Krooninen sairaus

tiivistelmä

Normaali toiminta HLA luokan I (HLA-I) ja antigeenin koneet (APM) proteiinien vaaditaan T-soluvälitteinen anti-kasvain tai immuniteettia viruksia, kun taas kasvain selviytymisen ilmaisee epäonnistumista isäntä immuunivalvonnan liittyy toimintahäiriön antigeenin esittelyyn, lähinnä sääntelyn purkamista HLA -I ja APM ilmentymistä tai toimintaa. Posttranskriptionaalisella sääntely HLA-I ja APM ilme voi liittyä epigeneettiset muutokset syövän kehittymisessä, jota ei ole kuvattu tähän mennessä. Tässä osoitimme, että kehitys CIN-muutos (CIN) ja kohdunkaulan levyepiteelisyöpä (CSCC) in uiguuri naisilla oli mukana osittain tai kokonaan menetys proteiinin HLA-I, SS2-m ja APM komponentteja, mukaan lukien kuljettajan liittyvät antigeenin prosessointia (TAP1 /2), alhainen molekyylimassa proteiinia (LMP2, LMP7), solulimakalvoston aminopeptidaasi 1 (ERAP1), kaperonia molekyylejä ovat kalretikuliinin (CLR), kalneksiini (CNX) ja ERp57, ja tämä on osoittautunut jälleen analyysi transkription saman geenien lisäksi kolme geeniä HLA-A, B ja C, jotka koodaavat HLA-I. By bisulfiitti sekvensointi lähestymistapa tunnistimme kohde-CpG-saarekkeiden metyloitu geenin promoottorialueen TAP1-, TAP2, LMP7, tapasin ja ERp57 Kohdunkaulan syöpä soluissa. Edelleen analyysi CpG erityisiä metylaation näiden geenien tapauksissa CSCC ja CIN osoitettu käänteinen korrelaatio muuttuneen CpG-saarekkeen metylaation TAP1-, LMP7, ja ERp57 muutoksiin proteiinin ilmentymisen. Lisäksi promoottori metyloinnin näistä geeneistä oli merkitsevästi korkeampi tapauksissa positiivinen ihmisen papilloomaviruksen 16 (HPV 16) kuin kielteisiä. Tuloksemme ehdotti, että epigeneettisellä muutokset ovat vastuussa poikkeavasta ilmentymistä tiettyjen HLA-I ja APM geenit, ja ne voivat auttaa ymmärtämään paljastamattomien mekanismeja kasvaimen paeta immuunivalvonnan Kohdunkaulan syövän syntymistä.

Citation: Hasim A, Abudula M, Aimiduo R, Ma JQ, Jiao Z, Akula G, et ai. (2012) posttranskriptionaalisella ja Epigeneettiset asetukseen Antigen koneet (APM) Komponentit ja HLA-I kohdunkaulasyövän alkaen uiguuri naiset. PLoS ONE 7 (9): e44952. doi: 10,1371 /journal.pone.0044952

Editor: Torbjörn Ramqvist, Karolinska Institutet, Ruotsi

vastaanotettu: 20 tammikuu 2012; Hyväksytty: 14 elokuu 2012; Julkaistu: 14 syyskuu 2012

Copyright: © Hasim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin rahoitusta Xinjiangin uiguurien autonomisella alueella Fund (2009211B14) ja National Natural Science Foundation of China (81060164). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

muodostuminen ja selviytyminen kasvainsolun on merkki onnistuneesta immuuni paeta ja epäonnistumista isännän immuunivalvonnalle ja poistamiseen. Normaali toiminta HLA-luokan I (HLA-I) ja antigeenin koneet (APM) on edellytys T-soluvälitteinen synnynnäisen ja adaptiivisen immuunivasteen virusinfektiota vastaan ​​tai solun karsinogeneesin [1] – [3]. HLA-I on keskeinen toimija ja toimii yhdessä APM jäsenten kokoamiseen, lastaus- ja esittää endogeenisen antigeenisen peptidin sekä säännellä solu- ja humoraalinen immuniteetti [4] – [5]. Näin ollen, tuumorisolujen eliminaatiota immuunijärjestelmä riippuu suuresti ilmentymistä APM: n ja HLA-I.

Viime vuosina on edistytty ymmärtää, miten peptidejä HLA-I-molekyylejä. Erityisesti on tunnettua, jotka proteaasit osallistuvat siihen ja miten solunsisäisiä reittejä vaikuttaa antigeenin esityksiä antigeeniä esitteleviä soluja ja erilaisten pahanlaatuisten tautien [6] – [8]. APM solun on monimutkainen järjestelmä vuorovaikutuksessa proteiinien, kuten proteasomin alayksiköt, pienimolekyylistä-massa proteiinit 2 ja 7 (lmp2 ja LMP7), kuljettajat liittyvät antigeenin käsittely 1 ja 2 (TAP1- ja TAP2), Endoplasmakalvosto aminopeptidaasi 1 (ERAP1), ja ER kaperoni proteiinit kalneksiini, kalretikuliini, ja tapasin. Lisäksi tioli oksidoreduktaasi ERp57 vastaa esittely HLA-I peptidikomplekseja solun pinnalla ja on ratkaisevan tärkeää tunnustamista viruksen tartunnan tai pahanlaatuisiksi transformoituneiden solujen, ylläpito Itsetoleranssiprosessi, ja valvonta vasta johtuvat kasvainten immuunijärjestelmä [ ,,,0],9]. Downregulation HLA-I ja APM komponentit on havaittu monissa kasvaimissa ja liittyy läheisesti kasvaimen immunoevasion, kasvua, ja metastaattisen kyvyn [6] – [8]. Molekyylitason mekanismit suhteellisen alhainen transkription HLA-I ja APM komponenttien syöpäsoluissa ovat pitkälti selittämätön. Epigeneettiset muutokset ihmisen genomin, kuten poikkeava DNA: n metylaatio, edustavat kasvain geneettisiä tapahtumia, jotka ovat toiminnallisesti vastaavia geneettisiä muutoksia. Downregulation HLA-I ilmentymisen aiheuttaman hypermetylaatiota HLA-I-geenien on dokumentoitu ruokatorven okasolusyöpä, paksusuolen karsinooma, ja melanoomasolulinjat, ja tämä voisi olla päinvastainen käsittelemällä DNA-metyylitransferaasin estäjien [10] – [11].

Ihmisen papilloomavirus (HPV) -infektio on keskeinen rooli patogeneesissä CIN-muutos (CIN) ja kohdunkaulan syöpä HPV-infektio pidetään välttämättömänä, mutta ei aina riitä, aiheuttaa [12]. Kehittäminen ihmisen kohdunkaulan syöpä ei osallistu tietyn HPV on poikkeuksellinen, ja se on laajalti hyväksytty, että lisäksi HPV-infektio, muut kofaktoreita, kuten endogeeniset hormonit, geneettiset tekijät, kuten HLA-I, ja muut tekijät, jotka liittyvät isännän immuunivasteen , voi olla tärkeä rooli kehittämisessä kohdunkaulan solumuutoksia [13].

kohdunkaulasyövän uiguuri on tapahtunut korkea sairastuvuus ja kuolleisuus naisten Xinjiangin alueella ja pidetään korkean tapaus sairaus alueen Kiinassa [14]. HPV-infektio uskotaan olevan tärkein syy kohdunkaulan syövän kehityksen, ja tulehdus viruksen, erityisesti korkean riskin HPV on havaittavissa uiguuri naisten kohdunkaulan syöpä nopeudella verrattavissa muiden populaatioiden ja Kiinan ulkopuolella [15] . Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että suuntaus hävikki HLA-I-proteiinin ilmentymisen olivat vertailukelpoisia naisten uiguurien ja Han etnisten ryhmien kohdunkaulan syövän kehittymisen, mutta kokonaismäärä hävikki HLA-I yksilöitä kohdunkaulan okasolusyöpä (CSCC) ja sen edeltäjän leesioita (CIN II tai III) oli suurempi Uighur naisilla (27% ja 53%, vastaavasti) kuin Han naisilla (18% ja 37%, vastaavasti) [16]. Näyttää siltä, ​​että etninen eroilla voi olla jossain määrin, vaikutusta kasvaimen kehitys johtuu eri geneettisen taustan, elintapoihin tai maantieteelliseen ympäristöön. Näin ollen, ottaen huomioon, että poikkeava pinnan HLA-I kohdunkaulan syövän liittyy korkean riskin HPV16 infektion aiheuttavat usein puuttuminen APM [17] – [18], voisi kysyä epigeneettisiä muutoksia olisi moduloida pinnan ilmentyminen HLA en suoraan tai välillisesti hiljentäminen tai inaktivoiva APM komponentin geenien ja johtaa kehitystä kohdunkaulasyövän uiguuri naisilla.

tässä tutkimuksessa keskityimme 10 kandidaattigeenit kuuluvat HLA-I ja APM perhe, analysoi yhdistys syövän kehityksen muunnetun geenin ilmentymisen eri tasoilla, mukaan lukien geenin promoottori metylaatio, transkriptio, ja proteiinin ilmentymistä. Nämä tiedot tarjoavat tietoa tuntematon mekanismeja kohdunkaulan syövän syntymistä suhteessa asetuksen HLA-I ja APM ilmaisun ja voi tarjota kanssa molekulaarinen merkkiaine profiilin varhaisen diagnoosin perustuu havaitsemiseen epigeneettiset muutokset ja näiden geenien ilmentymistä. Lisäksi tämä tutkimus mahdollistaa edelleen ymmärrystä vaikutuksista HLA-I välittämä antigeenin esitys antiviraalista tai kasvaimen vastaisen immuniteetin tai poikkeavuuksien aiheuttamia, tai mikä, kohdunkaulan syövän syntymistä.

Materiaalit ja menetelmät

Kliiniset ominaispiirteet ja kudosnäytteiden

Tuoreet tai formaliinilla kiinnitetyt ja parafinoidut kohdunkaulan kudosnäytteitä kerättiin uiguuri naisten kohdunkaulan levyepiteelisyöpä (CSCC) ja CIN-muutos (CIN), tai ilman kohdunkaulan sairauksien , mutta hoitaa kohdunpoisto. Kaikki kohdunkaulan syöpäpotilailla tarkoitetut välillä kesäkuuta 2009 ja maaliskuu 2010, koska kohdunkaulan syövän pyydettiin osallistumaan tutkimuksemme aikana käynnin Department of naistentautien ensimmäisen Affiliated sairaalan Medical University of Xinjiang. Tietoinen suostumus saatiin kaikilta potilaiden ja verrokkien osallistuvat tähän tutkimukseen. Tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea meidän sairaalassa.

Gynekologinen tutkimus suoritettiin kaikissa kohdunkaulan syöpäpotilaiden lavastus mukaisesti kansainvälisen liiton Gynecology and Obstetrics (FIGO) kriteerit. 152 tapausta formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) kudosnäytteet saatiin kudosnäytteestä arkisto patologinen osasto tutkittuaan arkistointia levyihin kokenut patologia. FFPE yksilöt (tai tuore kohdunkaulan kudosten kuvattu alla) on alun perin kerätty Alkuvaiheessa vierailun poliklinikalla tai gynecologic tutkimusta tai sen jälkeen operatiivista hoitoa yleisanestesiassa. Kärsivien potilaiden CSCC ilmoittautunut tässä tutkimuksessa oli 29 FIGO vaiheessa II B, 25 FIGO IIIB, 9 FIGO vaiheessa IVB. Niistä 28 tapausta patologisesti luonnehtia hyvin eriytetty, 19 kohtuullisesti erilaistunut ja 16 huonosti eriytetty kasvaimia. Imusolmuke etäpesäke dokumentoitiin 31 kasvain potilaille. Kaikkiaan 64 potilaalla on CIN valittiin tähän tutkimukseen, joista 33 tapauksia CIN I-II ja 31 kanssa CIN III. Mediaani-ikä kohdunkaulan syövän potilaiden oli 49,5 vuotta (IQ alue 29-67 vuotta). Ohjaus tapauksissa (n = 25) saatiin potilailta, joilla on aiemmin ollut kohdunkaulan solumuutoksia tai syöpä ja suunniteltujen tehdään kohdunpoisto pahanlaatuisten syistä saman ajanjakson aikana. Indikaatiot kohdunpoisto oli kohdun, prolaps kohtu tai adenomyoosi tai pääasiassa yhdistelmä kohdun kanssa prolaps kohtu.

Lisäksi 55 jäädytetyt koepaloja, mukaan lukien 20 CIN, 20 CSCC ja 15 ohjaus tapauksissa kerättiin mukaan edellä mainitut kriteerit, havaitsemiseksi geenin transkription semikvantitatiivinen käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR).

immunohistokemiallinen Studies

immunohistokemiallinen (IHC) värjäys suoritettiin ensisijainen tunnistavien vasta-aineiden kohdeproteiineja ja IHC Kits sisältäviä biotiinileimatuilla toissijainen vasta-aineita. Hiiren mAb HLA luokan I raskaan ketjun (HC-10,1:300; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) oli tunnustettu SS2-m-vapaa [19]. Kanin polyklonaalinen anti-b2-m-vasta-aine hankittiin (1:100, Shanghai Jingtian, Biotechnology, Kiina), TAP1- ja TAP2-aineella (1:300, Santa Cruz Biotechnology, vastaavasti), lmp2 ja LMP7 vasta-ainetta (1:100 ; Abcam, Cambridge, MA, USA, vastaavasti), ERAP1 vasta-aine (1:200; Abcam), ERp57 vasta-aine (1:300, Santa Cruz Biotechnology), kalneksiini ja kalretikuliini vasta-ainetta (1:50, Shanghai Jingtian, Biotechnology, Kiina, vastaavasti), ja tapasin vasta-ainetta (1:300, Santa Cruz Biotechnology). Lyhyesti, 3 um: n paksuisia leikkeitä leikattiin parafinoidut kudospaloista. Oltuaan liuottimella ksyleenissä ja niihin lisätään alkoholin ja tislattua vettä, antigeeni noudettiin kuumentamalla mikroaaltouunissa 15 minuuttia 95 ° C: ssa EDTA-puskuriin (pH 8,0). Jäähdytyksen jälkeen ja huuhtelu tislatussa vedessä, endogeeninen peroksidaasi aktiivisuus estettiin inkuboimalla osissa 15 min 3% H

2O

2, jota seuraa huuhtelu 0,01 M PBS: ssä (pH 7,4) 10 minuutin ajan. Näytteet esi-inkuboitiin proteiinin esto liuokseen 10 min ajan, ja leikkeitä inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli kosteassa kammiossa, jossa on esitetty vasta-aineiden, Objektilasit pestiin kolme kertaa PBS: ssä ja inkuboitiin sitten biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen (Zhong Shan Goldenbridge Biotechnology Co. Ltd., Kiina) ja 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Reaktiotuotteet visualisoitiin diaminobentsidiiniä (DAB Kit; Zhongshan Goldenbridge Biotechnology). PBS: ää käytettiin sijasta primaarista vasta-ainetta negatiivisena kontrollina ja objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä, kuivattu, ja arvioitiin alla valomikroskoopilla.

prosenttiosuus ja intensiteetin positiivisesti värjäytyneitä kasvainsolujen joka vaurion tutkittiin kaksi patologit joka ei ollut tietoa potilaiden ominaisuudet. Yhteisymmärrys määrä saavutettiin kunkin kasvaimen näytteen väliin kaksi tutkijaa. Tulokset pisteytettiin asteikolla 0-3, jonka prosenttiosuus ja intensiteetti positiivisten solujen kesken syöpäsoluja. Niiden positiivisten solujen pisteytettiin 0 ≤10%, 1 11-25%, 2 26-50%, 3 51-75%, 4 ≥76%. Värjäytymisen intensiteetti on seuraava: 0 osoittaa värjäytymisen puuttuminen, 1 tarkoittaa heikkoa värjäytymistä, 2 osoittaa kohtalainen värjäytyminen, ja 3 osoittaa voimakas värjäytyminen. Summa molempien pisteiden käytettiin tunnistamaan kolmeen ryhmään ilmaisun: normaali lauseke (yhteensä pisteet 7-8), osittainen menetys ilmaisun (3-6), ja täydellinen menetys ilmaisun (0-2). IHC värjäys osoitti vahvaa HLA-I strooman kudos- ja kasvaimen infiltroituneen tulehdussolujen, jolloin saadaan sisäinen positiivinen kontrolli, ehdottivat aiemman tutkimuksen [20].

RNA ja Semikvantitatiivisilla RT- PCR

Yhteensä RNA eristettiin potilaiden kudoksista käyttämällä Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan suosittelemia. MRNA: n (1 ug) käänteiskopioitiin cDNA: RevertAid (MBI Fermentas, Burlington, Ontario, Kanada) 42 ° C: ssa 60 min. CDNA (20 ng) monistettiin PCR: 25 ui seosta seuraavissa olosuhteissa: 95 ° C 1 min, jota seurasi 25 tai 30 sykliä denaturointi 95 ° C 30 sekuntia, pariutuminen 60 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, ja synteesi 68 ° C: ssa 1 minuutin ajan, ja lopullinen laajennus 68 ° C: ssa 10 min. PCR-tuotteet erotettiin 4% agaroosigeelillä, visualisoitiin GoldView I (Beijing Solarbio Co., Peking, Kiina) ja ultravioletti havaitsemiseen ja kvantitointiin Gel Imaging System ja ammatillinen ohjelmisto (GelDoc XR, Bio-Rad Laboratories, CA, USA) . Kukin analyysi toistettiin vähintään kahdesti varmistavat jäljentää mRNA, β-aktiini-mRNA: ta käytettiin sisäisenä kuormaus- ja normalisointi valvontaa. Eteen- ja taaksepäin alukepareja ja niiden tuotteiden on lueteltu taulukossa S1.

Cell Lines

SiHa ihmisen karsinooman solut saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) . Soluja kasvatettiin RPMI 1640: ssä media (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% FCS: ää, L-glutamiini, ja antibiootteja (Sigma-Aldrich).

DNA Extraction, bisulfiittikäsittelyn ja bisulfiittimodifiointi-sekvensointi PCR (BSP)

DNA uutettiin SiHa-soluja käyttämällä DNA: n (Qiagen, Valencia, CA, USA), ja genominen DNA (500 ng) oli bisulfiitti-modifioitu käyttäen EZ metylointi Gold Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) valmistajan ohjeiden [21]. CpG-saarekkeen fragmentti spesifisiä alukkeita suunniteltiin skannaamalla geenin promoottori alueille käyttäen erikoistunut metyyli Primer Express -ohjelmiston (ABI yhtiö), joka perustuu geneettiseen saatujen tietojen Genbank tietokannasta. Vetysulfiitilla käsitellyn DNA: n kohdunkaulan syövän solujen PCR-amplifioitiin. Käytetyt alukkeet myöhempää monistusta lueteltu taulukossa S2. Täydellinen bisulfiittimodifikaatio varmistettiin sekvenssianalyysillä. BSP monistukset suoritettiin 50-ul reaktioseokset, jotka sisältävät 2 ui bisulfiitti-muunnetun genomisen DNA, 2 ui dNTP, 1,2 ui alukkeet, 2 ui MgCI

2, 20 nM ammoniumsulfaatti,

. 75 nM Tris-HCl (pH 8,3), ja 3 U Taq-DNA-polymeraasia. Kosketuskohta-PCR järjestelmää sovellettiin vahvistamaan seuraavien sykliolosuhteita: 95 ° C denaturaatio 15 minuutin ajan, 95 ° C 20 sek, hehkutus lämpötila vaihtelee 62 ° C: sta 56 ° C 1 min, pidentäminen 72 ° C 1 minuutin ajan, 45 sykliä, ja lopullinen inkubaatio 72 ° C: ssa 7 min. Hehkutus lämpötilat olivat seuraavat: HLA-B: 60 ° C, TAP1:62 ° C, TAP2:56 ° C, LMP: 60 ° C, LMP2:58 ° C, tapasin: 58 ° C, ERAP1:62 ° C, ja ERP57:56 ° C. PCR: ää seurasi kloonaus vektorit ja sekvensointi tunnistaa CpG-sivustoja, jotka liittyvät geenin promoottorin metylaation.

Genomisen DNA: n eristäminen ja määrälliset DNA Metylointi Analyysi

Genominen DNA uutettiin käyttämällä QIAamp DNA Mini Kit ( QIAGEN, Valencia, CA). Havaitsemiseksi kvantitatiivisesti metyloitua DNA, MassARRAY (Sequenom, San Diego, CA, USA) käytettiin analysoimaan kohdunkaulan kudoksen DNA CpG sisältöä. Kohdegeenin erityisiä alukepareja käytettiin vertaamaan metylaatiotasoilla kohde-fragmenttien ja CpG-sivustoja eri näytteiden mukaan valmistajan ohjeiden ja kuten aiemmin on kuvattu [22] – [23]. Analysoidut alueet ja CpG sivustoja kandidaattigeenifragmenttikloonien promoottorit on esitetty taulukossa S3. Käytetyt alukkeet suunniteltiin mukaan Sequenom Standard EpiPanel (Sequenom, marraskuu 2007 versio ja taulukko S4). PCR-monistus suoritettiin käyttäen seuraavia parametreja: PCR-seos sisälsi 10 ng ui bisulfiittikäsiteltyä DNA: ta, 200 mM dNTP: itä, 0,2 U Hot Start Taq DNA-polymeraasia (QIAGEN), ja 0,2 mM eteenpäin ja taaksepäin-alukkeita kokonaistilavuudessa 5 ui. Syklit sisältyi hot start 94 ° C: ssa 15 min, mitä seurasi denaturointi 94 ° C: ssa 20 sekuntia, pariutuminen 56 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, pidentäminen 72 ° C: ssa 1 min (45 sykliä), jonka lopullinen 72 ° C: ssa 3 min. Yhtiöimätön dNTP defosforyloitiin lisäämällä 2 ml esiseosta lukien 0,3 U katkaravun alkalisella fosfaatti (SAP, Sequenom). Reaktioseos inkuboidaan 37 ° C: ssa 40 min ja SAP Sitten lämmöllä inaktivoitu 5 min 85 ° C: ssa. Sen jälkeen SAP hoito, 2 ml PCR-tuotetta käytettiin mallina

in vitro

transkription ja RNaasi A: pilkkominen käytettiin käänteisen reaktion, kohti valmistajan ohjeiden (Sequenom). Näytteet vakioitiin ja täpliksi 384-pad Spectro-sirulla (Sequenom) käyttäen MassARRAY nanodispenser (Samsung, Irvine, CA, USA), jota seurasi spektrin hankinta on MassARRAY analysaattorin kompakti MALDI-TOF-massaspektrometri (Sequenom). Metylointi analyysit tehtiin käyttäen EpiTYPER sovelluksen (Sequenom) tuottaa kvantitatiivisia tuloksia kunkin CpG-sivuston tai yhteenlaskettu useiden CpG sivustoja.

määritys HPV genotyyppien

Perimän DNA uutettiin kohdunkaulan kudoksissa käyttäen QIAamp DNA Mini Kit? (QIAGEN, Dusseldorf, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pitoisuus ja puhtaus DNA määritettiin absorbanssilla 260 ja 280 nm: ssä. HPV-genotyyppien todettiin käyttäen HPV genotyypin Diagnoosi Kit (yjkuang Genetel Pharmaceuticals, Shenzhen, Kiina) ja analysoitiin HPV-genotyyppien DNA-siru lukija järjestelmä (HPV-GenoCam-9600, yjkuang Genetel Pharmaceuticals, Shenzhen, Kiina)) kuvatulla [24]. Lyhyesti, HPV-DNA uutettiin ja PCR-monistettiin käyttäen seuraavia parametreja: denaturaatio 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 30 sekuntia, 52 ° C 45 sekuntia, ja 65 ° C: ssa 90 sekunnin ajan. Lopussa viimeisen syklin, seosta inkuboitiin 65 ° C: ssa 5 min. Geeni siru valmistettiin PCR-tuotteet hybridisoitiin, ja visualisoida.

TILASTOANALYYSI

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin SPSS version 17 ohjelmistopaketti. Kaikki P-arvot olivat kaksipuolisia ja merkitsevyystaso oli

P

0,05. Mann-Whitneyn testiä käytettiin testaamaan jatkuvien muuttujien erojen immunohistokemiallisella värjäyksellä tulokset välillä kasvain ja normaaleissa kudoksissa HLA-I ja APM komponentteja. Fisherin testiä käytettiin arviointiin yhdistysten kliinisiä patologisia parametreja. Määrällinen DNA: n metylaatio saatujen tietojen MassARRAY käsiteltiin jatkuvia muuttujia ja puuttuvat mittaukset olivat laskennallisia osaksi monimuuttujasäätöjen regressioanalyyseissä näytteiden kanssa korvaaja nonmissing arvot (single imputations). Linear assosiaatioita 2 jatkuvia muuttujia kvantitoitiin Pearsonin korrelaatiokerrointa.

Tulokset

APM Komponentti ja HLA minä ilmentäminen kohdunkaulan solumuutoksia

Kaikki vasta-aineet testattiin for- maliini- kiinteä, parafinoidut, normaali kohdunkaulan kudoksissa, CIN ja CSCC. Edustava värjäys kaavoja HLA luokka I raskasketjujen, SS2-m ja APM komponentit on esitetty kuvioissa. 1 ja kuvio S1. Kuten kuviossa 1 on esitetty, värjäys HLA-luokan I raskasta ketjua ja SS2-m olivat paikallisia solun kalvot kohdunkaulan epiteelin ja interstitiaalinen soluja, kun taas APM komponenttien värjäytymistä pääasiassa sijaitsi sytoplasmassa kohdunkaulan epiteelin. Anti HLA luokka I ja anti SS2-m-vasta-aineita osoittivat vahvaa värjäytymistä solukalvojen normaalissa kohdunkaulan kudokseen, kun taas erittäin vaihteleva ilmentyminen profiilin CIN ja CSCC kudosnäytteitä, jotka vaihtelevat osittain tappion kokonaan kadonnut ilmaisua, mutta laskivat ilme, normaaliksi ilme. Expression of HLA luokka I raskasketjujen, SS2-m ja APM komponentit on esitetty yhteenvetona taulukossa 1.

A-C. Värjäytymiskuvioissa HLA-I, SS2-m ja ERAP1, vastaavasti. (Muut APM komponentit TAP1-, TAP2, lmp2, LMP7, kalneksiini, kalretikuliini, ERp57, ja tapasin värjäys kuvassa S1), Paneelit A1-C1 kuvaavat normaali kohdunkaulan kudoksen normaalin proteiinin ilmentymisen. Paneelit A2-C2 osoittavat CIN osittainen menetys proteiinin ilmentymisen. Paneelit A3-C3 osoittavat kohdunkaulansyövän heikkoja tai täydellinen menetys proteiinin ilmentymisen.

Näistä 64 tapausta CIN ja 63 tapausta CSCC tähän tutkimukseen rekisteröidyt (taulukko I ja kuvio 2), proteiinin ilmentymisen taso HLA luokka I ja APM komponentteja muutettiin normaalista ilmaisun osittaisesta katoamisesta tai täydellinen menetys, jossa kehitetään normaalin epiteelin kohdun kohdunkaula CIN ja CSCC. Kokonaispoistuma proteiinin ilmentyminen oli merkittävä useimpien jäsenten HLA luokka I ja APM perheen CSCC verrattuna CIN tai terveillä, paitsi CNX ja CRT. Osittainen menetys proteiinin HLA-I, SS2-m, TAP1-, TAP2, lmp2, LMP7, ERAP1, tapasin ja ERp57 oli tilastollisesti merkitsevä CIN tapauksia verrattuna normaaleihin kontrolleihin.

Analysoi ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia ( kasvain grad, kliinisessä vaiheessa ja imusolmukemetastaaseja) proteiinin HLA-I ja APM komponentit (TAP-1, TAP-2, lmp2, LMP7, Tapasin, ERAP1, CNX, CRT ja ERp57) kohdunkaulan cancer.Results ovat edustettuina prosentteina (%). ylempi histogrammi A1 esittävät HLA-I ja APM komponentit ilmaistaan ​​hyvin eriytetty kasvain, A2 osoittavat ilmaistuna Kohtalainen huonosti eriytetty kasvain. B1 näyttää ilmaistu ≤II kasvain ja B2 esittävät ilmaistu ≥II B, C1 osoittavat ilmaistuna imusolmukemetastaaseja negatiivinen kasvain ja C2 esittävät ilmaistu imusolmukemetastaaseja positiivinen kasvain, vastaavasti. *

P

0.05.

Yhdistyksen välillä HLA-luokan I, SS2-m, ja APM komponentit ja kliinis ominaisuuksia tutkittiin CSCC vaurioita. Kuten voidaan nähdä kuviossa 2A, oli käänteinen korrelaatio downregulation HLA-I, SS2-m TAP1-, LMP7, ja ERp57 proteiinin ilmentyminen ja kasvaimen erilaistumiseen luokka. Käyttämällä FIGO lavastus kriteerit, ERp57 proteiiniekspressiota oli merkitsevästi pienempi alempi vaiheessa kasvaimia kuin korkeamman vaiheissa (kuvio 2B). Lisäksi downregulation HLA-I, TAP1-, LMP7, tapasin, CRT, ja ERp57 oli käänteinen korrelaatio imusolmuke etäpesäke (kuvio 2C). Molemmat korrelaatiot olivat tilastollisesti merkitseviä (P 0,05). Vaimennussäätely SS2-m, TAP1-, TAP2, LMP7, ERAP1, tapasin, ja ERp57 proteiinin ilmentyminen liittyvät positiivisesti HLA-I ilmaisun CIN vaurioita, kun taas SS2-m, TAP1-, TAP2, lmp2, LMP7, ERAP1, ERp57, ja tapasin ilmentyminen liittyvät positiivisesti HLA-I pahanlaatuisten vaurioiden. Down-regulation tahansa APM komponentin paitsi kalneksiini ja kalretikuliini oli merkitsevästi yhteydessä HLA luokka I alassäätöä CIN ja CSCC ryhmä (P 0,05).

varmistamiseksi edelleen tulosten immunohistokemiallisella värjäyksellä analyysissa havaittiin transkription HLA luokan I ja APM komponenttien semikvantitatiivinen RT-PCR. Ilmentymisen taso HLA-A, -B ja -C, joka koodaa HLA-I oli alempi sekä CIN ja CSCC kuin kontrolleilla (kuvio 3). Selostukset TAP-1/2 lmp2 /7 oli vaikea havaita, eikä transkriptio Tapasin ja ERp57, CIN ja CSCC kudoksiin. Ei kuitenkaan eroa havaittiin CNX ja CRT transkription välillä CIN tai CSCC ja hallintalaitteet (kuva 4). Vaikka näytteet RT-PCR: ää ja IHC-analyysi olivat eri alkuperää, nämä tulokset viittaavat siihen, että suuntaus downregulation kohdegeenin ilmentymisen sekä transkription ja translaation taso oli verrattavissa kehittämiseen kohdunkaulan syövän, erityisesti patogeneesin esiasteleesioita.

M: 100-600 bp markkeri tikkaat. Kaistat 1 näyttää normaalissa kohdunkaulan kudos, 2 ja 3 on esitetty CIN, 4 esittää CSCC kudosta. mRNA-tasot normalisoitiin p-aktiini-mRNA: n (D). Puute mRNA: n ilmentymisen yhden alleelin HLA-I vaikuttaa normaaliin pinnan HLA-I molekyylien mukainen proteiini havaitaan IHC.

Expression tasoilla APM komponenttien (TAP-1, TAP-2, lmp2, LMP7, Tapasin, ERAP1, CNX, CRT ja ERp57) analysoitiin Semi-kvantitatiivinen RT-PCR normaalissa kohdunkaulan kudos, CIN ja CSCC. Kontrolliin verrattuna, CIN ja CSCC, mRNA-tasot normalisoitiin p-aktiini-mRNA: n. Ylempi histogrammi on osoittanut, että ekspressiotasot APM komponenttien normaalissa kohdunkaulan kudoksen, CIN ja CSCC. Tulokset RT-PCR edustettuina keskiarvoja ± SD 15 valvontaa, 30 CIN ja 33 CSCC vastaavasti. *

P

0.05.

metylointi profiilit APM Gene Family on CSCC Cell Line

Koska teoreettinen suhde geenin promoottori hypermetylaation kuin epigeneettisestä muutos kanssa downregulation geenin transkription, me analysoitiin HLA-B, TAP1-, TAP2, LMP2, LMP7, ERAP1, tapasin, ja ERp57, koska downregulation näiden geenien kohdunkaulan syövän tai esiasteen leesiot, ja metylaatiostatuksen CpG-saarekkeiden on promoottorialue SiHa- kohdunkaulan syöpäsoluissa bisulfiitti-sekvensointi lähestymistapaa. Monistamalla kohde CpG-saarekkeiden tunnistaa ammatillinen ohjelmisto bisulfaatti sekvenssointialukkeiden (BSP, kuva 5) käyttäen genomista DNA: ta templaattina, ja sen jälkeen kloonaamalla ja sekvensoimalla, löysimme eri laajuudessa CpG sivuston metylaation TAP1-, TAP2, LMP7, tapasin ja ERp57 geenejä. Ei kuitenkaan metylaatio havaittiin HLA-B, lmp2, ja ERAP1. Kaikki CpG sivustoja metyloituja kandidaattigeenejä on esitetty taulukossa S4, jossa sijainti alukkeiden esiteltiin korostaa kohdistaa CpG sivustoja kursiivilla ja metyloituja CpG: t lihavoitu.

Jokainen pystysuora osoittavat yksittäisen CpG . Yhtenäinen viiva kannat BSP alukkeita. Kaikki BSP alukkeet suunnitellaan peittämään transkription aloituspaikan olisi lähellä transkription aloituskohdasta. Paneelit AH esittävät HLA-B, TAP-1, TAP-2, lmp2, LMP7, Tapasin, ERAP1 ja ERp57.

DNA Metylointi vuonna kohdunkaulan solumuutoksia ja sen Assosiaatio mRNA Expression ja HPV Infection

lähestymistavan avulla Sequenom MassARRAY alustan havaitsemiseksi kvantitatiivisesti metyloitua DNA: iden, huomasimme, että globaali metylaatio tavoitekäyrälle CpG saaret TAP1-, LMP7 ja ERp57 geenit oli merkitsevästi suurempi genomi-DNA CSCC kuin joko CIN tai normaali tarkastukset (

P

0,05), mutta eroa ei löytynyt TAP2 ja tapasin (taulukko 2). Metylointi taso TAP1- oli huomattavasti korkeampi sekä CIN ja CSCC kuin verrokeilla (

P

= 0,015 ja 0,001, tässä järjestyksessä). Of LMP7 ja ERp57 geenien metylointi taso CSCC, mutta ei CIN, poikkeaa merkittävästi ohjaus (

P =

0,001). Tarkempi analyysi yhden CpG paikkakohtaisten metylaation TAP1-, LMP7 ja ERp57 osoitti merkittävän kasvun metylaatio tason useimmat CpG sivustoja tavoite CpG saarilla TAP1-, LMP7, ja ERp57 geenien CSCC kontrolleihin verrattuna, kun taas mitään tilastollista merkittävyyttä välillä todettiin CIN ja ohjaus (

P

0,05).

lisäanalyysi tietojen johtui kvantitatiivinen analyysi yhden CpG sivuston metylaation Sequenom MassARRAY alustalla, on osoittaneet, että TAP1-geeni sisältää 23 CpG sivustoja ja metylaation tason kahden tai kolmen CpG sivustoja CpG_1, CpG_2.3, CpG_4, CpG_16, CpG_19, CpG_20, CpG_21, CpG_22 ja CpG_23 liittyvät toisiinsa, mutta mitään yhteyttä ei löytynyt metylaatio suhde muiden CpG sivustoja. LMP7-geeni sisältää 22 CpG sivustoja ja metylaation tason välillä CpG_1, CpG_2, CpG_6, CpG_8, CpG_9, CpG_12, 13, 14, CpG_20 ja CpG_22 liittyvät toisiinsa. ERp57 geeni sisältää 9 CpG sivustoja, joissa CpG_1, CpG_2, CpG_5, CpG_6, CpG_7 on merkitystä välillä ohjaus ja syövän ryhmä. Vaikka mitään tilastollista merkittävyyttä havaittiin kokonaisia ​​kohde CpG fragmentti metylaatio taso TAP2 kolmen ryhmien tietojen analysointiin johtui kvantitatiivinen analyysi TAP2 yhden CpG metylaatio on osoittanut, ettei ollut merkittäviä eroja metylaation tason CpG_8 sivustojen välillä CSCC ja valvontaa, mutta ei havaittu yhteyttä varten metylaation suhteen muiden CpG sivustoja (

P

0,05).

lisäksi vertaileva analyysi TAP1-, LMP7, ja ERp57 metylointi proteiinin kanssa ekspressiotasot ja korkean riskin HPV16 tartunnan osoitti käänteinen korrelaatio muuntuneen CpG-saarekkeen metylaation muutoksiin proteiinin ilmentymistä vastaavien geenien. Lisäksi metylointi taso näiden geenien oli merkitsevästi korkeampi tapauksissa positiivinen HPV16 tartunnan kuin negatiivisiin (taulukot 3 ja 4).

Keskustelu

Alennettu immunokompetenssille liittyvän kanssa downregulation HLA-I ilmentyminen on usein raportoitu potilailla, joilla on lisääntynyt tuumorin invaasio ja etäpesäkkeiden, mikä tarkoittaa, että toiminnallista poikkeavuutta HLA-I solujen antigeenin esittely todennäköisesti olemaan keskeinen tapahtuma kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen [20], [ ,,,0],25] – [26].

tässä tutkimuksessa selvitimme yhdistys kohdunkaulan syövän synnyn ja patogeneesiin sen esiasteleesioita poikkeavaan sääntely HLA-I ja APM ilmaisun eri tasoilla kuten geenin promoottori metylaatio, transkriptio ja proteiinin ilmentymiseen.