Krooninen sairaus

tiivistelmä

mitokondrion Bit1 (Bcl-2-estäjän transkription 1) proteiini on osa apoptoottisen reitin, joka on ainutlaatuinen säätelee integriinin välittämä kiinnitys. Kuten anoikis efektori, Bit1 vapautuu sytoplasmaan seuraavat menetys solujen kiinnittymistä ja indusoi kaspaasi-riippumaton apoptoosin muodossa. Ottaen huomioon, että anoikis vastus on kriittinen tekijä muutoksen, me arveltu, että syöpäsolut voivat kiertää Bit1 apoptoottista polku saavuttamiseksi kiinnittymisestä itsenäisyyttä ja Tuumorigeenisuustutkimuksissa. Tässä tarjoamme ensimmäiset todisteet kasvaimen estävä vaikutus on Bit1 mekanismin avulla, johon anoikis induktio ihmisen keuhkojen adenokarsinooma peräisin A549-soluja. Palauttamista Bit1 vuonna anoikis resistenttien A549-soluja on riittävä indusoimaan irtoaminen aiheuttamaa-apoptoosin huolimatta vika kaspaasin aktivaatio ja heikentää niiden kiinnittymisestä riippumatonta kasvua. Toisaalta, vakaa downregulation Bit1 näissä soluissa merkittävästi parantaa niiden anoikis kestävyys ja kiinnittymisestä riippumattomaan kasvuun. Bit1 Knockdown soluilla merkittävästi parannettu tumorigenecity

in vivo

. Aikaisemmin on osoitettu, että ydin- TLE1 corepressor on oletettu onkogeenin keuhkosyöpä, ja osoitamme tässä, että TLE1 estää Bit1 välittämää anoikis osittain sitomalla pro-apoptoottisen kumppani Bit1, aminoterminaalisen Enhancer of Split (AES) proteiini, tumaan. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että tuumoria tukahduttavan rooli kaspaasin riippumaton anoikis efektori Bit1 keuhkosyövässä. N rooli tuumorisuppressorina, olemme havainneet, että Bit1 on vaimentua ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kudoksiin.

Citation: Yao X, Jennings S, Irlanti SK, Pham T, Temple B, Davis M, et al. (2014) Anoikis Effector Bit1 Näyttää tuumoria tukahduttavan Tehtävä Keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 9 (7): e101564. doi: 10,1371 /journal.pone.0101564

Toimittaja: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 maaliskuu 2014; Hyväksytty: 8 kesäkuu 2014; Julkaistu: 08 heinäkuu 2014

Copyright: © 2014 Yao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen tietokantojen

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Louisiana Cancer Research Consortium (LCRC) Käynnistä Grant (HB), NIH RCMI G12RR026250-03 Grant (Xavier University of Losuiana), ja NIH 1R15CA158677-01A1 Grant (HB). Nämä rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kriittinen tekijä pahanlaatuisen epiteelin fenotyyppi on ankkurointiriippumattomuudeksi. Menetys tuki- riippuvuuden solunulkoiseen matriisiin pahanlaatuisten solujen ne voivat kasvaa ilman soluadheesiota, levittää kolmiulotteisessa matriisissa, hyökätä viereisiin kudoksiin, ja etäpesäkkeitä kaukaisiin elimiin [1], [2]. Molekyylimekanismeja ja solureiteillä taustalla kiinnittymisestä itsenäisyyttä syöpäsolujen on tutkittu laajasti [3], ja useimmat näistä molekyyli muutoksiin antaa pahanlaatuisten solujen kykyä kiertää anoikis ohjelma, joka on käytössä normaaleissa soluissa. Ottaen huomioon, että jaottelu anoikis ohjaus edistää kasvua ja maligniteetin monien kiinteiden kasvainten, palauttaminen anoikis herkkyys on tärkeä terapeuttinen strategia kuriin kasvaimen aggressiivisuus ja etäpesäkkeiden. Näin ollen, tunnistaminen uusien mole- tavoitteita anoikis-välitteisen solukuoleman reaktiotien on merkittäviä terapeuttisia vaikutuksia.

kaksi apoptoottisia reittejä, mitokondrio (luontainen) ja solukuolemaa reseptorin (ulkoinen), on osoitettu säädellä anoikis käsitellä asiaa. Seuraavat irtoaminen aiheuttama menetys integriini-välitteisten selviytymisen signalointi, luontaisen apoptoottisen reitin laukaisee aktivaation kautta pro-apoptoottisen jäsenten BCL perheen proteiinit (mukaan lukien Bax, Bad, Bid ja Bim). Nämä proteiinit laukaista läpäiseväksi ulomman mitokondriokalvon johtaa sytosolisten vapautumisen sytokromi c: n ja alavirran kaspaasi entsyymien [5], [6]. Tämä mitokondrioiden riippuva kaspaasin aktivaatio silmukka, joka voidaan edelleen monistaa kautta downregulation ilmentymisen anti-apoptoottisten Bcl perheenjäsenten (kuten Bcl-2 ja Bcl-x L), jotka toimivat vartiointi- mitokondrioiden eheys [7], voi lopulta johtaa DNA: n fragmentoituminen ja solukuolemaa. Kuoleman reseptori (ulkoista) reitin riippuu sitova kuoleman ligandien (Fas tai TRAIL) kuolemaan reseptoriin ja hyödyntää muodostumista kuoleman aiheuttavia signalointikompleksiin (DISC) aktivoinnissa loppupään kaspaasi-8. Tämä kuolema reseptori-välitteisen kaspaasi 8 aktivaatio voi vaikuttaa epävakautta mitokondrion kalvon, joka johtaa apoptoosin [8], [9]. Vaikka lähentymistä ja ylikuulumisen välillä ulkoisten ja sisäisten apoptoottisten reittien olemassa eri tasoilla, sekä reitit luottaa kaspaasin aktivaatio silmukan aikaansaamiseksi solukuolemaa. Kuitenkin nousi esiin, mikä olisi osoitus kaspaasi riippumattomia mekanismeja anoikis [10],. Erityisesti inhibitio kaspaasin aktivaatio joko yli-ilmentymisen Bcl-2 tai hoito maailmanlaajuinen kaspaasi-inhibiittorit ei pysty estämään pohjapinta anoikis kasvainsoluissa arvioituna DNA-ladder-analyysi [10]. Toissijaisesti kaspaasi riippumaton tilassa anoikis on tärkeä terapeuttinen tavoite kasvaimia, joilla on vammaisen kaspaasiriippuvaisen apoptoosireittiä.

Ruoslahti ja kollegat ovat äskettäin tunnistaneet uuden integriini-riippuvaisen apoptoottisen reitin, joka välittää mitokondrion Bit1 (Bcl2, estäjä transkription 1) proteiini [11]. Seuraavat menetys integriinin välittämä solujen kiinnitys, Bit1 vapautuu sytoplasmaan, muodostaa kompleksin transkription säätelijäproteiinien AES, ja sen jälkeen indusoi kaspaasi-riippumaton tilassa apoptoosin. Vaikka tunnetaan useita anti-apoptoottisia tekijöitä, kuten Bcl-2, Bcl-xl, Akt on tehoton estämään Bit1 apoptoosin, integriini-välitteinen kiinnitys on ainoa anti-apoptoottisia hoito, joka voi estää Bit1 apoptoosin toiminto [11]. Ottaen huomioon, että integriinin välittämä soluadheesiota, erityisesti α5β1-integriiniin, on ainoa vastavirran hoito, jotka voivat estää Bit1 apoptoosireitin, Bit1 voi olla tärkeä rooli anoikis valvojana tuki- riippuvuuden [11] – [15]. Joka perustuu kyvyttömyys kaspaasi-inhibiittoreita Bit1 apoptoosin ja puuttuminen kaspaasin aktivaation Bit1 transfektoiduissa soluissa Bit1 reitti voi edustaa yhtä kaspaasi-riippumaton anoikis mekanismeja pahanlaatuisten solujen [11]. Siten Bit1 apoptoottinen reitti näyttää olevan houkutteleva terapeuttinen kohde kiertämisessä anoikis vastus erityisesti syöpäsolujen osoittavat puutteellinen kaspaasiaktiivisuus. Hyödyntäminen Bit1 terapeuttisena kohteena edellyttää yksityiskohtaista tarkastelua mekanismi sen apoptoosin toiminta, jota on havaittu olevan riippuvainen osittain sammuttamalla eloonjäämistä edistävän geenin transkription ohjelma ohjaa groucho transkription corepressor TLE1 [15].

rooli Bit1 on anoikis on osoitettu useissa transformoiduista solulinjoista. Geenimanipulaation lähestymistapoja, olemme osoittaneet, että eksogeeninen ekspressio mitokondrioiden Bit1 estää anoikis vastus useiden kasvainsolulinjojen kun downregulation endogeenisen Bit1 ilmentymisen edelleen hämmentää niiden anoikis ali- [11] – [15]. Koska hankinta anoikis vastus on tärkeä tekijä neoplastisten muutosta ja metastaattinen potentiaali [1], [2], tukahduttaminen Bit1 anoikis väylän pahanlaatuiset solut voivat edistää syövän etenemiseen, erityisesti hankkimalla kehittyneitä tuumorigeenisemmiksi ja metastaattinen käytös. Todellakin, meidän aikaisemmat tutkimukset osoittivat, että Bit1 voi toimia vaimennin etäpesäkkeiden

in vivo

[14]. Vaikka tarkkaa mekanismia taustalla sen etäpesäkkeitä estävä vaikutus jää määritelty, Bit1 anoikis indusoiva toiminta voi olla nopeutta rajoittava vaihe etäpesäkkeitä prosessissa. Mielenkiintoista, rooli Bit1 kasvainten synnyssä ei ole osoitettu tähän mennessä.

lähemmin käsitellä roolia Bit1 syövän muodostumista, olemme suorittaneet alustavan verkossa tietokantahaku tutkia Bit1 ilmentyminen muuttuu erilaisissa ihmisen kasvaimissa verrattuna niiden normaaliin kollegansa. Kiinnostavaa, olemme havainneet, että Bit1 ilmentymistä selektiivisesti ja merkittävästi vaimentaa keuhkosyöpä. Tämä alustava havainto, yhdessä viimeaikaisten todisteiden dokumentointia että TLE1 voi toimia keuhko erityinen onkogeeni [16], on saanut meidät tutkimaan merkitystä Bit1 apoptoottisen väylän anoikis insensitiivisyys ja Tuumorigeenisuustutkimuksissa Non pienisoluinen keuhkosyöpä ( NSCLC), joka on kaikkein aggressiivinen muoto keuhkosyöpään ja on erittäin solunsalpaajaresistentti johtuu osittain puutteellinen kaspaasiriippuvaisen apoptoosireitin [17], [18]. Tässä osoitamme, että eksogeeninen Bit1 kiertää anoikis vastus ihmisen keuhkojen A549-solujen aktivaation kautta kaspaasi-riippumattoman apoptoosin ja heikentää niiden kiinnittymisestä riippumattomaan kasvuun. Tasaisen, knockdown endogeenisen Bit1 näissä soluissa edelleen parantaa niiden anoikis sieto ja kiinnittymisestä riippumatonta potentiaalia

in vitro

ja voimistaa niiden tuumorigeenisia kasvu

in vivo

. Mukaisesti sen kasvain tukahduttava toiminto, Bit1 ilmentyminen havaittiin vaimentua NSCLC kasvaimissa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja transfektio määritykset

NSCLC A549 ja H460 solu linjat saatu American Type Culture Collection (ATCC) viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), jossa glutamiinin, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia, penisilliiniä ja streptomysiiniä. Vakaa A549 johdettu ohjaus ja Bit1 shRNA allas soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), jossa glutamiinin, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia, penisilliiniä, streptomysiiniä, ja 1 ug /ml puromysiiniä (Invitrogen). Ohimenevä transfektio määritykset suoritettiin lipofektamiinin 2000 (Invitrogen) ja A549-soluja ja Lipofectamine LTX reagenssia (Invitrogen) ja H460-soluja OPTI-MEM (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollan kanssa kokonaismäärä käytetyn plasmidin transfektiota kohden normalisoituna vastaavan tyhjän vektorin konstrukti.

Kemialliset reagenssit, vasta-aineet, ja plasmidit

Poly (2-hydroksietyylimetakrylaatti (Polyhema) ja hiiren monoklonaalinen anti-FLAG, anti-AES, anti-GFP: n ja anti- -B-aktiini-vasta-aineet hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO). polyklonaalinen anti-TLE1-vasta-aine saatiin Abcam (Cambridge, MA). kaspaasi-inhibiittori zVad-fmk ja anti-myc-vasta-aine hankittiin Calbiochem ( La Jolla, CA). anti-kaspaasi-3, anti-pilkottiin kaspaasi-3: n, Bcl-2, Bcl-xl, Bax, Bad, ja anti-PARP-vasta-aineita saatiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). nisäkkään ilmentämisvektori, joka koodaa mitokondrioiden Bit1 muodostettiin kuten aiemmin on kuvattu [11]. GFP-TLE1 plasmidit saatiin Origene (Rockville, MD). Konstrukti, joka koodaa solun kuoleman domeenin (CDD) on Bit1 saatiin tri Erkki Ruoslahti (Sanford-Burnham Medical Research Institute) ja on aiemmin tunnettu [19].

siRNA ja shRNA transfektio

Euroopan TLE1 erityinen siRNA: t ja ohjaus ei-suunnattu siRNA: ita ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Ohimeneviä transfektion kokeissa, A549-solut (2 x 10

5) transfektoitiin 25 uM kutakin siRNA käyttäen Lipofectamine RNAiMAX transfektioreagenssia (Invitrogen). 48 tuntia transfektion jälkeen solut kerättiin ja alistettiin immunoblottaus tai anoikis määrityksissä, kuten on kuvattu alla. Tavoitteena on tuottaa vakaa A549 Bit1 Knockdown ja ohjaus altaat, A549 vanhempien soluja transfektoitiin PRS vektorin sisältävä lyhyt hiusneula-RNA vastaan ​​TLE1 (Origene) tai ei-kohdentaminen salattu shRNA (Origene). 48 h transfektion jälkeen, 1 ug /ml puromysiiniä (Invitrogen) lisättiin alustaan ​​valikoida puromysiiniresistenttejä klooneja. Yksittäiset puromysiiniresistenttejä klooneja seulottiin Bit1 downregulation immunoblottauksella käyttämällä spesifistä vasta-ainetta Bit11 [15]. Kaksi Bit1 shRNA Knockdown-positiivisia klooneja ja kahden vertailuryhmän shRNA kloonia yhdistettiin edelleen karakterisointia.

Apoptoosin analysointi, anoikis, ja solujen elinkelpoisuus

Apoptoosi määritettiin kvantitatiivisesti taso sytosolin nukleosomaalisten fragmenttien käyttämällä Cell Death Detection ELISA-kittiä (Roche Molecular Biochemicals) kohti valmistajan ohjeiden [14], [15]. Joilla arvioidaan anoikis solukuoleman, solut maljattiin Polyhema päällystetty 96-kuoppaisille levyille täydelliseen kasvualustaan, joka sisälsi 0,5% metyyliselluloosaa, jonka tiheys on 1,0 x 10

4 /kuoppa eri ajankohtina, kuten aikaisemmin on kuvattu [14], [15 ]. Erillinen Sitten solut kerättiin ja alistettiin Cell Death ELISA apoptoosimäärityksessä. Solujen elinkelpoisuus kvantifioitiin alarmar sininen värjäys (Invitrogen) ja myöhemmin fluoresenssilukema (485 nm: n virityksellä aallonpituudella ja 520 nm: n emission aallonpituus) käyttämällä mikrolevyn lukijaa (BioTek Instruments).

Solulisääntyminen ja pehmeä agar määritykset

Anchorage-riippuvaista kasvua määritettiin maljaamalla solut tilavuudessa 150 ui tiheydellä 2000 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille. Kullakin määritettynä ajankohtana, määrä metabolisesti aktiivisia soluja mitattiin käyttämällä MTT-analyysi, kuten aiemmin on kuvattu [15]. Lyhyesti, kymmenen mikrolitraa MTT-reagenssia 5 mg /ml (Sigma) lisättiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppalevylle. Levyä inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa, 5% CO2: ssa 3 tuntia. Sen jälkeen tuloksena saatu MTT sakka liuotettiin 100 ui 50% MeOH-50% DMSO-liuosta, ja altistetaan 550 nm absorbanssi käsittelyn kautta mikrolevylukijalla (BioTek Instruments). Ankkuroinnista riippumattoman kasvun solujen assesed käyttäen 96-kuoppaisen levyn muodossa [15]. Kuten aiemmin on kuvattu, 5000 soluja 0,3% agaria Liuos maljattiin kuoppiin esipäällystetty 0,6% agar viljelyalustassa. Kasvu saadut pesäkkeet kvantifioitiin alarmar blue -värjäyksellä (Invitrogen) ja fluoresenssin lukemista 485 nm viritysaallonpituudella ja 520 nm emissioaallonpituudella mikrolevyspektrofotometrillä levylukijalla.

Caspase aktivaatiomääritys

Kaspaasi -3 aktiivisuus määritettiin fluorimetrisesti käyttämällä substraattia Ac-DEVD-AFC alustan ja suoritettiin valmistajan ohjeiden (Roche Applied Science).

Protein valmistelu ja western blotting määritykset

Protein valmistelu ja Länsi blottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [14], [15]. Lyhyesti, solut kerättiin 24-48 tuntia transfektion jälkeen eri konstruktioita tai siRNA: ita lisäämällä jääkylmää NP-40 lyysipuskuria (1% NP-40; 20 mM Tris-HCI [pH 7,4]; 150 mM NaCl; 10% glyserolia , 2 mM natriumvanadaattia, 1 mM henylmethylsulfonyl fluoria; 10 ug /ml leupeptiiniä ja 5 ug /ml aprotiniini), ja niitä inkuboitiin 4 ° C: ssa 20 min. Sillä immunoblottausanalyysi, yhtä suuret määrät proteiineja erotettiin 4-20% kaltevuus Tris-glysiini geeleillä (Invitrogen) ja siirrettiin elektroforeettisesti nitroselluloosakalvolle. Membraanit inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa, jota seuraa sekundaarisia vasta-aineita on konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin. Membraanit kehitettiin käyttämällä ECL-detektointijärjestelmällä.

Solunosafraktiointi

Solunosafraktiointi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [15]. Lyhyesti, transfektoituja soluja viljeltiin kiinnitetään tai irrotetaan olosuhteissa ilmoitettuina aikoina otettiin talteen pestiin kerran PBS: llä, suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan isotonista mitokondrion-puskuria (250 mM mannitoli, 70 mM sakkaroosi, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES [pH 7,5]) , ja homogenoitiin 40 iskulla Dounce-homogenisaattorissa. Lysaatit sentrifugoitiin 500 x g: ssä 5 min poistamiseksi tumien ja ehjä soluja. Supernatantti sentrifugoitiin edelleen 10000 x g 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa eristää mitokondrioiden rikastetun pelletti. Saatu soluliman supernatantti altistettiin SDS-PAGE-elektroforeesilla ja immunoblottaus. Erottamiseksi sytosoliin ja tumafraktios-, NE-PER ydinaseiden eristäminen (Pierce, nro 78833) käytettiin ja suoritettiin valmistajien ohjeiden mukaisesti [15]. Proteiinipitoisuus eri fraktioissa kvantifioitiin käyttäen Bio-Rad proteiinimäärityksellä kit BSA standardina.

Coimmunoprecitation määrityksessä

Coimmunoprecipitation määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [15]. Lyhyesti, transfektoidut solut kerättiin pesemällä kerran PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen jääkylmään Nonidet P-40 lyysipuskuria (1% Nonidet P-40, 20 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 10% glyserolia, 2 mm natriumvanadaattia, 1 mm fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 10 ug /ml leupeptiiniä ja 5 ug /ml aprotiniini), jota seurasi 20 minuutin inkubaatio 4 ° C: ssa. Solujätteet poistettiin sentrifugoimalla. Myc-merkityn Bit1 immunosaostettiin anti-Myc-agaroosi-konjugaattia (Abcam), kun taas GFP-merkitty TLE1 immunosaostettiin anti-GFP-agaroosia (Medical and Biological Laboratories). Immunopresipitaattia pestiin perusteellisesti lyysipuskurilla. Sitoutuneet proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja Western-blottaus suoritettiin käyttäen vastaavaa vasta-ainetta.

In vivo

tuumorigeneesiä määritys

Kaikki toimenpiteet tehtiin protokollien mukaisesti hyväksytty institutionaalisten komitea käytön ja hoidon Laboratory Animals Xavier University of Louisiana Institutional Animal Care ja Käytä lausunnon (IACUC, hyväksynnän numero 060911-001BI). Kahdeksan viikon ikäisiä naaras kateenkorvattomia nude-hiiriä (BALB /c) käytettiin tuumorigeneesin määrityksissä. A549 johdettu ohjaus shRNA ja Bit1 shRNA soluja (1,0 x 10

6) injektoitiin ihon alle. Kasvain koot mitattiin määräajoin kanssa tulkki, ja kasvaimen tilavuus määritettiin kaavan (d1 x d2

2) /2, jossa d1 vastaa suuremman halkaisijan ja D2 pienempi halkaisija. Hiiret tapettiin, kun ensisijainen kasvaimet saavuttivat 2 cm halkaisijaltaan.

In Situ Apoptosis Detection

Detection apoptoottisten solujen valvonnan shRNA ja Bit1 shRNA tuumorisektioiden suoritettiin käyttäen DeadEnd Kolorimetrinen TUNEL-järjestelmä ( Promega) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, leikkeet parafiini, vedettömät, ja inkuboitiin proteinaasi K: lla 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. PBS-pesun jälkeen, leikkeitä inkuboitiin on työskentelytila ​​pitoisuus rekombinantti-Terminal deoksinukleotidyylitransferaasia (TTKK) 37 ° C: ssa 1 h. Leikkeet pesty PBS: llä ja upotettiin 0,3% vetyperoksidia endogeenisen peroksidaasin salpaamiseksi toimintaa. Leikkeet pestiin sen jälkeen PBS: llä ja inkuboitiin streptavidiini-HRP ratkaisu. Saatu tummanruskea signaali visualisoitiin Diaminobenzidine (DAB) kromogeenina.

Ihmisen keuhkojen kasvain kudosta erilaisia ​​analyysi

Ihmisen kasvainkudoksen array dioja sisältävä okasolukarsinoomia, adenokarsinooma, suuremman solun syöpä, ja vastaaviin normaaleihin keuhkokudokset saatiin US Biomax, Inc. (Rockville, MD). Immunohistokemia menettely suoritettiin Biomax- Inc. kahteen kudokseen microarray dioja. Kuten aiemmin on kuvattu [14], [15], kudoksen array objektilasit deparaffinised, sammutettua ja alistettiin antigeenin haku. Levyjä inkuboidaan sitten 2,5% normaalia hevosen seerumia ja 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, mitä seuraa inkubaatio primaarisen vasta-aineen (1:100 laimennos) 1 h huoneen lämpötilassa. Affiniteettipuhdistetun kanin anti-Bit1-vasta-aine (HPA012897), joka oli aiemmin testattu sen spesifisyys [14], [15] hankittiin Sigma. Kanin normaalia seerumia käytettiin negatiivisena kontrolli vasta-korvaamaan ensisijainen vasta-aineen säätöluistiin 1 tunnin inkuboinnin. Tissue array jälkeen objektilasit pestiin ja inkuboitiin ImmPRESS reagenssilla (Vector Laboratories), jota seuraa käsittely peroxidise substraatin DAB-liuoksella (DAKO Cytomation). Objektilasit pisteytettiin keskimääräinen Bit1 värjäytymisen intensiteetti kaksi tutkijaa ilman tietoa patologisen tilan näytteitä. Keskimääräinen värjäytyminen luokiteltiin 0, ei värjäystä; 1, lievä värjäys; 2, kohtalainen värjäytyminen; ja 3, vahva värjäytyminen.

Tilastollinen

Tulokset esitetään välineet (± S.E.). Länsi-blotit ja anoikis määritykset, kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa kolmen rinnakkaisen. Tilastolliset erot ryhmien välillä oli vahvistettu P-arvo 0,05 käyttäen kaksisuuntaisia ​​Studentin t-testiä. Keuhkosyövän kasvainkudoksen erilaisia ​​analyysi, yksisuuntainen ANOVA ja sitä seuraava post hoc testaus käyttäen Tukey-Kramer monivertailukoetta käytettiin vertaamaan keskimääräinen värjäytymisen intensiteetti kussakin tapauksessa tyypin [14], [15]. Kaikki laskelmat tehtiin käyttäen sävyä NCS tilasto-ohjelmalla (sävyä NCS, Kasville, UT) B

Tulokset

Euroopan Anoikis Resistance A549-solujen liittyy puute Merkittävä kaspaasiaktiivisuus

NSCLC solut tunnetusti tiedetään olevan vastustuskykyisiä erilaisia ​​apoptoottisen ärsykkeitä kuten kuolema reseptorin stimulaation, sytotoksiset lääkkeet, ja säteily. Kyky NSCLC kiertää apoptoosin syyksi on osittain tehoton kaspaasi-riippumaton koneet [17], [18]. Kuitenkin mekanismit kuinka NSCLC lohkojen anoikis ei ole tutkittu perusteellisesti. Vastatakseen mahdollisen käyttökelpoisuuden kaspaasin riippumattomia mekanismeja kiertämiseen anoikis vastus NSCLC-solujen, ensin tutkinut panos kaspaasi väylän anoikis. Yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien [20], NSCLC A549 osoitti hyvin vähäistä apoptoosin viljeltynä suspensiossa (kuvio 1A). Staurosporiini (STS), joka on voimakas estäjä, merkittävästi indusoi apoptoosia näissä soluissa (kuvio 1A). Vastatakseen rooli kaspaasin riippuvainen väylän anoikis saarto A549-soluja, tutkimme sytosolin vapauttamaan mitokondrion sytokromi c-proteiinia (keskeinen tekijä aktivoinnissa loppupään kaspaasi effektorit) aikana irtoaminen. Toisin kuin STS käsitellyt solut, jotka osoittivat huomattavia määriä sytokromi c: n sytoplasmaan, irrotettuja soluja esillä ainoastaan ​​pieniä määriä sytokromi c: in sytoplasminen osa (kuvio 1 B). Seuraavaksi seurataan aktivointi alavirran tai executioner kaspaasi 3 kautta pilkkominen fluoresoivan kaspaasi-3-substraattia (kuvio 1C) ja käsittely pro-kaspaasi 3: sta immunoblottauksella (kuvio 1 D). Mukaisesti eivätkä ne merkittävästi sytosolin sytokromin c vapautumiseen, erillinen A549-solut eivät osoittaneet merkittävää kaspaasi 3 aktivaation (kuvio 1 C) ja ei ollut mitään käsittelyä pro-kaspaasi 3 (kuvio 1 D). Loppuun tavoite kaspaasin kone on pilkkoa ydin- poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) proteiini [5], [6]. Kuten on esitetty kuviossa. 1E, PARP pysyi suhteellisen koskemattomana sen alkuperäisessä 116 kDa muodossa irrottaa A549-soluja (kuvio 1 E). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että anoikis vastus A549-soluja on liitetty tehoton sytokromi c /kaspaasiriippuvaisen solukuolemareittiin.

. Soluja viljeltiin on kiinnitetty (A) tai irrottaa ECM 24 tunnin ajan (D24) ja 48 tunnin (D48) ja kerättiin apoptoosin analyysillä käyttämällä Cell Death Elisa ELISA. Samanaikaisesti solut käsiteltiin myös 1 uM staurosporiini (STS) 24 tunnin ajan ja altistettiin Cell Death Elisa ELISA. B. Sytosoliset fraktiot saatiin solujen A ja niistä analysoitiin sytokromi c Western blot. C. läsnäolo kaspaasi-3-kaltaisen aktiivisuuden solulysaateissa soluista käsiteltiin A määritettiin pilkkomalla fluoresoivan substraatin z-DEVD-AFC (DEVD). D. ja E. Solut A alistettiin western blotting havaita käsittelyä pro-kaspaasi 3 (D) ja PARP (E). A ja C, kolmen erillisen kokeen suoritettiin kolmena rinnakkaisena, * osoittaa p 0,05 verrattuna liittyvät ehdot (Studentin t-testi).

Bit1 heikentää Anoikis resistanssi keuhkosyöpä solujen

Kun otetaan huomioon, ettei merkittäviä irronnut indusoiman kaspaasin aktivaation A549-soluja, me sitten tutkitaan rooli Bit1 solukuolemareittiin kiinnikkeessä riippumaton eloonjäämistä näissä soluissa. Lisäsimme ilmentymistä mitokondrioiden Bit1 A549-soluihin transfektoimalla Bit1 rakenteen, joka ilmentää Bit1 proteiinin yksinomaan mitokondrioissa (Bit1 mito) [11], [15], ja testattiin solujen kykyä selviytyä ilman liitetiedoston ECM: stä. Bit1 mito ja ohjaus transfektoituja soluja oli samalla tasolla spontaanin apoptoosin, kun niitä kasvatetaan kiinnitetty viljelymaljalle (kuvio 2A). Sen silmiinpistävä sijaan Bit1 mito transfektoidut solut osoittivat huomattavasti apoptoosin kuin kontrolli solujen upon irtoaminen. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin, kun Bit1 mito tuotiin ihmisen NSCLC H460 solulinjassa (kuva S1). Puuttua spesifisyys anoikis induktion Bit1 mito, suunnattiin Bit1 ilmentymistä sytoplasmassa A549-solujen kanssa käyttämällä Bit1 rakenteen, joka sisältää tunnisteen, N-terminaalisen alueen Bit1 proteiinin (Bit1 cyto) [11] , [15]. Eksogeeninen ekspressio sytoplasmisen paikallisia Bit1 (Bit1 cyto) A549 (kuvio 2B) ja H460 (kuvio S2-solut) laukeaa apoptoosin. Solukuolemaa domeeni (CDD) on Bit1 äskettäin kartoitettu N-terminaalista 62 aminohappoa, ja sen osoitettiin olevan tehokas apoptoosin indusoimiseksi rintasyöpäsoluissa [19]. Käyttöönotto CDD peptidin myös johtanut apoptoosia A549- (kuvio 2C) ja H460 (kuvio S3) soluja. Karakterisoimiseksi Bit1 anoikis väylän A549-soluja vahvisti, että Bit1 laukaista solukuolema riippumaton kaspaasien. Ensin ei havaittu huomattavia käsittely pyöveli kaspaasi 3 Bit1 transfektoiduissa soluissa (kuvio 2D). Toiseksi loppupään ydin- substraatin kaspaasien, PARP, säilyi ennallaan (kuvio 2D). Kolmanneksi yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä z-Vad-fmk oli tehoton estämään Bit1 aiheuttama anoikis (kuvio 2E). Yhdenmukainen puute Bit1 vaikutus kaspaasin aktivaatio, ilmaus apoptoosin perheen säätimiä, jotka ohjaavat kaspaasiriippuvaisen mitokondrioiden apoptoottisen reitin ei muuttunut Bit1 (kuvio 2D). Erityisesti, vakaan tilan tasot anti-apoptoottisten Bcl-2 ja Bcl-XL-proteiinit samoin kuin pro-apoptoottisen Bax ja Bad proteiinit pysyivät ennallaan ektooppinen Bit1 sekä kiinnittää ja irrottaa olosuhteissa. Nämä havainnot osoittavat, että Bit1 voivat kiertää anoikis vastus keuhkosyövän solujen induktion kautta kaspaasi-riippumaton apoptoottisen reitin.

. Solut transfektoitiin C-terminaalisesti myc-leimatun mitokondrioiden paikallinen Bit1 (Bit1 mito) tai tyhjän vektorin konstruktia. 24 h transfektion jälkeen soluja viljeltiin on kiinnitetty tai irrottaa ECM. Seuraavat 48 h viljelyn jälkeen solut kerättiin ja analysoitiin apoptoosin määrän mittaamiseksi DNA-histoni-fragmenttien (Cell Death ELISA). B ja C. Solut transfektoitiin N-terminaalisesti myc merkitty sytoplasminen paikallinen Bit1 (Bit1 cyto) (B), Bit1 solukuolemaa verkkotunnuksen (CDD) (C), tai vektorirakenne ja 48 tuntia myöhemmin, solut altistettiin Cell Death ELISA. D. Vector tai Bit1 mito transfektoituja soluja viljeltiin on kiinnitetty (A) tai irrottaa (D) ECM varten ilmoitettu kertaa. Sitten solut otettiin talteen ja niille suoritettiin Western blotting vastaan ​​spesifisten vasta-aineiden kaspaasi-3, PARP, Bcl-2, Bcl-xl, Bax, Bad, myc, ja B-aktiini. E. Bit1 mito transfektoituja soluja viljeltiin kiinnitetään tai irrotetaan olosuhteissa, kun läsnä on z-Vad-fmk (50 uM) tai DMSO: ta 48 tuntia. Sitten solut otettiin talteen ja saatettiin Cell Death ELISA. A, B, ja C, kolmen erillisen kokeen suoritettiin kolmena rinnakkaisena, * osoittaa p 0,05 Studentin t-testillä.

varmistamiseksi edelleen roolia Bit1 kuin anoikis efektori keuhkosyövän, me tutki knockdown endogeenisen Bit1 lauseke vaikuttaa anoikis epäherkkyys A549-solut. Me perusteltu, että A549-solut käyvät läpi anoikis kun pitkäaikainen kulttuurin jousitus ja jos ablaation Bit1 apoptoottinen reitti voi tarjota anoikis suojaa. Todellakin, pitkään kestäneen 72 tunnin viljelyn suspensiossa, irrallaan A549-solut lopulta näkyi merkkejä apoptoosin (kuvio 3A). Havaittu anoikis induktio ei liittynyt mitään merkittäviä käsittelyn kaspaasi 3 ja PARP (kuvio 3B), mikä osoittaa, että vaihtoehtoisia solukuoleman mekanismin (t), muut kuin kaspaasi-riippuvaisen reitin on mukana. Sitten vaimentua Bit1 ilmentymistä A549-soluja kautta lyhyen häiritseviä RNA: t (siRNA: t) ja alistanut Bit1 ja ohjaus siRNA käsiteltyjen solujen anoikis määritystä. Kaksi Bit1 erityisiä siRNA: t # 1 ja # 2 osoitti merkittävää 70-80% downregulation Bit1 ilmentymisen (kuvio 3C). Verrattuna A549 vanhempien tai ohjaus siRNA käsiteltyjen solujen Bit1 siRNA transfektoidut solut osoittivat vähentynyttä apoptoosia jälkeen 72 h kulttuuri suspension (kuvio 3D). Täydentää nämä tulokset, myös syntyy kaksi stabiilia Bit1 pudotus A549 peräisin klooneista, nimittäin Bit1 shRNA1 ja Bit1 shRNA2, kunkin kloonin ilmentämään selvä Bit1 shRNA, joka on kohdistettu eri sekvenssi 3′-ei-koodaavan alueen Bit1 mRNA. Samanaikaisesti, vakaa ohjaus shRNA kloonien 1 ja 2 syntyvät nontargeting salattu shRNAs. Kuten kuviossa 3E, vakaa Bit1 shRNA1 ja shRNA2 osoitti vähenemistä Bit1 ilmentymistä 70% ja 80% vastaavasti verrattuna ohjata shRNA klooneja. Vakaa Bit1 shRNA1 ja shRNA2 yhdistettiin sitten tuottamaan Bit1 shRNA uima kun valvonta shRNA kloonit 1 ja 2 käsitti ohjaus- shRNA allas (kuvio 3E). Yhdenmukainen saatujen tietojen siRNA tutkimuksissa Bit1 shRNA allas näkyy huomattavasti alentuneen tason apoptoosin kuin kontrolli shRNA altaan jälkeen 72 h kulttuurin jousitus (kuvio 3F). Yhdenmukainen vaikutuksen puuttuminen kohdunulkoisen Bit1 on mitokondrio-reitin (kuvio 2D), havaitun parannettu anoikis resistenssin Bit1 Knockdown soluissa ei liittynyt muutoksia ekspressiotasot Bcl-2 perheen apoptoosisäätelijät (kuva S4). Nämä havainnot yhdessä tuloksemme osoittaa, että eksogeeninen mitokondrioiden Bit1 voi aiheuttaa anoikis, antaa vahvaa näyttöä siitä, että Bit1 apoptoottista reitin edustaa tärkeää kaspaasi-riippumaton anoikis mekanismi keuhkojen syöpäsoluja.

. ja B. Soluja viljeltiin liitteenä (A) tai irrottaa (D) edellytykset merkitty kertaa ja sitten altistettiin suoritettiin Cell Death ELISA: lla (A) tai Western-blottauksella (B), jossa vasta-aineita kaspaasi-3, PARP, ja B aktiini. A, kolmesta itsenäisestä kokeet suoritettiin kolmena kappaleena; *, P 0,05 verrattuna kiinnittyneitä soluja (Studentin t-testi). C. ja D. Solut transfektoitiin ohjaus- tai Bit1 erityisiä siRNA: t, ja 48 tuntia myöhemmin, solut altistettiin immunoblottaus (C), jossa vasta-aineiden Bit1 ja B-aktiini vahvistaa knockdovvn Bit1 ilmaisun.