Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vastustuskyky kasvutekijän reseptori tyrosiinikinaasin estäjät (EGFR-TKI), gefitinibi ja erlotinibi, on kriittinen ongelma hoidossa

EGFR

mutantti keuhkosyöpä. Useita mekanismeja, kuten ohitusleikkaus signalointia hepatosyyttikasvutekijän (HGF) -triggered Met aktivointi, ovat osallisina välittäjinä vastarintaa. Nisäkkäiden rapamysiinin kohde (mTOR), on alavirtaan putki EGFR ja MET signalointi, ja sitä on siten pidettävä terapeuttisesti houkutteleva kohde hoidettaessa erilaisia ​​syöpiä. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia 2 kliinisesti hyväksytty mTOR-inhibiittorit, temsirolimuusin ja everolimuusi, voittaa HGF-riippuvainen vastus EGFR-TKI: in

EGFR

mutantti keuhkosyövän soluja. Sekä Temsirolimuusin ja everolimuusi esti fosforylaatiota p70S6K ja 4E-BP1, jotka ovat alavirtaan tavoitteita mTOR koulutusjakson, ja vähensi kannattavuutta

EGFR

mutantti keuhkosyövän soluja, PC-9, ja HCC827, jopa läsnäolo HGF

in vitro

. Vuonna ksenograftimallia temsirolimuusi tukahdutti kasvu PC-9 solua yliekspressoivat

HGF

-geenin; tämä liittyy tukahduttaminen mTOR signalointireitin ja kasvaimen angiogeneesissä. Sen sijaan, erlotinibi ei tukahduttaa tätä signalointireitin tai kasvaimen kasvua. Useita mekanismeja, mukaan lukien inhibointi verisuonten endoteelin kasvutekijän tuotantoa tuumorisoluissa ja tukahduttaminen endoteelisolujen elinkelpoisuutta, edistää anti-angiogeeninen vaikutus temsirolimuusiannokset. Nämä havainnot osoittavat, että mTOR-inhibiittorit voivat olla hyödyllisiä ohjaukseen HGF-laukaisi EGFR-TKI resistenssi

EGFR

mutantti keuhkosyöpää, ja ne tarjoavat perustelut kliinisissä tutkimuksissa mTOR-inhibiittorit potilailla ositettu

EGFR

mutaation ja HGF ilmentymisen tila.

Citation: Ishikawa D, Takeuchi S, Nakagawa T, Sano T, Nakade J, Nanjo S, et ai. (2013) mTOR estäjät valvonta kasvua EGFR Mutant keuhkosyöpään jälkeenkin saaminen Resistance HGF. PLoS ONE 8 (5): e62104. doi: 10,1371 /journal.pone.0062104

Editor: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korea

vastaanotettu: 29 marraskuu 2012; Hyväksytty 18 maaliskuuta 2013 Julkaistu: toukokuu 14, 2013

Copyright: © 2013 Ishikawa et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat KAKENHI (Grants-in-tuki tieteellisen tutkimuksen innovatiivisia Areas ”Integratiiviset Syöpätutkimuskeskus mikroympäristölle Network” (SY) ja Grant-in-Aid nuorten tutkijoiden (TY ja ST)), ja Grants-in- Tuet Project for Development of Innovative Research on Cancer Therapeutics (P-Direct) alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede ja teknologia (MEXT). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Seiji Yano saanut palkkioita päässä Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. ja AstraZeneca. Seiji Yano saanut tutkimusrahoitusta Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., Kyowa Hakko Kirin Co, Ltd ja Eisai Co., Ltd. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

keuhkosyöpä on johtava syy pahanlaatuisuuteen liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti ja yli 80% tapauksista on luokiteltu ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Kasvutekijän reseptorin (EGFR) aktivoivat mutaatiot, kuten eksonin 19 deleetio ja eksonin 21 L858R pistemutaatio, löytyy asukkaan NSCLC, ja liittyy kliininen vaste EGFR tyrosiinikinaasin estäjät (EGF-TKI), gefitinibi ja erlotinibin [1] – [3]. Kuitenkin lähes kaikki vastanneista resistenteiksi ja kehittää uusiutumisen jälkeen eripituisia aikoja (hankittu resistenssi) [4]. Lisäksi 20-30%: lla potilaista osoittavat epäsuotuisa vasteet, vaikka niiden kasvaimet ovat kohde-mutaatioita (luontainen resistenssi) [5]. Monia tutkimuksia on tehty, jotta hahmotella strategioita, jotka voivat voittaa hankittujen ja luontainen vastus. Nämä tutkimukset ovat tunnistaneet useita mekanismeja hankittu resistenssi, mukaan lukien

EGFR

T790M mutaatio [6], [7],

MET

vahvistus [8], [9], hepatosyyttikasvutekijän (HGF) yliekspressio [10], menetys PTEN [11], muutos on pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) fenotyyppi [12] – [14], epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) [15] – [17], aktivointi NFKB polku [18], muuttaminen mikroRNA [19], ja Gas6-Axl akselin aktivointi [20]. Monimutkaisuus NSCLC heijastuu co-esiintyminen eri yhdistelmiä näistä resistenssimekanismeja eri yksilöillä. Olemme aikaisemmin havainneet, että HGF laukaisee EGFR-TKI vastus aktivoimalla MET /PI3K /AKT akselilla [10]. Lisäksi osoitimme, että HGF yliekspressio on läsnä kasvaimia Japani potilaalla on hankittujen ja luontainen kasvainten vastustuskyvyn EGFR-TKI: n taajuuksilla noin 60% ja 30%, vastaavasti [21]. Tämä osoittaa, että HGF on ihanteellinen kohde voittamiseksi EGFR-TKI resistenssi

EGFR

mutantti keuhkosyöpäpotilaita. Voittamiseksi HGF laukaisema vastus, 2 signaalit EGFR ja HGF-MET olisi estetty samanaikaisesti. Olemme jo ilmoittaneet, että HGF-riippuvainen vastus voidaan ohjata anti-HGF-neutraloivien vasta-aineiden [22], HGF-antagonisti NK4 [22], MET-TKI [23] – [25], ja fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) estäjät [26] yhdessä EGFR-TKI. Kuitenkin nämä inhibiittorit eivät ole kliinisesti hyväksytty ja sen vuoksi ei voida käyttää syöpäpotilaiden hoitoon.

nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR), seriini /treoniini-kinaasi, on alavirran kohde PI3K ja AKT reittejä , ja sillä on kriittinen rooli solujen eloonjäämistä ja lisääntymistä [27] – [29]. Aktivoituminen PI3K /AKT ja sen jälkeen fosforylaation mTOR aloittaa fosforylaation tärkeitä loppupään tavoitteita, mukaan lukien ribosomaalinen p70S6 seriini /treoniini-kinaasi (S6K1) ja eukaryoottiset aloittamista tekijä (EIR) -4E sitova proteiini (4E-BP1), mikä johtaa kasvuun mRNA käännös ja cap-riippuvaisten proteiinisynteesiä, vastaavasti. Näin ollen, mTOR-kinaasi on keskeinen solmu PI3K /AKT-signalointireitin [27] – [30]. Tähän mennessä useat mTOR-estäjä rapamysiinin analogeja on kehitetty, mukaan lukien temsirolimuusia ja everolimuusia, joita on käytetty hoitoon munuaiskarsinoomia ja haiman neuroendocrine kasvaimia. Rapamysiini ja sen analogit sitoutuvat FK506-sitova proteiini-12 (FKBP12) ja vuorovaikutuksessa mTOR, estämällä sen kinaasin toimintaa ja pysäyttää kääntämisen proteiinien kriittinen solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen.

Koska mTOR on alavirtaan sekä EGFR ja MET, me arveltu, että mTOR esto, vaikka monoterapiana aineena, voivat estää EGFR- ja MET-välitteisen signaloinnin samanaikaisesti ja voittaa HGF-laukaisi EGFR-TKI vastarintaa. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme onko kliinisesti hyväksytty mTOR-inhibiittorit, temsirolimuusin ja everolimuusi, kiertää HGF-laukaisi EGFR-TKI resistenssi

EGFR

mutantti keuhkosyövän soluihin käyttämällä

in vitro

ja

in vivo

malleja, ja arvioidut, taustalla olevien mekanismien.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät ja reagenssit

EGFR

mutantti ihmisen keuhkojen adenokarsinoomasolulinjaan linjat PC-9 (del E746_A750) ja HCC827 poistoineen in

EGFR

eksonin 19, ostettiin Immuno-Biological Laboratories Co. (Takasaki, Gunma, Japani) ja American Type Culture Collection (Manassas, VA ), vastaavasti. Ihmisen

HGF

-geenin transfektanteilla (PC-9 /HGF) ja vektorisäätö (PC-9 /Vec) soluja perustettiin aikaisemmin kuvatulla [10]. Kaikkia solulinjoja pidettiin yllä RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja antibiootteja. Kaikki solut jatkettiin alle 3 kuukautta ennen uusiutumista jäädytetty, varhaisen passage varastot. Solut säännöllisesti seulottiin mycoplasma käyttämällä MycoAlert Mycoplasma Detection Kit (Lonza, Rockland, ME). Solulinjoja todennettu laboratoriossa National Institute of Biomedical Innovation (Osaka, Japani) lyhyellä tandem uusintaa. Erlotinibin everolimuusi, ja temsirolimuusi saatiin Selleck Chemicals (Houston, TX). Ihmisen rekombinantti HGF valmistettiin, kuten on aiemmin kuvattu [10].

valmistus HGF ja VEGF soluviljelysupernatanttia

Soluja (2 x 10

5) viljeltiin 2 ml elatusainetta 10% FBS: ää 24 tuntia, pestiin PBS: llä ja inkuboitiin 48 tuntia väliaineessa, jossa oli 10% FBS: ää. Joissakin kokeissa, HGF lisättiin väliaineeseen. Elatusaineet otettiin talteen ja sentrifugoitiin, ja supernatantit säilytettiin -70 ° C: ssa analyysiin saakka. Pitoisuudet HGF: n ja VEGF määritettiin IMMUNIS HGF EIA: n (Institute of Immunology, Tokio, Japani) ja Quantikine VEGF ELISA: lla (R Sigma, St. Louis, MO), kuten aiemmin on kuvattu [10]. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena näytteitä.

Vasta-aineet ja Western blotting

Proteiininäytteitä (25 ug kutakin) erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (Bio-Rad, Hercules, CA) ja siirretään polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Bio-Rad). Pesun jälkeen 4 kertaa, kalvoja inkuboitiin estäminen Yksi (Nacalai Tesque, Inc., Kioto, Japani) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa (RT) ja yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden p-aktiini (13E5), Met (25H2), fosfo-MET (anti-p-MET, Y1234 /Y1235, 3D7), p-EGFR (Y1068), AKT tai p-AKT (S473), mTOR, p-mTOR (S2448), p70S6K, pp70S6K ( T389), 4E-BP1, p4E-BP1 (T37 /46) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), ihmisen EGFR (1 ug /ml), ihmisen /hiiri /rotta ERK1 /ERK2 (0,2 ug /ml), ja p-ERK1 /ERK2 (T202 /Y204; 0,1 ug /ml) (R 0,01 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

mTOR estäjät tukahduttaa elinkelpoisuus

EGFR

mutantti keuhkosyöpään solujen läsnäollessa HGF

PC-9 ja HCC827 ovat ihmisen keuhkon adenokarsinooma solulinjoja deleetioita eksonin 19

EGFR

, jolloin konstitutiivisen aktivaation tämän proteiinin. Nämä solulinjat olivat herkkiä erlotinibille, kun taas HGF aiheuttama erlotinibi vastus (Fig. 1). Hoito joko mTOR-estäjä (temsirolimuusi tai everolimuusille) yksinään havaittavasti tukahdutti elinkelpoisuuden näistä solulinjoista. Näissä koeolosuhteissa, HGF ei vähennä herkkyyttä näistä solulinjoista joko lääkeaineen. Nämä tulokset viittaavat siihen, että mTOR-inhibiittorit voivat tehokkaasti kontrolloida kasvua

EGFR

mutantti keuhko- syöpäsoluja, riippumatta siitä, HGF, joka aiheuttaa EGFR-TKI vastus.

PC-9 tai HCC827 soluja inkuboitiin kanssa tai ilman erlotinibin, temsirolimuusille tai everolimuusi, läsnä ollessa tai ilman HGF (20 ng /ml) 72 tuntia. Sitten solujen elinkykyisyys määritettiin MTT-määrityksellä. Bars näyttää SD. Esitetyt tiedot edustavat 5 itsenäistä koetta samoin tuloksin.

edellinen tutkimus osoitti, että potilailla, joilla on NSCLC, HGF ensisijaisesti havaitaan syöpäsolut kehittynyt resistenssi EGFR-TKI, mikä viittaa siihen, että tuotantoa HGF näiden solujen tapahtuu pääasiassa kautta autokriini mekanismi. Tutkimaan edelleen vaikutusta mTOR estäjien autokriinisella HGF Tuotannossa syntyy vakaa

HGF

-geenin transfektanttien PC-9 solua (PC-9 /HGF). PC-9 /HGF-solujen erittämät korkeita pitoisuuksia HGF (28 ± 1 ng /48 h), kun taas pitoisuudet HGF erittämän PC-9- ja ohjaus vektori transfektoitiin PC-9 /Vec solut olivat alle määritysrajan. Lisäksi PC-9 /HGF-solujen tuli resistentti erlotinibi (Fig. 2). Huomasimme, että temsirolimuusin ja everolimuusin havaittavasti vähentänyt kannattavuutta sekä PC-9 /Vec ja PC-9 /HGF solua samassa määrin, kun taas yhdistelmä mTOR-estäjän plus erlotinibi ei ollut vaikutusta in PC-9 /Vec solujen läsnä HGF, mikä osoittaa, että mTOR-inhibiittorit eivät vielä herkistää näiden solujen erlotinibille

in vitro

(Fig. S1). Knock alas mTOR siRNA aiheutti eston elinkelpoisuuden PC-9 /Vec ja PC-9 /HGF-soluissa 30% (kuva S2 B), mikä osoittaa, että esti solujen elinvoimaisuuden temsirolimuusille jopa läsnäollessa HGF johtuu mTOR esto. Olemme myös suorittaa virtaussytometrillä käyttämällä anneksiini V ja totesi, että temsirolimuusin ei aiheuttanut havaittavaa apoptoosia PC-9 /Vec tai PC-9 /HGF-soluissa (kuvio. S3). Nämä havainnot osoittavat, että mTOR-inhibiittorit, kun sitä käytetään yksittäisinä aineina, tukahduttaa kasvua

EGFR

mutantti keuhkosyövän soluja kautta proliferaation inhibitiota sen sijaan, että apoptoosin induktion.

PC-9 /Vec ja PC -9 /HGF soluja inkuboitiin erlotinibi (A), temsirolimuusi (B), tai everolimuusin (C) 72 tuntia. Sitten solujen elinkyky määritettiin käyttämällä MTT-määritystä. Bars näyttää SD. (D) PC-9 /Vec ja PC-9 /HGF-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman erlotinibin (0,3 uM), temsirolimuusia (0,3 uM), tai everolimuusille (0,3 uM) 4 tuntia. Solulysaatit otettiin talteen ja niille suoritettiin Western blot. Esitetyt tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta samoin tuloksin.

mTOR-inhibiittorit tukahduttaa p70S6K ja 4EBP1 fosforylaatio jopa läsnäollessa HGF

tutkia molekyylitason mekanismi, jolla mTOR-inhibiittorit tukahdutetaan solujen elinkelpoisuus vaikka läsnä HGF, tutkimme proteiinin ilmentymisen ja fosforylaatio tilasta EGFR, MET, ja niiden loppupään molekyylien (ERK1 /2, PI3K /AKT, p70S6K, ja 4EBP1) PC-9 /Vec ja PC- 9 /HGF solujen western blottauksella (kuvio. 2D). PC-9 /Vec solut ilmaisivat EGFR ja MET proteiineja, kun taas vain EGFR oli havaittavasti fosforyloitu. Erlotinibin merkittävästi inhiboi fosforylaatiota EGFR, sekä alavirran ERK1 /2 ja AKT, mutta hieman esti p70S6K fosforylaatiota. Vaikka kumpikaan temsirolimuusi eikä Everolimuusi vaikutti fosforylaatiota EGFR, MET, ERK1 /2 tai AKT, ne estivät fosforylaatiota p70S6K ja 4EBP1, loppupään molekyylit mTOR.

PC-9 /HGF soluja, MET oli myös fosforyloituu, mikä johtuu oletettavasti HGF että tuotettiin autokriini tavalla. Erlotinibin inhiboi EGFR fosforylaatiota, mutta se ei merkittävästi inhiboi fosforylaatiota MET, AKT, p70S6K tai 4EBP1. Vaikka kumpikaan temsirolimuusi eikä everolimuusi esti fosforylaatiota EGFR, MET, ERK1 /2, tai AKT, ne inhiboivat merkittävästi fosforylaation p70S6K ja 4EBP1. Nämä tulokset osoittavat, että mTOR-inhibiittorit tukahduttaa fosforylaatiota loppupään molekyylien mTOR, riippumatta siitä, sisältääkö HGF.

mTOR esto estää HGF aikaansaamasta kasvusta erlotinibin vastustuskykyisten kasvainten

in vivo

seuraava arvioida, onko mTOR-inhibiittorit hallitsisivat kasvua

EGFR

mutantti keuhkosyöpään solujen HGF laukaisema EGFR-TKI-vastus

in vivo

. Suun kautta antaminen erlotinibin tukahdutti kasvun PC-9 /Vec-kasvaimia, mutta ei PC-9 /HGF kasvaimia, mikä osoittaa vastus PC-9 /HGF kasvaimia erlotinibille

in vivo

(Fig. 3A). Toisaalta, laskimoon temsirolimuusin tukahdutti kasvua sekä PC-9 /Vec kasvaimia ja PC-9 /HGF kasvaimia. Nämä tulokset osoittivat, että mTOR inhibointi voi olla käyttökelpoinen kasvun kontrolloimiseksi HGF-indusoitua resistenttejä kasvaimia

in vivo

.

(A) SCID-hiirissä, joissa PC-9 /Vec tai PC-9 /HGF kasvaimia annettiin 25 mg /kg erlotinibi kerran vuorokaudessa tai 50 mg /kg temsirolimuusia kerran viikossa päivästä 8 päivään 20. Kasvaimen tilavuus mitattiin käyttämällä calipers ilmoitettuihin päiviin. Keskiarvo ± SE kasvainten on esitetty ryhmille 5 hiirtä. * P 0,01 (yksisuuntainen ANOVA). Esitetyt tiedot edustavat 2 toisistaan ​​riippumatonta koetta samoin tuloksin. (B) SCID PC-9 /Vec tai PC-9 /HGF kasvaimia annettiin 25 mg /kg erlotinibia kerran päivässä 4 päivää tai 50 mg /kg temsirolimuusia kerran päivässä 8. Neljän tunnin kuluttua lopullisen erlotinibin annon, kasvaimet olivat korjattu, ja suhteelliset tasot proteiinien kasvaimen lysaatit määritettiin western blottauksella.

arvioitu, molekyylitason mekanismit, joiden temsirolimuusille inhiboi kasvua PC-9 /HGF-kasvaimia. Western blot-analyysit paljastivat, että erlotinibin merkittävästi inhiboi fosforylaatiota EGFR, ERK1 /2, ja AKT, ja hieman tukahdutti fosforylaatiota p70S6K PC-9 /Vec-kasvaimia (Fig. 3B). Vaikka erlotinibin estettiin merkittävästi EGFR fosforylaatiota, se vain hieman esti ERK1 /2 ja p70S6K fosforylaatiota, kun taas se ei estänyt AKT fosforylaatiota in PC-9 /HGF-kasvaimia. Toisaalta, vaikka temsirolimuusi ei merkittävästi vaikuta fosforylaation EGFR tai ERK1 /2 sekä PC-9 /Vec kasvaimia ja PC-9 /HGF kasvaimia, se estettiin merkittävästi p70S6K fosforylaatiota, mikä viittaa toimintatapa tämän lääkettä mTOR-estäjä.

Mielenkiintoista temsirolimuusi hieman esti Akt fosforylaation in PC-9 /HGF kasvaimia, mutta se kasvoi AKT fosforylaatiota PC-9 /HGF-solujen

in vitro

tilassa (kuvio. 2D). Selventää syynä tähän ristiriita, tutkimme ajankul- mTOR-estäjä hoidon AKT fosforylaatioon

in vivo

(Kuva S4). Olemme havainneet, että tulosten mukaisesti on

in vitro

kokeissa AKT-fosforylaation kasvaimissa lisättiin 4 h kuluttua temsirolimuusihoidon hoidon. Mutta sitten taso AKT-fosforylaation väheni ja se hieman inhiboitui 96 h käsittelyn jälkeen, mukaisesti ja tulokset on esitetty kuviossa. 3B. Siksi ristiriita tulosten välillä Fig. 2D ja kuvio. 3B johtuivat eron ajoituksesta näytteet kerättiin.

mTOR esto estää angiogeneesiä

in vivo

Lisäksi tutkittiin kasvainsoluproliferaation (Ki-67) ja angiogeneesiä (CD31) immunohistokemiallisesti. Erlotinibi hoito inhiboivat merkittävästi kasvainsoluproliferaation ja angiogeneesiä PC-9 /Vec ksenografteja, kun taas erlotinibi ei vaikuttanut solujen lisääntymisen tai angiogeneesin merkittävästi PC-9 /HGF ksenograftit (Fig. 4). Sen sijaan temsirolimuusi merkittävästi esti solujen lisääntymisen ja angiogeneesiä sekä PC-9 /Vec ja PC-9 /HGF kasvaimia. Nämä havainnot viittaavat siihen, että temsirolimuusille estää niiden kasvun, PC-9 /HGF kasvaimia (ainakin osittain) estämällä angiogeneesiä.

SCID-hiirten PC-9 /Vec tai PC-9 /HGF kasvaimia annettiin, kuten on kuvattu kuvassa. 3B. Neljän tunnin kuluttua viimeisestä antamisesta erlotinibin, kasvaimet kerättiin, ja kasvaimen solujen lisääntymistä (A, B: Ki-67) ja angiogeneesiä (C, D: CD31) määritettiin immunohistokemiallisesti. B ja D esittävät kvantifiointiin positiivisten solujen.

* P 0,01, (yksisuuntainen ANOVA). Bars näyttää SD.

lähemmin molekyylitason mekanismeja, joilla temsirolimuusille esti angiogeneesiä, tutkimme sen vaikutus kasvainsolun tuotannon VEGF, näkyvä angiogeneesiä molekyyli. Sekä PC-9 ja PC-9 /Vec solujen konstitutiivisesti tuotettu havaittavia määriä VEGF, joka stimuloi HGF (Kuva. 5A). Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, PC-9 /HGF solut tuottivat suurempia VEGF kuin PC-9 ja PC-9 /Vec soluja. Temsirolimuusi tukahdutti VEGF tuotantoa näissä syöpäsoluja läsnä ollessa tai ilman HGF. Knock alas mTOR siRNA aiheutti VEGF tuotannon PC-9 /Vec ja PC-9 /HGF soluja, kuten temsirolimuusia hoitoon (Kuva S2). Nämä tulokset osoittavat, että esti VEGF tuotantoa temsirolimuusille vaikka läsnä on HGF johtuu mTOR eston. Olemme myös arvioineet suoraa vaikutusta temsirolimuusin elinkelpoisuudesta endoteelisolujen

in vitro

. Temsirolimuusi ei inhiboinut konstitutiivinen elinkelpoisuutta HMVEC solujen väliaineessa, jossa oli 10% FBS: ää yksinään (kuvio 5B). VEGF: n ja HuMedia-MVG, jotka sisältävät EGF: ää ja fibroblastikasvutekijä-2 (FGF-2), lisääntynyt elinkelpoisuutta HMVECs. Temsirolimuusi pitoisuuksina, 1 nM ja suurempi, esti kasvusta elinkelpoisuutta. Nämä tulokset osoittavat, että temsirolimuusille estää angiogeneesin useita mekanismeja.

(A) Kasvaimen soluja inkuboitiin kanssa tai ilman HGF (50 ng /ml), kun läsnä on eri pitoisuuksia temsirolimuusihoidon 48 tuntia. Sitten supernatantit kerättiin, ja tuumorisolujen lukumäärän laskettiin. VEGF pitoisuus supernatanteissa määritettiin ELISA: lla. VEGF-määrät korjattiin kasvaimen solujen määrä on esitetty. (B) HMVECs inkuboitiin RPMI-1640-väliaineessa, jossa oli 10% FBS: ää (kontrolli), RPMI-1640-väliaineessa, jossa oli 10% -FBS plus VEGF tai HuMedia-MVG eri pitoisuuksilla temsirolimuusihoidon 72 tuntia. Sitten solujen elinkyky määritettiin käyttämällä MTT-määritystä. Bars näyttää SD. Esitetyt tiedot ovat 2 riippumattoman kokeen tulokset olivat samanlaiset.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että mTOR-inhibiittorit tukahdutti kasvua

EGFR

mutantti keuhko syöpäsolut, vaikka läsnä HGF,

in vitro

ja

in vivo

. Tuloksemme osoittavat myös, että mTOR-estäjät tukahduttaa angiogeneesiä estämällä VEGF tuotantoa ja endoteelisolujen proliferaatiota stimuloidaan eri pro-angiogeenisten tekijöiden. Nämä havainnot viittaavat siihen, että mTOR-inhibiittorit, kuten monoterapeuttisesta aineina, ovat käyttökelpoisia ohjaamiseksi etenemisen

EGFR

mutantti keuhkosyöpä ja HGF-laukeaa vastustuskyky EGFR-TKI.

HGF, jota kutsutaan myös Hajontatekijän , on monitoiminen sytokiini [31]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että HGF on mukana Karsinogeneesin invaasio /motiliteettia, EMT, angiogeneesi, ja etäpesäkkeiden keuhkosyöpää, ja siksi liittyy huonoon ennusteeseen potilaista [32]. Raportoimme aikaisemmin, että HGF indusoi EGFR-TKI-resistenssi

EGFR

mutantti keuhkosyöpäsoluissa palauttamalla MET /PI3K /AKT-reitin signalointi [10]. HGF Yliekspressio ei mukana paitsi hankittu resistenssi mutta myös luontainen vastustuskyky EGFR-TKI: [21]. Lisäksi HGF stimuloi VEGF tuotantoa

EGFR

mutantti keuhkosyövän soluja, samoin kuin helpottaa angiogeneesiä, mikä edistää kasvaimen etenemistä [24]. HGF yliekspressio usein yhteistyössä havaittiin

EGFR

-T790M portinvartija mutaatio hankittu resistentti kasvaimissa [9], [11], [21]. HGF indusoi resistenssi peruuttamatonta EGFR-TKI ja mutantti EGFR-selektiivisen TKI [33], joka on kehitetty voittamaan T790M välittämää EGFR-TKI vastarintaa. Viimeaikaiset kliiniset kokeet, joissa peruuttamattomia TKI monoterapiana pystynyt osoittamaan objektiivisen vasteen

EGFR

mutantti keuhkosyöpäpotilaita jotka olivat reagoinut hoitoon palautuva EGFR-TKI-gefitinibi ja erlotinibi [34]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että rinnakkaiselo muuttuneen HGF signalointi edistää epäedullinen vaste peruuttamatonta EGFR-TKI: näillä potilailla [32]. Lisäksi, läsnä HGF nopeuttaa kasvua jo olemassa olevien EGFR-TKI-resistentit kloonit, jotka Harbor

MET

monistus [35]. Äskettäin HGF raportoitu aiheuttavan resistenssiä ALK selektiivisiä in

EML4-ALK

keuhkosyöpä [36] ja BRAF estäjillä

BRAF

mutantti melanooma [37]. Tällaiset kertyvät todisteet osoittavat, että HGF on yhteinen tavoite voittamiseksi vastustuskykyä kohdennettuja lääkkeitä onkogeenin-riippuvainen kasvaimia.

Tuloksemme viittaavat myös siihen, että mTOR inhibiittorit ovat hyödyntää useita mekanismeja tukahduttaa kasvua EGFR-TKI vastus laukeaa HGF on

EGFR

mutantti keuhkosyövän soluja. Esimerkiksi nämä inhibiittorit todennäköisesti lohko mTOR /p70S6K /4E-BP1 eloonjääntisignaaleja jotka ovat yleensä mukana aikana PI3K /AKT aktivaation syöpäsoluissa. PI3K /AKT /mTOR polku edistää selviytymistä

EGFR

mutantti keuhkosyövän soluihin [38], [39]. Olemme aiemmin raportoitu, että tämä reitti on myös ratkaisevan tärkeää hankkia HGF laukaisema vastustuskykyä EGFR-TKI: in

EGFR

mutantti keuhkosyövän soluihin [40]. Esillä olevassa tutkimuksessa, sekä temsirolimuusia ja everolimuusi osittain tukahdutti fosforylaation p70S6K ja 4E-BP1, sekä esti selviytymistä

EGFR

mutantti syöpäsoluja

in vitro

. Näin ollen, mTOR-inhibiittorit saavuttaa kasvun inhibition tukahduttamalla eloonjääminen signaaleja EGFR ja kestävyys signaalit MET syöpäsoluissa.

Toinen mahdollinen mekanismi on angiogeneesin inhibitio. Viimeaikaiset tutkimukset raportoitu että mTOR-välitteinen signalointi stimuloi HIF-1α transkriptio, joka säätelee VEGF kautta 4E-BP1 fosforylaatio [41]. mTOR-inhibiittorit tukahduttaa HIF-1α transkription ja siten estää VEGF tuotantoa [28], [29], [41] – [43]. Raportoimme aikaisemmin, että HGF aktivoi MET /GAB1 polku ja lisää VEGF tuotantoa

EGFR

mutantti keuhkosyövän soluihin [24]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme vahvistaneet tämän havainnon ja edelleen osoittanut, että mTOR-inhibiittorit tukahdutti sekä konstitutiivista VEGF tuotantoa ja HGF-stimuloidun VEGF tuotantoa. Lisäksi olemme havainneet, että vaikka mTOR-estäjät eivät vaikuttaneet elinkelpoisuutta stimuloimattomien endoteelisolujen, ne estivät endoteelisolujen proliferaatiota stimuloitiin eri pro-angiogeenisten tekijöiden, mukaan lukien VEGF. mTOR aktivoidaan seuraavat sitoutumista useiden reseptorityrosiinikinaasien kuten VEGFR-2, EGFR, ja FGFR-1 [41]; siten, mTOR-estäjät voivat kumota stimulaation aiheuttaman useita pro-angiogeenisten tekijöiden endoteelisoluissa. Siksi mTOR-estäjät voivat estää angiogeneesiä vähintään 2 tilaa toimia. Ensinnäkin ne voivat estää VEGF: n tuotantoa jopa, kun läsnä on HGF. Toiseksi ne voivat estää endoteelisolujen proliferaation joka stimuloi eri pro-angiogeenisten tekijöiden.

tulokset viimeaikaisten kliinisten tutkimusten täsmälääkkeet osoittavat, kuinka tärkeää on potilaan valinnan. Esimerkiksi vastausprosentti gefitinibin oli vain 10-20% vuonna valitsemattomat NSCLC [44], mutta se oli noin 80% vuonna

EGFR

mutaatio-positiivisten NSCLC [43]. Etenemisen elinaika on

EGFR

mutantti keuhkosyöpäpotilaita oli myös paljon kauemmin kuin valitsemattomat NSCLC potilaiden [45]. Vaikka suuri määrä mTOR-estäjät on kehitetty ja arvioidaan parhaillaan kliinisissä kokeissa keuhkosyöpä, ei sirolimuusin temsirolimuusi tai everolimuusia käytettäessä monoterapeuttisesta aineina, osoittavat kliinistä tehoa valitsemattomat NSCLC [46] [47]. Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset mTOR-inhibiittorit yhdistettynä EGFR-TKI myöskään osoittanut kliinistä hyötyä valitsemattomat NSCLC [46], [48] – [50]. Nykyinen tutkimus on prekliinisissä, ja osoitimme, että mTOR-inhibiittorit osoitti huomattavaa tehoa keuhkosyövän solujen HGF välittämää vastus EGFR-TKI vastus sekä

in vitro

ja

in vivo

. Dong et ai. raportoivat myös kasvaimen vastainen aktiivisuus mTOR-inhibiittorit vastaan ​​EGFR-TKI-resistenttejä

EGFR

mutantti keuhkosyövän solut T790M portinvartijan mutaatio [51]. Sekä HGF ja T790M portinvartija mutaatiot ovat usein havaitaan EGFR-TKI resistenttejä kasvaimia, missä ne edistävät vastarintaa. Siksi nämä havainnot kuvaavat tarvetta kliinisissä tutkimuksissa mTOR estäjien

EGFR

mutantti keuhkosyöpään potilailla, jotka tulevat tulenkestävä gefitinibille ja erlotinibi. Koska HGF antaa resistenssin kohdennettuja lääkkeitä useissa kasvaintyypeissä, kliinisissä kokeissa mTOR-inhibiittorit ovat perusteltuja.

tukeminen Information

Kuva S1.

mTOR-estäjät eivät vielä herkistää

EGFR

mutantti keuhkosyöpäsoluissa erlotinibille

in vitro

. PC-9 /Vec soluja inkuboitiin kanssa tai ilman temsirolimuusille (A) tai everolimuusille (B), läsnä ollessa tai ilman HGF (20 ng /ml) ja erlotinibin (0,3 uM) 72 tuntia. Sitten solujen elinkykyisyys määritettiin MTT-määrityksellä. Bars näyttää SD. Esitetyt tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta samoin tuloksin.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0062104.s001

(TIF) B Kuva S2.

Knock-down mTOR estivät solujen kasvua ja VEGF tuotantoa. Kasvaimen solut transfektoitiin mTOR tai valvoa siRNA: ssa 24 tuntia ja (A) solulysaateista otettiin talteen ja niille suoritettiin Western blot.