Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

aiemmin raportoitu kohonneeseen proteiinia linkatun fukosyloitu- kehittämiseen maksasyövän ja tunnistaa monia proteiineja, jotka sisältävät muuttuneen glykaanirakenteet. Eräs tällainen proteiini on alfa-1-antitrypsiini (A1AT). Edistää näitä tutkimuksia, suoritimme N-kytkettyä glykaanianalyysissä on viisi suurta isoformit A1AT ja valmistunut kattava tutkimus glykosylaation A1AT löytyy terveillä verrokeilla, hepatiittipotilailla C- (HCV) aiheuttama maksakirroosi, ja potilailla tartunta HCV diagnoosi maksasolusyövän (HCC).

Menetelmät /Principal havainnot

Maksakirroosipotilaille ja maksasyöpä olivat kohonneet triantennaariset glykaanitähteen sisältävien ulkovarteen (α-1, 3) fukosyloitu-. Kohonneita ydin (α-1,6) fukosyloitu- havaittiin vain A1AT päässä syöpäpotilailla. Suoritimme lektiini fluorofori immunosorbenttimääritys käyttämällä

oranssimaljakas

lektiini (AAL), spesifinen ydin ja ulkovarteen fukosyloitu- yli 400 potilaalla, joilla on maksasairaus. AAL-reaktiivinen A1AT pystyi havaitsemaan HCC herkkyydellä 70% ja spesifisyys 86%, mikä oli suurempi kuin mitä havaittiin nykyisen merkkiaine HCC, alfafetoproteiinia. Glykosylaatio analyysi väärien positiivisten suoritettiin; Tulokset osoittivat, että näillä potilailla oli korotukset ulkovarteen fukosyloitu- muttei ydin fukosyloitu-, viittaa siihen, että ydin fukosyloitu- on syöpä erityinen.

Johtopäätökset /merkitys

Tässä raportissa esitetään portaittain muutos glykosylaation A1AT kanssa etenemistä maksakirroosi syöpään ja tunnistaa ydin fukosyloitu- päälle A1AT kuin HCC erityisiä muutoksia.

Citation: Comunale MA, Rodemich-Betesh L, Hafner J, Wang M, Norton P, Di Bisceglie AM, et ai. (2010) Linkage Erityiset fukosyloitu- Alfa-1-antitrypsiini in Maksakirroosi ja syöpäpotilaiden: vaikutukset biomarkkereiden maksasolusyövän. PLoS ONE 5 (8): e12419. doi: 10,1371 /journal.pone.0012419

Editor: Wang-Shick Ryu, Yonsei University, Korean tasavalta

vastaanotettu: 15 kesäkuu 2010; Hyväksytty: 22 heinäkuu 2010; Julkaistu: 25 elokuu 2010

Copyright: © 2010 Comunale et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat apurahan R01 CA120206-01 National Cancer Institute (NCI), myöntää UO1 CA084951-06 NCI Early Research Detection Network (EDRN), hepatiitti B Foundation, ja tilinpäätössiirtona Commonwealth of Pennsylvania. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

hepatiitti B -viruksen (HBV) tai C-hepatiittiviruksen (HCV) on tärkein etiologia maksasolutoiminnan syöpä (HCC) [1] – [4]. Sekä HBV ja HCV aiheuttaa akuutin ja kroonisen maksan infektioita, ja useimmat kroonisesti infektoituneiden yksilöiden oireeton monta vuotta [5]. Noin 10%: sta 40% kaikista kroonisista HBV-kantajien lopulta kehittää maksasyövän, ja on arvioitu, että yli miljoona ihmistä maailmassa kuolee HBV ja HCV-liittyvän maksasyövän [2], [6], [7]. Todellakin, HBV ja HCV-infektiot liittyvät yli 80% kaikista tapauksista HCC maailmanlaajuisesti ja voi olla niinkin korkea kuin 96% alueilla, joissa HBV on endeeminen [3].

eteneminen maksasairaus ja maksasyövän ensisijaisesti seurataan seerumissa onkofetaalinen glykoproteiinin, alfa-fetoproteiini (AFP), tai ydinfukosyloitujen glykomuodon AFP, AFP-L3. AFP voi kuitenkin tuotetaan monissa olosuhteissa, myös suhteessa muihin maksasairauksien [8] – [10] ja ei ole kaikissa joilla HCC [11]. Siksi käyttöä AFP ensisijaisena näytön HCC on asetettu kyseenalaiseksi [12], ja herkempiä seerumin biomarkkereita HCC tarvitaan.

proteiinien glykosylaatio on soluspesifinen. N-kytketty glykosylaatio proteiinin heijastaa muutoksia, joita esiintyi solu, josta se tuli [13]. Glykosylaation samaa proteiinia erittyy sairaan kudoksen, pahanlaatuiset solut tai normaalit solut voivat, ja usein poikkeavat [14]. Me ja muut, ovat havainneet muutoksia N-sitoutunut glykosylaatio kehityksen kanssa maksakirroosi ja HCC [15] – [19]. Erityisesti määrä ydinfukosyloitujen N-kytketyn glykaanin johdettu yhteensä proteiinipreparaattien eristetty seerumista yksilöiden krooninen infektio HCV ja ne, joilla on diagnosoitu HCC oli johdonmukaisesti suurempi kuin terveillä potilailla tai joilla on HCV ja ”ei-aktiivinen ”tauti [19].

Käyttämällä fukoosispesifisen lektiinejä tunnistamiseksi proteiineja, jotka tulevat fukosyloituja potilailla, joilla on maksasairaus, tunnistimme yli 100 glykoproteiineja potilailta, joilla HCC ja /tai kirroosi, joka sisälsi lisääntynyt fukosyloitu- [19 ]. Yksi näistä proteiineista oli alfa-1-antitrypsiini (A1AT). Analysoimme N-sidottu glykosylaatio viisi suurta isoformit A1AT ja löysi lisäksi kohonneeseen ydin fukosyloitu-, merkittävä nousu ulkovarteen fukosyloitu- kehityksen kanssa maksasyövän. Käyttämällä lektiini perustuva määritys, mittasimme tätä muutosta yli 400 potilasta, joilla on maksasairaus ja löysi AAL reaktiivinen A1AT voisi havaita HCC herkkyydellä 70% ja spesifisyys 86% käyttäen cut-off 5 suhteellista yksikköä. Glykaanianalyysin vääriä positiivisia tunnistettu uloimman sakaran fukosyloitu- olevan syynä väärän positiivisuutta. Sen sijaan kasvaa ydin fukosyloitu- havaittiin vain syöpäpotilailla. Syyt tähän muutokseen ja kliininen käyttökelpoisuus Tämän muutoksen keskustellaan.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Sekä Drexel University College of Medicine ja Saint Louisin yliopiston Institutional Review Boards hyväksynyt tutkimussuunnitelman, mikä oli sopusoinnussa laatimat standardit Helsingin julistuksen 1975. Kirjallinen suostumus saatiin kullekin osallistujalle.

Potilaat

seeruminäytteet saatiin Saint Louis University School of Medicine (Saint Louis, MO). Väestörakenteen ja kliiniset tiedot yhdessä verinäyte kerättiin kunkin osanottajan seerumin erotin putkeen. Näytettä pyöritettiin 2 tunnin kuluessa, ja seerumi säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes testaus. Potilaat otettiin Saint Louisin yliopiston Maksasyöpä Clinic ja HCC todettiin käyttäen samoja perusteita, joilla HALT-C tutkimuksessa [20]. Osallistujat oli HCC tunnistaa koepala, uudella maksan vika näytetään verisuonten lisälaite yhtä kuvantamismodaliteetin (ultraääni [US], magneettikuvaus [MRI], tai tietokonetomografian [CT]) AFP tasot 1000 ng /ml, tai jonka oletetaan HCC. Osallistujat oletettiin olevan HCC jos heillä oli diskreetti maksan vika Yhdysvaltain AFP tasot 1000 ng /ml ja joko kaksi muuta skannaukset (MRI, CT, angiografia) osoittaa pahanlaatuisuuden ainakin yksi seuraavista ominaisuuksista: hypervascularity, valtimoiden portaalin vein shunts, porttilaskimon tromboosi lähellä vika, kasvain porttilaskimon, tai yhden muun scan (MRI tai CT) osoittaa varustelu ominaista HCC ja joko kasvuun koko ajan kuluttua alkuperäisen löytö (vähintään kaksinkertaistaa, jos alle 1 cm) tai korottamalla tason AFP 200 ng /ml. Tuumorin luokitus määritettiin käyttäen United verkoston Organ Sharing-modifioitu (UNOS) TNM pysähdyspaikan järjestelmä HCC. Sillä maksakirroosi ryhmä, potilailla, joilla on hepatiitti C ja biopsialla kirroosi otettiin. Kaikki kirroottisilla säätimet seulottiin HCC käyttäen Yhdysvaltain, CT tai MRI ennen tutkimusta. Potilaat, jotka olivat HBsAg + (tai ilman HBV DNA luokiteltiin HBV ryhmään. Samoin potilailla, jotka olivat HCV-RNA on positiivinen, ilman kirroosin, luokiteltiin HCV ryhmään. Potilaat, joilla on muita kuin virusperäinen maksasairaus ilman maksakirroosi olivat luokiteltu muut maksasairaus ryhmä (VANHA). verrokeilla olivat terveitä potilaita rekrytoitaville tutkimuksen toimimaan valvontaa.

Kaksiulotteinen (2-D) geelielektroforeesi

yhteensä 7 ui seerumia laimennettiin 330 ul: ssa liukenemisen puskuria, joka sisälsi 7 M ureaa, 2 M tioureaa, 4% CHAPS, 65 mM DTT: tä, 5 mM tributyylifosfiini, ja 0,4% seosta kantaja-amfolyyttejä (Servalyt pH 2-4, pH 3 -10, pH 9-1, 01:02:01). Näytteet vorteksoitiin jaksottaisesti 1 h ja levitettiin 18-cm pH 3-7 NL immobilisoidun pH-gradientin (IPG) nauhan (Amersham, Piscataway, NJ, USA) . Gel nesteytys suoritettiin 14 tunnin ajan 50 V ja siirtää käyttäen IPGPhor (Amersham) isoelektrinen fokusointi laite. Kun keskitytään, geeliliuskoja vähennettiin ensin alkyloidaan sitten 6 M ureaa, 2% SDS, 30% glyseroli, 50 mM Tris, pH 6,8, ja joko 30 mM DTT tai 75 mM jodiasetamidia 10 minuuttia kukin. Toinen ulottuvuus ratkaistiin jossa on 8%: sta 18% akryyliamidia-0,8% PDA gradienttigeeli Protean II xi Cell (Biorad Laboratories pääkonttori, Hercules, CA, USA) kanssa käyttöolosuhteet asetettu 20 mA /geeli 20 minuuttia ja 40 mA /geeli 4 tuntia. Geelit kiinnitettiin ja värjättiin kolloidisella Coomassie. Geelit kuvataan useilla Odyssey Infrared Imaging System (Li-Cor Biosystems, Lincoln, Nebraska) ja analysoitiin käyttäen epälineaarinen Dynamics Progenesis Workstation geeli kuvankäsittelyohjelma (epälineaarinen Durham, NC, USA).

Matrix-laserdesorptio /ionisaatio-Time of Flight (MALDI-TOF) massaspektrometria

Proteiinitäplät leikattiin kolloidinen Coomassie sininen värjättyä geelit, väri poistettiin, ja pilkottiin trypsiinillä. Talteen peptidit konsentroitiin ja suola poistettiin käyttämällä ZipTip C18 (Millipore, Bedford, MA, USA) valmistajan ohjeita ja valmis MALDI-TOF-massaspektrometrialla sekoittamalla 0,5 ml peptidin seosta 0,5 ml: lla 10 mg /ml α-syaani- 4-hydroksikanelihappoa ja 1% muurahaishappoa 50% asetonitriiliä ja antamalla pisaran kuivua MALDI levy. Peptidi massa karttoja saatiin käyttämällä Voyager-DE Pro Mass Spectrometer (Applied Biosystems, Life Biotekniikka, Carlsbad, CA) toimii positiivisionisella reflektoritoimintatilaa. Proteiinit tunnistettiin peptidi massasta karttoja käyttämällä MASCOT Internet-tietokannasta (www.matrixscience.com) etsiä nonredundant proteiini tietokantaan.

glykaanianalyysissä

2DE geeli täplät leikattiin ja poistettiin väri käyttäen 40% metanolia 7% etikkahappoa. Geeli tulpat poistettiin vesi asetonitriilin kanssa, asetonitriili poistettiin, ja 25 mM DTT: tä annettiin imeytyä tulpan. Tulppa kuumennettiin 100 ° C: ssa 5 minuutin ajan, sen annettiin jäähtyä, ja alkyloidaan pimeässä 30 min 75 mM jodiasetamidilla. Geeli tulpat pestiin kahdella toistoa asetonitriiliä nestehukka ja 20 mM ammoniumbikarbonaattia nesteytyksen. Sen jälkeen, kun lopullinen kuivuminen, geeli tulpat kuivattiin speed vac. Peptide:N-glykosidaasi F (PNGaasi F) laimennettiin 20 mM ammoniumbikarbonaattia pH 7 ja annettiin adsorboitua geeliin tulppa. Geeli tulppa peitettiin sitten samaa liuosta ja annettiin inkuboitua yön yli 37 ° C: ssa. Glykaanit eluoitiin geelistä plug sonikoimalla Milli-Q-vedellä kolme kertaa; eluenttina yhdistettiin, kuivattiin alas, ja leimattu 2AB väriaine (Ludger, Oxford, UK) mukaan valmistajan ohjeiden. Glykaanit sitten puhdistaa käyttämällä paperikromatografiaa ja suodatetaan käyttäen 0,22 um ruiskun suodattimen. Fluoresoivasti leimattu glykaanien sittemmin analysoitiin käyttämällä Waters Alliance korkean erotuskyvyn nestekromatografia, jossa normaalifaasikolonnia sarake (TSK amidi 80 saraketta) täydennetään Waters fluoresenssidetektoria ja mittaamaan Millennium Chromatography Manager (Waters Corporation, Milford, MA). Liikkuva faasi koostui liuotinta A (50 mM ammoniumformaattia, pH 4,4) ja liuotin B (asetonitriili). Käytetty gradientti oli seuraava: lineaarinen gradientti 20%: sta 58%: iin liuotinta A 0,4 ml /minuutti 152 minuutin ajan, mitä seurasi lineaarinen gradientti 58%: sta 100%: iin liuotinta A seuraavan 3 min. Virtausnopeus nostettiin 1,0 ml /minuutti; pylväs pestiin 100% liuotinta A 5 min ajan. Seuraavan pesuvaiheen Pylväs tasapainotettiin 20% liuotinta A 22 minuutin ajan valmistelemiseksi seuraavaa näytettä. Glykaanirakenteet tunnistettiin laskemalla glukoosin oton arvo ja exoglycosidase ruoansulatusta, kuten aiemmin on kuvattu [21].

lektiini-Fluorofori-kytketty immunosorbenttimääritys (Flisa) B

capture-vasta-aine (hiiren anti-ihmis-A1AT , ABD Serotec, Raleigh, USA), inkuboitiin 10 mM natriumperjodaattia 1 h ajan 4 ° C: ssa. Tämä käsittely takaa lektiini ei pysty reagoimaan glykosylaation vasta-aineen ja ei vaikuta vasta-aineen substraatin sitoutumisen. Yhtä suuri tilavuus etyleeniglykolia lisättiin, ja hapetettu vasta-aine tuotiin pitoisuuteen 10 ug /ml natriumkarbonaattia, pH 9,5. Vasta-ainetta (5 ug /kuoppa) lisättiin levylle, ja inkuboinnin jälkeen, pestiin 0,1% Tween 20 mM fosfaattipuskuroitua suolaliuosta, pH 7,4. Levy blokattiin yön yli 3% naudan seerumin albumiini /fosfaattipuskuroitua suolaliuosta. Analyysia varten 5 ui seerumia laimennettiin 95 ul estää reagenssin heterofiilisten estäminen putket

tm (Scantibodies Laboratory, Inc. Santee, CA, USA) ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 1 tunti. Sen jälkeen näytteet lisättiin levyille 2 tunnin ajan ja pestiin 5 kertaa lektiini inkubaatiopuskuria (10 mM Tris, pH 8,0, 0,15 M NaCl, 0,1% Tween 20). Fukosyloituja A1AT havaittiin biotiini konjugoituna

oranssimaljakas

lektiini (AAL) (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Sitoutunut lektiini havaittiin käyttäen IRDye 800 konjugoitu streptavidiini; signaali voimakkuus mitattiin käyttämällä Odyssey infrapuna Imaging System (LI-COR Biotechnology, Lincoln, Nebraska). Kaikissa tapauksissa signaali-intensiteettejä verrattiin signaalien havaita hankkia kaupallisesti ihmisen seerumia (Sigma Chemicals). Lektiini-Flisa havaitsee määrä fukosyloitu- läsnä yhtä suuri määrä molekyylejä, jää kunkin potilaan näytteestä ja suoritetaan riippumattomalla tavalla kokonaismäärästä proteiinin tahansa tietylle potilaalle.

Tilastollinen analyysi

Tarkempi tilastot vaiheittaisen potilaita verrattiin sirontakuvaajiin joka sisälsi poikkeavia havaintoja. Kaikki arvot on raportoitu keskiarvoina plus tai miinus keskivirhettä, ellei toisin mainita. Koska data ei noudata tyypillinen Gaussin jakauma, joka on nonparametrical testi (two-tailed, 95% luottamusväli, Mann-Whitney-testi) käytettiin määrittämään tilastollista eroa ryhmien välillä. Määrittää optimaalisen kynnysarvon kullekin markkerille, vastaanotin toimii ominaisuus konstruoitiin käyttäen kaikkia mahdollisia cutoffs kutakin määritystä varten. Pinta-ala saa toimii ominaiskäyrä on rakennettu ja sitä verrattiin aikaisemmin kuvatulla tavalla. Kahden pyrstö P-arvo on 0,05 määrittämiseen käytettiin tilastollisen merkitsevyyden. Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen GraphPad Prism (San Diego, CA, USA).

Tulokset

Tasot A1AT ja aste Sialyation in Maksakirroosipotilailla ja HCC

Yhdistetty seerumit terveillä potilailla (n = 20), Maksakirroosipotilaille (n = 20) ja potilailla, joilla on HCC joiden tausta on kirroosi (n = 20) erotettiin kautta 2-D geelielektroforeesi (2DE) (taulukko 1). Kuviossa 1A esitetään edustava 2-DE normaalia ihmisen seerumia ja kuviot 1B, 1C ja 1D esittävät keskittyä 5 isoformia (M1, M2, M4, M6 ja M7) on A1AT kolmesta potilasryhmille. Kolme suurta ja kaksi pientä A1AT isotyyppejä ovat yleisesti nähtävissä, kun ihmisen seerumia on isoelectrically keskittynyt ja ajettiin 2-D geeli [22], [23] ja niitä ei muuteta kolmessa potilasryhmissä. A1AT pitoisuudet kunkin potilaan ryhmässä olivat vertailukelpoisia (kuviot 1E-1G) ja kuului normaali pitoisuudet seerumissa. Tämä tulos vahvistettiin analysoimalla A1AT entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA), jolloin A1AT pitoisuudet olivat 3,2 mg /ml komposiitti terveistä potilaista, 3,3 mg /ml komposiitti päässä Kirroosipotilaiden, ja 3,3 mg /ml komposiitti päässä HCC potilaista.

Sera pooleista terveiden verrokkien (A, B, E) ja kirroosi (C, F) ja syöpä (D, G) potilaat kohdistuivat käyttäen IPGPhor 3-7 NL ensimmäinen ulottuvuus nauhat ja sen jälkeen SDS-PAGE erotus 8%: sta 18% akryyliamidigeeleillä. Pl valittujen geelin täplät ovat M1 = 4,91, M2 = 4,95, M4 = 5.00, M6 = 5,05, ja M7 = 5.10. Paneelit E, F, ja G esittävät suhteellinen runsaus kunkin geelin päällä.

Me tehdään glykaanianalyysissä M1, M2, M4, M6 ja M7 isotyypit päässä seerumipoolia normaalista osallistujien ja kirroottiset ja HCC potilasta (kuviot 1B-1D) ja tutki sialylaatiota kuvioita kunkin isotyyppiä. Kuvassa S1 esitetään edustava glykaaniprofiili M4 isotyypin kontrolleista. Yhdenmukainen tuloksia aikaisempien tutkimusten [24] kaksiantenniset glykaanin on yleisin laji. Kuva S1-B esittää tason sialyated kaksihaarainen ja kolmihaarainen glykaanin, joka liittyy kuhunkin isoformien kunkin potilaan ryhmästä. S1-B osoittaa, taso sialyation on bi-anntennery glykaanitähteen (A2G2S1 tai A2G2S2) oli samanlainen eri potilasryhmissä. Samoin taso sialyation ei muutettu sen triantennaariset glykaania. Oli kuitenkin kasvu tason tri-sialyated α-1,3 sidottu fukosyloituja ulkovarteen fukosyloituja glykaanin (A3F (3) 1G3S3) on A1AT syöpäpotilaista, verrattuna terveiden ja Kirroosipotilaiden. Nämä huippu on merkitty kuvassa S1A B tähdellä.

kohonneeseen Core ja Outer Arm fukosyloitu- havaitaan siitä A1AT potilailta, joilla HCC

Voit testata, jos tehostetun tri-sialyated α-1,3 siihen liittyvän fukosyloituja ulkovarteen fukosyloituja glykaanitähteen (A3F (3) 1G3S3) oli seurausta kasvusta sialyation tai lisääntymiseen kokonaismäärän vanhemman glykaani, siaalihapon poistettiin entsymaattisesti ja näytteen analysoitava uudelleen. Kuvio 2 esittää yksinkertaistetun Desialyloitujen glycoprofile on viisi suurta isoformeja kullekin potilasryhmälle hoidon seurauksena neuraminidaasin (

Arthrobacter ureafaciens

). Kolme huiput edun merkitty tähdellä kuviossa 2, ovat toistettavasti muuttunut M1, M2, ja M4-isoformit kuin sairaat maksan etenee maksakirroosi syöpään. Sequential exoglycosidase ruoansulatus (tietoja ei esitetty) osoitti näiden huippujen olla ydinfukosyloitujen kaksihaaraisen glykaanin (F (6) A2G2), joka on kolmihaarainen glykaanin (A3G3), ja kolmihaarainen glykaani yhdellä α 1,3 liitetty ulomman varren fukoosia jäännös ( A3F (3) 1G3). Kuviossa 3A on esitetty edustava desialyloidut profiilin vastaavaan glykaanirakenteeseen tunnistaa kunkin piikin. Taulukossa 2 on kvantitoimiseksi kunkin glykaanirakenteeseen läsnä viisi suurta isoformeja kullekin potilasryhmälle. Erityisiä muutoksia glykosylaation havaitaan A1AT isoformeja kanssa etenemisen maksakirroosi ja HCC. M6, isoformivyöhykkeet hyvin vähän tri ja tetra-antennaarisen rakenteissa kaksiantenniset ydinfukosyloitujen glykaanitähteen (F (6) A2G2) edustaa 4,48% normaaleilla potilailla, 4,37% potilailla, joilla on kirroosi, ja 7,04% syöpäpotilailla, suuntaus nähdään jokaisen eri isoformeja (taulukko 2, glykaania 3). Prosentuaalinen muutos terveiden ja kirroosi välillä maksakirroosi ja syöpä on esitetty kuvassa 3C ja osoittaa, että tämä rakenne muuttuu syöpää vain. M4, kolmihaarainen glykaanin ulommalla varsi fukoosin jäännös (A3F (3) 1G3) nousee 4,34% normaalissa osallistujia 6,78% potilailla, joilla on kirroosi, ja 13,18% maksakirroosipotilaista plus syöpä. Jälleen, tämä suuntaus näkyy kunkin isoformien kanssa lukuun ottamatta M6, koska täydellinen puuttuminen triantennaariset rakenteiden (taulukko 2, glykaania 8). Suhteellinen kasvu kussakin näistä fukosyloitujen glykaanirakenteet funktiona taudin on esitetty kuviossa 3B, ja osoittaa, että tämä rakenteiden muutoksia sekä maksakirroosi ja HCC. Kasvu ulkovarteen fukosyloitu- liittyi myös lasku emä-N-sidottu glykaanin. Tämä merkitsee, että kasvu ulkovarteen fukosyloituja kolmihaarainen glykaani, A3F (3) 1G3, liittyi lasku kolmihaarainen glykaanin A3G3. (Taulukko 2, glykaania 6).

Suurimmat piikit, jotka ovat muuttuneet, on merkitty tähdellä ja ovat (vasemmalta oikealle) ytimen fukosyloituja bianntennary glykaanitähteen (F96) A2G2), joka on trianntennary N-kytketyn glykaanin ja trianntennary N-kytkettyä glykaanin yhdellä ulkovarteen fukoosin jäännös (A3F [3] 3). Prosentuaalinen Kunkin näistä piikeistä eri isoformit ja eri potilasryhmille on esitetty taulukossa 2.

(A) Edustava N-sidottu glykaaniprofiili normaalista kontrolli potilaalle. 11 suurimmalta glykaanirakenteet tunnistettu osoitetaan ja annetaan numero. Tätä numeroa käytetään taulukossa 2 rakennetta nimet säädetty. Suhteellinen muutos tason trianntennary N-kytketty glykaani yhdellä ulkovarteen fukoosin jäännös (A3F [3] G3) (B) ja ydinfukosyloitujen bianntennary glykaanin (F [6] A2G2) (C) normaalissa kirroottisiin ja kirroottisilla että HCC esitetään prosenttia muutos. Koska tämä luku osoittaa, korotukset ulkovarteen fukosyloitu- liittyvät sekä maksakirroosi ja HCC, kun taas lisääntynyt ydin fukosyloitu- on havaittu vain HCC.

Analyysi fukosyloitujen A1AT lektiiniblottianalyysillä-Flisa on kohortti 458 potilaat

tutkia edelleen, jos muutoksia sekä ydin ja ulkovarteen fukosyloitu- näkyi yksittäisillä potilailla ja mahdollisesti käyttää diagnostisena markkerina syövän, analysoimme potilas kohortti koostuu 458 potilasta varten taso fukosyloitujen A1AT käyttämällä lektiini-Flisa perustuva määritys. Tässä määrityksessä A1AT siepattiin käyttäen monoklonaalista vasta-ainetta ja taso fukosyloitu- määritettiin käyttäen fukoosia sitova AAL. AAL tunnistaa sekä ulkovarteen ja ydinfukosyloitujen glykaania. Kaksikymmentä potilasta, joilla ei ole merkkejä maksasairaudesta käytettiin verrokkeina; 33-infektiota sairastavilla potilailla HBV oli tuntematonta maksafibroosin; 215 potilasta tartunnan HCV oli tuntematonta maksafibroosin; 65 potilaalla oli maksakirroosi; 62 potilaalla oli muiden maksan sairaudet; ja 63 potilaalla oli maksasyöpä (taulukko 1). Kuvio 3A esittää suhteellista tasoa fukoosin lektiini-reaktiivisen A1AT kuuden potilaan ryhmää. Arvot annetaan kertainen kasvu suhteessa tasoon kaupallisesti ostettu ”normaali” seerumit. Keskiarvo ja 95%: n luottamusväli keskiarvosta on esitetty kullekin ryhmälle. Olemme löytäneet selvä tilastollinen ero HCC-ryhmän, ja kaikki muut ryhmät (P 0,0001), ja välillä kirroottinen ryhmän ja kontrolliryhmän (P = 0,0173), mutta ei minkä tahansa muun ryhmän (kuvio 3A). Keskimääräinen taso lektiini-reaktiivisen A1AT oli 1,4-kertainen (± 0,80) yläpuolella sigma kontrolliryhmässä, 1,7-kertainen (± 0.1.8) ryhmässä tartunnan HBV, 1,9-kertainen (± 1,8) ryhmässä tartunnan HCV, 2,6-kertainen (± 2,3) ryhmässä, joilla on kirroosi, 2,6-kertainen (± 2,0) ryhmässä muiden maksasairauksien sekä 7,70-kertainen (± 4,45) ryhmässä, jossa HCC. Yllättäen ei ollut eroa keskimääräinen taso AAL-reaktiivisen A1AT HCC potilaiden osalta vaiheessa HCC (tuloksia ei ole esitetty). Se on potilaita, joilla on vaiheen 1 HCC, joka määritellään yhdeksi vaurio alle 2cm [11], oli 9,1-kertainen (± 4,70) kasvu tason AAL reaktiivisen A1AT kun potilaalla on vaiheessa 4 HCC (ne, joilla on useita leesioita 6cm halkaisijaltaan) keskiarvo oli 6,7-kertainen (± 5,54), joka ei ollut erilainen kuin on havaittu vaiheessa 1 potilaalla (

p

= 0,114).

tässä kohortissa, fukosyloitu A1AT voisi erottaa HCC ja ei-HCC tapausta, joiden ala saa operaattori käyrä (AUROC) on 0,871. Verrattaessa vain HCC versus kirroosissa syrjivä kyky oli 0,867. Käyttämällä katkeamisen 5 suhteellista yksikköä AAL reaktiivinen A1AT voisi erottaa HCC maksakirroosi herkkyydellä 70% ja spesifisyys 86%. Sen sijaan, AFP, kun analysoitu tässä kohortissa, oli AUROC on 0,764 ja voisi erottaa HCC maksakirroosi herkkyydellä 59% ja spesifisyys 93% käyttäen cut-off 20 ng /ml.

vääriä positiivisia ovat lisänneet tasot Outer Arm fukosyloitu- katsoo Core fukosyloitu- on spesifinen HCC

Jotkut potilaat eivät syöpä vaan ovat kohonneet lektiini-reaktiivisen A1AT (kuvio 4A). Koska havaitsimme muutoksia ulkovarteen fukosyloitu- on A1AT potilailta, joilla on kirroosi, oli kiinnostavaa määrittää, jos niitä vääriä positiivisia tuloksia oli ydin tai ulkovarteen fukosyloitu-. Kuvio 4A esittää tulokset glykaanianalyysissä puhdistetusta A1AT kolmesta Kirroosipotilaiden (yhdeksästä) ja kolme potilasta, joilla on vaiheen 1 tai 2 HCC (yhdeksästä) ja analysoitiin kuten aiemmin. Tulokset näistä potilaista on esitetty kuviossa 4A, ja edustava glykaaniprofiili yksi näistä potilaista on esitetty kuviossa 4B, sekä tason 4 suurta glykaanirakenteet ilmoitettu. Kuten kuvio 4B esittää, vastaa tuloksia, esitetty taulukossa 2 ja kuvioissa 3A-3C, kolme Kirroosipotilailla tasot ovat keskeisiä fukosyloitu- (F (6) A2G2) kuin terveillä valvontaa. Kuitenkin näillä potilailla on merkittävä nousu ulkovarteen fukosyloitu- (A3F (3) 1G3), samanlainen korkeimpia potilailla esiintyi HCC. Tämä tarkoittaa, että taso ulomman varren fukosyloitu- näillä potilailla vaihteli 10%: sta 17%, joka on samanlainen kuin tasolle potilailla, joilla oli HCC (13%). Sitä vastoin kolme potilasta, joilla HCC oli erittäin voimakas positiivisia tuloksia lektiinin Flisa testi oli kasvanut ydin ja ulkovarteen fukosyloitu-. Esimerkiksi ydinfukosyloitujen bianntennary glykaanitähteen edusti 9,55% enemmän A1AT puhdistettu potilaasta H27. Samoin tämä glykaanitähteen edusti yli 9% A1AT puhdistettu potilailta H18 ja H23. Kohonneita ulkovarteen fukosyloitu- vaihtelee 14,03%: sta 15,97% koko glykaanin A1AT havaittiin myös näillä potilailla. Kuvio 4D esittää tulokset kaikista 18 potilasta, joka keskittyy tasosta ulkovarteen (α-1,3) ja ydin (α-1,6) fukosyloitu-. Tutkiessaan kaikki 9 kirroottiset vääriä positiivisia keskimääräinen taso keskeisten fukosyloitu- oli 3,77% ± 0,25 ja keskimääräinen taso ulkovarteen fucosyalation oli 11,88% ± 2,79. Kun kyseessä syöpien keskimääräisen tason ydin fukosyloitu- oli 8,62% ± 1,2 ja keskimääräinen taso ulkovarteen fukosyloitu- oli 14,26% ± 1,9. Oli tilastollista eroa tason ydin α-1,6 fukosyloitu- näiden yhdeksän kirroottiset ja yhdeksän HCC potilaalla (p 0,0001) mutta ei α-1,3 sidoksissa fukosyloitu- (p = 0,07). Tärkeää on, enimmäismäärä ytimen fukosyloitu- havaittu vääriä positiivisia Kirroosipotilailla oli 4,01%, samanlainen kuin mitä havaittiin terveillä verrokeilla (3,62%).

(A) taso lektiini-reaktiivisen A1AT potilailla, joilla on HCC, HBV-infektio, HCV-infektion tai muiden maksasairauksien (VANHA) ja valvontaan. Kiinteä viiva edustaa keskiarvo. X-akseli edustaa potilaan ryhmää. Y-akseli esittää kertainen kasvu lektiini-reaktiivinen A1AT verrattuna kaupallisesti ostettu seerumissa. (B) glykaanianalyysin A1AT isoformin M4 potilaasta 21 (C) kvantifiointi glykaanianalyysissä kolmesta kirroosipotilailla (01,21 ja 27) ja kolme potilasta, joilla on vaiheen 1 tai 2 HCC (HCC-23, HCC 27 ja HCC 18 ). Tasot 4 suurta glykaanirakenteet näkyvät. Koska tämä luku osoittaa, maksakirroosia vääriä positiivisia, on kasvu ulkovarteen mutta ei ydin fukosyloitu-. Yhdenmukainen tiedot kuvioissa 2 ja 3, nousu ydin fukosyloitu- on AAT havaittiin vain potilailta, joilla on HCC. (D) sirontakuvaajaan tason α-1,3 tai a 1,6 sitoutunutta fukoosia 9 kirroottiset vääriä positiivisia ja 9 potilasta joko vaiheen 1 tai 2 HCC.

Keskustelu

Viimeaikaiset raportit ovat osoittaneet, että lisääntynyt ydin ja uloimman sakaran fukosyloitu- voitiin havaita seuraava glycomic analyysi joko koko ihmisen seerumin tai seerumin köyhdytetty immunoglobuliini [18], [19], [25]. Olemme tutkineet glykosylaation yhden proteiinin, A1AT, funktiona maksakirroosi ja maksasyöpä. Tätä varten löysimme joitakin muutoksia, jotka olivat yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen kuten kasvu ydin fukosyloitu- sekä muutokset ulkovarteen fukosyloitu-.

Havainto, että muutokset sekä ydin- että ulkovarteen fukosyloitu- tapahtua voi antaa vihjeitä molekyylitasolla tämän muutoksen. Se on, vaikka tarkkaa mekanismia lisätä ytimen fukosyloitu- HCC ei tunneta, ne ajatellaan kuuluvan kasvaa kummankin tason entsyymin ja substraatit mukana ytimessä fukosyloitu- [17].

On myös mahdollista että nämä merkit kuvastavat joitakin muutoksen Golgin laitteessa. Viimeaikaiset raportit ovat ehdottaneet, että Suhteen maksa, fukosyloitu- proteiinien on mukana proteiinia lajittelu sappi [26]. Näin ollen, on mahdollista, että ulkonäkö fukosyloitujen proteiinien seerumissa voi heijastaa yhteinen virhe proteiinin lajitteluun. On mielenkiintoista huomata, että glykosylaatio A1AT seerumissa potilailla, joilla on maksasyövän (kuviot 2, 3 ja 4), on samanlainen kuin sappeen terveiden yksilöiden [26].

On myös mielenkiintoista huomata, että lektiinin reaktiivisuus oli suurempi kuin kokonaismuutos havaittu fukosyloitu-. Esimerkiksi potilaalla 27 oli joko ytimen tai ulkovarteen fukoosin on 22.82% hänen N-sitoutunut glykaanien. Sen sijaan, A1AT peräisin terveen yksilön oli fukoosin (ydin tai ulkovarteen) 9%: n N-kytkeytyneisiin glykaaneihin. Näin ollen, käyttämällä lektiini Flisa, olisimme havaittu lähempänä 2,5-kertainen lisäys eikä 11-kertainen kasvu, joka saatiin. Tämä ero voi olla artefakti lektiini-Flisa, tulos muiden proteiinien kiinnitetty A1AT, lisääntynyt tai muunnettu O-glykosylaatio, tai lisääntynyt saatavuutta lektiinin on fukoositähteitä. Kaikki nämä mahdolliset skenaariot tutkitaan.

On myös tärkeää huomata, että lisääntynyt ulkovarteen fukosyloitu- havaittiin sekä potilailla, joilla on kirroosi ja niissä kanssa HCC. Tämä havainto merkitsee sitä, että ulompi varsi fukosyloitu- ei ollut erityinen syöpään, vaan oli todennäköisesti liittyy tulehdukseen, ensin maksan maksakirroosi ja sitten läsnäolo HCC vaurion. Itse asiassa taso ulkovarteen fukosyloitu- voi olla tarkempi tulehdusmerkkiaine ja voi ennustaa syövän kehittymisen [27], [28]. Sen sijaan, lisäykset ydin fukosyloitu- havaitaan vain potilailla, HCC, mikä viittaa siihen, että tämä muutos on syövän erityinen.

Kuten kuviossa 4A on esitetty, monet potilaat ei- HCC ryhmät ovat kohonneet lektiini-reaktiivisen AAL . Analyysi kolme potilasta, joilla on kohonnut AAL tasoja maksakirroosi ryhmä ilmoitti, että heillä oli muutokset ensisijaisesti ulkovarteen fukosyloitu-, ei ydin fukosyloitu-. Tätä varten ydin fukosyloitu- voi olla tarkempi tavoite havaitsemalla syöpä [29].