja MS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat konflikteja. FB: Institutional tutkimusrahoitus (Boehringer Ingelheim). TG: Travel tuki, palkkiot ja konsulttipalkkiot (Boehringer Ingelheim, Pfizer, Roche, Lilly). JK: Palkkiot, matkailu tuki (Boehringer Ingelheim, Amgen, Roche). SK: Konsultointipalkkiot, palkkiot, matka- tuki (Merck-Serono, Amgen, Roche). MS: Institutional tutkimusrahoitus, konsulttipalkkiot (Boehringer Ingelheim). Kaikki jäljellä olevat kirjoittajat ovat ilmoittaneet lainkaan eturistiriitoja. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

aktivointi

EGFR

mutaatioita määrittävät ryhmä geneettisesti riippuvainen keuhkojen adenokarsinooman , jotka ovat erittäin herkkiä EGFR tyrosiinikinaasin estäjät (EGFR-TKI). Terapeuttinen päätökset metastasoituneen NSCLC ohjaavat

EGFR

mutaatio asema, joka määräytyy kasvainbiopsioissa [1]. Hankkinut kyseiset koepaloja voi olla vaarallista potilaalle. Lisäksi yksi Tuumorinäytteiden eivät välttämättä täysin vastaa tilan metastaattinen. Ei-invasiivisia menetelmiä toistuvaan määrittämiseksi prognoosi- ja prediktiivisten biomarkkerit voisi helpottaa henkilökohtaista syöpähoidon.

Kiertävä kasvainsolujen (CTC) on kuvattu useissa syövän yhteisöihin. Leimaus CTC on korreloinut hoitotuloksia ja hoitovasteen [2] – [6]. Nämä tutkimukset ovat soveltaneet immunosytokemiallisessa havaitseminen proteiinimarkkereita, enimmäkseen unohtamatta genomista biomarkkerit kuten

EGFR

mutaatio tila. Toisin kuin leukemiat, jossa pahanlaatuiset solut ovat täysin läsnä perifeerisessä veressä, CTC ovat harvinaisia ​​potilailla, joilla on kiinteitä kasvaimia ja suuri vaihtelu CTC laskee on havaittu [3], [5], [7] – [9]. CTC tunnistus perustuu epiteelin markkereita, kuten EpCAM tai sytokeratiineja (CK) voidaan jättää tuumorisolut käynnissä epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) [10].

Ohessa kuvataan uusi erittäin herkkä ja erityinen strategia havaita CTC kätkeminen somaattiset mutaatiot pienisoluista keuhkosyöpää. Koska proof-of-concept mallia olemme käyttäneet lukukehyksessä deleetioita

EGFR

eksonissa 19 (DelEx19), jotka käsittävät noin 48% kaikista

EGFR

mutaatioita [11]. Pystyimme tunnistamaan

EGFR

DelEx19-mutatoitunut CTC ennen hoitoa kaikilla potilailla, joilla

EGFR

mutaatiostatuksesta riippumatta tunnetaan kasvainbiopsioissa jotka arvioitiin. Lisäksi puhdistuma mutaatio-positiivisten CTC korreloi hoitovasteen ja tautien torjunta.

Materiaalit ja menetelmät

Genomisen DNA: n valmistus

Perimän DNA eristettiin PBMNC ja solulinjoista käyttämällä NucleoSpin® Veren Kit (Macherey- Nagel, Düren, Saksa). Tarvittaessa, genomista DNA: ta monistettiin käyttäen REPLI-g Midi Kit (Qiagen, Hilden, Saksa). Genominen DNA solulinjoja tai plasmidi-DNA (pcDNA3.1V5 /HisTOPO, Clontech, Mountain View, USA), joka koodaa ihmisen

EGFR

eksoni 19 cDNA-sekvenssi kätkeminen 15 emäsparin deleetio (delE746-A750) laimennettiin sarjaksi. Solulinjat A431 (

EGFR

villityypin, wt) ja NCI-HCC-827 (

EGFR

delE746-A750) saatiin DSMZ (Braunschweig, Saksa) ja

EGFR

mutaatio asema varmistettiin Sangerin sekvensoinnilla.

PCR-monistus ja

EGFR

DelEx19 mutaation havaitseminen

EGFR

DelEx19 mutaatioita havaittiin sulamiskäyräanalyysillä päälle LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Saksa). Optimaalinen mutaation herkkyys saavutettiin yhdistämällä erityisesti suunniteltu hybridisaatiokoettimien epätäydellisesti sitoutumista EGFR: n eksonin 19 sekvenssit kätkeminen poistetaan aminohappoasemassa 746 tai 747, lukittu-nukleiinihapot (LNA) estävä monistus wildtypic

EGFR

sekvenssit ja estää hybridisaatio koettimien wildtypic

EGFR

eksoni 19-sekvenssit ja lopuksi soveltaa epäsymmetrinen PCR-olosuhteet edullisesti monistetaan DNA-juosteen hybridisaatiokoettimet sitoutuvat. Kaikki parametrit empiirisesti optimoitu optimaalisen määrityksen herkkyyden. Kukin reaktio (20 ui) sisälsi 50 ng genomista DNA: ta, 2 pmol eteen ja 2 pmol reverse-alukkeen (Eurofinsille MWG, Ebersberg, Saksa, Ex19S: 5′-GTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGG-3 ’, Ex19R: 5′-GGGCCTGAGGTTCAGAGC-3′), 2 ui LightCyclerFastStart DNA Master HybProbe (Roche, Mannheim, Saksa), 3 pmol hybridisaatiokoettimen 1 ( ”ankkuri”: 5′-LC640-ATTTTAACTTTCTCACCTTCTGGGATCCAG-PH) ja 3 pmol hybridisaatiokoettimena 2 ( ”anturi”: 5′-TAATTCCTTGATAGCGACGGG-FL) (TIBMolbiol, Berliini, Saksa). Kaikki PCR-reaktiot suoritettiin ilman lisäystä 6 pmol lukittu-nukleiinihappo (LNA: 5’-TAATTCCTTGATAG-NH2; TIBMolbiol, Berliini, Saksa).

Immunomagneettihelmiä rikastumista verenkierrossa olevia kasvainsoluja perifeerisen veren

Perifeerisen veren (20 ml) kerättiin natriumsitraattia putkiin (Sarstedt, Nümbrecht, Saksa). PBMNC eristettiin tiheysgradienttisentrifugaatiolla. Mediaani rikastaminen WBC tiheysgradienttisentrifugaatiolla oli noin kolminkertaiseksi. EpCAM-positiivisiin soluihin ja CD45-negatiiviset solut rikastuneet kaksi rinnakkaista reaktioita käyttäen anti-EpCAM (CD326) ja anti-CD45-mikrohelmiä (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Saksa). Genomi-DNA eristettiin tuloksena neljän näytteen fraktiot (CD45

+, CD45

-, CD326

+ ja CD326

-) ja alistettiin reaaliaikaista PCR ja sulamiskäyräanalyysi.

mutaation havaitseminen sekvenssianalyysillä

sekvenssianalyysi, genomisen DNA: n valitut näytteet monistettiin koko genomin monistamisen (WGA) käyttäen REPLI-g Midi Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) mukaan valmistajan ohjeet. Kaikki järjestyksessä lukee kertyi kaupallinen sekvensoimalla palvelu (LGC Genomics, Berliini, Saksa) on Rochen 454 GS FLX + Titaani (Roche, Branford, USA) ja analysoitiin CLC genomiikan työpöytään (CLCbio, Aarhus, Tanska). Lukee tuotiin CLC genomiikan työtasolla (käyttäen * .fna ja * .qual data), leikattu ja kartoitetaan viittaus lukien

EGFR

eksonin 19 sekvenssi sekä 50 bp alku- ja loppupään intronisekvenssit. Mediaani kattavuus eksonin 19 sekvenssit oli 7316 lukee (alue 3,717-17,368).

Patient näytettä /Ethics selvitys

Oheislaitteet verinäytteitä saatiin potilailta, joilla

EGFR

mutantti ja

EGFR

paino- NSCLC seuraava kirjallinen lupa. Tutkimuksen hyväksyi eettisen komitean lääketieteellisen tiedekunnan yliopiston Duisburg-Essenin (AZ. 10-4359).

Tilastot

valmisteleva tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen GraphPad Prism 4 (GraphPad ohjelmisto, La Jolla, USA) ja IBM SPSS Statistics versio 19 (IBM, Armonk, USA).

tulokset

herkkyys ja spesifisyys mutaation havaitsemisen

sen määrittämiseksi kynnys

EGFR

DelEx19 mutaation havaitseminen sulamiskäyräanalyysillä, olemme alun perin tutkittu sarjalaimennoksia genomi-DNA

EGFR

paino- A431-solujen ja NCI-HCC-827 -solut

EGFR

DelEx19 mutaatio (kuva 1a). Optimoimalla PCR parametrien ja sisällyttäminen paino-

EGFR

erityisiä LNA havaitsemisen herkkyyttä parannettiin 0,1%

EGFR

DelEx19-mutanttisekvensseistä (kuva 1b). Edelleen sarjalaimennoksia plasmidi-DNA: ta (pcDNA3.1.EGFRdelE746-A750) mutaation havaitsemisen kynnys oli niinkin alhainen kuin 0,01% (tuloksia ei ole esitetty).

A)

EGFR

DelEx19 mutaation havaitseminen in sarjalaimennetun DNA (50 ng /reaktio) A431-soluista (

EGFR

-wild kirjoita control) ja NCI-HCC-827-solut (

EGFR

DelEx19 mutantti ohjaus 1). Sulamispiikit osoitus

EGFR

-wild tyypin DNA (oikealla) ja

EGFR

DelEx19 (vasemmalla) voidaan selkeästi erottaa. Reaaliaikainen PCR-reaktiot suoritettiin lisäämättä lukittu nukleiinihappojen (LNA) ja sarja DNA laimennokset jopa 1:16. Vettä (H

2O, bottom line) ja 50 ng laimentamaton genomista DNA

EGFR

-wild tyyppi (A431) ja

EGFR

-mutant soluja (NCI-HCC-827) sisällytettiin kontrolleiksi (edustavia esimerkkejä päällekkäisiä reaktiot). B) Reaktiot suoritettiin kuten (A), mutta lisäämällä LNA (6 pmol). Huomaa tukahduttaminen

EGFR

-wild -modulointityyppiä, joka mahdollisti syrjintä on

EGFR

DelEx19 mutaatio signaalin jopa laimennus 1:1,024 ( 0,1%). C, D) Normaali perifeerisen veren näytteitä, joihin on lisätty määriteltyjen numeroiden (0, 1, 10, 100 solua /ml)

EGFR

DelEx19 mutantti NCI-HCC-827-soluja. Sen jälkeen immunomagneettisia rikastamiseen genomista DNA uutettiin ja sille reaaliaikainen PCR ja sulamiskäyräanalyysi lukien valvonta kuin (B). Edustavia tuloksia eristetyn genomisen DNA: leukosyyttejä solufraktioiden (CD45

-, C) tai CD326-rikastettu solufraktioiden (CD326

+, D) on esitetty. Molemmissa solufraktiois-

EGFR

DelEx19 mutaatio signaalit voivat olla selvästi erotettavissa

EGFR

-wild tyyppi tausta saakka kynnysarvo on 1 solu /ml. Mutaatio ei signaaleja ei havaittu CD45

+ tai CD326

– solufraktioiden (tietoja ei esitetty).

Seuraavaksi piikki verinäytteet terveillä vapaaehtoisilla määritelty solujen määrä NCI- HCC-827 soluja. Näytteet käsiteltiin kuten on kuvattu rikastuttaa piikki kasvainsoluihin, ja kaikki tuloksena solujen fraktioille tehtiin genomi-DNA: n eristäminen, reaaliaikaista PCR: llä ja sulamiskäyräanalyysi. Näissä kokeissa toistettavissa alempi havaitsemisraja oli 1

EGFR

-mutant solua per 1 ml perifeeristä verta (kuvio 1 c, d). Tämä protokolla sovellettiin sitten verinäytteitä kolmelta NSCLC potilaalla on

EGFR

wildtypic kasvaimia ja kaksi tervettä vapaaehtoista. DNA eristettiin kaikista solufraktiois- testattu negatiiviseksi

EGFR

DelEx19 mutaatioita (Suppl. Kuva S1 a-e).

Määrityksen validointi kliinisissä näytteissä

Validoida strategiamme CTC-rikastus ja mutaation tunnistus me takautuvasti saatu ääreisveren näytteitä 8 Metastasoivassa NSCLC kätkeminen

EGFR

DelEx19 mutaatioita, käsitellään meidän keskustaan ​​LUX-Lung 3 tutkimuksessa (EudraCT-nro. 2008-005615-18 ; [12]). Per tutkimus sisällyttämiskriteerit kaikki potilaat olivat histologisesti vahvistanut, lääketieteellisesti käsittelemättömät vaihe IIIB /IV keuhkojen adenokarsinooma (taulukko 1). Kaikki

EGFR

mutaatiot vahvistettiin keskeinen analyysi.

Verinäyte oli nimetty ”negatiivinen” varten

EGFR

-mutant CTC jos mutaatio signaali saatiin reaaliaikainen PCR-analyysi genomisen DNA eristettiin kaikista solufraktiois- (CD45

+, CD45

-, CD326

+ ja CD326

-) hankittu vastaavissa ajankohtana. Perustuu titrauskokeita tämä osoitti, että

EGFR

-mutant CTC laskenut alle 1 solu /ml verta. Siinä tapauksessa, että

EGFR

DelEx19 mutaatio havaittiin genomista DNA: ta vähintään yhden solun osa näyte todettiin ”positiivisiin”

EGFR

-mutant CTC.

Base line näytteet saatiin 7 päivän sisällä ennen tutkimusta hoitoa, peräkkäiset verinäytteet otettiin säännöllisin aikavälein hoidon ja seurannan. Kun taudin kliinistä etenemistä ja /tai hoidon lopettamisesta ylimääräinen otettiin verinäyte. Kaikkiaan 148 otettiin verinäytteet yli 36 kuukauden ajanjakson aikana ja analysoitiin esiintyminen

EGFR

-mutant CTC (mediaani: 12 näytettä /potilas; alue 7-56). Base line verinäytteitä 8 8 potilaalla (100%) olivat ”positiivisiin”

EGFR

-mutant CTC. Mielenkiintoista, peräkkäiset näytteet 4 8 potilasta kytketty ”negatiivinen” varten

EGFR

-mutant CTC sisällä mediaani 34 päivää (vaihteluväli: 20-84 päivää) hoitoajan (kuva 2 a-j). ”CTC negatiivisuuden” (eli alle 1

EGFR

DelEx19-mutatoitunut solu millilitrassa verta) keston mediaani 109 päivää (vaihteluväli: 35-199 päivää). Perimän DNA näytteistä näyttää vahva

EGFR

DelEx19 mutaatio signaali hotellin vastikään kehitetty määritys (esitetty kuvioissa 2A-2C ja 2F), analysoitiin Rochen 454 GS FLX + Titanium sekvensserin. Yllätykseksemme, yhdessäkään näistä näytteistä deleetio

EGFR

eksoni 19 voidaan havaita (tuloksia ei ole esitetty).

Edustavia esimerkkejä

EGFR

-mutant CTC analyysit ja kliininen kulku potilaiden mahdollisen validointi kohortti. Kaikkia potilaita hoidettiin sisällä LUX-Lung 3 tutkimuksessa vaiheessa IV

EGFR

-mutant NSCLC. Hoitojakso, kuvantamisen ajankohtina (CT) ja ajankohtina CTC analyysejä havainnollistetaan E ja J. Solid nuolet ”CTC positiivisuuden”, katkoviivoilla ”CTC negatiivisuus”. Tähdet osoittavat ajankohtina CTC analyysien /TT esitetty A-D, ja F-I. (A) Base linja analyysi potilaan 018 osoitti vahvaa

EGFR

DelEx19 signaalit kahteen solufraktiois- (CD326

+ ja CD45

-). (B, C) Sequential analysoi potilaan 018 paljastavat vahva

EGFR

DelEx19 signaaleja ainakin yhdessä asiaan solufraktio. (D) edustaja CT-kuvia potilaasta 018 at peruslinja, ja päivänä 84 hoitoajan vahvistaa etenevä sairaus. (F) Base line analyysi potilaan 017 vahvassa

EGFR

DelEx19 signaalit kahteen solufraktiois- (CD326

+ ja CD45

-). (G, H) Sequential analyysi potilaalla 017 osoittaa laski (G) ja negatiivinen (H)

EGFR

DelEx19 signaaleja molemmissa asiaa solufraktioita. (I) edustaja CT-kuvia potilaasta 017 at peruslinja, ja päivänä 84 hoitoajan vahvistaa osittainen vaste.

Association of EGFR mutantti CTC kanssa hoitotuloksia

Perustuen tämän havainnon olemme kyseenalaistaneet yhdistyksen

EGFR

-mutant CTC kanssa hoitovaste ja kesto meidän validointi kohortissa. Määrittelimme potilaalle ”

EGFR

-mutant CTC selvitetty”, jos kahden peräkkäisen verinäytettä ”negatiivinen”, eli

EGFR

-mutant CTC määrä laski alle 1 solu /ml. ”CTC toistuminen” julistettiin kun kaksi peräkkäistä verinäytteestä ”positiivisiin”

EGFR

-mutant CTC. Tulokset CTC mutaatiosta analyysin korreloivat radiologisten vastauksen arvioitava osana LUX-Lung 3 tutkimuksessa. Kaikki 4 potilaalla ”selvitetty”

EGFR

-mutant CTC saavutettu tautien torjuntaan, jossa 3 osittaista vastetta (PR) ja yksi stabiili tauti (SD) per RECIST. 4 potilaalla jatkuvia CTC niiden ääreisverenkierron ja jotka näin ollen jättänyt ”selvä”

EGFR

-mutant CTC vain yksi tavoite vastaus (PR) havaittiin, kun taas 2 potilaat saavuttivat SD ja yhden potilaan etenevä sairaus (PD ). Seurannassa kaikki 4 potilaalla on ”etäisyys” on

EGFR

-mutant CTC kehitetty PD.

EGFR

-mutant CTC palasi ”positiivinen”, mediaani 140 päivää (vaihteluväli 0-960 päivää) ennen röntgenkuvauksessa dokumentoitu PD. Siksi kasvu

EGFR

-mutant CTC laskee kynnyksen ylittävää 1 solu /ml voi olla ensimmäinen merkki taudin uusiutumisen ja vastustuskykyä potilailla, jotka ovat ”selvitetty” CTC. By valmisteleva tilastollisia analyysejä havaitsimme merkittävää yhteyttä (Spearman-Rho korrelaatiokerroin 0,868, p 0,01) välillä kesto ”CTC negatiivisuuden” ja aika hoidon epäonnistumiseen. Potilaat, jotka olivat ”selvitetty”

EGFR

-mutant CTC tason alapuolella havaitseminen osoitti merkittävästi pidentynyt aika hoidon epäonnistumiseen (mediaani: 355 päivää, alue: 189-1,086 päivää; p = 0,006, Log-rank-testi ) kuin potilailla, jotka jatkoivat ”positiivisiin”

EGFR

-mutant CTC (mediaani: 116 päivää, vaihteluväli: 84-173 päivää, Fig. 3).

Kaplan-Meier-analyysi vertaamalla TTF potilasryhmien kanssa ja ilman puhdistumaan CTC hoidon aikana. Potilaat ryhmiteltiin ”välys” (mediaani TTF 355 päivää) tai ”ei-tila” (mediaani TTF 116 päivää) on

EGFR

-mutant CTC-hoidon afatinib tai pemetreksedin /sisplatiinia. Ryhmät vertailtiin eksploratiivisen Kaplan-Meier-analyysi (p = 0,006, Log-rank-testi).

Keskustelu

Tällä hetkellä havaita sellaisia ​​geneettisiä poikkeavuuksia tuumorikudoksissa on kliinisesti kaikkein voimakas biomarkkeri kerrostuneisuus ”kohdennettu” lääkehoitojen metastaattisessa keuhkosyövän [13], [14]. Hoito gefitinibin ja crizotinib sekä ensilinjan erlotinibin, ehtona on osoitus

EGFR

mutaatioita ja

ALK

uudelleenjärjestelyjä. Mutaatio tunnistus on usein suoritetaan pienissä ja /tai arkistointia kasvaimen yksilöitä, jotka eivät välttämättä heijasta nykyistä genomista profiili hoidon aloittamisesta [15]. Lisäksi mutaation kirjo syövän muuttuu alla selektiivisen paineen tietyn terapian, joka voidaan paljastui peräkkäisellä koepaloja. Tätä taustaa vasten, havaitseminen syövän mutaatioiden muissa muodoissa kuin kasvainbiopsioissa on saavuttanut kiinnostusta. NSCLC, onnistunut havaitseminen mutatoituja DNA-sekvenssejä on raportoitu seerumin, plasman tai bronchioalveolar huuhtelunesteessä [16] – [19]. Kuitenkin useimmat näistä raporteista näkyy herkkyysasteeltaan alapuolella kliiniset vaatimukset.

varhainen systeeminen levittäminen syöpäsolujen pidetään of biologista merkitystä. Käyttämällä ensisijainen vasta-aineita epiteelin markkereita, levittää kasvainsoluja ja CTC on havaittu luuytimessä ja veressä potilaista, joilla oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia. Joukossa monenlaisia ​​vaihtoehtoisia strategioita haki CTC-rikastamiseen ja analyysi, automatisoitu järjestelmä immunocytometric havaitsemiseksi ja kvantitoimiseksi CTC on kehitetty, joka validoitu rinta-, eturauhas-, peräsuolen ja keuhkosyöpäpotilaita [2], [5], [8], [20] – [23]. Mielenkiintoista, absoluuttinen määrä CTC havaittu pitkälle syöpäpotilailla vaihteli huomattavasti riippuen CTC-eristäminen tekniikoita. Vaikka suuri määrä CTC havaittiin potilailla, joilla oli pienisoluinen keuhkosyöpä, absoluuttinen CTC numerot ja dynaaminen alue NSCLC tuntui liian alhainen laaja kliininen sovellettavuus. Siitä huolimatta se on tullut yhä selvemmäksi, että CTC populaatiot ovat fenotyypiltään heterogeenisiä ja epiteelin-merkki riippumaton rikastaminen lähestymistapoja ovat perusteltuja näyttää koko kuvaa CTC vuonna syöpäpotilaan tiettynä ajankohtana. Useat viimeaikaiset raportit tukevat tätä käsitystä johdonmukaisesti osoittavat suuremmat CTC numeroita verrattaessa epiteelin-merkki riippumaton CTC rikastaminen tekniikoita (esim väkevöimisen solukoko) kanssa laajasti soveltava CTC eristämistä valinta EpCAM ja CK-positiivisten solujen avulla CellSearch järjestelmää [5 ], [8], [24], [25].

tätä taustaa vasten me perusteltu, onko hyvää syöpään erityisiä somaattiset mutaatiot sijaan mikroskopia-pohjainen parametrit parantaa herkkyyttä CTC havaitseminen NSCLC. Olemme valinneet

EGFR

DelEx19 mutaatiot mallina kehittää erittäin herkkä, erityiset ja luotettava menetelmä mutaation havaitsemiseksi seokset genomisen DNA uutettiin CTC-rikastettu perifeerisen veren solupopulaatioiden. Uuden menetelmän soveltaa tässä tutkimuksessa on suunniteltu havaitsemaan valtaosa

EGFR

DelEx19 mutaatioita, etenkin kaikki mahdolliset mutantti vaihtoehdot häiritsevät kodoneja 746 ja 747

EGFR

geeni. Toisin kuin ennen tutkimusta analysoidaan vain EpCAM-positiivisten verisolujen [26] olemme valinneet puolueeton, epiteelin merkityllä riippumaton CTC rikastaminen strategia joissa näytteet jaettiin ja CTC rikastus aikaansaatiin kaksi lähestymistapaa, leukosyyttien yhdessä puolet näyte ja valinta EpCAM-positiivisten solujen toinen puoli. Tämä otetaan huomioon fenotyyppinen vaihtelevuus CTC, joka voi menettää yhden tai useamman epiteelin markkereita samalla irtoa ensisijainen kasvain tai etäpesäkkeitä [27] – [29]. Pilottikokeissa, immunofluoresenssi valittu CTC näytteiden pienisoluista keuhkosyöpää todellakin osoitti heterogeenisia CTC näyttää epiteelin, mesenkymaaliset ja sekoitetaan fenotyypit (tuloksia ei ole esitetty). Soveltamalla tätä puolueeton CTC-rikastamiseen lähestymistapa saavutimme 100% etsivä arvioida pilottitutkimuksessa kohortin 8 potilaalla on

EGFR

-mutant NSCLC. Mitä mielenkiintoisinta, havaitsimme yhdistys

EGFR

-mutant CTC kanssa hoitovastetta ja lopputulos. Nämä havainnot ovat todennäköisimmin johtua uusia ja erittäin herkkä mutaation tunnistusmenetelmä sovellettu tässä tutkimuksessa. Se on tunnustettu jo jonkin aikaa, että mutaatiot matalammalle tasolle 1% ei ole luotettavasti mahdollista seuraavan sukupolven sekvensoinnin sovellusten takia luontainen virhemääriä tätä tekniikkaa [30]. Vasta aivan äskettäin parannetun teknologian raportoitu tehden mutaatiot tasolle 0,1% ja alle mahdollisia [31], [32]. Sopusoinnussa näiden tulosten, emme pystyneet havaitsemaan

EGFR

Del19 mutaatioita seuraavan sukupolven sekvensoimalla genomisesta DNA näytteiden näyttämään yksiselitteinen mutaatio signaaleja hotellin vastikään kehitetty mutaatio detektiomäärityksen. Nämä havainnot osoittavat, että meidän äskettäin kehitetty mutaatio havaitsemismäärityksessä ilmeisesti näyttää korkeampi herkkyys kuin standardi seuraavan sukupolven sekvensoinnin tekniikoita. Toinen merkittävä piirre meidän mutaation havaitsemisen määrityksessä oli havainto, että eri

EGFR

DelEx19 mutaatiot johtivat eri sulamis- käyriä (katso kuva 2 ja suppl. Kuvio S1). Tämä johtuu todennäköisimmin ominaisuuksista yksi hybridisaatiokoetinten, joka on suunniteltu sitoutumaan

EGFR

eksoni 19 wildtypic sekvensseihin mahdollisten deleetiot johtavat dissosiaatiota koettimen aikana sulamiskäyräanalyysillä at eri lämpötiloja riippuen sekvenssin vastaavien poisto.

Vaikka nämä tulokset ovat lupaavia, olemme tietoisia siitä, että potilasryhmää analysoitiin tässä on hyvin pieni ja validointi suurempia potilasryhmissä myös ylimääräisiä mutaatioita tarvitaan. Tällä hetkellä yhtä herkkiä mutaation detektiomäärityksiä kattavat useita terapia-asiaan liittyvät alueet

EGFR

geeni (esim kodonit L858 ja T790) ja muut onkogeenien kehitetään.

Yhteenvetona ovat kuvanneet novel perustuva strategia CTC rikastamiseen ja erittäin herkkä havaitsemiseen somaattisista mutaatioista, joita voidaan soveltaa mutaatioanalyysiä profilointiin ja hoidon seurantaa tehoa potilailla, joilla

EGFR

-mutant NSCLC. By määritys optimointi olemme osoittaneet, että ongelma tunnetusti alhainen CTC laskee vaiheessa IV ei voi voittaa. Tämä voi olla yksi askel kohti visiota ”nestemäinen koepala” for vaarattomista molekyylidiagnostiikassa ja taudin seuranta Metastasoivassa keuhkosyöpä.

tukeminen Information

Kuva S1.

EGFR

DelEx19 mutaatio analyysi verinäytteistä NSCLC potilaalla on

EGFR

-wild tyypin kasvaimet ja terveillä verrokeilla henkilöitä. Perifeerisen veren näytteitä kolmen potilailla, joilla on

EGFR

-wild tyyppi NSCLC (A, B, C) ja kaksi tervettä vapaaehtoista (D, E) oli rikastettu, erotettu solufraktioiden ja altistetaan DNA: n eristä-, kuten on kuvattu. Mutaatio havaittiin suoritettiin reaaliaikaisella PCR ja sulamiskäyräanalyysi läsnäollessa LNA. Ei

EGFR

DelEx19 signaalia ei havaittu. H

2O (bottom line) ja 50 ng laimentamaton genomista DNA NCI-HCC-827-solujen ( ”

ohjaus 1

”), plasmidi-DNA, joka sisältää

EGFR

DelEx19 sekvenssi ( ”ohjaus 2”) ja A431-solut ( ”

EGFR wildtypic ohjaus

”) sisällytettiin negatiivisina ja positiivisina kontrolleina. Selvyyden vain yhden arvojen kaksoiskappaleita näkyvät.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0085350.s001

(TIF) B

Kiitokset

Kiitämme kaikkia potilaita osallistumaan Tämä tutkimus. Kaikki osaltaan henkilökunnan jäsenet osastot Medical Oncology, patologia ja Neuropathology, Länsi-Saksan Cancer Center, University Hospital Essen, ja osastot rintakehä Syöpätautien ja Interventionaalinen Keuhkosairausoppi, Ruhrlandklinik, ovat kiitti. Sabrina Schilling ja Sarah-Luise Stergar tunnustetaan erinomaista teknistä tukea ja Sabine Kasimir-Bauer varten hyödyllisiä keskusteluja ja neuvoja. Olemme kiitollisia Ivonne Nel ja Andreas-Claudius Hoffmann neuvoa ja erinomainen tekninen tuki immunofluoresenssivärjäyksessä. Saksan tutkimussäätiö (DFG) myönnetty tuki Julkaisukustannukset.