Krooninen sairaus

tiivistelmä

fenformiini (phenethylbiguanide, diabeteksen aine) plus oksamaattia [laktaattidehydrogenaasin (LDH) estäjä] testattiin mahdollisena syövän terapeuttisen yhdistelmän. In

in vitro

tutkimuksissa, fenformiini oli tehokkaampi kuin metformiini, toinen biguanidi, hiljattain todettu olevan syövän vaikutukset, edistää syöpäsolun kuoleman välillä 25 kertaa 15000000 kertoja eri syöpäsolulinjoissa . Syövän vastaisen vaikutuksen fenformiini liittyi monimutkaisia ​​I inhibition mitokondrioissa ja myöhemmin ylituotanto reaktiivisen hapen (ROS). Lisäämällä oksamaattia esti LDH-aktiivisuuden ja laktaatin tuotannon soluissa, joka on merkittävä sivuvaikutus biguanideista, ja indusoi nopeampia syöpäsolun kuoleman vähentämällä ATP-tuottamista ja nopeuttaa ROS. Fenformiinilla plus -oksamaattia oli tehokkaampi kuin fenformiinilla yhdistettynä LDH knockdown. Syngeenisessä hiirimallissa, fenformiini kanssa -oksamaattia lisääntynyt kasvaimen apoptoosin, vähensi kasvainten kokoa ja

18F-fluorodeoksiglukoosia (FDG) oton on positroniemissiotomografia /tietokonetomografia verrattuna kontrolliin. Voimme päätellä, että fenformiinilla on sytotoksinen kohti syöpäsoluja kuin metformiini. Lisäksi phenformin ja -oksamaattia on synergistisiä syöpälääkkeen vaikutuksia kautta samanaikaisesti estämällä kompleksin I mitokondrioissa ja LDH sytosoliin, vastaavasti.

Citation: Miskimins WK, Ahn HJ, Kim JY, Ryu S, Jung YS Choi JY (2014) synergistinen Anti-Cancer vaikutus fenformiinilla ja -oksamaattia. PLoS ONE 9 (1): e85576. doi: 10,1371 /journal.pone.0085576

Editor: Rafael Moreno-Sanchez, Instituto Nacional de Cardiologia, Meksiko

vastaanotettu: 09 toukokuu 2013; Hyväksytty: 29 marraskuu 2013; Julkaistu: 21. 2014

Copyright: © 2014 Miskimins et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tuettiin osittain Susan G. Komen varten Cure palkinnon numero KG100497 (WKM), National Cancer Institute of National Institutes of Health palkinnon numero 1R01CA180033 (WKM), National Institute of General Medical Sciences of National Institutes of Health palkinto numero 015P20GM10358 (WKM), Basic Science Research Program kautta National Research Foundation of Korea (NRF) rahoittama opetus-, tiede- ja teknologia-palkinto numero 2011-0013087, ja Samsung Medical Center avustuksen myöntämistä numero SMR1120911. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Havainnot että metformiini (1,1-dimetyylibiguanidi), yleisimmin määrätty lääke tyypin II diabeteksen vähentää syöpäriskiä ovat edistäneet innostuksen metformiinin kuin syövän hoitoon [1], [2]. Nyt kliinisissä tutkimuksissa rintasyövässä käyttäen metformiini yksinään tai yhdessä muiden hoitojen ovat käynnissä [3], [4].

phenformin, toinen biguanidi (1-phenethylbiguanide) otettiin käyttöön samaan aikaan kuin metformiini, vuonna 1950-luvun lopulla kuin diabeteksen lääke. Fenformiinilla on lähes 50 kertaa niin voimakas kuin metformiini mutta myös liittyi suurempi Maitohappoasidoosin ilmaantuvuutta, suuri sivuvaikutus biguanidit. Fenformiinilla vedettiin pois kliinisessä käytössä monissa maissa 1970-luvun lopulla, kun yhdessä maitohappoasidoosia ja useita kuolemaan johtanut raporttien tunnustettu [5]. Näin ollen, vaikutusta fenformiini on syöpä on harvoin tutkittu.

kehittymisen estämiseksi resistenttien syöpäsolujen, nopea ja täydellinen tappaminen syöpäsolujen kemoterapian on tärkeää. Näin ollen on mahdollista, että fenformiini voi olla parempi syövän vastainen aine kuin metformiini, koska sen suurempi teho. Eräässä

in vivo

tutkimuksessa, perustettiin rinta- kasvaimia, käsiteltiin metformiinin eivät osoittaneet merkittäviä tuumorin kasvun estäminen, kun taas fenformiini osoitti merkittävää kasvaimen kasvun inhibitiota [6].

mekanismeja, joilla metformiinin inhiboi syövän kehityksen ja kasvaimen kasvua ei täysin ymmärretä. Ehdotetut mekanismit sisältävät aktivointi AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) [7], mTOR toimintaa [8], Akt defosforyloinnilla [9], häiriöt UPR transkription [10], ja solusyklin pysähtymisen [11]. Äskettäin, kävi ilmi, että anti-diabeettinen vaikutus metformiinin liittyy esto kompleksin I Hengitysketjun mitokondrioiden [12], [13]. Kuitenkin monimutkainen En ole koskaan tutkittu osalta syövän vaikutusta biguanideista.

Siksi tässä tutkimuksessa pyrittiin ensimmäinen testi, onko fenformiinilla on voimakkaampi syövän vaikutusta kuin metformiini ja jos näin , tutkia syövän mekanismi. Oletimme, että fenformiini on voimakkaampi syövän vastainen vaikutus kuin metformiinin ja että sen syövän mekanismi liittyy esto kompleksin I

Lisäksi olemme yhdistetty oksamaattia, laktaatti dehydrogenaasi (LDH) estäjä, ja fenformiinilla vähentää sivuvaikutuksena maitohappoasidoosin. Oksamaattia estää pyruvaatin ja laktaatti sytosoliin ja siten estää maitohappoasidoosi. Mielenkiintoista on, että maitohappoasidoosi on yleinen ilmiö syöpä mikroympäristössä ja niihin liittyvät syöpäsolujen lisääntymistä, metastaasia, ja inhibitio immuunivasteen syöpäsoluja vastaan ​​[14], [15]. Viimeaikaiset kokeet osoittivat, että LDH Knockdown esti syövän kasvua [16], [17], siis lisääminen -oksamaattia voi paitsi parantaa sivuvaikutuksena fenformiinilla mutta voisi myös itse estää kasvun ja etäpesäkkeiden syöpäsolujen.

Ei tutkimukset ovat testattu fenformiinilla yhdessä oksamaattia joko

in vitro

tai immunokompetentti hiirissä. Tässä tutkimuksessa tutkimme onko fenformiinilla ja -oksamaattia on synergistinen syöpälääkkeen vaikutuksia samanaikaisesti estämällä kompleksin I mitokondrioissa ja LDH sytosoliin kautta sekä

in vitro

testejä ja syngeenisessä hiirimallissa.

Materiaalit ja menetelmät

Neljä ryhmää verrattiin tässä tutkimuksessa: kontrolliryhmä (ryhmä C), fenformiini ryhmä (ryhmä P), oksamaattia ryhmä (ryhmä O), ja yhdistelmä ryhmä fenformiinilla ja oksamaatin (ryhmä PO). Kaikki mitat

in vitro

tutkimukset suoritettiin 1 päivä sen lääkehoidon ellei toisin mainita.

Kemikaalit ja Cell Culture

metformiini (1,1-dimetyylibiguanidi), fenformiini ( 1-phenethylbiguanide), ja natrium-oksamaatti ostettiin Sigma Chemicals ja laimennettiin steriilillä vedellä eri pitoisuuksina. PARP-inhibiittori (INH2BP, 5-jodi-6-amino-1,2-bentsopyroni) hankittiin Calbiochem ja kaspaasi-inhibiittori (Q-Val-Asp-OPh) hankittiin MP Biomedicals. Solulinjat MCF7 (rintasyöpä), B16F10 (melanooma), CT26 (paksusuolen syöpä), A549 (keuhkosyöpä), ja DU145 (eturauhassyöpä) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC). E6E7Ras (nielurisojen syöpä) saatiin tohtori J Lee (Sanford Research, Cancer Biology Research Center) [18], [19]. Kaikki soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia ja jota on täydennetty 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2. Lääkkeet annettiin solu- konfluenssiin 70%.

määritys Drug Annostus

CT26, joka on koolonisyöpäsolulinja BALB /c-hiiristä, valittiin ensisijaiseksi järjestelmän tutkimuksen koska CT26 solut ovat suhteellisen resistenttejä fenformiinilla mutta osoitti dramaattisen synergistinen vaikutus lisäämällä -oksamaattia. Lisäksi meidän syngeenisiä hiiren kokeet suoritettiin BALB /c-hiirissä.

MCF10A soluja, ei-transformoitu ihmisen rintarauhasen epiteelisolujen linja, pysyi muuttumattomana, kun läsnä on enintään 1 mM fenformiini plus 40 mM oksamaatti 1 viikko. Kuitenkin, suuremmat annokset tuotti solukuoleman (tietoja ei esitetty). Siksi käytimme 1 mM phenformin, 40 mM oksamaattia, ja 1 mM fenformiinin plus 40 mM -oksamaattia lisäkokeita varten.

Measurement of Cell Death trypaanisinieksluusiolla Analyysit ja virtaussytometria

Soluja levytettiin 35 mm ruokia ja käsitelty tai ilman lääkkeitä. Sillä trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä solususpensio värjättiin 0,02% trypaanisinisellä. Trypaanisinistä positiiviset ja negatiiviset solut laskettiin käyttäen hemasytometriä. Virtaussytometriaa mittauksia, 7-aminoactinomycin D (7AAD, 5 ui), lisättiin 500 ui solususpensiota ja inkuboitiin 20 minuuttia jäillä. Kaikki virtaussytometrillä mittaukset suoritettiin käyttäen BD Accuri C6 virtaussytometrillä (BD Biosciences).

annos-vaste-käyrä, EY

50, ja yhdistelmä-indeksi (CI) saatiin käyttäen CalcuSyn-ohjelmiston (versio 2.1 , BIOSOFT).

mittaus pH ja laktaatti

pH elatusaineet mitattiin käyttäen pH-mittaria (Accumet AB15 Basic ja BioBasic pH /mV /° C-mittari, Fisher Scientific). Laktaatin elatusaineissa mitattiin käyttämällä laktaattia iinianalyysikitissä (Eton Bioscience, Inc.) ja mikrolevylukijaa (absorbanssi 490 nm, SpectraMax Plus

584, Molecular Devices) kvantitatiivisella tavalla laktaatti standardeja. Laktaattituotanto oli vakioitu kohti 10

5 solua.

kompleksi I Activity

kompleksi I aktiivisuus määritettiin hapettamalla NADH: n (Fluka) per mg proteiinia. Solupelletit sonikoitiin 20 sekunnin ajan jäillä IME puskurissa (50 mM imidatsoli, 2 mM MgCI

2, 1 mM EDTA, proteaasi-inhibiittorit) ja 80 ug solu-uutetta lisättiin reaktiopuskuria [1 mM EDTA, 50 mM KCI , 1 mM KCN, 1,2 uM antimysiini A, 10 mM Tris-HCI (pH 7,4)]. Juuri ennen mittausta, 150 uM NADH: ta ja 100 uM koentsyymi Q1 (Sigma), kuten elektronin vastaanottajan, lisättiin. Absorbanssi 340 nm: ssä mitattiin 2 minuutin aikana käyttäen spektrofotometriä 30 ° C: ssa. NADH hapetus ei estänyt rotenone (monimutkainen I: n estäjä, 2,5 uM) poistettiin laskemista mitata NADH hapettuminen tapahtuvat monimutkainen I vain.

Validoida rooli monimutkaisten I inhibitiota phenformin, 0,5 mM metyyli sukkinaatti (Sigma) lisättiin loppuun kasvualustaa kanssa fenformiinilla samanaikaisesti tarkkailla jos fenformiinilla vastaisen syöpäsolun vaikutuksia olivat päinvastaiset. Metyylisukkinaatin toimii vaihtoehtoisen energialähteen, joka ohittaa monimutkainen I elektronin kuljetusketjun. Solukuolema mitattiin 24 tuntia käsittelyn jälkeen.

LDH Activity

LDH-aktiivisuus määritettiin seuraamalla NADH: n kulutusta, kun lisäksi pyruvaattia. Solupelletit suspendoitiin uudelleen 0,1 M KH

2PO

4 (pH 7,2), 2 mM EDTA, ja 1 mM ditiotreitolia (DTT), sonikoitiin 300 ui määrityspuskurissa (50 mmol /l kaliumfosfaattia, pH 7,4) ja sentrifugoitiin 10000 g: ssä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti lisättiin 50 mM kaliumfosfaattia (pH 7,4), 2 mM pyruvaattia, ja 20 uM NADH: ta. Absorbanssi mitattiin 10 minuutin aikana käyttäen spektrofotometriä virityksellä 340 nm: ssä ja 30 ° C: ssa. LDH-aktiivisuus vakioitu per 10

5 solua.

hapenkulutuksen (OCR) ja Solunulkoisilla happamoituminen Rate (ECAR) B

OCR ja ECAR mitattiin käyttäen Seahorse XF24 solunulkoisen flux analysaattori ( Seahorse Bioscience, Billerica, MA, USA). Tässä laitteessa käytetään kertakäyttöistä anturipatruunan joka on upotettu fluoresenssipohjaiset optinen biosensorit (happi ja protonit), joka mahdollistaa samanaikaisen solunulkoisen reaaliaikamittauksiin koskemattomien solujen kasvaa yksittäiskerroksina. CT26 siirrostettiin 40000 solua per kuoppa on XF24 V7 multi-kuoppalevyille ja esi-inkuboitiin 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Seuraavana päivänä solut huuhdottiin määrityksessä media, ja sitten inkuboitiin ilman CO

2 37 ° C: ssa yhden tunnin ajan määritysmediassa (DMEM emäs, 4 mM glutamiinia, 143 mM NaCl, 25 mM glukoosi pH: ssa 7,4 ). Todettuaan kaksi perustason OCR ja ECAR lukemat, tutkittu lääkkeet injektoitiin ja mittauksia jatkettiin 70 minuutin ajan. Sen jälkeen seitsemänkymmentä minuuttia, 10 mM glukoosi injektoitiin ja OCR ja ECAR mitattiin vielä 20 minuutin ajan. Kokeet ajettiin neljänä kappaleena.

Mitokondrioiden reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) B

Mitokondrioiden ROS todettiin käyttäen punainen mitokondrion superoksidi merkkivalo (MitoSOX ™, Molecular Probes). MitoSOX ™ on fluorogeenisen värin erittäin selektiivinen havaitsemiseksi superoksidi mitokondrioissa elävien solujen. Kun mitokondrioissa, MitoSOX ™ Red reagenssi hapettuu superoksidi ja osoittaa punaisen fluoresenssin. Soluja kasvatettiin 35 mm lasipohja kulttuuri astia (Mat Tak Corporation) inkuboitiin 5 uM MitoSOX ™ ja 100 nM MitoTracker Green ® (Molecular Probes) ja mitokondrioiden värjäys 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa valolta suojattuna. Solut pestään varovasti kolme kertaa lämpimällä puskurilla ja kiinnitettiin lämpimään puskurissa kuvantamiseen. Olympus FV1000 konfokaalimikroskopialla suoritettiin Ex /Em: 510/580 nm.

vahvistaa, kuinka tärkeää on ROS tuotanto, ROS scavenger, N asetyylikysteiini (NAC, Sigma, 1 mM) lisättiin loppuun kasvua keskipitkän 6 tuntia ennen testiä lääkkeen antoa. Solukuolema mitattiin 24 tuntia käsittelyn jälkeen.

ATP-tasot

ATP-tasot määritettiin lusiferiini-lusiferaasi-määrityksessä, jossa ATP bioluminisenssimäärityksen Kit (Molecular Probes, Invitrogen). Määritys perustuu vaatimukseen lusiferaasin ATP valon tuottamiseen. Mittaukset saatiin käyttämällä luminometriä (GloMax® 96 Microplate Luminometer, Promega) on emission maksimi on noin 560 nm: ssä 300 sekunnin ajan. ATP standardit ajettiin samanaikaisesti kunkin kokeen tuottaa standardikäyrän, ja laskelmat tehtiin vastaan ​​käyrän määrittämiseksi solussa ATP-tasot. ATP ilmaistiin kohti 10

5 solua.

DNA Damage

DNA-vaurioita kvantitatiivisesti mitattiin 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG-pitoisuuksiin) media-, ytimet, ja mitokondrioita. 8-OHdG-pitoisuuksiin on hyvin erityinen sivutuote oksidatiivisen vaurion DNA: n ja heijastaa solunsisäisen oksidatiivisen stressin. Soluja viljeltiin 35 mm astiat 8-OHdG-pitoisuuksiin havaitseminen media- ja ytimet, ja 100 mm: n astiat mitokondrioiden 8-OHdG-pitoisuuksiin. Tumat ja mitokondrioita erotettiin differentiaalisentrifugoinnilla. DNA uutettiin ytimistä ja mitokondriot käyttäen kaupallista DNA: n eristämiseksi kit. DNA muutettiin yksijuosteiseen DNA: han inkuboimalla 95 ° C: ssa 5 minuuttia, ja nopeasti jäähdytettiin jäillä. Denaturoidun DNA-näyte pilkottiin sitten ja nukleosidien inkuboimalla 10 yksikköä nukleaasia P1 2 tuntia 37 ° C: ssa 20 mM natriumasetaattia (pH 5,2), minkä jälkeen seuraa käsittely 10 yksiköllä alkalista fosfataasia 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa 100 mM Tris (pH 7,5). Reaktioseos sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 6000 g: ssä ja supernatanttia käytettiin ELISA 8-OHdG-pitoisuuksiin kit (OxiSelect ™, Cell Biolabs). Jäljellä menettely tehtiin seuraavat protokollaa valmistajan toimittama ELISA 8-OHdG-pitoisuuksiin kit. DNA-vaurioita oli vakioitu per 10

6 solua.

LDH Knock Down

Expression of LDHA joka pudotettiin siRNA. Kohdesekvenssi on LDHA oli CAACUGCAGGCUUCGAUUA. Thermo Scientific DharmaFECT transfektio reagenssit käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Käsittelemättömät solut ja solut transfektoitu negatiivinen kontrolli siRNA (non-kohdentaminen) tai testiä siRNA valmistettiin kolmena kappaleena. 165000 soluja inkuboitiin 35-mm: n kuoppalevyille 1 päivä ja transfektoitiin 15 ui siRNA ja 6,8 ui Dharmafect varten 2 päivää. Drug käsittely aloitettiin 24 tunnin kuluttua transfektion jälkeen. LDH pudotus varmistettiin Western blot -analyysillä sen jälkeen, kun 2 päivää transfektion (anti-LDHA-vasta-aine, 1:1000, # ab47010, Abcam®).

Cancer Cell Death

Western blotting ja konfokaalimikroskoopilla suoritettiin havaitsemiseksi pilkotun PARP [poly (ADP-riboosi) polymeraasin] ja apoptoosia indusoivan tekijän (AIF). PARP on substraatti kaspaasien ja pilkotaan PARP (cPARP) on tunnusmerkki kaspaasi-riippuvaista apoptoosia. AIF on tunnusmerkki PARP-riippuvaisen solukuolemaa. Käytimme myös kaspaasiestäjä ja PARP inhibiittori testata, ovatko nämä inhibiittorit estävät syöpäsolun kuoleman.

Western blottauksella.

Vasta-aineita PARP (# 9542, käytetään 1:1000), ja AIF ( # 4642, käytetään 1:1000) ostettiin Cell Signaling Technology. cPARP havaittiin kokosolulysaateista ja AIF havaittiin tumaekstraktien. Saada ytimiä mittaus AIF, solut pestiin kylmällä PBS: llä ja suspendoitiin 400 ul: jääkylmässä hypotonisessa puskurissa [10 mM HEPES /KOH: a (pH 7,9), 2 mM MgCI

2, 0,1 mM EDTA, 10 mM KCL , 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF (fenyylimetyylisulfonyylifluoridi) ja 1% (v /v) eukaryoottisen proteaasiestäjäseostabletit] 10 minuuttia jäillä. Solupelletti suspensoitiin varovasti uudelleen 100 ul: aan jääkylmää suolaliuosta puskuria (50 mM HEPES /KOH: a (pH 7,9), 50 mM KCI, 300 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10% glyserolia, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF, 1 % (v /v) eukaryoottisen proteaasiestäjäseostabletit) ja inkuboitiin jäillä 20 minuutin ajan. Solususpensio vorteksoitiin ja sentrifugoitiin 15000 g: llä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti otetaan ydinvoiman lysaatin ja alistettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (PAGE) ja Western blot analyysi mitata AIF.

Konfokaalimikroskopia.

Solut pestiin PBS: ssä ja kiinnitettiin 4 % paraformaldehydillä 15 minuutin ajan. Havaitsemiseksi endogeenisten proteiinien immunofluoresenssilla, solut tehtiin läpäiseviksi 0,25% Triton X-100: ssa 5 minuuttia ja sitten pestiin PBS: ssä kolme kertaa. Tätä seurasi eston 10% naudan seerumin albumiinia (BSA) PBS: ssä 30 minuutin ajan ja inkuboinnin primaarisen vasta-aineen 2 tuntia 37 ° C: ssa. Primaarista vasta-ainetta (1:100) valmistettiin 3% BSA: lla PBS. Levyjä pestiin kolme kertaa PBS: ssä ja inkuboitiin Alexa Fluor 594-leimattua sekundaarista vasta-ainetta (1:200, Molecular Probes) 45 minuuttia. Lopuksi levyjä pestiin PBS: ssä kolme kertaa, ja asennetaan käyttäen Vectashield väliaineessa, joka sisälsi 4, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) (Vector Laboratories). Dioja havaittiin käyttäen Olympus FV1000 -konfokaalimikroskoopilla.

estäjä hoitoa.

CT26-solut esikäsiteltiin 1 uM kaspaasiestäjä (Q-Val-Asp-OPh, MP Biomedicals) tai PARP estäjä ( INH2BP, 5-jodi-6-amino-1,2-bentsopyroni, Calbiochem) ja 4 tuntia ennen hoitoa fenformiini tai fenformiini plus oksamaatti. Prosenttiosuus kuolleet solut laskettiin 24 tunnin kuluttua hoidon ryhmässä P ja 12 tunnin kuluttua hoidon ryhmässä PO virtaussytometrialla käyttämällä 7-AAD.

Hiiret

Seitsemän viikon ikäisiä BALB /c-hiiriä (Orientbio Inc. Korea) käytettiin. Kokeet hyväksynyt Institutional Animal Care ja käyttö komitean Samsung Biomedical Research Institute ja tehtiin mukaisesti ARRIVE (Animals in Research: raportointi In vivo -kokeet) suuntaviivat [20]. Kaikki hiiret ylläpidetään patogeenittomassa eläin laitokseen.

Hoito-ohjelma.

BALB /c-hiiret saivat suolaliuosta (ryhmä C, n = 24), oksamaattia 300 mg /kg (ryhmä O , n = 31), fenformiini 17 mg /kg (ryhmä P, n = 31), tai fenformiini 17 mg /kg + 300 mg /kg oksamaattia (ryhmä PO, n = 31). Hiiret inokuloitiin subkutaanisesti 1 x 10

7 CT26 solua 0,2 ml: lla PBS läpi vasemmalta laidalta. Nimetyt lääkkeet kunkin ryhmän annettiin vatsakalvon 3 vuorokauden kuluttua solujen injektion. Kaikki lääkkeet injektoitiin kokonaistilavuudessa 0,25 ml laimennettiin steriilillä vedellä. Eläimiä käsiteltiin päivittäin 21 päivää. Kehon paino ja kasvaimen koko mitattiin 3 kertaa viikossa. Kasvaimen koko mitattiin ulkoinen jarrusatulat (Mitutoyo, Japani). Tuumorin koko arvioitiin käyttäen kaavaa: = (d1 x d2

2) /2, jossa d1 ja d2 ovat pisin ja lyhin halkaisija kasvaimen, vastaavasti, mitattuna mm.

21. päivänä käsittelyn jälkeen hiiret nukutettiin 2,5% enfluraania O

2 ja tuumorit poistettiin ja leikattiin kahtia. Yksi puoli kunkin kasvain oli jäädytettiin ja toinen puoli kiinnitettiin 4% paraformaldehydi 0,1 M fosfaattipuskurissa yön yli 4 ° C: ssa.

Apoptosis määrityksessä.

Kasvaimen leikeltiin paksuuteen 10 um käyttäen kryostaattia, sulatus on asennettu gelatiinilla päällystetyille objektilaseille ja säilytettiin -20 ° C: ssa. Apoptoosin havaitsemiseen, kudosleikkeiden värjättiin terminaalin deoxynucleotidyltransferase välittämää dUTP nick-end merkinnät (TUNEL) menetelmää käyttäen Fluoreseiini

in situ

solukuoleman havaitseminen kit (DeadEnd ™ fluorometrinen TUNEL System, Promega). Objektilasit tarkkailtiin konfokaalimikroskoopilla LSM700 (Zeiss, Saksa). FITC-leimattuja soluja apoptoosin kirjattu ydinten vahvojen vihreän fluoresenssin. Kvantifiointiin, Tunel positiiviset solut laskettiin kolmeen osaan (304 pm x 304 nm) on × 20.

18F-FDG pieneläinten PET /TT.

PET /TT suoritettiin 24 päivää sen jälkeen, CT26 injektion ja 21 päivän kuluttua aloittamisesta lääkehoitoon. Omistettu pieni eläin PET /TT skanneri (Inveon Multimodaalisuus System, Siemens Healthcare, Knoxville, TN, USA) käytettiin hiiren kuvantamisen. Sen luontainen spatiaalinen resoluutio ja aksiaalisen kentän-of-view olivat 1,4 mm ja 12,5 cm. Aluksi hiiret nukutettiin isofluraanilla. Sen jälkeen kun CT vaimennusta korjaus (putken jännite 60 kVp, putki nykyinen 400 uA) suoritettiin, 7,4 ± 3 MBq

18F-FDG injektoitiin häntälaskimoon. PET päästöjen scan 5 min suoritettiin 60 minuutin kuluttua injektion

18F-FDG. Yksi hiiri kerrallaan oli kuvaamisen ja pidetään lämpimällä lavan aikana kuvantamisen menettelyssä. Sen jälkeen tiedonkeruu, poikittainen PET Kuvat otettiin rekonstruoitu järjestetyn osajoukko odotuksen maksimointi 3D algoritmi (4 toistojen), jonka voxel koko 0,776 x 0,776 x 0,796 mm. CT-kuvia rekonstruoitiin käyttämällä suodatettua takaisin projektio algoritmi kanssa Shepp-Logan suodatin.

PET, CT ja sulatettu PET /CT-kuvia oli esillä ja analysoitiin Inveon Research Työpaikka ohjelmisto (Siemens Healthcare). Tilavuus kiinnostuksen (VOI), joka kattaa koko kasvaimet määriteltiin perustuvat CT-kuvia. Keskimääräinen standardoitu oton arvo (SUV

avg) kasvaimen saatiin käyttämällä VOI terrorisminvastaiselta kuvan. SUV korjattiin pistoksena annos

18F-FDG, hiiren ruumiinpainon ja kasvaimen kokoa. SUVavg tiedot näkyvät prosentteina perustason jotta helposti arvioida suhteelliset muutokset.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin ohjelmiston IBM SPSS tilastojen (SPSS Inc., Chicago, USA ). Tilastolliset erot avulla määritettiin

t-

testi tai yksisuuntaista ANOVA seurasi Tukeyn HSD testi. Nimellinen kategorinen data verrattiin Pearsonin chi neliö. Tilastollinen merkittävyys hyväksytty p arvojen 0,05.

Tulokset

fenformiinilla Näytteillä Higher Cancer Cell Sytotoksisuus kuin metformiinin

Useimmat saatavilla olevat tiedot, jotka koskevat vaikutuksia biguanidit syövän soluja, ja oman aikaisemman työn [21] – [23], ovat huolissaan metformiini. Olemme aikaisemmin havaittu metformiini sytotoksisuus MCF7-soluissa, mutta tämä vaaditaan suurempia annoksia pidemmän ajan [21], [22]. Koska korkea metformiinin tarvitaan ja mahdollisesti suurempi teho fenformiinilla [24], halusimme verrata suoraan sytotoksisuus kahta lääkettä useita syövän solulinjoissa. Vuonna E6E7Ras soluissa, malli HPV + pään ja kaulan okasolusyöpä [18], [19], n

50 metformiini ja fenformiini edistämiseksi syöpäsolun kuoleman oli 504 mM ja 0,6 mM. N

50 metformiinia on 840 kertaa suurempi kuin fenformiini (Fig. 1A). Fenformiini osoitti erinomaista sytotoksisuutta useisiin muihin syöpäsolulinjoissa, jossa metformiinin osoittivat vähän, jos ollenkaan, vaikutusta näissä olosuhteissa (Fig. 1 B-F). N

50 metformiinin olivat 15,2 miljoonaa kertaa, 448 kertaa, 67 kertaa, 26 kertaa, ja 25 kertaa suurempi kuin fenformiinilla vuonna B16F10 (melanooman), MCF7 (rintasyöpä), CT26 (paksusuolen syöpä), A549 (keuhkosyöpä) ja DU145 (eturauhassyöpä), vastaavasti.

soluja käsiteltiin 2 (A) tai elävien solujen lukumäärä (B-F) määritettiin. (A) E6E7Ras soluja, hiirimallissa HPV + pään ja kaulan okasolusyöpä, (B) B16F10 hiiren melanoomasoluja, (C) ihmisen A549-keuhko-adenokarsinoomasoluja, (D) ihmisen maitorauhasen MCF7-syöpäsoluja, (E) CT26 hiiren paksusuolen syöpäsolut, ja (F) DU145 ihmisen eturauhasen syöpäsoluja. *: P 0,05.

fenformiinilla ja -oksamaattia Näytteillä synergistinen vaikutus syövän Cell Sytotoksisuus

Biguanidit, esim. metformiini ja fenformiini, ovat tunnettuja estäjiä kompleksin I mitokondrioiden elektroninsiirtoketju ja aikaisemmat tutkimukset osoittivat, että mitokondriot ovat tärkeitä tavoitteita metformiinin rintasyöpäsoluissa [22]. Esto mitokondrioiden aineenvaihdunnan edistää glykolyyttisiä aineenvaihduntaa ja laktaatin tuotantoa ja vientiä. Siksi perusteltu, että estämällä Pyruvaatin laktaatin olisi edistää pääsyä pyruvaatin osaksi mitokondrioiden aineenvaihduntaa ja parantaa sytotoksisia vaikutuksia fenformiini. Oksamaattia on tunnettu estäjä LDH [25]. Tutkimuksissa esitetään tässä, oksamaatti yksinään osoitti heikkoa sytotoksista vaikutusta, joka on alueella 0-80 mM (Fig. 2A). Fenformiini yksin osoitti sytotoksisia vaikutuksia, mutta teho oli erilainen eri syöpäsolulinjoissa (Fig. 2B, 2C). Fenformiinilla ja -oksamaattia samanaikainen kuitenkin osoitti voimakasta synergistinen vaikutus syöpäsolujen tappaminen kaikissa syöpäsolulinjoissa testattu. Yhdistelmä-indeksi (CI) laskettiin käyttäen useiden lääkkeiden vaikutus yhtälö Chou-Talalay [26] in CalcuSyn- ohjelmassa. CI heijastavat tapahtuvaa vuorovaikutusta samanaikaisesti lääkkeitä. Cl-arvot ovat välillä 0,9 ja 1,1 osoittavat lisäävä vaikutus, kun taas CI arvot 0,9 osoittavat synergiaa ja CI-arvot 1.1 osoittavat antagonismia. Yhdistelmä-indeksi (CI) oli 0,494 vuonna E6E7Ras, 0,310 vuonna B16F10, 0,009 vuonna CT26, 0,227 A549- ja 0,067 vuonna DU145, ja 0,503 MCF7 (epätehokkaalla), kun samanaikaisesti verrattuna yhden hallinnon ED

50. Pidemmät hoitoon (Fig. 2B) ja suuremmilla annoksilla (Fig. 2C) lisännyt sytotoksisuuteen fenformiini.

(A) E6E7Ras-soluja käsiteltiin 2 päivää kanssa oksamaatti ilmoitettuina pitoisuuksina (0-80 mM) ja sitten kuolleet solut laskettiin virtaussytometrialla. (B, C) Ilmoitettu solulinjoja käsiteltiin vaihtelevilla pitoisuuksilla fenformiini, oksamaattia, tai näiden yhdistelmiä huumeita. (B) Soluja käsiteltiin 1, 2 tai 3 päivää ennen laskemalla kuolleet solut. In (C) Soluja käsiteltiin 24 tuntia ennen kuin määritetään määrä kuolleita soluja. C: ohjaus, P: fenformiini, O: oksamaattia, PO: fenformiini + -oksamaattia. In (C) alla olevaa numeroa kunkin palkin osoittavat pitoisuuksia kunkin lääkkeen mM (esim P0.5O20 tarkoittaa P 0,5 mM + O 20 mM). * Tarkoittaa synergististä vaikutusta ryhmässä PO verrattuna muihin ryhmiin.

Vaikutukset fenformiinilla ja -oksamaattia päälle laktaatintuotto ja pH

Biguanidit ovat tiedetään lisäävän glukoosin ottoon, glykolyyttisissä aineenvaihdunta ja laktaatti eritystä. Oksamaattia, toisaalta, on inhibiittori LDH ja odotetaan vähentävän laktaatintuotto soluja. Sen tutkimiseksi, onko nämä yhdisteet vaikuttavat oletetaan solukohteita, laktaatti viljelyalustassa mitattiin CT26. Koska laktaatti kuljetetaan solun yhdessä protonin kanssa, alustan pH mitattiin myös. Fenformiinilla lisääntynyt laktaattituotanto ja laski alustan pH kontrolliin verrattuna, mikä osoittaa kohonnut hinnat Glykolyysivaiheen. -oksamaattia Vähentynyt laktaattituotanto ja lisääntynyt pH, mikä viittaa odottaa eston LDH. Lisäämällä oksamaattia ja fenformiini päinvastaiseksi sekä kasvua laktaatin ja pH: n lasku aiheuttama fenformiini hoitoon (Fig. 3A, 3B).

CT26-soluja käsiteltiin osoitetuilla yhdisteillä 1, 2, tai 3 (A) tai väliaineen pH: n (B) määritettiin. P: phenformin 1 mM, O: oksamaattia 40 mM, PO: fenformiini 1 mM + oksamaattia 40 mM, C: käsittelemätön kontrolli. *: P 0,05 verrattuna muihin ryhmiin. †: P 0,05 verrattuna ryhmään C ja P.

sytotoksiset vaikutukset fenformiinilla ja oksamaatti liittyvät Complex I ja LDH esto, Vastaavasti

Kuten edellä on kuvattu, oletetun tavoitteet fenformiinilla ja -oksamaattia ovat monimutkaisia ​​I mitokondrioiden elektroninsiirtoketju ja LDH, vastaavasti. Muutokset laktaattia vastauksena näiden yhdisteiden tukevat tätä päätelmää. Seuraavat kokeet oli suunniteltu suoremmin määritellä yhdisteiden vaikutukset niiden oletetun tavoitteita. Ensinnäkin vaikutukset fenformiinilla monimutkaisiin I aktiivisuus mitattiin suoraan kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Fenformiinilla hoitoon solujen voimakkaasti esti mitokondrioiden kompleksi I aktiivisuutta (Fig. 4A). Jotta edelleen vahvistettaisiin tätä päätelmää, mitokondrio oksidatiivisen metabolian mitattiin Seahorse XF24-3 solunulkoisen vuon analysaattori käsittelyn jälkeen CT26-soluja yhdisteiden kanssa. Fenformiinilla laski hapenkulutuksen (OCR) odotetulla monimutkainen I: n estäjä. Sen sijaan -oksamaattia lisääntynyt OCR. Tämä on myös odotettavissa, koska pyruvaattia suuntautuisi mitokondrioiden oksidatiivisen aineenvaihdunnan jos LDH estyy. Mielenkiintoista, OCR oli matalin fenformiinilla plus -oksamaattia ryhmä (Fig. 4B). Metyylisukkinaatin voivat ohittaa elektronien kuljetusta kautta monimutkainen I koska se lahjoittaa elektroneja suoraan kompleksi II mitokondrioiden elektroninsiirtoketju. Lisäksi metyyli-sukkinaatin ja fenformiini vähensi sytotoksista vaikutusta fenformiini (Fig. 4C), jälleen viittaa siihen, että kompleksi I inhibitio on tärkeä kohde lääkkeen.

(A) CT26-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman fenformiini varten 24 tuntia, ja sitten uutteet valmistettiin mitata monimutkaisia ​​I aktiivisuus, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Y-akseli on% monimutkaisten I toiminnan, kun toiminta kompleksin I kontrolliryhmässä pidetään 100%. (B) vaikutukset osoitetaan yhdisteiden hapenkulutus CT26-solut määritettiin indikaattorina mitokondrioiden oksidatiivisen metabolian. (C) Soluja käsiteltiin tai ei fenformiini läsnä ollessa tai poissa ollessa metyyli sukkinaatti, joka ohittaa kompleksi I elektroninsiirtoketju. 24 tunnin kuluttua elävien solujen lukumäärä viljelmissä määritettiin. MS: metyylisukkinaatin. C: ohjaus, P: fenformiini 1 mM, O: oksamaattia 40 mM, PO: fenformiini 1 mM + -oksamaattia 40 Mm. *: P 0,05.

suorat vaikutukset fenformiinilla ja -oksamaattia on LDH-aktiivisuus mitattiin myös. Solujen käsittely fenformiini lisääntynyt LDH-aktiivisuus ja käsittely oksamaatti esti LDH-aktiivisuuden (Fig. 5A). Tämä on yhtäpitävää tunnettujen solujen toimintaa kahta lääkettä. Tärkeää on, oksamaattia myös esti voimakkaasti LDH-aktiivisuuden in fenformiini käsitellyissä soluissa, mikä osoittaa, että fenformiini ei voi kääntää inhiboivia vaikutuksia oksamaatti entsyymiin.

(A) CT26-solut käsiteltiin yhdisteillä, kuten jäljempänä esitetään kunkin baari, 24 päivää. Uutteet valmistettiin sitten määrittämiseen LDH-entsyymin aktiivisuutta. Y-akseli on% ja LDH-aktiivisuus, kun LDH-aktiivisuus kontrolliryhmän pidetään 100%. (B) Extracellular happamoituminen nopeudella, että läsnä on ilmoitettua lääkkeiden mitattiin käyttämällä Seahorse XF24 väline, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät.