Krooninen sairaus

tiivistelmä

L-karnitiini (LC) uskotaan yleisesti kuljettaa pitkäketjuisia asyyliryhmiä rasvahapoista osaksi mitokondrioiden matriisin ATP sukupolven

kautta

sitruunahapposyklissä. Perustuen Warburg teoriaan, että useimmat syöpäsolujen riippuu lähinnä Glykolyysivaiheen ATP sukupolven oletamme, että LC käsittely johtaisi häiriöitä solun aineenvaihduntaan ja sytotoksisuus syöpäsoluissa. Tässä tutkimuksessa ihmisen hepatooma HepG2, SMMC-7721 solulinjoja, ensisijaisesti viljellyt tymosyyttien ja hiirillä, joilla HepG2 kasvaimen käytettiin. ATP-pitoisuus havaittiin HPLC-analyysillä. Cell cycle, solukuolemaan ja solujen elinkelpoisuus määritettiin virtaussytometrialla ja MTS vastaavasti. Gene, mRNA ilmentyminen ja proteiinin taso havaittiin geeni microarray, reaaliaikainen PCR ja Western blot vastaavasti. HDAC toimintaa ja histoni asetylaatio havaittiin sekä koeputkessa ja viljellyissä soluissa. Molekyylikerros telakointi Tutkimus toteutettiin CDOCKER protokollan Discovery Studio 2.0 ennustaa molekyylien vuorovaikutus L-karnitiinia ja HDAC. Täällä olemme huomanneet, että (1) LC käsittely valikoivasti esti syöpäsolujen kasvua

in vivo

ja

in vitro

; (2) LC hoito indusoi ilmentymistä p21

CIP1 geeni, mRNA ja proteiini syöpäsoluissa mutta ei p27

kip1; (4) LC lisää histoni asetylaatio ja indusoi kertymistä asetyloitu histonien sekä normaali- tymosyyttejä ja syöpäsolujen; (5) LC suoraan estää HDAC I /II toiminta

kautta

sitoutumalla aktiiviset kohdat HDAC ja indusoi histonien asetylointi ja lysiini-asetylointi kertymistä

in vitro

; (6) LC hoito indusoi kertyminen asetyloitua histonien kromatiinin liittyy p21

CIP1 geeni mutta ei p27

kip1 havainnut Chip määrityksessä. Nämä tulokset tukevat että LC, paitsi kuljettavat asyyliryhmä, toimii endogeeninen HDAC estäjä solussa, joka olisi fysiologisia ja patologisia merkitystä.

Citation: Huang H, Liu N, Guo H, Liao S, Li X, Yang C, et ai. (2012) L-karnitiini on sisäsyntyinen HDAC estäjä selektiivisesti Cancer Cell Growth

In vivo

ja

In vitro

. PLoS ONE 7 (11): e49062. doi: 10,1371 /journal.pone.0049062

Editor: Wei-Guo Zhu, Pekingin yliopiston Health Science Center, Kiina

vastaanotettu: 21 joulukuu 2011; Hyväksytty: 09 lokakuu 2012; Julkaistu: 5. marraskuuta 2012

Copyright: © 2012 Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National korkean teknologian tutkimus- ja kehittämisohjelma Kiinassa (Project 2006AA02Z4B5), National Natural Science Foundation of China (Projects 81070033, 30770835, 81170608, 81072091); Projects (9251018201002, 94510018201003604) Guangdong Natural Science Foundation ja projektien Guangzhou Education komissio (10A 057S, 08A 108) (JL, HH ja CZ). Tämä tutkimus on osittain tuettu National Institutes of Health avustuksen R01HL072166 ja R01HL085629 (sen XW). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

karnitiini on biosynthesized aminohapoista lysiini ja metioniini ja sen biologisesti aktiivinen muoto on L-karnitiinia (LC). Yleisesti uskotaan, että karnitiini kuljettaa pitkäketjuisia asyyliryhmiä rasvahapoista osaksi mitokondrioiden matriisiin, jossa ne voidaan jakaa kautta β-hapettumista asetyyli-CoA saada käyttökelpoista energiaa

kautta

sitruunahapposyklissä [ ,,,0],1] – [3]. Näin ollen LC tarvitaan sukupolven metabolisen energian elävissä soluissa.

On hyvin tunnettua, että useimmat syöpäsolujen pääasiassa energian tuottamiseksi, jonka korkea glykolyysin seuraa maitohapon käymisen sytosoliin, sen sijaan, suhteellisen alhainen glykolyysin seuraa hapetus pyruvaatin mitokondrioita kuten useimmat normaalit solut. Tämä tunnetaan Warburgin vaikutus syöpäsoluissa [4], [5]. Nopeasti kasvava pahanlaatuisia soluja on tyypillisesti glykolyyttisissä hinnat, jotka ovat jopa 200 kertaa suurempi kuin niiden normaalit kudokset ovat peräisin. Vaikka Warburg vaikutus on kyseenalaistettu ja kehittää edelleen, tämä teoria on edelleen useimmin mainittu näyttöä siitä, että kasvaimet näyttää huonosti aineenvaihdunta [6].

Tämän teorian pohjalta, että sitruuna- sykli on haitallista useimmissa syöpäsoluissa [7 ], [8], oletamme, että LC johtaisi häiriöitä solun aineenvaihduntaan syöpäsoluissa mutta ei normaaleissa soluissa. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet vaikutuksia LC sytotoksisuuteen sekä syövän ja normaaleissa soluissa. Huomasimme, että LC valikoivasti esti syöpäsolujen kasvua sekä

in vitro

ja

in vivo

. Tutkimme lisäksi mekanismi LC sytotoksisuus ja totesi, että fysiologiset pitoisuudet LC voi suoraan estää HDAC toimintaa.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit ja aineet

LC, R -karnitiinin, oligomysiini (nro 04876), butyraatti (Buty) ja trikostatiini A (TSA) ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). HDAC

TM I /II kokeessa ja seulontajärjestelmän hankittiin Promega Corporation (Madison, WI). L-glukoosia ja D-glukoosia saatiin Alfa Aesar (Karlsruhe, Saksa). Naudan sikiön seerumia (FBS) hankittiin Invitrogen Co. (Carlsbad, CA). Rabbit monoklonaalisia vasta-aineita asetyyli-H3 (Lys9) (C5B11), kanin polyklonaalinen vasta-aineita PARP, asetyloitu-lysiini, asetyyli-H4 (Lys8), ja hiiren monoklonaalisia vasta-aineita p21

Waf1 /CIP1 (DCS60) olivat kaikki hankittiin Cell Signaling (Beverly, MA). Vasta-aineita Rb (G401), Phospho-Rb (S780) ostettiin Bioworld Technology, Inc. Hiiren monoklonaalinen vasta-aine p27 (F-8), kanin polyklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​GAPDH (FL-335) ja piparjuuriperoksidaasi (HRP) -leimattua toissijainen vasta-aineet olivat peräisin Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Parannettu kemiluminesenssin reagenssit hankittiin Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).

Hiiret ja ruokavalio

Male normaali Balb /c ja Balb /c-nude-hiiriin aged 5 viikkoa (18-22 g), olivat ostettu vastaavasti Guangdongin animal Center ja sijoitettu ruostumatonta terästä mesh häkeissä eläinhuoneessa vakiolämpötilassa on 12-h-valo /-Dark sykli. Hiiret kulutettu kaupallinen puhdistamattomassa ruokavalion ja vettä halun. Kaikki koemenettelyn olivat mukaiset Guangdongin Animal Center for eettisen eläinten hoitoon ja hyväksytty eläinten kokeellinen komitean Guangzhou Medical College (SCXK2008-2002). Mies normaali Balb /c-hiiret jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään (n = 8 hiirtä /ryhmä) ja olivat

vatsaontelon

. injektoitiin joko vehikkeliä (suolaliuosta) tai LC 400 mg /kg peräkkäisinä 15 päivää. Ruumiinpaino ja elimen painon havaittiin ja tiivistää. Mies Balb /c nude-hiirissä olivat

s.c.

. ympättiin vasemmassa kainalossa kanssa HepG2 solut (1 x 10

6 solua /hiiri). Kun kasvaimen koko kasvaa 50-75 mm

3, hiiret jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään (n = 8 hiirtä /ryhmä) ja niitä

ip

injektoitiin joko vehikkeliä (suolaliuosta) tai LC (400 mg /kg, kerran /vrk) 15 päivän ajan, paitsi päivä 8. Ruumiinpaino ja kasvaimen paino havaittiin ja tiivistää. Valaisemiseksi paremmin nämä tulokset, kaikki ensisijainen tiedot muutettiin suhteellisen tason (%).

Soluviljely

Ihmisen hepatooma- HepG2 ja SMMC-7721 solulinjat, hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA), kasvatettiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää, 100 U /ml bentsyyli- penisilliiniä ja 100 U /ml streptomysiiniä, pH 7,4: ssa kosteutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 37 ° C: ssa. Tymosyyttien eristäminen ja primäärisestä viljelmästä suoritettiin seuraavasti: lyhyesti, kateenkorva Balb /c-hiiri on rullattu pala steriiliä sideharsoa poistaa kiinnitetty rasvaa ja sidekudos ja rauhanen asetettiin 60 mm petrimaljaan, joka sisälsi 5 ml: lla kylmää media (HBSS pH 7,0, joka sisälsi 5% vasikan sikiön seerumia 4 ° C: ssa), ja varovasti vetänyt kateenkorva toisistaan ​​neulojen ja pipetoidaan ylös ja alas useita kertoja huolellisesti hajottaa minkä tahansa solun möhkäleitä. Seokset johdettiin 75 pm ruostumattomasta mesh poistaa möhkäleitä kudoksen, sentrifugoitiin solususpensiot (250 g, 10 min, 4 ° C) ja suspendoitiin uudelleen solupelletit 5 ml RPMI 1640-väliaine. Yhteenlaskettu solujen lukumäärät laskettiin trypaanisinisellä on valkosolujen laskuri.

Solukuolemaan määritys

Tämä tehtiin käyttämällä anneksiini V-FITC ja propidiumjodidilla (PI) kaksinkertainen värjäys, jota seuraa virtaussytometria kuten aiemmin on kuvattu [9]. Lyhyesti, viljellyt HepG2-solut kerättiin ja pestiin kylmällä PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen sitomispuskurissa, jonka jälkeen anneksiini V-FITC: llä inkuboimalla 15 minuutin ajan ja PI-värjäyksellä vielä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa pimeässä. Värjätyt solut analysoitiin virtaussytometrillä 30 min.

ATP sisällön määrittämiseksi

ATP sisällön määrittämiseksi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [10]. Lyhyesti, Equal useita viljeltyjä soluja kerättiin ja solupelletti jäädytettiin välittömästi ja varastoitiin nestemäisessä typessä myöhempää ATP analyysejä. Lysaatteja sentrifugoitiin 12 000 rpm 10 min 4 ° C: ssa. Supernatantti kerättiin analysointiin ATP käyttämällä käänteisfaasi-C18-HPLC: llä (LC-6AD, Shimadzu, Japani) määrityksessä, kun pH säädettiin 7,4. 180 mM KH

2PO

4 (5% metanolia) käytettiin liikkuvana faasina (pH 6,25), joka kulkee 0,8 ml /min. Määritys oli lineaarinen 0,05-200 ug /ml ATP determinaatiokerroin (R

2) 0,999. Validointi variaatiokertoimet sisäisten ja välisten päivän määrityksissä olivat alle 1,5% ja 5,1%, tässä järjestyksessä. Suhteellinen ATP pitoisuus lasketaan huippujen pinta

verrattuna

ATP seistä käyrä.

solunelinkykyisyysmääritys

Huumeiden vaikutus solujen elinkelpoisuus määritettiin MTS määritys (CellTiter 96® vesikerros Solution Cell Proliferation määritys, Promega Corporation, Madison, WI, USA), kuten on raportoitu aikaisemmin [9]. Lyhyesti, soluja viljeltiin 96-kuoppaisilla levyillä ja käsiteltiin osoitetulla aineita 24 tai 48 tuntia. Käsiteltiin sitten soluja inkuboitiin 20 ui MTS vielä 3 tuntia. Absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä Automatic mikrolevylukijalla (Sunrise, Tecan). Solujen elinkelpoisuus laskettiin seuraavalla kaavalla: solujen elävyys (%) = (keskimääräinen absorbanssi käsitellyssä ryhmässä – keskimääräinen absorbanssi tyhjä) /(keskiarvo absorbanssi käsittelemättömän ryhmä- keskimääräinen absorbanssi tyhjä)] x 100%.

Histoni ja proteiinin asetylaatio

in vitro

ja viljellyissä soluissa

in vitro

proteiinin asetylaatio, solulysaattia joko syöpäsolujen tai hiiren tymosyyttejä inkuboitiin erilaisten annosten LC ja TSA tai Buty on HDAC koepuskuriin 37 ° C: ssa 1,5 tuntia, sitten asetyloitu H3, -H4, ja lysiini-asetyloitu proteiinit havaittiin Western Blot. Proteiinin asetylaatio viljellyissä soluissa, joko syöpäsolun tai hiiren tymosyyttien käsiteltiin eri pitoisuuksilla LC tai TSA ja Buty eri ajankohtina, solut kerättiin ja sitten proteiinin asetylaatio havaittiin Western Blot.

Western Blot

Western blot suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [11], [12]. Lyhyesti, sama määrä kokonaisproteiinia uutettu viljellyistä soluista erotettiin 12% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF). Primaaristen vasta-aineiden ja piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sopivan sekundäärisen vasta-aineita käytettiin havaitsemaan nimetty proteiinit. Rajattu sekundääriset vasta-aineet on PVDF-kalvolle oli reagoinut ECL detektioreagensseja ja valotettiin röntgenfilmejä (Kodak, Japani). X-ray elokuva altistuminen skannattiin ja digitalisoidaan käyttämällä korkean resoluution skanneri. Tiheys Haluttu bändejä kvantifioitiin kanssa Määrä One ohjelmisto (BioRad).

Solusyklianalyysiä

Solusyklianalyysiä suoritettiin raportoitu aiemmin [12]. HepG2-soluja siirrostettiin 6-cm: n maljoihin yli yön RPMI 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, sitten käsiteltiin LC ilmoitettuina ajankohtina. Solut kerättiin, pestiin PBS: llä ja värjättiin PI: n läsnä ollessa RNaasi. Tiedot analysoitiin perustuen jakautumiseen solupopulaatioiden eri vaiheissa solusyklin.

tietokonemallintaminen

Jotta ymmärtää molekyylitasolla vuorovaikutusta L-karnitiinia ja HDAC, molekyylitasolla telakointi tutkimus oli suoritetaan CDOCKER protokollan Discovery Studio 2.0 (Accelrys Software Inc). Kiderakenne HDAC (ATE ID: 1ZZ0) käytettiin telakointi proteiinia. Ensinnäkin, vain ketju A-alayksikkö säilyi jälkeen toisen ketjun alayksiköiden, vuorottelevat konformaatioita alkuperäisen ligandin ACT, Kalium metallit ja vesimolekyylejä poistettiin. Sitten vetyatomien ja Gasteiger maksuja lisättiin alayksikköön. Lopuksi vain vetyä kannat optimoitiin kanssa Dreiding kaltainen voimakentän avulla Clean Geometry valikosta. Samaan aikaan yhdiste L-karnitiini valitaan telakointi estäjä myös optimoitu Dreiding kaltainen voimakentän avulla Clean Geometry valikosta. Proteiini HDAC oli jäykkä, kun taas ligandi LC oli joustava aikana telakoinnin prosessi. Input Site Sphere keskittyi alkuperäiseen ligandin ACT, jonka säde on 12 Å. Top osumia, Random konformaatioita ja suuntaviivat tarkentaa parametrit kaikki asetettu 20. konformaatio vastaa alhaisinta CDOCKER Interaction Energia valittiin todennäköisin sitoutumiskonformaation. Vihdoin, telakointi kompleksi edelleen arvioitiin sitova ilmaista energiaa, jonka Laske sidosenergioiden protokollaa. Kaikki käytetyt parametrit laskennassa olivat oletus paitsi selitti.

HDAC määritys

in vitro

ja viljellyissä soluissa

HDAC

in vitro

ja viljellyt solut havaittiin HDAC-Glo ™ I /II Assay and Screening System (Promega, USA) noudattaen standardia protokollaa. HDAC-määritys suoritettiin valkoinen 96-kuoppaiselle levylle. Sillä

in vitro

HDAC-määritys, solulysaattia (optimaalinen proteiinipitoisuus: 1 ug) inkuboitiin eri aineita HDAC koepuskuriin (100 ui) kanssa 37 ° C: ssa 60 min ja sitten 100 ui HDAC

TM I /II reagenssia lisättiin 30 min, luminesenssi mitattiin. HDAC-määritys viljellyissä soluissa, soluja (10000 solua /kuoppa) käsiteltiin LC tai positiivisena kontrollina aineita 6 h tai 12 h, sitten solun alusta vaihdettiin seerumia plus HDAC-puskuria (50 ui + 50 ui). 15 min kuluttua inkuboinnin HDAC

TM I /II reagenssit (100 ui) lisättiin soluihin, luminesenssi mitattiin 30 minuutin jälkeen.

Quantitative real-time PCR

Yhteensä-RNA: t uutettiin HepG2 solujen TRIzol reagenssilla. Käänteistranskriptio puhdistettua RNA: ta suoritettiin käyttäen standardi III käänteistranskriptio mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen). Kvantifiointi kaikista geenitranskriptien tehtiin kvantitatiivinen käyttämällä TAKARA SYBR Esisekoite Ex Taq pakki Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR-järjestelmä. Arvot P21 ja P27 ovat osoittaneet vastaan ​​arvo GAPDH, jota käytettiin kontrollina. Alukesarjat monistamista ovat seuraavat: p21-F: 5’GTC CAG CGA CCT TCC TCA TCCA3 ’; p21-R: 5’CCA TAG CCT CTA CTG CCA CCA TC3 ’; p27-F: 5’ACT GAG GCG GAG ACG AAG GT3 ’; p27-R: 5’CCT GAC AAG CCA CGC AGT AGAT3 ’; GAPDH-F: 5’CCA GCA AGA GCA CAA GAG GAA3 ’; GAPDH-R: 5’GGT CTA CAT GGC AAC TGT GAGG3 ”.

ChIP määrityksissä

1 x 10

7 HEPG2 solut valmistettiin sirulle määrityksessä, suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],13] mukaan KangChen biotekniikan yritys (Shanghai). Kunkin ChIP määrityksessä näyte oli sekoitus 3 itsenäisen solun näytteitä. Anti-H3K9 vasta-ainetta käytettiin immunosaostamaan histonien. Kaikki palanäytteet tehtiin reaaliaikaisella PCR käyttäen TaKaRa PCR lämpösyklilaitteeseen ja Roottorin Gene 3000 Realtime PCR. P21 ja P27-alukkeet olivat seuraavat: p21-F: 5’GCC GAA GTC AGT TCC TTG TG3 ’; p21-R: 5’CGG GGT CCC CTG TTG TCT3 ’; p27-F: 5’CTC TGA GGA CAC GCA TTT GGT3 ’; p27-R: 5’TGC AGG TCG CTT CCT TAT TC3 ”. Tiedot esitetään kertainen rikastus laskettu kullekin vasta-aineelle ChIP-arvo (IP /Input, prosenttiosuus tulo) verrattuna IgG-ohjaus ChlP arvo.

DNA microarray-analyysissä ja analyysin

HepG2-soluja käsiteltiin eri annoksilla LC 24 tuntia, ja sitten solut kerättiin ja uutettiin TRIzol aineita. RNA määrän ja laadun mitattiin NanoDrop ND-1000. RNA: n eheys arvioitiin standardin denaturointia agaroosigeelielektroforeesilla. DNA-siru suoritettiin KangChen biotekniikan yritys (Shanghai) noudattaen ja MIAME ohjeita. Ihmisen 12 × 135K Gene Expression Array on valmistanut Roche NimbleGen. Lyhyesti, noin 5 ug kokonais-RNA kutakin näytettä käytettiin merkintää ja array hybridisaatio kuin seuraavat vaiheet: (1) Käänteiskopiointireaktioita kanssa Invitrogen Superscript ds-cDNA synteesi kit; (2) ds-cDNA leimaamisen NimbleGen yksivärinen DNA -leimauskittiä; (3) Array hybridisaatio käyttäen NimbleGen Hybridisaatio System, ja sen jälkeen pesemällä NimbleGen pesupuskuria kit; (4) Array skannaus käyttämällä Axon GenePix 4000B mikrosiru skanneri (Molecular Devices Corporation). Skannatut kuvat (TIFF-muodossa) sitten tuodaan NimbleScan ohjelmiston (versio 2.5) varten ruudukontasaus ja ilmaisun tietojen analysointi. Kertainen nousu geeniekspression laskettiin verrattuna vehikkelikontrolliin.

Tilastolliset menetelmät

Ellei toisin mainita, tarkoittaa + SD esitetään tarvittaessa. Parittomia Opiskelijan

t

-testi tai yksisuuntainen ANOVA käytetään tarvittaessa määrittämiseen tilastollinen todennäköisyyksiä.

P

arvo alle 0,05 pidetään merkittävänä.

Tulokset

LC hoito estää selektiivisesti syöpäsolujen kasvua

in vivo

ja

in vitro

on hyvin tiedossa, että useimmat syöpäsolut ovat riippuvaisia ​​Glykolyysivaiheen ATP sukupolvi. Edelleen vahvistaa, että meidän solujärjestelmät, useita syövän solulinjoja käytettiin testaamaan, onko oligomysiini voisi inhiboida ATP-tuottamista. Tulos edustavissa syöpäsoluissa näytettiin. Todettiin, että kun läsnä on L-glukoosin elatusaineessa, oligomysiini nopeasti loppuun ATP-tuottamista, kun läsnä on D-glukoosin viljelyalustassa oligomysiini ei vaikuttanut ATP sukupolven (Fig. 1

). Koska L-glukoosia ei voida käyttää tuottamaan ATP tuotantoon [10], tämä tulos tarkoittaa, että syöpäsolut pääosin luottaa D-glukoosista Glykolyysivaiheen ATP tuotantoa, johdonmukainen Aiempien raporttien [4], [5]. Me tutkimme seuraavaksi LC hoito voisi lisätä solunsisäistä ATP tuotantoa syöpäsoluissa. Johdonmukaista meidän ennustus, LC hoito voinut lisätä ATP tuotantoa sekä maksan HepG2 ja SMMC-7721 syöpäsoluihin (Fig. 1

b

). Kuitenkin, toisin kuin vaikutus syöpäsoluja, oligomysiini, kun sitä lisätään hiiren tymosyyttejä viljeltiin D-glukoosia, aikariippuvainen esti ATP sukupolven (Fig. 1

c

), kun taas LC tehokkaasti solunsisäinen ATP sisältöä eri ajankohtina näissä olosuhteissa (Fig. 1

d

). Nämä tulokset vahvistavat, että LC pystyy tuottamaan ATP normaaleissa hiiren tymosyyttejä, mutta ei maksan HepG2 ja SMMC-7721 syöpäsoluihin.

(a) syöpäsolut ovat vastustuskykyisiä oligomysiini läsnä ollessa D-glukoosia ( 2 g /l), mutta ei L-glukoosia (2 g /l). Ihmisen HepG2 syövän soluja viljeltiin läsnä ollessa tai puuttuessa joko D-glukoosia tai L-glukoosi elatusaineeseen ja käsiteltiin erilaisilla annoksilla oligomysiini (0,1, 0,25, 0,5. 1,0 ug /ml) 6 tunnin ajan ja ATP-pitoisuus oli arvioitu. Keskiarvo + SD (n = 3). *

P

0,01,

verrattuna

ohjaus. DM: DMSO. (B) LC ei lisää solunsisäistä ATP pitoisuus syöpäsoluissa. Ihmisen maksan HepG2 ja SMMC-7721-soluja viljeltiin normaalissa elatusaineessa vastaavasti ja käsiteltiin eri annoksilla LC 6 h, ATP-pitoisuus havaittiin. LC: L-karnitiini. (C) Thymotytes ovat herkkiä oligomysiini läsnä ollessa D-glukoosia (2 g /l). Hiiren tymosyyttejä käsiteltiin oligomysiini (1 mg /ml) eri ajankohtina (1, 3, 6, 9 h), yhteensä ATP sisällön havaittiin. (D) LC tehokkaasti lisää solu- ATP sisältöä. Hiiren tymosyyttejä käsiteltiin LC (1 mM) ja eri aikoina, solujen ATP-pitoisuus oli assassed. Veh: ajoneuvo.

Seuraavaksi verrattiin LC normaalia kudosta ja syövän kasvua

in vivo

. Normaali Balb /c-hiiriä tai Balb /c-nude-hiirillä, jotka inokuloitiin HepG2 syöpäsolut olivat

vatsaontelon

. injektoitiin LC (400 mg /kg) ja 15 päivää, paitsi päivänä 8, ja sen jälkeen kokeiden päättyessä. Tämä annoksen ohjelma on siedetty annos Balb /c nude-hiirissä. Elinten painon ja kasvaimen paino kunkin hiiren käsitelty LC tai valvontaa verrattiin. Havaittiin, että LC hoito esti yli 70% syövän kasvua, kun taas saman kohtelun laski alle 20% normaalista elimen kehitystä ja kehon paino (Fig. 2

).

(a) LC estää selektiivisesti HepG2 kasvaimen kasvua verrattuna normaaleihin kudoksiin. BALB /c-nude-hiiret olivat

s.c.

. ympättiin vasemmassa kainalossa jokaisen hiiren HepG2 solut (1 x 10

6 solua /hiiri). Kun kasvain koko kasvaa 50-75 mm

3 nude-hiiret olivat

vatsaontelon

. injektoidaan 400 mg /kg peräkkäisinä 15 päivää. Normaali Balb /c-hiiriä käsiteltiin kuten nude-hiiriin. Kehon ja elinten painossa havaittiin. B. W: Paino. Keskiarvo + SD (n = 8). *

P

0,01, **

P

0,05,

verrattuna

kullekin valvonta vastaavasti. % Inhibitio = paino tai elimen paino LC-hoidetussa ryhmässä /keskimääräinen paino tai elimen paino verrokkiryhmässä × 100. (B) LC estää HepG2 solujen proliferaatiota annoksesta riippuvaisella tavalla. HepG2-soluja käsiteltiin eri annoksilla LC (1,25, 2,5, 5, 10 mM) 24 tunnin ajan tai 48 h, soluproliferaatiota havaittiin MTS-määrityksellä. Keskiarvo + SD (n = 3). *

P

0,01, **

P

0,05, verrattuna kontrolliin. (C) LC indusoi solukierron pysähtymisen Go /G1 vaiheeseen. HepG2-soluja käsiteltiin eri annoksilla LC 24 tuntia, solu- syklin havaittiin virtaussytometrialla. Edustavia Tulokset on esitetty. (D, e) LC hieman indusoi solukuolemaa. HepG2-solut altistettiin eri annoksia LC 24 tuntia ja solujen apoptoosin havaittiin virtaussytometrialla. Yhteenveto tiedoista näytettiin (d) ja edustavan ryhmää virtauksen kuvia näytettiin (e). ** P 0,05, vs. kontrolli. (F) LC ei dramaattisesti vaikuta tymosyyttien solujen elävyyden. Hiiren tymosyyttejä käsiteltiin erilaisilla annoksilla LC (2,5, 5, 10 mM) 24 tunnin ajan, solujen elinkykyisyys havaittiin MTS-määritys ja solujen määrä oli määrä.

Sitten tutkittiin vaikutukset LC soluproliferaatioon MTS määrityksessä. Todettiin, että LC annoksesta riippuvaa laskua HepG2 solujen elinkykyä (Fig. 2

b

), joka liittyy solusyklin pysähtyminen G0 /G1 vaiheeseen (Fig. 2

c

) ja alhainen solukuoleman (Fig. 2,

d

ja

e

). Nämä tulokset ymmärtää, että LC pääasiassa indusoidun soluproliferaation inhibition, mutta hieman indusoimaa solukuolemaa syöpäsoluissa. Lopuksi normaaleissa hiiren tymosyyttejä, LC oli vähän vaikutusta tymosyyttien elinkelpoisuus ja solumäärä 24 tunnin hoito (Fig. 2

f

). Nämä tulokset vahvistavat, että LC valikoivasti aiheuttaman syövän solusytotoksisuutta

vitro

ja

in vivo

.

LC hoito indusoi p21

CIP1 geeni, mRNA ja proteiini syöpäsoluissa

vieressä määritetty molekyylitason mekanismi miten LC voisi selektiivisesti estää kasvaimen kasvua. Tehdä niin, geeni-ilmentymisen profiili tutkittiin HepG2-soluissa sen jälkeen, kun kolme annosta LC hoidon (2,5, 5, ja 10 mM) 24 tunnin ajan. Kaikki ylös-säänneltyjen ja alas geenien (vähintään 2-kertainen nousu tai lasku ollenkaan kolme annosta) jälkeen LC hoidon tiivistetysti (tuloksia ei ole esitetty). Niistä up-geenien, p21

CIP1 geeni mutta ei p27

kip1 geeni, kaksi tärkeää liittyviä geenejä solukierron säätelyssä, havaittiin olevan erittäin ja annoksesta riippuen ilmaistaan ​​(Fig. 3

). Vaikutukset LC hoidon p21

CIP1 ja p27

kip1 mRNA-tasot ensi määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä. HepG2-soluja viljeltiin kanssa tai ilman LC (2,5, 5, 10 mM) joko 12 h tai 24 h, RNA valmistettiin soluista. Hoidon jälkeen LC, p21

CIP1 mRNA tasolla annosriippuvaisesti lisäsi sekä 12 h ja 24 h ajankohtina, ja p21

CIP1 mRNA taso on suhteellisesti korkeampi, kun 12 tunnin kohtelun kuin 24 tuntia hoitoa, kun taas p27

kip1 mRNA ei näytä paljon muutoksia näihin kahteen ajankohtina (Fig. 3

b

). Määrittää proteiinin tasot p21

CIP1 ja p27

kip1, Western blot-määritys suoritettiin käsiteltyjen HepG2-soluissa. Tulokset osoittivat, että käsittelyn jälkeen eri annoksilla LC 48 tuntia, p21

kip1 proteiinin tasot nousivat annoksesta riippuvalla tavalla HepG2 syöpäsolulinjoissa (Fig. 3

c

,

vasemmalle

). Edelleen dynaaminen tutkimus HepG2 solut osoittivat, että hoidon jälkeen LC (5 mmol) 12, 24, 36, ja 48 h, p21

CIP1 aikariippuvainen lisääntyi (Fig. 3

c

,

keskimmäinen

). Vuonna SMMC7721 soluissa LC hoito lisäsi myös p21-proteiinin ilmentymistä annoksesta riippuvalla tavalla kuin HepG2-soluissa (Fig. 3

c

,

oikea

). Yllättäen p27-proteiini lisääntyi sekä annoksesta ja ajasta riippuvaa tapojen jälkeen LC hoidon (Fig. 3

c

) vaikka p27

kip1 mRNA taso on vakaa, mikä viittaa siihen, että LC saattaisi estää hajoamista p27 proteiinia. Edelleen vaikutuksen tutkimiseksi LC loppupään vaikutuksia p21

CIP1 ja p27

kip1, tasot fosforyloitumaton Rb ja fosforyloidun Rb (phos-Rb) havaittiin. Todettiin, että LC-hoito laski hieman Rb-proteiini, mutta laski jyrkästi Phos-Rb-proteiinia (Fig. 3

d

). Nämä tulokset osoittivat, että LC selektiivisesti indusoi p21

CIP1 ilme.

(a) LC indusoi p21

CIP1 geeniekspressiota muttei p27 ja GAPDH. HepG2-soluja käsiteltiin LC (2,5, 5,0, 10 mM) 24 tunnin ajan; solut kerättiin geeniekspressioprofiili analyysi. Geenissä siru on 2 koettimina p21

CIP1 ja 1 koetin p27

kip1. Kaikki kertaisesta p21

CIP1 ja p27

kip1 geeniekspressiota

verrattuna

ohjaus näytettiin. (B) LC annosriippuvaisesti indusoi p21

CIP1 mRNA ilmaisun mutta ei p27

kip1 HepG2-soluissa. HepG2-soluja inkuboitiin eri pitoisuuksien kanssa LC (2,5, 5, 10 mM) joko 12 h tai 24 h; solut kerättiin mRNA määritystä p21

CIP1 ja p27

kip1 reaaliaikaisella PCR: llä. Kertaiseksi LC-käsitellyn

verrattuna

kontrolli näytettiin. Keskiarvo + SD (n = 3). *

P

0,01, **

P

0,05 verrattuna kontrolli. (C) LC annosriippuvaisesti ja aikariippuvainen indusoi p21

CIP1 proteiinin kerääntymisen HepG2 syöpäsoluja. HepG2 ja SMMC7721 soluja käsiteltiin eri annoksilla LC 48 h tai HepG2-solut altistettiin 5 mM LC 12, 24, 36, 48 h; p21 ja p27-proteiinit havaittiin Western blot. (D) LC annosriippuvaisesti pienenee Rb fosforylaatiota. HepG2-soluja käsiteltiin LC 48 h; Rb ja fosforyloitu Rb olivat dectected Western blotilla. Tyypillinen Western kuvia näytettiin (vasemmalla) ja bändi intensiteetti kvantifioitiin (oikealla).

LC hoito lisäsi histoni asetylaatio viljellyissä soluissa

Perustuu Warburg teoria, me arveltu, että lisämaksu LC syöpäsoluissa häiritsisi proteiinin asetylaatio. Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että histoni asetylaatio HDAC-inhibiittorit valikoivasti aiheuttama p21

CIP1 ilmaisua muttei p27

kip1 [14], [15]. Tuloksemme ovat osoittaneet, että LC selektiivisesti indusoi p21

CIP1 ilmaisua muttei p27

kip1 (Fig. 2). Siksi tutkimme vaikutuksia LC histoni asetylaatio ja kertymistä lysiini-asetyloitua proteiinien viljellyissä soluissa. HepG2, SMMC-7721 syöpäsoluihin ja hiiren tymosyyttejä käsiteltiin LC. Kuten on esitetty kuviossa. 4,

ja

b

, LC lisääntynyt asetylaatio histoni H3 ja H4 annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla HepG2 syöpäsoluja. LC voi myös aiheuttaa kertymistä lysiiniä asetyloitua proteiinien sekä HepG2 ja SMMC-7721 syöpäsoluihin (Fig. 4

c

). Vuonna ensisijainen tymosyyttiantigeeneista kulttuurin LC annosriippuvaisesti lisäsi histoni asetylaatio samanlainen syöpäsoluissa (Fig. 4

d

). Nämä tulokset viittaavat siihen, että LC-hoito lisäsi proteiinin (histoni) asetylointi viljellyissä soluissa.

(a) LC annosriippuvaisesti indusoi kertymistä asetyloitu histonien. HepG2-solut altistettiin LC (1,25, 2,5, 5,0 mM) 48 h, asetyloidut histonien H3 ja H4 todettiin Western blot. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. (B) LC aikariippuvainen indusoi kertymistä asetyloitua histonien. HepG2-soluja käsiteltiin LC (5 mM) ja eri ajankohtina (12 h, 24 h, 36 h, 48 h) ja asetyloitu histonit havaittiin. (C) LC hoito kasvattaa lysiini-asetyloitiin proteiinin kertymistä ihmisen HepG2 ja SMMC-7721 syöpäsoluja. Ihmisen HepG2 ja SMMC-7721-soluja käsiteltiin LC (10 mM) 12 tunnin ajan, ja sitten solut kerättiin Western blot havaita asetyloitu proteiinien lysiinillä asetyloitu vasta-aineella. (D) LC annoksesta depentently lisää kertymistä asetyloitua histonien hiiren tymosyyttejä. Hiiren tymosyyttejä käsiteltiin LC 24 h, histoni asetylaatio havaittiin Western Blot. Buty (1 mM) käytettiin positiivisena kontrollina.

LC suoraan estää HDAC toiminta

in vitro

ja viljellyissä soluissa

Koska LC indusoi histonien asetylointi, me olivatko LC voi välittömästi vaikuttaa HDAC toimintaa. Tietokoneavusteinen telakointi malli sai alkunsa. Kiteen rakennetta HDAC-kaltainen proteiini hypertermofiilisellä bakteerin

aquifex aeolicus

kanssa HDAC-inhibiittori TSA on raportoitu [16]. Rakenne näkyy asento olennaista sinkki atomi, joka osallistuu katalyysin luokan I /II HDAC. Kemiallinen rakenne LC ja telakointi malli monimutkaisia ​​(L-karnitiini ja HDAC) on esitetty kuvassa. 5,

ja

b

, ja sen CDOCKER vuorovaikutus Energia ja Sidonta Energia olivat -29,01 ja -85,79 kcal /mol, vastaavasti. Kuva. 5

b

osoittaa, että yksi happiatomi karboksyylianionilla ja happiatomi hydroksyyliä lomakkeen koordinoinnin vuorovaikutusta sinkki-ionin, jossa etäisyydet 2,696 Å ja 2.640 Å, vastaavasti. Tämä vuorovaikutus malli on erilainen verrattuna alkuperäiseen ligandin ACT sen kaksi happiatomia on karboksyylianionilla koordinoidaan Sinkki-ionin. Karboksyyli anioni muodostetaan heikko vetysidoksen Gly310, jossa etäisyys 2,966 Å, ja hydroksyyli on muodostettu vety- sidoksen Tyr312, jossa etäisyys 1,839 Ä. Lisäksi (CH

3)

3 N

+ ryhmä sijaitsee hydrofobisen eteinen ja vuorovaikutuksessa hydrofobisen pinta muodostuu sivuketjujen Leu21, Ile100, Phe152, Phe208 ja Leu275. Lisäksi ryhmä muodostunut kationin π vuorovaikutus bentseenirenkaat Phe152 ja Phe208. Tämä malli ennustaa, että LC on potentiaalia olla vuorovaikutuksessa HDAC aktiivisia kohtia.

(a) kemiallinen rakenne LC näytettiin. Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa.