Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

TLR9 agonisti CpG yhä sovelletaan prekliinisissä ja kliinisissä tutkimuksissa terapeuttinen liikennemuotojen parantaa kasvaimen koskemattomuutta. Kliininen soveltaminen CpG näyttää kuitenkin vähemmän onnistuneita kuin voidaan ennustaa eläinkokeista. Yksi syy voi olla eri antoreittejä käytössä useimmissa hiiri tutkimuksissa ja kliinisissä tutkimuksissa. Tutkimme, onko tehoa CpG adjuvanttina syövän immunoterapiassa riippuu reitin CpG hallinnon, erityisesti silloin, kun kasvain on palamatta

in situ

.

Menetelmät /Principal Havainnot

In situ kasvaimeen hävittämistekniikka ovat invasiivisia hoitovaihtoehtoja hoitoon (leikattavissa) kiinteitä kasvaimia. Toisin kuin kirurginen resektio, kasvaimen hävittäminen johtaa induktioon heikko, mutta kasvain-spesifisen immuniteetin, joka voidaan parantaa coapplication CpG. Kuten in situ kasvaimeen tuholta cryosurgery luo välittömän paikallisen vapautumisen antigeenejä, haimme tämä malli tutkia tehoa CpG parantaa kasvainten vastainen immuniteetin kun ylläpitäjä eri reittien kautta: peritumoraalista, laskimoon ja ihon alle, mutta kaukana kasvain. Osoitamme, että peritumoraalista anto on parempi aktivoituminen dendriittisolujen, induktio kasvain-spesifisen CTL-, ja pitkäkestoisia kasvaimen suojaa. Vaikka suonensisäinen ja ihonalainen (kaukaisiin site) vastuut käytetään yleisesti kliinisissä tutkimuksissa, ne vain mikäli osittainen suoja tai jopa jättänyt parantaa kasvainten vastainen vasteita kuin aiheuttama cryosurgery yksin.

Johtopäätökset /merkitys

CpG hallinto parantaa merkittävästi tehoa in situ kasvaimeen hävittämistekniikka, että CpG annostellaan lähellä vapautuneesta antigeenejä. Näin ollen tämä tutkimus auttaa tarjoamaan suuntiin täysin hyödyntämään CpG kuten immuuni nautintoaine kliinisessä ympäristössä.

Citation: Nierkens S, den Brok MH, Roelofsen T, Wagenaars JAL, Figdor CG, Ruers TJ, et al . (2009) Antoreitti että TLR9 Agonisti CpG Kriittisesti Määrittää tehon Cancer immunoterapia hiirissä. PLoS ONE 4 (12): e8368. doi: 10,1371 /journal.pone.0008368

Editor: Roberto F. Speck, University Hospital Zurich, Sveitsi

vastaanotettu: 11 lokakuu 2009; Hyväksytty 25 marraskuuta 2009; Julkaistu: 18 joulukuu 2009

Copyright: © 2009 Nierkens et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus mahdollistivat avustukset Alankomaiden Cancer Society (KWF-2003-2893, KWF-2004-3137, KWF-2005-3325). SN on tutkija Alankomaiden Cancer Society (KWF, Amsterdam, Alankomaat). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kirurginen resektio kiinteitä kasvaimia yleensä tarjoaa parhaan mahdollisuuden parannuskeino syöpäpotilailla. Monissa tapauksissa kuitenkin kasvain vaurioita ei myönnetä resektion ja vaativat vaihtoehtoisia hävittämistekniikka, kuten cryosurgery, radiotaajuisen tai laser ablaatio. Nämä menetelmät tarjoavat vähän invasiivisia hoitoja laaja valikoima kasvaimia. Itse asiassa, radiotaajuisen todettiin tarjota paikallista kasvaimen ohjaus vastaa resektio alaryhmässä potilaiden [1], jossa korostetaan, että in situ kasvaimeen hävittämistekniikka yhä onnistunut hoitotapoja.

Toisin kuin kirurginen resektio, in situ kasvain tuhoa tarjoaa antigeenin lähteen käytettävissä immuunisolujen. Osallistuminen immuunijärjestelmän puhdistumaan syöpäsolujen yhä arvostetaan [2]. Antigeeniä esittelevät solut (APC), kuten dendriittisolut (DC), ovat hyvin varustettu fagosytoivat kuolevat solut ja prosessi kasvaimen antigeenien esittely T-lymfosyyteille [3]. Itse asiassa viimeaikaiset tiedot osoittivat, että DC kasvaimen tyhjennys imusolmukkeet tehokkaasti hankkia kasvain roskat seuraava in situ kasvaimeen tuhoutumisen [4]. Valitettavasti vaikka kasvain ablaatio on liittynyt esiintyminen immuuniaktivaatiota joillakin potilailla [5], uloskasvamisen kaukaisten mikrometastaaseihin merkitsee sitä, että mitään tai heikkoja systeemistä suojaavia immuunivasteita aiheuttama.

hakeminen viime aikoina kehitetty hiirimallissa olemme aiemmin osoittaneet, että in situ kasvaimen tuhoutumiseen avulla cryosurgery tai radiotaajuisen ablaatio johti induktion heikko, mutta kasvain-spesifisen immuniteetin [6], [7]. Nämä tulokset ymmärtää, että yhdistelmä in situ kasvaimen tuhoisa hoitomuotoja erityisten immuunistimulaatiota voisi olla strategia parantaa kliinisen tuloksen yhä useamman syöpäpotilaita.

Tässä suhteessa toll-like-reseptori (TLR ) agonistit ovat kiinnostavia kuin immuuni adjuvantteina. TLR ovat perheen taudinaiheuttajan tunnistaminen reseptoreja, jotka laukaistaan ​​tunnistaessaan taudinaiheuttajista liittyvien molekyylitason kuvioita ilmaistaan ​​monipuolinen joukko tarttuvien mikro-organismeja. Mielenkiintoista, immunostimuloiva teho Bacille Calmette-Guerin (BCG), käytetään jo 1970-luvulla stimuloida kasvainten vastainen immuniteetti [8], on nyt tiedetään olevan BCG DNA, joka sitoutuu TLR9 [9], [10]. Lisätutkimukset osoittivat, että DC ilmaista TLR9 ja suoraan aktivoidaan sitoutumisen TLR9 metyloimatonta CpG-motiivien DNA [8]. DC aktivaatio CpG liittyy signalointiryöpyn huipentui transkriptiotekijöiden esim. tumatekijä-KB (NF-KB), myöhemmin säätelyä kostimulatorisia molekyylejä ja tuotanto kemokiinien ja sytokiinien (esim. IL-6, IL-12, TNF-α). Tämän seurauksena, CpG-stimuloitu DC indusoivat Th1-vasteita ja ovat keskeisiä aktivoimiseksi CD8

+ sytotoksiset T-lymfosyytit (CTL).

Itse asiassa olemme aiemmin raportoitu, että kasvainten vastainen vasteita synergistisesti, kun CpG oli käytetään adjuvanttina cryo ablaation mallia. Co-injektion CpG lisääntynyt muodostuminen kasvaimen CD8

+ CTL ja suojattu -100% hiiristä vastaan ​​uudelleen haaste kasvainsolujen tämän mallin [6]. Muissa malleissa, CpG on osoitettu tehokas estämään kasvaimen kasvulta ennaltaehkäisevässä ympäristössä ja hävittää perustettu hiirissä [11], [12]. Soveltaminen CpG kliinisissä tutkimuksissa näyttää kuitenkin vähemmän onnistuneita kuin voidaan ennustaa eläinkokeista. Yhteinen perustelu on ero ilmaus TLR9 DC hiiressä ja ihmisen. TLR9 on runsaasti ilmaistaan ​​-DC (PDC) hiirestä ja ihmisen ja hiiren myelooisen DC (MDC). Ihmisille MDC, TLR9 ilme ei ole yhtä selkeä kuin joissakin tutkimuksissa on raportoitu heikko negatiivinen ilmaus [13], [14], kun taas tuore tutkimus osoittaa, että ihmisen MDC eivät sisällä TLR9 proteiinia määrinä verrattavissa pDC [15]. Lisäksi MDC ja pDC näyttävät toiminnallisesti liittyvät molemmilla lajeilla kuin intensiivinen cross-talk välillä DC osajoukot on olennaista CpG-indusoidun immuuniaktivaatiota niin hiirillä ja ihmisen [16], [17].

huomata, että hiiren tutkimuksissa osoittavat voimakkaimpia CpG vaikutuksia, CpG toimitetaan yhdessä antigeenin tai lähelle tuumoriantigeeneille [12], [18], [19], [20]. Lisäksi olemme viime aikoina raportoitu, että kolokalisaation antigeenin ja CpG sisällä DC: n endosomaalista osastoissa in vivo liittyy läheisesti kyky rajat läsnä antigeenin ja induktio myöhempien suojaavan immuniteetin ablaation jälkeen [21]. Kliinisissä tutkimuksissa reitin CpG hallinto harvoin perustuu sijainnin kasvain, mutta yleensä ohjaa toimittajan säännösten ja /tai helppous hallinnon. Koska nämä erot CpG annostamistavoissa voi olla huomattavia vaikutuksia sen kliinisen tehon vertasimme tehoa CpG annostella eri reittejä suhteessa sivuston antigeenin saatavuus on ainutlaatuinen hiiren kasvain ablaatio malli. Tuloksemme osoittavat, että laskimoon (i.v.) ja ihonalaisen (s.c.) reittiä CpG hallinnon (sovelletaan useimmiten ihmisen ympäristössä) ovat paljon vähemmän tehokkaita kuin peritumoraalista (P. T.) CpG injektioita. Olemme päätellä, että epäonnistuminen tai menestys CpG hallinto riippuu ratkaisevasti sijainnin CpG hallinnon suhteessa kasvaimen sijainnista.

Materiaalit ja menetelmät

Hiiret ja tuumorisoluissa

C57BL /6n hiiriä (6-8 viikkoa vanhoja) hankittiin Charles River Wiga (Sulzfeld, Saksa) ja ylläpidettiin spesifisissä patogeenivapaissa esteen olosuhteissa Central Animal Laboratory (Nijmegen, Hollanti). Juomavesi ja standardi laboratorio ruoka pelletit toimitettiin mielin määrin ja hiirten annettiin asettua vähintään 1 viikko ennen satunnaisia ​​tehtävä erityisiksi hoitoryhmissä. Kokeet suoritettiin ohjeiden mukaan eläinten hoidosta Nijmegen eläinkokeet komitea.

OVA-transfektoitujen hiiren melanoomasolulinjalla B16F10 (B16OVA, klooni MO5) luovutti ystävällisesti dr. K. Rock [22] ja viljeltiin täydellisessä elatusaineessa (MEM, 5% naudan sikiön seerumia (Greiner Bio-oni), 100 U /ml G-penisilliini ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Pen /Strep), MEM natriumpyruvaattia (1 mmol), NaH

2CO

3, MEM vitamiinit, MEM ei-välttämättömiä aminohappoja (kaikki Invitrogen), 20 uM β-merkaptoetanolia (β-ME)) täydennettynä 30 ug /ml hygromysiini ja 1 mg /ml G418: aa. B16F10 melanooma solulinja saatiin the American Type Culture Collection ja pidettiin täydellisessä elatusaineessa.

Kasvainmalli ja Cryosurgery

Kasvaimen solut suspendoitiin seokseen, jossa oli PBS: ää ja Matrigel (02:01 ) ja 0,5 * 10

6 solua kokonaistilavuudessa 50 ui injektoitiin sc oikeaan reisiluun. Kun kasvain halkaisijat mitataan 6-8 mm (yleensä päivänä 9-10), hiiret jaettiin satunnaisesti hoitoryhmiin (ei käsitelty; NT, cryo ablaatiota, cryo). Cryo ablaatio suoritettiin isofluraani /O

2 /N

2O anestesia käyttämällä nestemäistä typpeä cryo ablaatio järjestelmä (CS76, Frigitronics, Shelton, CT), jonka kärki jäähdytetään jatkuva kiertävän nestemäistä typpeä. Aikana 2 hoitojaksoa on jäädytys ja sulatus kasvain oli makroskooppisesti jäädytetty, jättäen ympäröivä terve kudos ennallaan. Voit seurata induktion pitkäaikaisia ​​kasvain suojaus, hiiret uudelleen altistettiin 25 * 10

3 B16OVA soluja 40 päivään sen jälkeen cryo ablaation. Kaksi kuukautta myöhemmin, hiiret, jotka selvisivät ensimmäinen kasvain uudelleen haaste sai toisen uudelleen haaste 5 * 10

4 B16OVA tai B16F10 soluja. Hiiret tapettiin, kun kasvaimen tilavuus ylitti 1000 mm

3, tai kun kasvaimet jarrun ihon läpi esteen.

CpG 1668 ( ’5-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3’), jossa fosforotioaattimuodossa selkäranka ostettiin Sigma Genosys (Haverhill, UK). CpG ruiskutettiin PBS P.T. (100 ug jaettuna 3 injektiota 10 ui ympäröivät kasvainta), i.v. (100 ug 100 ul), tai s.c. (100 ug 30 ul: ssa vasemmalla reisiluu hiiren, eli sen vasta sivupinnan hiiren viittasi kasvaimen sijainnista). Injektiot suoritettiin 30 minuutin kuluessa ablaation. Käytimme CpG 1668, joka on B-CpG, jotka vastaavat kliinisessä-luokan käytettävissä CpG nykyisin käytetään kliinisissä kokeissa.

rikastus ja analysointi DC

analysoimiseksi DC biologia, DC olivat eristetty nivusimusolmukkeista tyhjennys kasvain. Imusolmukkeet irrotettiin ja muussattu käyttämällä neulaa tai lasilevyille ja hajotettiin kollagenaasityyppi II ja DNaasia 15 minuuttia. Kun oli lisätty EDTA: ta ja suspendoida uudelleen, solut levitettiin suodatin poistaa roskat ja DC rikastettiin positiivinen valinta käyttäen anti-CD11 c-leimatun (N418) magneettinen mikro-helmiä (Miltenyi Biotec BV).

tutkia kohtalosta antigeenin ja CpG jälkeen kylmäpresipitaattien ablaation, kasvaimia injektoitiin fluoresoivasti leimatun OVA-proteiinia (OVA-Alexa488 tai OVA-Alexa647, 20 ug /20 ui) ja Cy5-leimattua CpG (CpG-Cy). CD11 c-rikastettu soluja inkuboitiin Fc Block (CD16 /CD32, 2.4G2) ja värjättiin anti-CD11 c (HL3), biotinyloitu anti-CD80 (1G10 /B7) tai isotyyppikontrolleja ja streptavidiini-PE, kaikki on saatu BD Biosciences. Expression of CD80 analysoitiin OVA

+ ja OVA

– soluja eroteltiin CD11 c

+ solujen virtaussytometrialla (FACS Calibur, Becton Dickinson Co., San Jose, CA). Aiemmin raportoitu, että otto mallin antigeenin OVA by luuytimestä peräisin DC riippuu pitkälti mannoosireseptoriin [23]. Näin ollen, olemme toistaneet kokeita BSA-Alexa488 ja ole eroja otto DC in vivo havaittiin kahden antigeenejä (tuloksia ei ole esitetty).

Ex vivo T Cell Monitoring

Soluja perna ja kasvaimen tyhjennys imusolmukkeet stimuloitiin 5 tuntia PMA: lla (0,5 ug /ml) /ionomysiinillä (0,1 ug /ml) läsnä ollessa Brefeldin A: ta (10 ug /ml). Solut analysoitiin CD8 ja solunsisäistä ekspressiota IFN-γ käyttäen virtaussytometrialla. Lisäksi, soluja stimuloitiin anti-CD3: lla tai OVA-proteiinia 96 tunnin ajan analysoida IFN-γ supernatantissa. IFN-y-ELISA suoritettiin valmistajan ohjeiden (BD Biosciences).

Antigeenispesifisen CTL

tutkimiseksi tehoa ero CpG anto aiheuttaa antigeenispesifisten CTL, pernat ja kasvaimen tyhjennys imusolmukkeet eristettiin kymmenen päivän kuluttua ablaation. Mixed solususpensiot imusolmukkeiden ja pernan maljattiin 24-kuoppaisille levyille täydelliseen IMDM: ssä, johon oli lisätty hIL2 (10 U /ml) ja stimuloitiin säteilytetyillä (1600 rad) B16OVA soluja (5 * 10

4 solua /kuoppa), että oli käsitelty yön yli r-IFN-γ (50 U /ml) ja säätää ylös MHC-luokan I esitys. Päivänä 3-4 viljelyn jälkeen solut otettiin talteen ja kuolleiden solujen roskat poistettiin käyttäen Ficoll-gradienttia. Soluja viljeltiin tuoreessa 24-kuoppalevyille vielä 4-5 päivää. Visualisoida kasvain-spesifisen CTL-solut värjättiin FITC-konjugoidulla CD4 (L3T4) tai CD8 (53-6.7) ja APC-konjugoidun OVA Kb tetrameerejä (Sanquin, Amsterdam, Alankomaat), ja analysoitiin virtaussytometrialla.

TILASTOANALYYSI

tiedot analysoitiin käyttämällä kaksisuuntaista t-testiä tai yksisuuntaista ANOVA monimuuttujille kanssa Bonferroni post hoc testi.

tulokset

arvosanojen Aktivoidun Antigen-Loaded Mature dendriittisoluilla imusolmukkeet riippuu Route CpG

pohjustus CD8

+ CTL riippuu ainutlaatuinen ominaisuus DC kaapata solunulkoiseen antigeenejä ja esitellä niitä MHC luokka I. Tämä prosessi, jota kutsutaan rajat esitys [24], voidaan voimakkaasti parantaa aktivoimalla DC kautta TLR9 [25]. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme vaikutus reitin CpG hallinnon DC toiminto ja antitumor vasteet jälkeen Cryo ablaation.

Kuten kuviossa 1A, peritumoraalista CpG injektiot lisääntyi merkittävästi absoluuttinen määrä DC kertyneiden kasvain-kuivaava imusolmuke 2 päivää sen jälkeen injektion sekä kasvain ei-käsitellyissä hiirissä ja hiirissä altistettiin cryosurgery. Ihonalaisen CpG on vasta sivusuunnassa puolella ei vaikuta lukuihin DC. Mielenkiintoista, i.v. CpG injektiot lisäsi kertymistä CD 11 c

+ DC kasvain-kuivaava imusolmuke vain yhdistettyinä cryo ablaatio (Fig. 1A).

(A) absoluuttinen määrä CD11 c

+ solujen tyhjennys imusolmukkeet 2 päivää sen jälkeen ablaation. Kasvain hiiret jätettiin käsittelemättä (NT) tai alistettiin CRYO ablaatio (cryo). Lisäksi jotkut ryhmät hiiret saivat CpG kautta ilmoitettu reittejä. Suluissa merkittäviä eroja (p 0,05) välillä osoitti ryhmien (n = 4-6 /ryhmä, 2 samanlaisia ​​kokeita). (B) antigeenin oton jälkeen kylmäpresipitaattien ablaation. OVA-Alexa488 ruiskutettiin B16OVA kasvaimissa (6-9 mm) juuri ennen Cryo ablaatio valvoa kohtalosta antigeenin jälkeen in situ kasvaimen tuhoamista. Hiiriä käsiteltiin lisäksi CpG kautta ilmoitettu reittejä. Kaksi päivää ablaation jälkeen, omaksumista antigeeni analysoitiin CD11 c

+ soluja rikastetaan altaat Kasvainten tyhjennys imusolmukkeet. Numerot paneelit osoittavat prosenttiosuuden OVA

+ kaikista CD11 c

+ soluja. Tiedot yhdestä edustavasta hiirtä per ryhmä. (C) kvantitatiivinen analyysit rinnakkaisten kokeiden kuvan (B) (5 hiirtä /ryhmä, edustaja 2 koetta). (D) antigeenin oton ja CpG by CD11 c

+ soluja valvotaan jälkeen P.T. ja i.v. CpG-Cy5 hallinnon ja sisäisen kasvaimen injektion OVA-Alexa488. Tulokset yhdestä edustaja hiiren näytetään (n = 4 /ryhmä). (E): n ekspressio CD80 on CD11 c

+ antigeenin sisältävistä soluista. * Tarkoittaa merkitsevää eroa (p 0,05) kaikista muista ryhmistä (n = 5 /ryhmä, 2 samanlaisia ​​kokeita).

antigeeni internalisaation ja kypsymisen tilan DC ovat kaksi merkittävää vaatimukset induktion tuottava antigeenispesifisiä immuunivasteita. Olemme aiemmin osoittaneet, että cryo ablaatio yhdistettynä P.T. CpG hallinto synergistisesti ajan säätelee ilmentymistä kostimuloivien molekyylien [26]. Tutkia, reitin CpG hallinnon differentiaalisesti vaikuttaa kykyyn DC ryhtyä antigeeni, OVA-Alexa-488 injektoitiin kasvaimen juuri ennen ablaation korvikemarkkerina liukoisen antigeenejä, joita vapautuu nopeasti kasvain seuraavista cryosurgery [ ,,,0],27]. Peritumoraalista CpG injektio samanaikainen kanssa ablaation synergistisesti lisäsi antigeenin oton valuttamalla imusolmuke DC. Sitä vastoin sekä i.v. ja s.c. injektiot epäonnistui parantaa antigeenin oton joko kasvain ei-käsitellyistä hiiristä tai hiiristä altistetaan cryosurgery (Fig. 1 B-C). Sovelsivat fluoresoivasti leimattu CpG, olemme lisäksi havaittu, että suurin osa kaikista imusolmuke DC hiirillä CpG- kautta P.T. tai i.v. injektiot olivat sisäistäneet CpG. Määrä CpG kohti DC oli kuitenkin paljon korkeampi, kun P.T. hallinto (Fig. 1 D) ja OVA

+ DC oli hankkinut kohonneeseen CpG verrattuna OVA

+ DC hiiristä, jotka saivat i.v. CpG injektiot. Lopuksi, s.c. ja i.v. CpG injektiot vain hieman lisääntynyt CD80 ilme antigeeni-ladattu DC, kun taas P. T. CpG anto paransi merkittävästi tasoilla kostimuloivien markkerien (Fig. 1 E).

Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että P.T. CpG injektiot merkittävästi lisätä määrää antigeeniä ja CpG-ladattu, CD80-ekspressoivat imusolmukkeiden DC jälkeen Cryo ablaation in vivo. Hallinnoivan CpG kautta i.v. reitti johtaa kertyminen kuivaava imusolmuke DC ablaation jälkeen, mutta nämä DC näytteille vain hiukan kohonneelta sisäistetty antigeenin ja CD80-ilmentymisen verrattuna cryo ablaation yksin. Ihonalaiset CpG on vasta sivusuunnassa puolelta tehdä lisätä DC paikallisen imusolmukkeen (tuloksia ei esitetty), mutta ei kasvain-kuivaava imusolmuke ja vain lujittaa antigeenin sisäänoton ja CD80 ilme.

Reitin CpG Administration Määrittää pohjustus CD4

+ ja CD8

+ T Cells

päästääkseen paremmin sisälle seurauksista ero DC fenotyyppien aiheuttama CpG hallinnon eri reittien kautta in vivo pernasolua lymfosyyttien kasvain tyhjennys imusolmukkeet analysoitiin. Havaitsimme, että prosenttiosuudet IFN-γ

+ CD4

+ ja IFN-γ

+ CD8

+ T-solut sen jälkeen, kun ei-spesifinen (Fig. 2A) tai erityiset uudelleen stimulaation (Fig. 2B), sekä solumäärän imukudoselimiin (ei esitetty) vaikutti CpG injektiokohdassa. Peritumoraalista CpG injektiot lisääntynyt IFN-γ

+ solujen pääasiassa kasvaimeen kuivaava imusolmuke, ja hieman myös pernassa. Sen jälkeen, kun i.v. injektioiden määrä IFN-γ

+ solujen lisääntyneet lähinnä perna. CD8

+ IFN-γ

+ T-solut hieman parannettu vuonna imusolmukkeessa poistetun sivuston. Ihon alle CpG injektiot vasta sivusuunnassa kasvain ei vaikuta IFN-γ

+ T-solujen määrä oli kasvain, kuivaava imusolmuke.

(A): n prosenttiosuudet IFN-γ

+ T-solujen sisällä CD4

+ tai CD8

+ populaatiot jälkeen cryo ablaation +/- CpG. B16-OVA tuumoreita kantavaa hiirtä käsiteltiin cryo ablaatio yhdistettynä CpG annon kautta ilmoitettu reittejä. Seitsemän päivää ablaation jälkeen, perna, kasvaimeen tyhjennys imusolmukkeiden ja ei-tyhjennys imusolmukkeet eristettiin. Soluja stimuloitiin PMA /ionomysiinillä ja värjättiin CD8, CD4: n ja IFN-γ. * Osoittaa huomattavia eroja (p 0,05) välillä osoitti CpG-hoidetussa ryhmässä ja naiivi ja Cryo ryhmä. (B) IFN-γ tuotannon jälkeen cryo ablaation +/- CpG. Soluja stimuloitiin OVA: lla 96 tuntia ja IFN-γ mitattiin supernatantista ELISA. Keskimääräiset tasot Cryo + CpG i.v. ryhmiä molemmissa elimissä ovat merkittävästi erilainen kuin kaikki muut ryhmät (n = 6 /ryhmä, 2 koetta).

Lopuksi luettelointi OVA CD8

+ T-solujen 10 päivän kuluttua cryosurgery vahvisti ylivoimainen induktio antigeenispesifisten CTL kun CpG annettiin pt (3,1% ± 1,1 kaikista CD8

+, Fig. 3). Suhteessa CRYO ablaatio yksinään (0,7% ± 0,2), eikä i.v. eikä s.c. CpG injektiot tuotti merkittävän kasvun CTL (1,5% ± 0,4; 0,60% ± 0,2). Sama suuntaus, vaikka ei merkittävää, havaittiin CTL spesifinen B16 luontaisen kasvaimen peptidi TRP-2 (ei kuvassa).

(A) edustaja pistekuvioita CD8

+ OVA-Kb tetrameerin

+ solut yksittäisten hiirien. Hiirillä B16OVA kasvaimia (6-9 mm) altistettiin Cryo ablaatio yksin tai myönnetty erillisiä CpG injektioita kautta ilmoitettu reittejä. Kymmenen päivän kuluttua kasvaimen tuhon, pernasta ja kasvaimen imusolmukkeet eristettiin ja stimuloitiin uudelleen IFN-γ-käsitellyn γ-säteilytettyjä B16OVA kasvainsoluja. Viljelmät puhdistetaan Ficoll vaiheena sen jälkeen 3-4 päivää viljelyn ja päivänä 8-9 solut analysoitiin läsnäolo kasvain-spesifisen CTL käyttäen APC-leimattua OVA-K

b tetrameerejä. Solut eroteltiin CD8

+ T-soluja. Tiedot yksi edustaja hiiren ryhmää kohti esitetään. (B) kvantitatiivinen analyysit kollektiivisen arvot on esitetty (A) (keskimääräinen taso 2 erillisessä kokeessa (4-6 hiirtä ryhmää kohti /koe)). * Tarkoittaa merkittäviä eroja (p 0,05) osoitetun ryhmässä verrattuna kaikkiin muihin ryhmiin.

Yhdessä nämä tiedot osoittavat siten, että parannettu lastaus ja kypsymisen DC seuraavista P.T. CpG hallinto korreloi havaittu Paikallisissa lymfosyyttiaktivaation.

peritumoraalista CpG ruiskeet ylivoimaisia ​​induktio Long-Term Kasvaintenvastainen Immunity

Edellä mainitut tiedot osoittavat, että pistoskohdan CpG suhteessa ablatoitu kasvaimen alueella on ratkaiseva tekijä induktion kasvain-spesifisiä CTL-vasteita. Lisätutkimuksia sen tärkeyttä, tuumoreita kantavaa hiirtä käsiteltiin cryo ablaatio ja CpG annettiin joko P. T., s.c. tai i.v. Neljäkymmentä päivää ablaation jälkeen, kasvaimettomina hiiret altistettiin tappavan annoksen kasvainsoluissa.

Cryosurgery yhdistettynä P.T. CpG hallinnot suojattu ~90% kaikista hiiristä, kun taas s.c. ja i.v. CpG injektiot eivät merkittävästi parantaa indusoimat vasteet cryosurgery yksinään (Fig. 4A). Vaikka i.v. CpG hallinto ei lisätä selviytymisen, kasvaimen kasvu oli huomattavasti hitaampaa kuin hiirillä, joille s.c. injektiot tai cryo ablaatio yksinään (Fig. 4B). Nämä tulokset osoittavat, että i.v. CpG injektiot voivat aiheuttaa kasvainten vastainen vasteita, jotka kykenevät rajoittamaan kasvaimen kasvua ja pidentää elinaikaa jossain määrin. Kuitenkin, kun hiiret saivat tappavan kasvaimen haastaa i.v. CpG injektiot suojattu vain 50% hiiristä, kun taas tapauksessa P.T. CpG injektiot ~90% hiiristä selviytyi. CpG esikäsittely naiivi hiiret eivät tarjoa mitään suojaa tappavaa kasvaimen haasteita riippumatta antoreitistä (tuloksia ei ole esitetty).

(A) Kaplan-Meier-eloonjäämiskäyrät naiivien hiirillä versus hiirillä, joita on hoidettu jossa cryo ablaatio yksin tai yhdessä samanaikaisen CpG hallinnon kautta ilmoitettu reittejä. Perustettu B16OVA kasvaimia Oikea reisiluu käsiteltiin cryo ablaatio yksin tai yhdessä CpG viranomaisten eri reittien kautta: P. T., i.v. tai s.c. contra sivusuunnassa kasvain. Neljäkymmentä päivää myöhemmin, naiivi ja kasvaimettomina hiiriä (8-13 hiirtä per ryhmä) saivat s.c. uudelleen haaste kasvainsolujen (25,000 B16OVA solut). (B) Kasvaimen koko määritettiin joka 2-3 päivän kuluttua hoidon. Data edustaa kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta.

Olemme aiemmin osoittaneet, että ajoitus CpG anto on kriittistä tehoa P.T. CpG injektiot yhdistettynä ablaatio. Pienentynyt tehoa i.v. annetaan CpG nykyisessä kokeet voivat siis liittyä viive, jossa CpG-ODN päästä vapautuu antigeenejä ablaation sivustolla. CpG syystä ruiskutettiin 1 päivää ennen, samanaikaisesti sen kanssa tai 1 päivä sen ablaation. Antaminen CpG 1 vrk ennen ablaatiota johti samanlaiset tulokset kuin havaittiin CpG injektioita samanaikaista kanssa ablaatio (40-45% hiiristä selviytyi). Sitä vastoin CpG hallinto 1 päivä sen ablaation jättänyt parantaa kasvainten vastainen koskemattomuuden aiheuttama CRYO ablaatio yksinään (Fig. 5). Pienentynyt tehoa i.v. CpG hallinnot verrattuna P.T. altistuminen ei siis ole, koska ajoitus näkökohtia.

perustettu B16OVA kasvaimia käsiteltiin cryo ablaatio yksin tai yhdessä i.v. CpG hallinto samanaikainen kanssa ablaatio, tai 1 päivää ennen tai jälkeen ablaation. Neljäkymmentä päivää myöhemmin, naiivi ja kasvaimen-hiiriä (7-10 hiirtä per ryhmä) saivat s.c. uudelleen haaste kasvainsolujen (25,000-50,000 B16OVA solut) on vasta-sivusuunnassa kylki ja eloonjäämistä seurattiin. Edustajalle 2 kokeesta.

Keskustelu

Vaikka hiiri mallit ovat selvästi osoittaneet voimakkaan antituumorivaikutukset CpG, kliiniset tulokset ovat toistaiseksi olleet pettymys, viimeaikaisen vaiheen 2 ja 3 tutkimuksissa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä pudotetaan epäonnistumisen vuoksi sc CpG-ODN hallinnon parantamiseksi kliiniseen tulokseen [28]. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että antoreitti määrää tehoa CpG immuunivasteiden stimuloimiseksi jälkeen in situ kasvaimen hävittäminen. Peritumoraalista CpG anto lisää aktivoitujen, kypsä, antigeeni-laakeri DC kasvain-kuivaava imusolmuke ja stimuloi kasvaimen CTL johtaa erinomaisen muistiin vasteita tuumoriantigeenejä vastaan. Ihonalainen CpG injektiot etäällä kasvaimen vain lujittaa antitumor koskemattomuutta. Myös systeeminen CpG hallinnon kautta i.v. injektio antaa vain rajoitetun suojan (50%) verrattuna peritumoraalista injektiota (90% suoja).

hakeminen uudenlainen kliinisesti merkittäviä in situ kasvaimeen tuhoa malli, olemme aiemmin raportoitu, että epäonnistuminen tai onnistuminen CpG kuin rokoteadjuvanttina riippuu kolokalisaation antigeenin ja CpG sisällä endosomaalista DC osastoissa ja siten ajoitus CpG hallinnon. Dendriittisolut olivat vain pystyy rajat esitellä antigeenejä ja edistää CTL induktio olosuhteissa, joissa antigeeni ja CpG oli yhteistyössä sijaittava DC. Itse asiassa, P.T. CpG hallinto 1 vrk ennen tai jälkeen kasvain ablaatio sijasta samanaikainen CpG injektio, oli jo suuri vaikutus sen tehoon [21]. Näiden tulosten perusteella, ryhdyimme vaikutuksen määrittämiseksi antotavan CpG- tässä mallissa järjestelmässä. Vaikka s.c. CpG injektiot kaukana kasvain ei aloittaa mitään antituumorivaikutuksen immuniteetti, i.v. CpG hallinto tuottanut jonkin verran eloonjäämishyötyä (ei merkitsevä) yli cryo ablaatio yksin. Nämä erot tehoa CpG ei koskenut eroja ajoituksessa, koska eri ajoitus hoito-i.v. CpG hallinto ei parantaa sen tehokkuutta. Nämä tiedot osoittavat, että sekä aika ja reitti CpG hallinnon tehokkuuden määrittämiseksi CpG- terapian ja merkitse, että saatavuus CpG ajassa ja paikassa (lymfaattisessa) kudoksiin on tärkeä tekijä adjuvanttisuus CpG-.

aikaisemmin on oletettu, että tulos on CpG-ODN kautta antoa tiettyä reittiä voi riippua tyypin solut, jotka kohtaamat ODN tietyn anatomisen [29]. Reagoivat solut imusolmukkeiden tyhjennystä pistoskohdan voi aktivoida eri koulutusjakson TLR9 signalointi kuin solut pernassa. Suostumuksella tämän hypoteesin ovat havainnot, jotka sisäisen kasvaimen [25], P. T. [26], [30] tai sisäistä lymfaattinen [31] antamisen CpG osoitti ennakoidun Th1 edistävää vaikutusta ja ne olivat erittäin tehokas parantamaan T-soluvälitteinen immuniteetti. Sitä vastoin systeeminen (i.v. tai i.p.) soveltamista CpG johti T-solujen suppression sijaan immuuniaktivaatiota [32], [33], [34]. Samanlaisia ​​merkkejä tuli ihmisten tutkimuksissa, joissa s.c. hallintojen antigeenin plus CpG indusoi systeemistä Th1-kaltainen sytokiiniekspressiota seerumissa, kun taas suonensisäisiä injektioita ei aiheuttanut tällaisia ​​vaikutuksia [35].

Tässä osoitamme, että DC otettu kasvain-kuivaava imusolmuke jälkeen i.v. CpG altistuminen ovat sisäistäneet optimaalinen taso antigeenin ja epäonnistuu ilmaisemaan korkeita kostimulatorisia molekyylejä. Tämä voi johtua siitä, ettei tuleva DC hintoihin tai siirtää antigeeni kun aiemman kohtaaminen CpG. Koska sekä asukas DC ja vaeltavat DC tarvitaan induktioon tuottava CTL- [36] Tämä voi rajoittaa induktio toiminnallisten CTL. Lisäksi se oli aiemmin osoittaneet, että i.v. anto indusoi ilmentymistä indoleamine 2,3-dioksigenaasin (IDO) DC, entsyymi-immuuni sääntelyä ja säätelijä-T-solujen (Treg), mikä vaimentaa T-solujen laajentamiseen ja CTL-aktiivisuuden. Vaikka emme tutkia immunosäätelyvaikutuksia ominaisuudet DC suoraan, havaitsimme huomattavasti määrä CD4

+ Foxp3

+ Treg pernassa hoidettujen hiirien i.v. CpG-(tuloksia ei ole esitetty). Treg vaikeuttaa induktion antitumor immuunivasteiden ja tiedetään säädellään useita mekanismeja, [37]. Havaittu optimaalinen DC: n kypsymistä kasvaimen imusolmukkeiden yhdistettynä induktion IDO-ilmentävien DC pernassa seuraavat i.v. CpG anto voi estää optimaalisen immuuniaktivaatiota.

Tämä tutkimus korostaa, että syövän immunoterapiassa CpG tulee antaa lähelle vapautuneesta kasvaimen antigeenejä. Kliinisissä tutkimuksissa CpG annetaan yleensä riippumaton vasta kasvaimen antigeeni-julkaisu [38]. Eräästä kliinisestä näkökulmasta on edullista antaa CpG at helppo saatavilla ja suurina määrinä perusteiden mukaisesti, että se matkustaa kasvaimen sijainti. Kuitenkin osoitamme tässä, että kumpikaan s.c. hallinto kaukaiselle päällä tai i.v. injektio hyödyntää täysimääräisesti adjuvanttia kapasiteetti CpG. Mukaisesti tuloksemme osoittavat, että kolokalisaation antigeenin ja CpG suosii immuniteetti, voimakas immuuni stimuloiva vasteet CpG havaittiin myös ihmisillä, jolloin antigeeni (rekombinantti hepatiitti B pinta-antigeenin) ja CpG (CPG 7909) olivat yhdessä pistetään [39]