Krooninen sairaus

tiivistelmä

endoteelisolujen (E-) ja verihiutaleiden (P-) selektiini välittämä adheesio kasvainsolujen verisuonen endoteeli on keskeinen vaihe hematogenous etäpesäkkeiden muodostumista. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että selektiinin puute vähentää merkittävästi etäpesäkkeiden muodostumista

in vivo

. Olemme valinnut E- ja P-

S

electin erityisiä

D

NA

ptamer (SDA) kautta SELEX (

S

ystematic

E

volution on

L

igands by

EX

ponential rikastettu), jossa on

K

d-arvo on noin 100 nM ja valmiutta inhiboimaan välillä selektiini ja sen ligandien. Käyttävät paksu- ja peräsuolisyövän (HT29) ja leukemia (EOL-1) solulinjat voisimme osoittaa anti-liima vaikutus SDA

in vitro

. Fysiologisissa leikkausjännitys olosuhteissa laminaarivirtausmittaria adheesiomääritystä SDA esti dynaaminen kasvain solun tarttumista immobilisoituun E- tai P-selektiini. Vakaus SDA yli kaksi tuntia sallitaan sen soveltaminen solu-solu-adheesion määritykset soluviljelyelatusainetta. Kun tartunta HT29-solujen TNFa-stimuloidun E-selektiini esittelee ihmisen keuhkojen mikrovaskulaarisia endoteelisolujen analysoitiin, esto kautta SDA voitiin osoittaa samoin. Lopuksi SDA on potentiaalinen uusi terapeuttinen aine, joka antagonisoi selektiinin välittämän adheesion aikana etäpesäkkeiden muodostumisen ihmisen syöpäsairauksia.

Citation: Faryammanesh R, Lange T, Magbanua E, Haas S, Meyer C, Wicklein D, et al. (2014) SDA, DNA aptameeriin estävä E- ja P-Selectin välittämä adheesio syövän ja leukemian solujen, ensimmäinen ja Pivotal Step in migraatiota aikana Etäpesäke Formation. PLoS ONE 9 (4): e93173. doi: 10,1371 /journal.pone.0093173

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 9. tammikuuta 2014; Hyväksytty: 03 maaliskuu 2014; Julkaistu: 03 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Faryammanesh et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Forschungs- und Wissenschaftsstiftung Hampurin Forschungsverbund ”Solun pinnan kohdistaminen”. Grant on FAZIT-STIFTUNG jotta R.F. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tällä aptameeriin on patentti vireillä; nimi ”DNA-Aptamere, die E- und P-Selektine spezifisch binden”, numero 2013112212485800DE. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Huolimatta edistysaskeleita molekyylilääketieteen, metastaattisen taudin on edelleen ratkaisematon ongelma näin kuolleisuus syöpään on edelleen korkea. Vuonna 2013 noin 1,6 miljoonaa ilmaantuvuus syövän ja 580000 syöpäkuolemista rekisteröitiin yksin Yhdysvalloissa [1]. Tämä korkea kuolleisuus johtuu pääasiassa siitä, että metastasized syöpä ei voida hoitaa parantavasti. Siten yli 90% syövän uhrien kuolee metastaattisen leviämisen pahanlaatuisia soluja [2]. Näin ollen eteneminen syövän hoidossa riippuu olennaisesti terapeuttista manipulointi metastaattisen prosessin.

aikana haematogeneous etäpesäkkeiden muodostumista kasvainsolujen tulee noudattaa ja transmigrate endoteeliin kohdepaikkaan tulevaisuuden etäpesäke. Näin ne matkivat käyttäytymistä normaalin valkosoluja sillä ne käyttävät selektiinin välittämän muuttavien reitin, valkosolujen tulehduksen [3], [4]. Kalsiumista riippuvainen selektiinit koostuvat lektiinidomeeni, joka on vastuussa ligandin sitoutumisen, epidermaalinen kasvutekijä-kaltaisen domeenin ja joustavan useita konsensus toistuvien yksiköiden [5], [6]. Syöpäsolut tartu endoteelin vuorovaikutuksessa endoteelin (E-) ja verihiutaleiden (P-) selektiinejä [3], [4] Seuraavat transmigraatio alla olevaan kudokseen ja myöhemmän proliferaation (kuvio 1). Vuonna ksenograftimallia ihmisen haiman adenokarsinooma, puuttuminen E- ja P-selektiinit johti 85%: n vähennys vatsakalvon carcinomatosis [7]. Samanlainen väheneminen etäpesäkkeiden havaittiin eosinofiilisen ja krooninen myelogeninen ksenograftimallia [8] ja peräsuolen karsinooma mallin puuttuessa molemmat selektiineiksi [4]. Siten estää selektiini-välittämä adheesio mekanismin hematogenous sekä vatsaonteloon etäpesäkkeiden on kliinistä merkitystä ja se voi olla potentiaalinen terapeuttinen lähestymistapa vastaan ​​patofysiologisia tapahtumia (kuvio 1). Tähän mennessä, monoklonaalisia vasta-aineita, glycomimetic antagonistit [9], ja erilaiset muunnetut aptameerit [10] – [12] on testattu selektiinin estäjät prekliinisissä tutkimuksissa.

metastaaseja syöpien tapahtuu kautta juokseva prosessi joka alkaa hyökkäys ensisijainen syöpäsoluja. Ylityksen jälkeen tyvikalvon ja vaeltavat läpi viereisen sidekudoksen, tietyt kasvainsolut intravasate osaksi kasvain pienten verisuonten ja kiertävät kanssa verenkiertoon kaukaisiin elimiin. Tulevaisuuteen metastaattinen sivuston, nämä verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC) hidastuvat verenkiertoon ja noudattaa verisuonten endoteeliin. Tämä vaihe on ratkaisevasti aloitetaan vuorovaikutuksia endoteelisolujen selektiinien ja tiettyjen hiilihydraattien ligandit kuten sialoidun Lewis rakenteita esitellään kasvainsolujen pinnalla. Tartunta on edellytys ekstravasaatio ja myöhemmin asuttaminen metastaattisen kudosta. Selektiini-sitovat aptameerit, jotka heikentävät vuorovaikutus selektiiniligandeille ja endoteelisolujen selektiinit vuoksi olisi lupaava uusi anti-metastaattinen terapeuttista.

Aptameerit ovat DNA- tai RNA-oligonukleotidit, joissa on määritelty kolmiulotteisia rakenteita näytetään suurella affiniteetilla ja spesifisyyttä kohdemolekyylejä. Suhteessa niiden sitovia ominaisuuksia, ne ovat verrattavissa vasta-aineita. Edut Aptameerien yli aineet ovat (i) niiden yksinkertainen ja edullinen synteesi, (ii) mahdollisuus niiden pitkäaikainen varastointi huoneenlämmössä ja siten (iii) niiden vakautta kuljetuksen aikana, (iv) erilaiset mahdollisuudet konjugoimiseksi toiseen reagenssit ja (v) niillä ei ole immunogeenisyyttä [12]. Aptameerit valitaan käytettäessä

in vitro

prosessi nimeltä

S

ystematic

E

volution on

L

igands by

EX

ponential Enrichment (

SELEX

) monistamalla DNA: n tai RNA-oligonukleotidien perustuu niiden affiniteetti kohdemolekyyliin [13] – [15]. Monimuotoisuus oligonukleotidien mahdollistaa valinnan Aptameerien lähes kaikkiin kohdemolekyyli. Siten aptameerit ovat sopiva väline lääketieteelliseen käyttöön diagnosoinnissa ja hoidossa.

Aloimme valita DNA Aptameerien joilla pyritään niiden lääketieteelliseen käyttöön estossa tuumorimetastaasissa. Olemme onnistuneet valitsemaan aptameeristä suurella affiniteetti E- ja P-selektiinin ja testattu sitoutuminen kohteeseensa molekyylien kautta suodattimen säilyttäminen määritykset (FRA). Arvioimaan aptameerin kykyä estää vuorovaikutuksen syövän ja leukemian solujen selektiinit, käytimme laminaarivirtausmittaria määrityksissä fysiologisissa leikkausjännitys olosuhteissa, joissa käytetään ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinja HT29, ihmisen krooninen eosinofiilinen leukemia cell line EOL-1, ja primäärisistä ihmisen keuhkojen mikroverisuonten endoteelisoluja (HPMECs). Valittu DNA Aptameerien esti vuorovaikutus syöpäsolujen kanssa endoteelin estämällä niiden selektiinin välittämän adheesion. Näin valitut Aptameerien tarjoavat houkuttelevan vaihtoehdon nykyisille vertailukelpoisia reagenssien.

Materiaalit ja menetelmät

Oligonukleotidit

Ensimmäinen DNA-kirjasto käyttää SELEX ostettiin Metabion. Se koostui satunnaistettiin alueen 50 nukleotidia reunustavat vakioalueet 5′- ja 3′-pään (21 tai 20 nukleotidia, vastaavasti), jotta PCR-monistusta. Lisäksi oligonukleotidit ostettiin Invitrogen.

biotinylointi E-selektiinin ja immobilisointi streptavidiinipäällystetyille Dynabeads (Target helmet) B

biotinylaatio reaktio, 50 ug rekombinanttia ihmisen E-selektiini /IgG-Fc- -chimeras (rh E-selektiini, R W-puskuria (1 mM EDTA, 2 M NaCl 10 mM Tris-HCl, pH 7,5), lisättiin streptavidiini-päällystetyt magneettiset helmet ja tämän jälkeen pestiin kahdesti 1 x B Invitrogen) rajoitettiin XcmI (Thermo Scientific) tuottaa 3 ’tymidiiniä ulokkeet [17], [18]. Aptameerit monistettiin PCR: llä käyttäen FIREPol DNA-polymeraasia tuottavien 5 ’adenosiini ulokkeet ja ligoitiin vektorin kanssa käyttämällä T4-DNA-ligaasia (Thermo Scientific). DNA 50 Tuloksena kloonit eristettiin ja sekvensoitiin (GATC-Biotech).

Suodata säilyttäminen Pitoisuus

Filter säilyttäminen määritykset (FRA) käytettiin määrittämään dissosiaatiovakioita aptameeri selektiinin vuorovaikutusta. Siksi DNA radioaktiivisesti leimattu [ $ \\ rasteri = ”RG1” $ –

32P] adenosiini-5′-triphosphte (Hartmann analyyttinen) käyttäen T4-polynukleotidikinaasia (Thermo Scientific) ja puhdistettu kautta geeli, jota seuraa saostus isopropanolilla. Sitoutumismäärityksiä varten, jatkuva määriä radioaktiivisia DNA ( 1 nM) inkuboitiin lisääntyvien määrien kanssa vastaavien proteiinien (0-1 uM) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa valinnassa puskurissa. Sen jälkeen proteiini-aptameeri komplekseja suodatettiin (Manifold I Dot-BlotSystem, Whatman) läpi, joka oli esitasapainotettu (15 minuuttia 0,4 M KOH) nitroselluloosakalvolle (Whatman) 5 minuuttia demineralisoitua vettä huoneenlämpötilassa ja pestiin sitten valinta puskurissa. Suodatuksen jälkeen nitroselluloosakalvolle kuivattiin ja altistettiin 3 tunnin aikana fosfori kuvaseinän (Bio-Rad). Kvantifiointiin käytimme Yksi sivusto-spesifinen sitoutuminen mallin (Määrä Yksi ohjelmisto).

nukleaasi-vastus-vakaus

DNA aptameeriin oli radioaktiivisesti leimattu [? –

32P] adenosine- 5′-triphosphte kuten edellä on kuvattu, ja inkuboitiin 100 ui koko väliaineessa 37 ° C: ssa. Sen jälkeen varmaa ajankohtina (0-720 min), 10 ui kutakin näytettä jäädytettiin nestemäisessä typessä ja sen jälkeen analysoitiin 10% denaturoivalla geelielektroforeesilla.

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

Ihmisen peräsuolen syövän solulinja HT29 (ostettu Euroopan Cell Culture Collection) ja ihmisen krooninen eosinofiilinen leukemia cell line EOL-1 (DSMZ: stä) ylläpidettiin RPMI-1640, jota oli täydennetty 2 mM L-glutamiinia, 10% naudan sikiön seerumia (FCS ), 100 ug penisilliini /ml ja 100 ug streptomysiiniä /ml (jälkimmäinen reagenssit hankittiin PAA) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Kaikkien määrityksiä, HT29 viljeltiin kunnes 80%: n konfluenssiin; EOL-1-soluja kasvatettiin suspensiossa. Ensisijainen ihmisen keuhkojen mikrovaskulaarisia endoteelisoluja (HPMECs) saatiin Promocell, viljellään endoteelisolujen kasvualusta MV täydennetty vastaavaan täydentää sekoitus kuin toimittajan tarjoamat, ja 100 ug penisilliini /ml ja 100 ug streptomysiiniä /ml. HPMECs oli sub-viljellä käyttäen tiettyä detach kit (Promocell) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikki kokeilut alkusolut tehtiin kuuden ensimmäisen kohtia.

esto Dynamic Kasvainsolun Tartunta immobilisoituun ihmisen E- ja P-selektiinin

Analysoimme aptameeriin estoa selektiiniligandin vuorovaikutus laminaarivirtausolosuhteissa edustavat endoteelin leikkausjännitys löytyy jälkeisessä kapillaarinen venules metastaattisen muodostuvista elimistä [19]. Tätä tarkoitusta varten, rh E- ja rh P-selektiinin immobilisoitiin IBIDI hoitoon microslides VI (IBIDI) lopullisena pitoisuutena 0,02 mg /ml, laimennettiin DPBS: ssä, mukaan lukien Ca

2+ ja Mg

2+ ( DPBS

+; PAA) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Samanaikaisesti kontrollina, kammiot päällystettiin myös 0,02 mg /ml IgG-Fc: tä (R 0,05 on merkitty *, hyvin merkittäviä eroja (p 0,01) ja ** ja erittäin merkittäviä eroja (p 0,001) kanssa ***.

Tulokset

valinta ja karakterisointi E- ja P-selektiinin Specific DNA aptameeriin

Kun tavoitteena valita DNA aptameerit jotka estävät vuorovaikutusta ihmisen E-selektiinien ja niiden ligandit esitetty syöpäsoluja, suoritimme SELEX käyttämällä rekombinantisti tuotettu ihmisen E-selektiini fuusioproteiinin kohdemolekyylin. Sen jälkeen kun 17 valintakierroksen rikastetun DNA-poolin osoitti noin 20% sitoutumisesta rh E-selektiinin verrattuna alkuperäiseen DNA allas (kuvio 3A), joka käsittää dissosiaatiovakio (

K

d) 170 ± 65 nM. Sekvenssianalyysit 50 single oligonukleotidien johdetut allas paljastaneet mitään järjestyksessä yhtäläisyyksiä näiden oligonukleotidien. Kuitenkin, tutkimalla useiden näiden molekyylien suodatin säilyttäminen määrityksiä tunnistimme RH E-selektiini erityinen DNA aptameeriin SDA (5′-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAACGATTTGGATTTGGGGTGGAGGGTATGGTTTGTGCTGGCGTTCTCATTTCCCATGCTTATTCTTGTCTCCC-3′) jossa

K

d-arvo on 98 ± 16 nM (kuvio 3B).

DNA oli radioleimattu, inkuboitiin kasvavia määriä proteiineja ja suodatettiin läpi nitroselluloosamembraanille. Jakeet Sitoutuneen DNA: t havaittiin muotoon autoradiografialla ja määrällisesti. (A) Rekombinantti ihmisen E-selektiini inkuboitiin DNA-poolin yhden (▴) ja 17 (•) SELEX kierrosta. (B) aptameeriin SDA inkuboitiin rh E-selektiini (•,

K

d ≈ 87 nM), rh P-selektiinin (▪,

K

d ≈ 84 nM) tai streptavidiini (▴) kontrollina. Kontrolli-DNA ei ole sitoutuvat ihmisen E- (▾) tai P-selektiinin (♦).

Koska sekvenssin samankaltaisuuksia E- ja P-selektiinit [6], [22] – [ ,,,0],24], testasimme affiniteetti SDA rekombinantti ihmisen E-selektiini /IgG-Fc-kimeerien (rh P-selektiinin; R 0,001

vs.

E-selektiini).

immobilisoidun suht E- (A ) tai rh P- (B) selektiinin (0,2 uM kumpaakin) sekä stimuloi HPMECs (C) inkuboitiin 5 uM SDA tai kontrolli-DNA. Selektiiniligandin esitteleviä kasvainsoluja perfusoitiin yli immobilisoitu proteiinien tai E-selektiinin esittää HPMECs (virtausnopeus 8 ml /h) ja säilyttää solut laskettiin. SDA vähentää adheesiota vastaavien solujen (n = 6, joiden kokonaispituus on 2 eri kokeissa,

P

-arvot soveltaa selektiinit). IgG-Fc-kontrolli ei osoittanut tarttuvuutta vaikutusta. Kaikki

P

arvot laskettiin hoitamatonta selektiineiksi vakiona

(* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001).

sen tutkimiseksi, mikäli SDA estää myös EOL-1 soluadheesiota ihmisen P-selektiini, me immobilisoituun ihmisen P-selektiinin kammion pinnalla. Laminaarivirtausolosuhteissa määrityksessä ennallaan EOL-1 soluadheesiota ihmisen P-selektiinin johti 10,42 ± 3,7 tapahtumaa per minuutti (kuvio 5B). Tämä arvo aleni 60% 6,54 ± 2,2 tapahtumaa per minuutti läsnäollessa SDA (

P

0,05

vs.

P-selektiini). Kun inkubointi ohjaus DNA, virtaus tarttuvuus EOL-1 solujen P-selektiinin pysyi muuttumattomana 13,00 ± 3,7 tapahtumaa per minuutti (

P

0,01

vs.

SDA).

SDA Estää HT29 Flow tartunta stimuloituihin ihmisen keuhkojen mikrovaskulaarisia endoteelisoluja

sen jälkeen osoitetaan, että SDA pystyi vähentämään kasvainsolujen tarttumista ihmisen E- ja P-selektiinin pinnoille laminaarivirtausolosuhteissa stressiä, me tutkimme seuraavaksi vaikutus SDA on solu-solu-vuorovaikutuksia. Näin ollen kaksi ihmisen solulinjoja käytettiin: ihmisen keuhkojen mikrovaskulaariset endoteelisolut (HPMECs) ja HT29. Non-stimuloitua HPMECs eivät aiheuta E-selektiini pinnallaan. Kun TNFa-stimulaatio, HPMECs tuottaa E-selektiinin ja esittää sen pinnallaan mahdollistaa vuorovaikutus HT29 jotka kantavat E-selektiiniligandeille SLE

X ja SLE

. Ensimmäisen ei-stimuloitua HPMECs päällystettiin mikro-kammiossa. Kiinnittyminen selektiiniligandin esittelevien HT29 määritettiin olevan 1,50 ± 1,3 solua per minuutti (-rh TNFa). Sen jälkeen kun E-selektiinin tuotantoa indusoitiin käsittelemällä rh TNFa 4 h ennen virtauksen tarttumista kokeiden määrä HT29 kiinni HPMECs kasvoi 23,17 ± 12,7 tapahtumaa per minuutti (+ rh TNFa,

P

0,01

vs.

stimuloidaan HPMEC). Tutkimaan vaikutusta SDA tämän solu-solu vuorovaikutus, rh TNFa stimuloimaa HPMECs inkuboitiin joko SDA tai kontrolli-DNA. Seuraavat laminaarivirtausmittaria määrityksessä HT29 osoittivat, että SDA pienentää HT29 tartunta E-selektiini esittämällä HPMECs merkittävästi 45% (10,50 ± 2,1 tapahtumaa /min,

P

0,05

vs.

stimuloidaan HPMECs). Sen sijaan ohjata DNA ei havaittu merkittävää vaikutusta (19,67 ± 7,7 tapahtumaa /min,

P

0,05

vs. SDA

; kuvio 5C).

Keskustelu

etäpesäke muodostuminen on tärkein kliininen este syövän hoidossa [2]. Kasvava joukko tutkimuksia paljasti ratkaisevan tärkeä osallistuminen E- ja P-selektiinit aikana metastaattista [4], [27], [28]. Niinpä selektiineiksi nousta lupaavia kohteita häiritse etäpesäkkeiden muodostumista. Tätä tarkoitusta varten, aptameerit voisi olla edullista työkaluja. Aptameerit kykenevät sitoutumaan niiden kohdemolekyyliin suurella spesifisyydellä ja affiniteetilla ja voi estää toiminnan kohdemolekyylin. Toisin kuin vasta-aineita, nämä oligonukleotidit osoittavat lämpötilan vakaus sekä yksinkertaista ja edullista synteesin yhdessä mutkaton käsittely. Erityisesti DNA aptameerit saattaa olla sovellettavissa niin RNA aptameerejä koskevat heidän pidempi puoliintumisaika seerumissa. Terapeuttinen merkitys Aptameerien on todistettu aikaisemmissa tutkimuksissa [12].

suorittamansa

in vitro

valinnassa DNA aptameerien sitoutumisesta E-selektiinin ja tunnistettu aptameeristä, nimeltään

S

electin

D

NA

ptamer (SDA), joka käsittää suuret affiniteetit sekä ihmisen E- sekä ihmisen P-selektiini. SDA dissosiaatiovakio on noin 100 nM määritettiin, joka dokumentoi suuri affiniteetti bimolecular vuorovaikutusta aptameerin ja selektiini.

Koska aminohapposekvenssin samankaltaisuuksia E- ja P-selektiinin ja saman affiniteetti SLE

X ja SLE

vastaavasti A [6], [22], [23], [29], vertailukelpoinen affiniteetti SDA molemmille selektiineiksi ei ole yllättävää.

In vitro

sitoutumismääritykset osoittivat lähes samanlainen affiniteetti SDA rekombinantti ihmisen P- ja E-selektiini. Määritykset rekombinantti hiiren selektiinit osoitti, että SDA säilytetään affiniteetti hiiren selektiinin sekä joka ei myöskään ole odottamatonta, koska sekvenssi analogisesti ihmisen ja hiiren selektiinit (tuloksia ei ole esitetty). Emme todistaa mahdollinen sitoutumisaffiniteettia SDA varten L-selektiinin, koska sen puuttuu merkitys etäpesäkkeitä prosessissa. Lisäksi L-selektiini on vuorovaikutuksessa muiden ligandien kuin E- tai P-selektiinin.

Kuten edellä on mainittu, nukleiinihapot yleensä ja RNA erityisesti eivät ole huomattavan stabiileja seerumissa läsnäolon vuoksi erilaisten nukleaasien [12] . Analysoida aptameeriin elinkelpoisuus, teimme vakautta määritys radioaktiivisesti leimatun SDA. Aptameeri osoittautui olevan stabiili suurelta osin kokonaan väliaineessa useita tunteja. Tunnin kuluttua noin 80% täyspitkää SDA voitu havaita. Lisäksi tiedetään, että Aptameerien, jonka massa on noin 40 kDa tai suurempi pysyä liikkeessä pitkäksi aikaa [30]. Näin me odottaa samanlaista käyttäytymistä meidän selektiinin aptameeriin jonka massa on 30 kDa, mikä on vaatimus tahansa

in situ

tai jopa

in vivo

sovelluksissa tulevina tutkimuksissa. Tämä tapaus ja osoittivat vakautta SDA ovat rohkaisevia piirteitä tulevaisuuden onnistuneen

in vivo

tutkimuksissa.

Kuten SDA kykenee estämään tarttumista E- sekä P-selektiini, me Oletetaan, että tämä aptameeri häiritsee lektiinidomeenia että selektiinit, koska ne ovat vastuussa hiilihydraattia sitovan [31]. Dynaamisen virtaus adheesiomäärityksiä, ensin osoittaa, että SDA inhiboi vuorovaikutusta E-selektiinin ja selektiiniligandin esittää HT29-solujen sekä vuorovaikutusta P-selektiinin ja selektiinin sitoutumisen EOL-1-soluja kokonaan väliaineessa leikkaus- stressiolosuhteissa. Myöhemmin, testasimme estävä vaikutus SDA vuorovaikutusta E-selektiinin esittelee HPMECs ja selektiinin sitova HT29. Tämä määritys simuloi luonnollista adheesioprosessia varsin hyvin, koska se toimii fysiologisissa leikkausjännitys olosuhteet ja mittasimme vähentää merkittävästi varten HT29 tarttumisen välittämä SDA 45%. Tämä seikka tarkistanut estävä tehokkuus tämän Aptameerin ja validoitu sen vakautta kokonaisuudessaan keskipitkällä ja myöhemmin sen kykyä

in vivo

tutkimuksissa.

parhaan tietomme mukaan vain yksi tio-modifioitua DNA aptameeriin (ESTA-1) on kuvattu, joka kykenee sitomisessa ja estää E-selektiini tehokkaasti [32]. Tämä ei kuitenkaan näytä yhtään kohdetta sitova käsissämme suodattimen säilyttäminen määrityksissä. Lisäksi kaksi modifioitu RNA aptameerejä PF377 [33] ja ARC5690 [30] olemassa, jotka sitovat ja lohko P-selektiini. Näitä tai muita aptameerien kanssa mitään muutoksia niiden sokeri lisäosa ovat suhteellisen kalliita valmistaa ja siten vähemmän sopivia pitkään hoitoja. Lisäksi 2′- fluori modifioitu RNA aptameeriin PF377 on rajoitettu mihinkään

in vivo

sovellus, koska se voidaan käsitellä vain synteettisillä PBS jätetään tyystin nukleaasien [33], [34]. Seerumin epävakaus Tämän mainitut ja useimmat muut RNA aptameerit on tärkein syy niiden epäonnistumiseen pitkälle tutkimuksissa.

Verrattuna jo olemassa modifioitu aptameerejä, olemme valinneet vakaan ei-muunnetun DNA aptameeriin kanssa estävä kapasiteetti selektiinin-ligandi vuorovaikutukset verisuonten endoteelin ja kasvainsoluja vähentämällä alkuperäisen ja nopeutta rajoittava vaihe aikana migraatiota syöpäsoluja.

lisäksi oligonukleotidi antagonistien, vaihtoehtoisten selektiini kohdistaminen estäjiä esittämä aineen luokan nimi glycomimetics. Nämä ovat muutettu oligosakkarideja, jotka matkivat luonnollisia hiilihydraatteja, joka sisältää kyky sitoa matkimalla hiilihydraatti ligandia. Yksi glycomimetic joka estää E-, P- ja L-selektiini on GMI-1070 [9]. SDA aptameerin kuvattu tässä on uusi selektiini-inhibiittori, jota voidaan käyttää yhdistelmänä jo olemassa olevien muiden estäjien estää etäpesäkkeiden muodostumista.

Päätelmät

Yhteenvetona, olemme valinneet ei-modifioitua 91 nukleotidin pituisia DNA aptameeriin, SDA, joka osoittaa suuri affiniteetti ihmisen E- ja P-selektiinin kanssa

K

d

arvot ovat noin 100 nM. Sen kyky estää vuorovaikutusta ihmisen syövän ja leukemian solujen Selektiinit edes virtauskammion simuloimalla veren virtausta fysiologinen ympäristö korostaa SDA lupaavana välineenä edelleen

vivo

tutkimuksissa. Sukupolvi hiirten kätkeminen vastaavien ihmisen selektiineiksi niille

vivo

määrityksiä on yksi tärkeä seuraava askel ja aihe nykyisen kokeiluja.

Kiitokset

kiitos Katrin Seelhorst varten huolellisesti käsittelyn käsikirjoitus.