Krooninen sairaus

tiivistelmä

Invasion ja myöhemmin etäpesäkkeiden on merkittävä kuolinsyy useimmat syövät kuten eturauhassyöpä. Tässä me raportoida mahdollisuuksista kasvain tukahduttava ominaisuuksia Rab7, GTPaasina joka säätelee kaupan lysosomeihin. Liikkeen lysosomeihin solun pinnan vasteena ympäristön ärsykkeille lisää eritystä proteinaasien ja solujen invaasiota. Olemme todenneet, että Troglitatsoni ja muiden jäsenten tiatsolidiinidioniryhmän perheen estävät solun pinnan suunnattu lysosomifuusio kaupan ja katepsiini B: n erityksen kautta Rab7 riippuvaisen mekanismin. Lisäksi Rab7 shRNA ilmentävien solujen havaittiin olevan enemmän invasiivisia

in vitro

ja

in vivo

. Lisääntynyt invasiivisuus mukana oli kohonnut ilmentyminen c-Met-reseptorin ja pitkittynyt alavirran signalointia, mikä tukee rooli Rab7 välittäjänä signalointi alassäätöä. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että Rab7 toimii negatiivisena säätelijänä eturauhasen kasvaimen kasvua ja invaasiota, jotka tarjoavat lisänäyttöä sen mahdollisuuksia tuumorisuppressorina.

Citation: Steffan JJ, Dykes SS, Coleman DT, Adams LK , Rogers D, Carroll JL, et al. (2014) tukeminen rooli GTPaasi Rab7 eturauhassyövässä Progression. PLoS ONE 9 (2): e87882. doi: 10,1371 /journal.pone.0087882

Editor: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia

vastaanotettu: 18 elokuu 2013; Hyväksytty: 05 tammikuu 2014; Julkaistu: 05 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Steffan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat National Institutes of Health myöntää NIH R01 CA104242. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat ristiriitoja: BJW toimii tällä hetkellä Astellas Pharma USA, Inc. . yritys, jolla on osuuksia onkologian terapeuttiset; kuitenkin, tämä työllisyyden tapahtui jälkeen käsikirjoituksen n loppuun ja yhtiön alueen kohteisiin ei edusta suoraa kilpailevaa etua. Kaikki muut kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

muodostaminen metastaasipesäkkeiden peräisin invasiivisen primäärikasvain on keskeinen tapahtuma prosessissa johtava syöpään liittyviä kuolemia. Kuolleisuus myöhemmän vaiheen eturauhassyövän (etäpesäkkeitä) eivät ole parantuneet merkittävästi viime vuosikymmenen aikana; siksi, ymmärrystä mekanismien kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden, sekä kehittämään hoitoja estämään kasvaimen etenemistä tarvitaan kiireellisesti. Hepatosyytti- kasvutekijän (HGF), Met signalointi-akselilla on tärkeä säätelijä kasvainsolun invaasiota ja etäpesäkkeiden [1]. Ligandin indusoiman c-Met-signalointi tiedetään indusoivan epitee- mesenkymaalitransitioon (EMT), jossa epiteelisolut menettävät solu-solu-kiinnikkeistä ja ottaa enemmän liikkuvia, mesenkymaaliset fenotyyppi [2]. Induktion EMT uskotaan parantaa kasvaimen solujen vaeltamiseen ja invaasion kautta tyvikalvoista. Lisäksi Met signalointia, muiden tekijöiden tuumorin sisällä mikroympäristössä, kuten hypoksian, aerobinen Glykolyysivaiheen, ja hapan solunulkoinen pH (pHe) voidaan lisätä kasvainsolun invaasiota [3], [4].

Kasvaimen invaasio vaatii usein eritystä proteolyyttisiä entsyymejä, vaikka jotkut muodot solumigraation /invaasion ovat proteaasi-independen [5], [6]. Vaikka proteinaasi eritys voi tapahtua konstitutiivisesti aktiivinen erityspolulle, suuria rooleja lysosomifuusio-lokalisoitu proteaasien on osoitettu kasvainsolun invaasiota [7], [8]. Olemme aiemmin osoittaneet, että happamat pHe ja HGF aiheuttaa salakuljetuksen lysosomeihin solun pintaan, mikä lisää katepsiini B: n erityksen [9], [10]. Tämä on merkittävä muutoksineen katepsiini B ja D lokalisointi havaitaan rinta- ja melanooma malleja vastauksena Ras muutosta tai muutoksia pHe [11], [12]. Aiemmissa julkaisuissa, olemme osoittaneet, että spatiaalinen sijainti lysosomeihin kasvainsoluissa on tärkeä solujen invaasiota [10], [13]. Kun lysosomeihin on sijoitettu lähempänä solun pintaan, kasvua erittyy proteaasien ja solujen invaasiota havaitaan; katsoo, kun lysosomeihin sijaitsevat lähempänä solun tumassa (pois solun pinnalla, eli vierekkäin solun tumassa) kasvainsolut erittävät vähemmän proteinaaseja ja ovat huomattavasti vähemmän invasiivisia.

lysosomeihin kaupataan koko soluja pitkin mikrotubuleiksi ja /tai aktiinisäikeiden käyttämällä molekyyli- moottori proteiineja, kuten dyneins, kinesiinien, ja /tai myosiinin perheenjäsenten [14]. Lisäksi useat GTPaaseja kuten RhoA, Rab7, Rab27, ja Arf perheenjäsenet säätelevät moottorin proteiinin aktiivisuutta tai rekrytointi, mikä säännellään jakelua lysosomeihin ja muiden endosyyttisissä rakkulat [15], [16].

Rab7 on säätelijänä intrasellulaarisen endosyyttisissä /kalvokuljetuksessa ja on mukana monissa tautitiloissa kuten syöpä ja useat tartuntataudit (tarkistetaan [17]). Rab7, jossa yksi sen -efektiboksejamme RILP (Rab7-vuorovaikutuksessa lysosomaalisen proteiinin), rekrytoida dynein-dynactin moottori monimutkainen lysosomeihin helpottaa lysosomiin kaupan pitkin mikrotubuluskimppujen kohti solun tuma [18]. Lisäksi, sen lisäksi, että kirjataan rooli rakkulan kaupan, Rab7 on viime aikoina kerännyt huomiota säätelijänä apoptoosin vasteena kasvutekijän peruuttamista [19] ja on ehdotettu toimia tuumorisuppressoriproteiinia [20].

estäjät natrium-protoni-vaihtimet (NHEs) on osoitettu olevan erittäin tehokas estämään solun pinnalla suunnattu lysosomiin kaupan, mikä vähentää proteaasin erityksen ja solujen invaasiota [9], [10], [13]. EIPAn (5 – (

N

etyyli

N

isopropyyli) -amiloride) on osoitettu estävän happamia pHe ja HGF-indusoitua solun pintaan suunnattu lysosomi kaupan; katsoo jäsenet tiatsolidiinidionin perheen yhdisteitä on osoitettu estävän happaman pHe-indusoidun solun pintaan suunnattu lysosomien kaupan. Meidän edellinen työ määräytyy yhdisteiden troglitazone ja EIPAn molemmat käyttävät Rab7 riippuvaisen mekanismin aikaansaamiseksi juxtanuclear lysosomiin aggregaatiota (JLA) [13]. Troglitatsoni on yksi useista jäsenistä tiatsolidiinidioni (TZD) perheen synteettinen korkean affiniteetin ligandit transkriptiotekijää peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptori-γ (PPAR γ). Nämä yhdisteet, mukaan lukien siglitatsoni (Cig), rosiglitatsonin (Rosi, Avandia) ja pioglitatsoni (Pio, Actos), osoittavat PPAR γ riippumattomia vaikutuksia, ja meidän laboratorio on osoittanut, että tehokas, troglitatsoni happamassa pHe-indusoidun lysosomi jakelu riippumattomiksi PPAR γ mutta vaativat Rab7 (TZD tarkistetaan [21]). Itse asiassa, se on äskettäin osoitettu, että lysosomeihin liikennettä solun pinnalla soluissa, jotka ilmentävät Rab7 shRNA (riippumaton ulkoinen ärsyke) viittaa siihen, että Rab7 on negatiivinen säätelijä solun pinnan suunnatun lysosomiin kaupan [10]. Lisäksi Rab7 shRNA ilmentävät solut osoittivat kohonneeseen erittyvien proteaasien ja olivat invasiivisia

in vitro

[10], [13].

Tässä esitämme useita rivejä näyttöä siitä Rab7 voi olla tukahduttava osassa kasvaimen kasvua ja etenemistä, mikä viittaa ensimmäisen että Rab7 on otaksuttu tuumorisuppressoriproteiinia

in vivo

. Troglitazone tarvitaan Rab7 estää HGF aiheuttamaa proteaasin erityksen ja kasvainsolun invaasiota

in vitro.

Lisäksi Rab7 shRNA ilmentävät solut muodostivat suurempia kasvaimia

in vivo

, joka näytteillä lisääntynyt leviäminen, vähentynyt apoptoosin, ja lisääntynyt invasiivisia kapasiteetti ympäröiviin kudoksiin. Lopuksi shRNA välittämä vähentäminen Rab7 lisännyt c-Met

in vitro

ja

in vivo

tarjoaa mahdollisen mekanismin osuus näihin muutoksiin.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Ei ihmisen kudosta käytettiin tässä tutkimuksessa. Kaikki käytetyt eläimet Tässä tutkimuksessa saivat inhimillinen hoito perustuu suuntaviivojen mukaan American Veterinary Medical Association (AVMA) sekä mukaisesti Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals (Institute for Laboratory Animal Research, Washington, DC ). Kaikki protokollat, joissa käytetään eläviä eläimiä tarkistaa ja hyväksyy Institutional Animal Care ja käyttö komitean LSU Health Sciences Center Shreveport. Tämä joukko kokeita hyväksyttyyn protokolla P-07-059. Kaikki pyrittiin minimoimaan eläinten kärsimyksiä, vähentää käytettyjen eläinten määrää, ja käyttää vaihtoehtoja in vivo tekniikoilla, jos käytettävissä.

Cell Culture

Ihmisen eturauhassyöpäsolulinja DU -145 hankittiin ATCC ja RPMI-1640 (Mediatech), jossa 10% FBS (Gemini Bio-Products) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (Mediatech). Soluja pidettiin 37 ° C inkubaattorissa 5% CO

2 ja oli osa-viljeltiin upon saavuttamiseksi 75% konfluenssiin.

reagenssit ja vasta-

-falloidiinia 1:100 ostettiin Molecular Probes. a-Tubulin vasta-1:1000, ostettiin Lab Vision. LAMP-1 vasta-aineella (H4A3), 1:50, ostettiin Kehittämisopinnot Hybridomaviljelmät Bank yliopiston Iowa, USA. Seuraavia vasta-aineita käytettiin Western bloting: pMet, Pakt, pErk1 /2, (1:1000), lohkaistaan-kaspaasi-3 (1-200) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), Rab7 (1:1000 ) (Sigma, St Louis, MO, USA), c-Met (kudosnäytteistä 1:500) (Abcam, Cambridge, MA, USA), c-Met (1:1000) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), Ki67 (01:50) (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Fluorofori-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (1:100) hankittiin Jackson Immunoresearch Laboratories (Westrgrove, PA, USA). IHC sekundäärisiä vasta-aineita (1:200) ostettiin Vector Labs (Burlingame, CA, USA). HGF (Calbiochem, San Diego, CA, USA) käytettiin 33 ng /ml.

uuttaminen Protein pakastetusta Kasvaimen Näytteitä

Pakastetut tuumorinäytteet laimennettiin ensin jääkylmällä RIPA-puskuria, joka sisälsi Roche proteaasinestäjät cocktail (Indianapolis, IN, USA), NaF, ja NaVO4 klo 01:05 suhde, massan tilavuuteen. Näytteet manuaalisesti homogenoitiin käyttäen huhmaretta ja survinta ja sen jälkeen sonikoimalla, ja asetettiin jäille 20 minuutin ajoittain vorteksoimalla. Sitten näytteitä sentrifugoitiin 12000 g: ssä 10 minuutin ajan poistamaan liukenematon roskia. Proteiinikonsentraatiot määritettiin BCA-määrityksellä, ja yhtä suuri proteiini laimennettiin Laemmli-puskurilla ja keitettiin 10 minuuttia.

katepsiini B: n erityksen määritys

määritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [9], [10] . HGF lisättiin viljelmiin 18 h 33 ng /ml.

Immunofluoresenssitesti (I. F.) Värjäys ja Mikroskopia

I.F.. mikroskopia suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [9], [10]. Lyhyesti, solut kiinnitettiin jääkylmällä 4% PFA 20 minuutin ajan. Solut pestiin sitten PBS: ssä inkuboitiin sitten anti-LAMP-1 (H4A3-s Iowa State University Hybridoma Bank) noin 1:100 laimennoksena BSP yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten solut pestiin, ja niitä inkuboitiin Dylight 594 anti-hiiri (Jackson IR) noin 1:100 laimennoksena BSP yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Falloidiinia käytettiin sitten värjätä aktiinisytoskeletonille (falloidiinia 488, Molecular Probes), ja inkuboitiin 20 minuutin ajan 1:200 BSP huoneenlämpötilassa. Objektilasit asennettu DAPI sisältävien SlowFade kultaa reagenssia (Invitrogen S36938). Solut kuvattiin käyttäen Olympus BX-50 mikroskooppia käyttäen MetaMorph ohjelmistoa. Kuvat yhdistettiin käyttäen ImageJ.

lysosomifuusio Distribution Analysis

lysosomifuusio jakelun tumasta mitattiin käyttämällä LysoTracker ohjelmistoa, antelias lahja Meiyappan Solaiyappan (Johns Hopkins). Yhteensä 25 solujen ulottuen kolmen erillisen kokeen analysoitiin kunkin datajoukon.

Western blot -analyysi

Western blot-analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [9].

Lentivirusvektorikonstruktit Toimitus Short-hiusneula-RNA

Short hiusneula-RNA: iden (shRNA) suunnattu Rab7 (CCGGGCCACAATAGGAGCTGACTTTCTCGAGAAAGTCAGCTCCTATTGTGGCTTTTT) luovutettiin osaksi DU145 syöpäsolujen (vakaiden Rab7 shRNA ilmentävät solut) käyttäen Mission Lentivirusvektorikonstruktit transduktiopartikkeleilla (Sigma) mukaan valmistajan protokollan ja kuten aikaisemmin on kuvattu [9]. Ei Target shRNA ilmentäviä soluja on luotu käyttäen samaa menetelmää, jossa kontrollivektorilla kohdistaminen ei ole tunnettua nisäkkäiden geeneistä (Sigma shc202V).

Invasion Pitoisuus

Invasion määritykset suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [10], [13]. HGF lisättiin seerumivapaassa sekä ylä- ja alaosassa kammiot pitoisuutena 33 ng /ml. Tulokset edustavat keskimäärin hyökkäsi solujen neljällä näkymä kohti kunnossa kolmesta itsenäisestä kokeesta.

In vivo

Kokeet

Kuusi 8 viikon ikäisiä uros- SCID /bg -hiiriin injektoitiin 2 x 10

6 DU145 eturauhaskasvainsoluissa, jotka ekspressoivat stabiilisti joko salattu (ei-kohde, NT) shRNA tai shRNA suunnattu Rab7 100 ul: ssa PBS: ää ihonalaisesti (n = 6 NT shRNA; n = 7 Rab7 shRNA) . Kasvaimet tuli mitattavissa päivällä 41 implantaation jälkeen ja mitattiin digitaalisilla jarrusatulat kahdesti viikossa. Kasvaintilavuudet laskettiin kaavalla: Volume = π /6 * Pituus * Leveys

2. Hiiret lopetettiin 104 päivän kuluttua implantaatiosta ja kasvaimet poistettiin kirurgisesti ja kiinnitettiin 10 prosenttia formaldehydiä tai jäädytetty. Kaikki kokeet suoritettiin suuntaviivojen mukaisesti asettamat LSUHSC-S Institutional Animal Care ja käyttö komitea.

immunohistokemia

Immunohistokemia suoritettiin käyttäen standardia DAB tekniikoita. Lyhyesti, formaliinilla kasvaimia käsiteltiin ja upotettiin parafiiniin. Nämä lohkot Sitten leikattiin, parafiini poistettiin, ja niihin lisätään ksyleeniin ja arvostellaan etanolipesujen. Antigeenejä paljastetaan esilämmitetyllä antigeenin haku puskurissa 15 minuutin ajan ja jäähdytettiin sitten. 0,3% H

2O

2 metanolissa saatettiin diat 30 min estää endogeenisen peroksidien, jonka jälkeen proteiini (seerumi) lohko 10 min. Primaarista vasta-ainetta lisättiin sitten 1 tunnin ajan osoitetulla laimennus. Biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen (1:200) lisättiin sitten 30 minuutin ajan. Biotiinia sitova nostettiin käyttäen ABC-Elite menetelmällä (Vector Labs) 30 minuutin ajan ja tahroja tehtiin näkyviksi DAB (Vector Labs) 7 minuutin ajan. Objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä 2 min.

Tilastollinen analyysi

GraphPad Software, Prism 3.0 käytettiin suorittaa kaikki tilastot. Yksi tai kaksisuuntainen Mann-Whitney T-testit tehtiin osoittamaan tilastollista merkittävyyttä. Kaikki kaaviot osoittavat standardin keskivirhe (sem).

Tulokset

Troglitatsoni Estää HGF-induced Cell Surface-suunnattu lysosomifuusio liikenteenohjaus, katepsiini B eritys, ja Cell Invasion

Olemme aiemmin osoittaneet, että HGF voi aiheuttaa solun pintaan suunnatun kaupan lysosomeihin [10]. Lisäksi olemme osoittaneet, että troglitatsoni esti hapan pHe-indusoidun solun pinnalla suunnattu lysosomiin kaupan [13]. Sen määrittämiseksi, mikäli Troglitatsoni voidaan myös estää HGF-indusoitua solun pintaan suunnattu lysosomiin kaupan, DU145 eturauhassyövän solut yhdessä käsiteltiin 10 uM troglitatsoni ja 33 ng /ul HGF 16 tuntia, jonka jälkeen lysosomeihin tehtiin näkyviksi I. F. mikroskopialla käyttäen LAMP1 (lysosomiin kalvoproteiini-1), kuten aiemmin vahvistettu lysosomiin markkeri [9]. Edustavia I. F. kuvia kuviossa 1A osoittavat, että HGF indusoi kaupan lysosomeihin solun pintaan kuten aiemmin julkaistu ja että Troglitatsoni paitsi estänyt HGF-indusoitua solun pintaan suunnattu kaupan, mutta myös indusoi taaksepäin kaupan ja yhtyminen lysosomeihin viereisen solun ytimiä. Lysosomeihin coalesced yli mikrotubuluksiin järjestää keskus (MTOC) in Troglitatsoni käsitellyissä soluissa (tietoja ei ole esitetty, [13]). Kvantifiointi lysosomiin paikassa kuin etäisyys solun tumassa (käyttäen aiemmin kuvattu ohjelmisto [9], [22], kuvio 1 B) osoittivat, että HGF aiheutti uudelleenjako lysosomeihin kohti solun pinnalla (pois solun tumassa) ja troglitatsoni estää HGF indusoimaan solun pintaan suunnattu lysosomiin kaupan.

A) DU145 eturauhassyövän soluja käsiteltiin 10 uM troglitatsoni ja /tai HGF: ssa yön yli, minkä jälkeen IF mikroskopia visualisoida lysosomeihin (punainen), aktiini (vihreä), ja ytimet (sininen). Troglitazone aiheuttaa myös lysosomeihin klusterin juxtanuclear soluun ytimeksi. B) kvantitointi tilajakauman lysosomeihin on esitetty keskimääräinen etäisyys yksittäisen solun ytimiä kussakin käsittelyssä kunnossa. Virhe palkit edustavat SEM 30 soluja vähintään kolmen erillisen kokeen. C) DU145-soluja käsiteltiin 16 tunnin ajan, jossa troglitatsoni ja /tai HGF: n määrän ja katepsiini B eritetään viljelyalustaan ​​havaittiin käyttäen katepsiini B aktiivisuuden määritys (katso menetelmiä ja materiaaleja). D) DU145-solut ympättiin Matrigel-päällystetty Transwell-irto ja annettiin tunkeutua 24 tuntia. Hoidot lisättiin, jossa ilmoitetaan sekä ylä- ja alaosassa insertin. * Tilastollisesti merkittävä (p 0,001) verrattuna valvonta; ** Tilastollinen merkitys (p 0,01) vs. kontrolli. Mittaviivat: 10 um.

osoittavat toiminnallista seurauksena lysosomi kaupan aktiivisuus katepsiini B eritetty viljelyalustaan ​​mitattiin. Kasvu katepsiini B aktiivisuus on suoraan verrannollinen katepsiini B erittää kasvainsoluissa [9]. Kuva 1C osoittaa, että Troglitatsoni merkittävästi esti HGF aiheuttamaa katepsiini B: n erityksen. Lopuksi Matrigel päällystetyt siirtokuoppaan insertit käytettiin suorittamaan

in vitro

hyökkäystä määrityksiä. Troglitazone merkittävästi esti hyökkäyksen HGF käsiteltyjen solujen (kuvio 1 D). Lasku hyökkäys ei johtunut solukuolemaa (tietoja ei esitetty, [10]).

jäsenet tiatsolidiinidioniryhmän (TZD) Perhe Yhdisteiden Differentially esto HGF-induced Cell Surface-suunnattu lysosomifuusio Ihmiskauppa ja Cell Invasion

troglitatsoni kuuluu tiatsolidiinidioniryhmän perheen yhdisteitä. Siksi testasimme kykyä muiden TZD estävän HGF-indusoitua solun pintaan suunnattu lysosomifuusio ihmiskaupan ja solujen invaasiota. Kuten kuviossa S1A ja kvantitoitiin kuviossa S1B, siglitatsoni ja rosiglitatsoni esti myös solun pinnan suunnattu lysosomaalisen kaupan; katsoo, Pioglitatsoni ei ollut vaikutusta. Tasauspyörästön vaikutukset kolmen TZD on lysosomifuusio klustereiden rankattiin: Troglitatsoni siglitatsonia = rosiglitatsoni. Koska Pioglitatsoni ei ollut vaikutusta lysosomifuusio ihmiskaupan vertasimme vaikutuksia Troglitatsoni ja Pioglitatsoni solujen invaasiota. Kuva S1C osoittaa, että Troglitatsoni esti merkitsevästi solujen invaasiota kautta Matrigel päällystetty suodattimien; katsoo, Pioglitatsoni ei ollut vaikutusta solujen invaasiota, mikä viittaa siihen, että spatiaalinen sijainti lysosomeihin on luonnostaan ​​tärkeä näkökohta kasvainsolun invaasiota.

Euroopan Rab7 GTPaasina on tarpeen ehkäisemisestä HGF-indusoidun Cell Surface-suunnattu lysosomi liikenteenohjaus, katepsiini B eritys, ja Cell Invasion

Vaikka olemme viime aikoina sekaantunut Rab7 negatiivisena säätelijänä lysosomifuusio kaupan, katepsiini B: n erityksen, ja solujen invaasiota [10], [13], emme ole osoittaneet rooli of Rab7 yhteydessä troglitatsoni ja HGF. Näin ollen, DU145 solut, jotka ilmentävät Rab7 shRNA (Rab7 pudotus oli 95% verrattuna ei-kohde (NT) shRNA ilmentävä solulinja (kuvio 2C upotus) [10]), käsiteltiin HGF tai troglitatsoni 16 tuntia. JOS. mikroskopia (kuvio 2A) osoitti, että Rab7 oli tarpeen Troglitatsoni estää HGF-indusoitua solun pintaan suunnattu lysosomien kaupan. Lisäksi, lysosomeista Rab7 shRNA ilmentävien solujen havaittiin lähempänä solun pinnalla jopa ilman HGF. Kvantitointi ydin-lysosomiin etäisyys (kuvio 2B) osoittaa, että lysosomien ovat huomattavasti kauempana solutumien ja että Troglitatsoni oli tehoton indusoimaan juxtanuclear lysosomiin aggregaatiota Rab7 shRNA ilmentävät solut.

A) I. F. mikroskopia suoritettiin DU145 eturauhaskasvainsoluissa joka joko ei-kohde (salattu) shRNA tai Rab7 ohjaama shRNA visualisoida lysosomeihin (punainen), aktiini (vihreä), ja ytimet (sininen). Rab7 shRNA ilmentyminen estää Troglitatsoni aiheuttama juxtanuclear lysosomiin klusterointi ja aiheuttaa lysosomeihin liikenteen solun pinnalle riippumatta HGF. B) kvantitointi tilajakauman lysosomeihin on esitetty keskimääräinen etäisyys yksittäisen solun ytimiä kussakin käsittelyssä kunnossa. Virhe palkit edustavat SEM 30 soluja vähintään kolmen erillisen kokeen. C) NT ja Rab7 shRNA ilmentävät DU145 soluja käsiteltiin 24 tunnin troglitatsonilla ja /tai HGF ja määrä katepsiini B erittyy viljelyalustaan ​​havaittiin käyttäen katepsiini B aktiivisuuden määritys (katso menetelmät ja materiaalit). Katepsiini B eritys lisääntyy ja Troglitatsoni enää estää eritystä Rab7 knockdown soluja. Inset osoittaa LAMP-1 ja Rab7 ilmaisun kohteena oleville (NT) tai Rab7 shRNA (KD) vakaa solulinjojen Western blotilla. D) NT ja Rab7 shRNA ilmentävät DU145-solut ympättiin Matrigel-päällystetty Transwell-irto ja annettiin tunkeutua 24 tuntia. Hoidot ilmoitti lisättiin sekä ylä- ja alaosassa insertin. * Tilastollisesti merkittävä (p 0,001) verrattuna NT valvonta; ** Tilastollinen merkitys (p 0,01) verrattuna NT valvonta. Mittaviivat: 10 um.

Samanlaisia ​​jakeluun lysosomeihin, Rab7 shRNA ilmentävät solut osoittivat lisääntynyt katepsiini B: n erityksen puuttuessa HGF (kuvio 2C). Lisäksi Troglitatsoni ei ole voinut estää HGF aiheuttamaa katepsiini B: n erityksen soluissa, jotka ilmentävät Rab7 shRNA. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin soluinvaasiota. Troglitatsoni esti HGF-indusoitua kasvaimen solujen invaasiota in NT shRNA ohjaus soluja, mutta ei Rab7 pudotus soluja (kuvio 2D). Lisäksi Rab7 shRNA ilmentävät solut olivat merkitsevästi invasiivisia verrattuna NT shRNA solujen puuttuessa ärsyke. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että i.) Rab7 lauseke vaaditaan Troglitatsoni estää HGF aiheuttamaa lysosomifuusio ihmiskaupan ja ii.) Rab7 toimii negatiivisena säätelijänä solun pintaan suunnattu lysosomifuusio kaupan, katepsiini B: n erityksen, ja kasvainsolun invaasiota.

Rab7 shRNA ilmaiseminen kasvaimet kasvavat suuremmiksi Kasvaneen leviämisen ja Vähentynyt Apoptootosinopeudet

Koska Rab7 shRNA ilmentävät DU145 soluja oli enemmän invasiivisia

in vitro

, nämä solut ruiskutettiin ihonalaista osaksi takakyljelle SCID hiirillä ja kasvaimen tilavuus mitattiin ajan kuluessa päättää, mitä, jos mitään, vaikutusta Rab7 alas sääntely oli

in vivo

. Kasvaimet, jotka ovat peräisin Rab7 shRNA ekspressoivat solut kasvoivat suurempia kuin NT shRNA ilmentäviä soluja (kuvio 3A). Ero tuli merkitsevä (p 0,05) päivänä 79 injektion jälkeen ja erittäin merkittävä ohi 79 päivää (p 0,001). On mielenkiintoista huomata, että lisääntynyt jakautuminen ei ole havaittu Rab7 shRNA ilmentävän solun

in vitro

(kuva S2). Sen jälkeen, kun suurin kasvain saavutti 1,4 cm

3, kaikki hiiret tapettiin ja kasvaimet poistettiin kirurgisesti. Ympäröivä Hiiren kudosten vieressä kasvaimet kerättiin myös tällä kertaa. Kasvaimet sitten kahtia ja joko vahvistetaan kymmenen prosenttia formaliinia tai flash-jäädytetty.

) SCID /Bg hiiriin injektoitiin 2 x 10

6 NT shRNA (n = 6) tai Rab7 shRNA (n = 7), joka ilmaisee DU145-solujen sc Kasvaimet tuli mitattavissa päivällä 41 ja mitattiin kautta digitaalinen jarrusatulat kahdesti viikossa. Hiiret tapettiin aikoinaan suurin kasvain saavutti 1,4 cm

2. Tiedot ilmaistaan ​​kuutiomillimetriä tilavuus. Virhe pylväät edustavat s.e.m. 6. ja 7. kasvaimet vastaavasti. * Tilastollisesti merkittävä (p 0,05) verrattuna NT shRNA kasvaimet; ** Tilastollinen merkitys (p 0,001) verrattuna NT shRNA kasvaimia. B) Immunohistokemia suoritettiin formaldehydi kiinteän kasvainkudoksen (katso menetelmät ja materiaalit). Proliferaatiota arvioitiin käyttäen Ki-67 merkkiaineena ja apoptoottisia soluja tarkasteltiin käyttämällä Pilkottua kaspaasi-3 markkerina. C) IHC kvantitoitiin laskemalla Ki-67 tai Pilkottua kaspaasi-3-positiivisia soluja. Kolme satunnaista kenttää per kasvain oli käsin laskettiin. Lukumäärä positiivisesti värjäämällä solut piirretään. * Tilastollisesti merkittävä (p 0,01) verrattuna NT shRNA kasvaimet; ** Tilastollinen merkitys (p 0,05) verrattuna NT shRNA kasvaimia. Mittaviivat: 100 pm.

Formaliinifiksoidusta kiinteitä kasvaimia Sitten leikattiin ja parafiiniin immunohistokemiallista (IHC) analyysi. Koska ero kasvaimen kasvu havaittiin, kasvaimen leikkeet värjättiin Ki-67 (a leviämisen markkeri) ja katkotun kaspaasi-3 (apoptoottisen markkeri) ja vastavärjättiin hematoksyliinillä. Edustava värjäys on esitetty kuviossa 3B. IHC värjäytyminen kvantitoitiin käsin laskemalla Ki-67 tai Pilkottua kaspaasi-3 värjäytyneiden solujen. Kvantitointi esitetään kuviossa 3C osoittaa merkittävän (p 0,01) lisäys Ki-67 positiivista värjäytymistä ja merkittävää (p 0,05) lasku katkotun kaspaasi-3 positiivista värjäytymistä, mikä viittaa siihen, että kasvaimen tilavuuden johtuu sekä lisääntyneestä jakautumista vähentynyt apoptoottinen hinnat.

Rab7 shRNA ilmaiseminen Kasvaimet osoittavat lisääntynyttä invaasio ja kudoksen uudelleen

Parafiini upotettu kasvain leikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla ja visualisoida kahdessa eri suurennoksilla. Kuten edellä todettiin, aikana kirurginen poisto kasvaimet, viereisen hiiren kudokset ja iho oli jätetty ennalleen. Edustavia poikkileikkauksia H kuitenkin kaksi tutkimukset olivat epäselviä yhdellä anturi havaitsee kasvua ja toinen koetin havaitaan laskua Rab7 mRNA eturauhaskasvainnäytteissä, ja yhdessä tutkimuksessa ei havaittu mitään muutosta Rab7 mRNA ilmaisun. Lisäksi analyysi PIN vaurioita osoitti myös merkittävää -1,939 kertaisesti alentunut Rab7, kun taas kaksi erillistä analyysit eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH) pystynyt osoittamaan vähenemistä Rab7. Yhdessä suuntaus näkyy jolla Rab7 säätyy alas varhain eturauhasen kasvainten kehittymiseen (PIN vaurioita) ja pysyy alassäädetty aikana syövän etenemiseen, mutta ei alas-säädellä lieviä sairauksia kuten BPH.

Rab7 knockdown aiheuttaa lisää c-Met tasot

Ennen määrittää sääntelymekanismeissa kasvua kasvaimen leviämisen ja invaasion soluissa sisältävät pienentää Rab7, tutkimme tasot ja aktivointi c-Met vektori ohjaus ja Rab7 shRNA ilmentävien solujen. Lisäys HGF kontrolloida solujen lisännyt c-Met fosforylaation ja aktivaation alavirran signalointireittien seurasi asteittainen väheneminen seuraavien muutaman tunnin. Sen sijaan, lisäksi HGF Rab7 pudotus soluihin johti vankempi kasvu c-Met: n fosforylaation ja hitaampi menetys aktivoidun Met ja alavirran signalointia kumppaneiden ajan (kuvio 5A). Yhdenmukaisesti näiden tietojen analysointi koko c-Met-proteiinia ohjaus ja Rab7 pudotus solut osoittivat, että c-Met: taso oli korkeampi soluissa vähemmän Rab7 ja että HGF-rustokadon c-Met: myös heikennetty (kuvio 5B).

A) kohtee- na oleville (NT) vektorisäätö tai Rab7 shRNA ilmentävät DU145 solut altistettiin HGF osoitetut ajat. Kokosolulysaateille talteen ja c-met, Akt, ja Erk-fosforylaation havaittiin Western-blottauksella. B) Soluja käsiteltiin HGF varten indictated ajanjaksoina ja veren kokonaiskolesterolia c-Met: proteiini määritettiin Western blot -analyysillä. Densitometria kolmesta itsenäisestä kokeesta käytettiin graafinen esitys c-Met: heikkene ajan myötä. C) Soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla HGF 30 minuuttia, jonka jälkeen Western blot -analyysi osoitti proteiineja. D) Proteiinin lysaatit ksenograftikasvaimissa kerättiin ja veren kokonaiskolesterolia c-met ja Rab7 proteiini havaittiin Western blot. Pylväsdiagrammi edustaa keskimääräistä c-met ja Rab7 ilmentyminen seitsemän kasvaimia kohti hoitoryhmän määritettynä densitometrisesti Western blot. * = P 0,0007 verrattuna NT shRNA Rab7. ** = P 0,03 verrattuna NT shRNA c-met. Virhepalkin edustavat SEM.

Koska c-Met tasot olivat korkeampia Rab7 Knockdown soluissa, me ennustaa, että nämä tuumorisolut olisi reagoivat pienempiä pitoisuuksia HGF. Kuten kuviossa 5C, Rab7 pudotus solut vastasivat pienempiä pitoisuuksia HGF mitattuna aktivaation c-Met: n, Akt ja Erk.

Lopuksi, sen määrittämiseksi, onko c-Met: tasot laskivat Rab7 pudotus hiiren ksenografteja , proteiini jäädytetty ksenografti kasvainkudoksessa kerättiin ja valmistettiin Western blot -analyysiä. Kuvio 5D osoittaa, että tuumorit muodostuu vektorisäätö DU145 soluja keskimäärin sisälsivät enemmän Rab7 ja vähemmän c-Met kuin kasvaimet muodostettiin Rab7 knockdown soluja.