Krooninen sairaus

tiivistelmä

kasvaimien syntyyn liittyy muutoksia DNA metylaatiokuvion. Tavoitteena oli testata uusi lähestymistapa tunnistamiseen-kopioita koko transkripti tasolle, joka säätelee DNA: n metylaatio. Lähestymistapamme perustuu vertailuun saatujen tietojen transcriptome profilointi ensisijainen ihmisen näytteitä ja in vitro soluviljelymalleissa. Epiteelisolujen kerättiin LCM normaalista, adenooma, ja tumorous paksusuolen näytteitä. Geenien ilmentymisen analyysi, olemme määritelleet vaimentua geenien kasvaimia verrattuna normaaleihin kudoksiin. Samanaikaisesti 3000 voimistunut geenit määritettiin HT-29 paksunsuolen adenokarsinooma soluviljelymalli jälkeen DNA demetylaation hoidon. Ja 2533 transkriptien osoittaa alentunut ilmentyminen tumorous näytteissä, 154 oli kasvanut ilmentyminen seurauksena DNA demetylaatio hoitoon. Noin 2/3 näistä geeneistä oli vähentynyt ilmentyminen jo adenooma näytteissä. Expression of viisi geeniä (

GCG

,

NMES-1

,

LRMP

,

FAM161B

ja

PTGDR

), validoitiin käyttämällä RT-PCR: ää.

PTGDR

osoitti epäselviä tuloksia, ja siksi tutkittiin edelleen tarkistaa määrin DNA: n metylaation ja sen vaikutus proteiinien tasolla. Tulokset vahvistivat, että lähestymistapamme on sopiva genominlaajuisten seulonta geenejä, jotka säätelevät tai inaktivoituvat DNA: n metylaatio. Aktiivisuus näistä geeneistä mahdollisesti häiritsee syövän etenemiseen, siis geenien tunnistettu voi olla avaintekijöitä muodostumiseen ja taudin etenemistä.

Citation: Spisák S, Kalmár A, Galamb O, Wichmann B, Sipos F , Peterfia B, et ai. (2012) Genome Wide seulonta säätelemät geenit DNA Metylointi Colon Cancer Development. PLoS ONE 7 (10): e46215. doi: 10,1371 /journal.pone.0046215

Toimittaja: Carmen J. Marsit, Dartmouth Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 28 elokuu 2012; Julkaistu: 01 lokakuu 2012

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee kansallisen toimiston Research and Technology, Unkari (TECH_08-A1 /2-2008- 0114 avustus), jonka Unkarin kansallisen Innovation Office ja Tanskan National Research Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

muutokset geeni-ilmentymisen, mukaan lukien aktivoituminen onkogeenien ja inaktivaation tuumorisuppressoreilla, ovat vastuussa muodostumista ja kehittymistä peräsuolen syöpä (CRC) [1], [2]. Rinnalla kertyvät muutoksia DNA-sekvenssissä, toimintahäiriön epigeneettisenä säätöjärjestelmä voi myös johtaa poikkeavaan muodostumista paksusuolen epiteelin pitkin etenevä prosessi syövän [3], [4]. On kuitenkin epäselvää, mitkä molekyylitason tapahtumien vaikutusta yksittäisen geenin toimintaan ja onko se on suora tai epäsuora vaikutus [5], [6], [7].

Yksi epigeneettiset prosessit vaikuttavat geenien ilmentyminen on DNA: n metylaatio, post-Replikoitumattoman DNA muutos, joka tapahtuu pääasiassa genomissa alueilla runsaasti CG dinukleotideissä ns CpG-saarekkeiden [8]. Muuttaminen emäksiä lisäämällä metyyliryhmä voi fyysisesti inhiboivat transkriptiotekijöiden, ja sallii myös rekrytointi metyyli-CpG-sitovan domeenin proteiinit (esim .: MDB1-3, MeCP2) ja promoottorialueita, jotka voidaan torjua transkription aloituskohdan [ ,,,0],9]. Poikkeava muutokset kudosspesifisesta metylaatiokuvion usein ilmenee kahdella tavalla: (i) maailmanlaajuinen hypometylaatio, joka esiintyy koko genomin ikääntymiseen, ja (ii) paikalliset hypermetylaatiota 5 ’säätelyalueiden kasvainten synnyssä, mikä johtaa yleensä vähentynyt tai lopettanut transkriptionaalinen aktiivisuus altistunutta geenien [10], [11], [12]. Hypermetylaation välittämien muutosten geenisäätelyn avainasemassa kehityksen aikana useita kasvaimen tyypit, mukaan lukien peräsuolen syöpä, ja osoittavat myös kasvainta-tietty kuvio. [13]

On hyvin tunnettua, että DNA: n metylaatio vaikuttaa geenin toimintaan muuttamatta DNA-sekvenssin itse, ja voi palauttaa demetyloimalla aineita, jotka vaikuttavat estämällä DNA: n metylaatio, kuten 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa). Tämä antaa teoreettinen mahdollisuus hidastaa tai pidättämään kasvainten kehittymistä tapauksessa varhaiseen havaitsemiseen. Kuitenkin ymmärtää paremmin DNA: n metylaation prosesseja, ja mahdollisuudesta käyttää kolorektaalisyövän erityisiä metylaation biomarkkerit seulomiseksi potilaille, tai jopa saavuttaa geenin kohdistetun demetylaatio tulevaisuudessa, kyseinen geenit täytyy tunnistaa. Vaikka useat metylaatio geenien on raportoitu liittyvän syöpään (mukaan lukien peräsuolen syöpä) kehittäminen, yksityiskohtainen prosessi on edelleen epäselvä [14], [15], [16], [17], [18], [19] .

Vaikka monet strategiat ovat saatavilla arvioimiseksi DNA: n metylaatio on koko genomin tasolla, mukaan lukien sekvensointi [20], [21] ja ryhmätallennuslaitteiden [22], [23], nämä lähestymistavat voi olla riittävä vain siinä tapauksessa, kudoksia tai soluviljelmät, josta suhteellisen suuri määrä lähtöainetta (genominen DNA) voidaan saada, kuten erilaisia ​​solutyyppejä ovat eri metylaation [24], [25], [26]. Laser capture mikrodissektion (LCM) voi toimia riittävän solu erottava menetelmä [27]. Kuitenkin rajallinen määrä kerättävissä näytteen tulokset haastava haitta tapauksessa metylaation tutkimuksia, koska tällä hetkellä saatavilla in vitro amplifiointitekniikkoja voi säästää metylaatiokuvion. Sen sijaan geeniekspressiota voidaan analysoida rutiininomaisesti laser microdissected soluja, jotka voidaan yhdistää mikrosiruanalyysi kerätä tietoa jopa yhdestä solun koko genomin tasolla.

Tässä artikkelissa esittelemme geeniekspression perustuva lähestymistapa, joka soveltuu tehokasta, suurikapasiteettisten, genominlaajuisten seulonta metylaation geenien, jonka suhteellinen ilmentyminen voi liittyä syövän etenemisessä. Mahdollisuuksia tämän menetelmän osoitettiin aikaisemmin kartoittamalla 17 selostukset jotka vaimentua aikana peräsuolen syövän etenemisen, ja osoittivat lisääntynyttä aktiivisuutta HT-29 peräsuolen syöpäsolujen jälkeen 5-atsa hoito [28]. Laajentaminen edellisessä tutkimuksessa me raportoimme tässä 154 geenejä, jotka todennäköisesti estävät metylaatio etenemisen aikana peräsuolen syöpä. Luotettavuus Menetelmän tukee monenlaisia ​​kokeellisia ja

in silico

menetelmiä esitellään tässä asiakirjassa. Expression useita transkriptien validoitiin RT-PCR: llä. Olemme osoittaneet suhdetta geenien ilmentymistä ja metylaatiostatuksen tapauksessa

PTGDR

-geenin RT-PCR-analyysillä, immunohistokemia, bisulfiitti sekvensointi, ja HRM analyysi. PCA analyysit normaali, adenooma, ja CRC-otokset voitaisiin menestyksekkäästi erottaa, perustuu ekspressiokuvioita näiden 154 selostukset, sekä omassa näytejoukolla ja riippumattomissa näytejoukoilla saatu GEO tietokannasta.

Tulokset

mikrosirut LCM Tissue Näytteet ja HT-29 Cells

hypermetylaatiota useiden genomisten alueiden aiemmin todistettu olevan yhteydessä syövän syntyyn. Koska metylaation CpG-saarekkeen (t) on geenin promoottorialue voi vähentää geenin transkription, etsittiin geenien vähenee ilmentymistä ihmisen paksusuolen kasvaimen näytteitä verrattuna normaaleihin paksusuolen epiteelin kudoksia. Expression muutokset Tuumorinäytteissä voi johtua erilaisista molekyylitason tapahtumia, kuten suorat ja epäsuorat vaikutukset mutaatioiden [29], [30], [31]. Kuitenkin muutokset ekspressiokuviota havaittu demetyloiduksi soluviljelymalli voi ennustaa, mitkä geenit säätelevät DNA: n metylaatio (kuvio 1). Geenien ilmentyminen kudosnäytteistä tutkittiin HGU133 Plus2.0 mikrosiruja, ja saadut tiedot analysoitiin SAM (merkitys analyysi mikrosirut) algoritmia. Noin 2000 selostukset, joka kuuluu noin 2500 koetinsarjojen, tunnistettiin joka oli vähentynyt ilmentyminen kasvaimen näytteistä (taulukko S1).

Geenit jotka inaktivoituvat hypermetylaation voidaan aktivoida poistamalla metyyli ryhmien sekä CpG-saarekkeiden niiden promoottorialueiden, joka voidaan saada kasvattamalla soluja, kun läsnä on DNA-metyylitransferaasi -estäjä 5-atsa-2′-deoksisytidiini. Geeni-ilmentymisen tasoa 5-atsa-käsiteltyjen ja ei-käsiteltyjen HT-29 koolonin adenokarsinoomasoluja verrattiin. Koska 5-atsa hoito aiheuttaa annosriippuvaista soluproliferaation inhibointi [32], [33], [34], MTT määrityksiä käytetään optimoimaan hoitoon pitoisuus. Tulosten perusteella 10 uM 5-atsa sovellettiin demetylaation hoidossa HT-29-soluja. Koska 5-atsa kohtelu ei aktivoida geenejä täysin, me pidetään alkuun 3000 koetinsarjojen jolla on korkein log

2fc arvot merkitsevyystasolla p 0,025 voidaan mahdollisesti voimistuvan. Niistä noin 2000 selostukset, jotka osoittivat alentunut transkriptio paksusuolessa kasvaimissa, 154 geenejä havaittiin joka kohonneen ilmentymisen 5-atsa-käsitellyn HT-29-soluihin käyttämällä edellä mainitut kriteerit. Perusteella mikrosiruanalyysi nämä ovat kandidaattigeenit jotka todennäköisesti vaiennetaan peräsuolen kasvainten DNA hypermetylaation joko suoraan tai välillisesti (taulukko S2). Mielenkiintoista, 108 154 selostukset olivat merkittävästi alentuneet jo adenooma näytteissä (kuvio S1) (taulukko S3). Promoottorialue ennustus suoritettiin käyttäen EMBOSS CpG Plot työkaluja. Perusteella tulosennusteita ja analyysien julkisten riippumattomien microarray data, 6 selostukset valittiin lisäanalyysiä. Nämä selostukset kuuluvat

GCG

(glukagoni),

NMES-1

(normaali ruokatorven limakalvon erityisiä 1, jota kutsutaan myös

C15orf48

),

LRMP

(lymfoidispesifiset rajoitettu kalvo proteiini),

FAM161B

(perheen kanssa sekvenssin samankaltaisuus 161, jäsen B), ja

PTGDR

(prostaglandiini D2-reseptorin) geenejä, jotka myös osoittivat differentiaalikaavojen meidän edellinen pilottitutkimus [35], mutta niitä ei ole liitetty CRC ennen, ja

CDKN2B

, tunnettu tuumorisuppressorigeeniä. Kuvio 2 esittää ekspressiokuvioita Tästä 6 geenien meidän LCM aineistoja. Heatmap osoittaa suhteellisen korkea geenin ilmentymistä asetettu normaaleissa kudoksissa, joka pienenee karsinogeneesissä.

Expression of tuumorisuppressorigeenin

CDKN2B

on esitetty vertailun vuoksi. Probe asettaa tunnistekoodit ja geeni nimet osoitettu oikealla. Kuusi saraketta osoittavat microarray saadut tulokset kuusi yksittäistä näytettä kunkin kudoksiin. Musta neliö osoittaa, että geenien ilmentyminen oli ennallaan koetta. Aste intensiteetti punainen tai vihreä ilmaisee geeni-ilmentymisen korkea tai matala, vastaavasti.

RT-PCR Validation Analyysit

mikrosiru analysoi transkriptio kaikkien näiden geenien estyi kasvaimen näytteissä, mutta osoittivat eriasteista heterogeenisyys adenooma näytteissä (kuvio 2). Lisäksi nämä geenit otettiin uudelleen eri tahtiin seurauksena 5-atsa hoidon HT-29-soluja. Vuonna mikrosiruanalyysi GCG, NMES-1, ja LRMP selostukset osoitti vahvaa vasteita ( 2,5-kertainen), kun taas FAM161B ja PTGDR mRNA: t osoittivat heikompaa vasteita ( 1,5-kertainen). Expression of

CDKN2B

, kuten tunnettu metylaatio säännelty tuumorisuppressorigeeniä, validoitiin RT-PCR ennen [36]. Lisäksi ilmaus viittä geenien,

GCG

,

NMES-1

,

LRMP

,

FAM161B

, ja

PTGDR

, testattiin myös itsenäinen laser microdissected paksusuolen ja myös demetyloituneiksi HT-29-solujen reaaliaikaisella PCR: llä. Käytetyn PCR-alukesekvenssit on esitetty taulukossa S4.

5-atsa käsiteltiin HT-29-soluja.

vaikutuksen tutkimiseksi demetylaation, HT-29-soluja käsiteltiin 10 uM 5- atsa ja ilmentymistason valitun geenin ryhmää tutkittiin verrattuna asetaatti-käsitelty (liuotin 5-atsa) kontrollinäytteitä (kuvio 3). Kun demetylaation,

GCG

,

NMES-1

, ja

LRMP

geenien osoitti kasvaa ilme, kun transkriptio

FAM161B

geeni ei muuttunut merkittävästi . Samanlaisia ​​tuloksia saatiin 20 uM 5-atsa hoitoon (tietoja ei esitetty).

Data-analyysi tehtiin vertailevan Cp-menetelmällä (katso materiaalit ja menetelmät). Geenit katsottiin vaimentua arvoilla alle 0,5 (50%: n lasku, vaakasuora pisteviiva), ja upregulated arvoilla yli 2 (kaksinkertainen lisäys). GAPDH: ta käytettiin kontrollina siivous geenin. Vaalea ja tummanharmaa sarakkeissa geeniekspressiotasot vuonna adenooma ja Tuumorinäytteissä suhteessa normaaliin näytteitä, vastaavasti. Haudottu sarakkeet ilmaisevat vertailu 5-atsa käsiteltyjen ja kontrolli soluja. Keskihajonnat mitatun transkriptipitoisuuksissa laskettiin ja ilmoitetaan kunkin transkriptio. Housekeeping geeni intensiteetit laskettiin keskiarvo kullekin ryhmälle.

LCM kudosnäytteitä.

RT-PCR tuloksia verrattiin normaalin paksusuolen limakalvo-adenooma ja normaalin paksusuolen limakalvo-kasvain suhteet yksittäisiä kudosnäytteitä. Nämä viisi normaalia epiteelin, viisi adenooma ja neljä kasvain näytteet olivat riippumattomia niistä käytetään mikrosiruanalyysillä. Tulokset osoittivat hyvää kanssa mikrosiruanalyysi,

GCG

,

NMES-1

, ja

FAM161B

geenit vaimentua sekä adenooma ja kasvain näytteet, kun taas

LRMP

oli vähentynyt ilmentyminen vain kasvainnäytteet (kuvio 3).

PTGDR

ilmaisu osoitti epäselvä tuloksia RT-PCR-kokeita. Se ei osoittanut voimakasta vastetta varten 10 uM 5-atsa hoitoa, mutta oli noin 1,7-kertainen ilme, kun soluja käsiteltiin 20 uM 5-atsa. Myös PTGDR RNA tasot osoitti heterogeenisuus kudosnäytteistä (kuvio 4A), siksi suoritimme edelleen analysoi paljastaa taustan näistä havainnoista. Expression arvot 215894_at PTGDR koetin asetetaan testattiin riippumaton GEO sarjaa (kuvio 4 B, C). Näiden riippumaton näytteen sarjaa, vähentynyt PTGDR mRNA-tasot löydettiin jo adenooma näytteet, jotka edelleen vähentynyt CRC näytteissä.

Reaaliaikainen PCR: llä ja data-analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Geenit katsottiin vaimentua arvoilla alle 0,5 (50%: n lasku, vaakasuora katkoviiva) (A) Expression arvo jakautuminen 215894_at probeset (varten

PTGDR

geeni) on GSE8671 (B) ja GSE18105 ( C) GEO aineistoja. P-arvot: Normaali vs. adenooma P = 0.000712; CRC vs. Normaali P = 0.0003797; LCM CRC vs. Normaali P = 0.0000004; LCM CRC vs. CRC P = 0,834.

bisulfiittimodifiointi-PCR ja HRM (High Resolution sulaminen) Analysis

Jos haluat varmistaa, että sääntely alue

PTGDR

on todellakin hypermetyloitunut, suoritimme bisulfiitti-PCR ja korkean resoluution sulava analyysi genomisen DNA [37]. Standardi laimennussarjaa käytettiin testaamaan herkkyyttä meidän HRM määrityksiä. Mukaan normalisoitu sulamiskäyriin meidän määritys pystyi havaitsemaan 2% metyloitua DNA: 98% metyloimaton tausta. Metylointi prosenttia kudosnäytteiden arvioitiin niiden normalisoitu sulamiskäyrät verrattuna standardilaimennussarja. Kaikki normaalit paksusuolen limakalvo näytteitä normalisoitu sulamiskäyrää putosi alueiden välillä rajaamaa 0% -2% vakionäytteet. Siinä tapauksessa, että kasvain näytteet, 1 näyte oli 0% -2% metylaation alue, 2 välillä 2-25% ja näytteessä oli metylaatio suhde yli 25% (kuva 5). Analyysi valitun

PTGDR

alue HT29 solulinjassa osoitti lähes 100% metylaatio. Validointi, bisulfiitti sekvensointi suoritettiin määrittämään metylaatiostatuksen tällä alueella. (Kuva S2.) B

Katkoviivat edustavat standardilaimennussarja keinotekoisesti metyloitua DNA (0%, 25%, 50%, 75% ja 100%). Kiinteä musta viiva edustaa tuloksia on saatu normaalista näytteestä. Solid harmaa viivat edustavat saatujen tulosten 5 riippumaton tumorous kudosnäytteitä. HRM analyysi voi erottaa metyloinnin normaalin ja syöpäkudoksissa perustuu eri G: C sisällöt bisulfiitti-muunnetaan promoottorisekvenssin. Promoottorialueet, jotka sisältävät enemmän metyloidun sytosiinit, joita ei voida muuntaa urasiili mukaan bisulfiittikäsittelyn, on korkeampi sulamis- lämpötila. Sulamislämpötila on verrannollinen suhde ei-muunnetun sytosiinien.

Tissue Microarray Analysis, PTGDR immunohistokemia

prostaglandiini D2-reseptorin tutkittiin edelleen immunohistokemiallisesti käyttämällä TMA liukuu määrittämiseksi vaikutus DNA: n metylaatio on proteiinin tasolla. Normaali paksusuolen limakalvon näytteet osoittivat voimakasta epiteelin sytoplasmista immunovärjäystä, joka peräkkäin vähentynyt adenooma vaiheessa lähellä luminaalipinnalla. Immunovärjäyksen intensiteetti pienennettiin edelleen etenemisen aikana ja vain kohtalainen ilme voitiin havaita kasvain näytteissä (kuvio 6 vasen paneeli). Vaikka joissakin adenooma ja tuumori- näytteiden proteiinin ekspressio havaittiin olevan samanlainen kuin mitä havaittiin normaalissa epiteelissä (kuvio S3). Johdattelevasti PTGDR proteiinin ilmentymisen väheneminen havaittiin adenooma-karsinooma sekvenssin etenemisen (kuvio 6 oikea paneeli).

Normaalissa näytteissä (ylhäällä), pääasiassa vahva, diffuusia sytoplasmista värjäytymistä havaittiin, mikä kohtalaisesti vähentynyt adenooma näytettä (keskellä), ja vain heikko sytoplasmista värjäytymistä havaittiin kolorektaalisyövässä näytteistä (alhaalla). Oikeassa paneelissa näkyy yhdistyksen tontteja jotka edustavat tendenssimäisesti laskussa PTGDR proteiinin ilmentymisen pitkin adenooma karsinooma järjestyksessä. Mitata yhdistyksen kaksi muuttujaa (ilmaisun ja tauti vaihe), Chi-square testillä. Korkeus (ja värisyvyys) laatikoista on verrannollinen eroa havaitun ja odotetun taajuuden tulokset. Alaspäin punaisia ​​laatikoita osoittavat, että havaittu taajuus on odotettua alhaisempi. Ylöspäin, sinisiä esineitä edustaa päinvastaista. PTGDR Immunovärjäyksen tulokset:

–

2 = ei värjäystä; 0 = heikko värjäystä; 1 = kohtalainen värjäytyminen; 2 = vahva hajanainen epiteelin sytoplasmista immunovärjäystä.

testaaminen Metylointi geenien Independent Sample /ilmaisun sarjat PCA

testaamiseksi erottelukykyä 154 valittujen geenien jotka todennäköisesti säädellään metylaatio aikana karsinogeneesin olemme testanneet ne kaksi itsenäistä näytesarjan päässä Gene Expression Omnibus (GEO) julkinen microarray arkisto. Yksi näytteen sarjaa, GSE8671 [38], on normaali ja adenooma, ja toinen, GSE18105 [39], normaali ja kasvainnäytteet. Jälkimmäinen näyte sarja sopii erityisesti validointi, koska se sisältää sekä homogenisoitiin ja LCM kasvain näytteissä. Toiminta kaikista 154 geenit listalta verrattiin tavallisella ulottuvuus vähentäminen menetelmä, pääkomponenttianalyysi (PCA) [40], joka muuttaa monimuuttuja log

2-ilmentymisen tiedot 2 mitat. PCA valitsee suuntiin suurin varianssi sitten pyörii ja projisoi data tähän tilaan. Laskimme muunnosmatriisi käyttämällä 6 normaalia ja 6 LCM CRC näytettä (adenooma näytteitä ei käytetä laskennassa muunnosmatriisi) ja käyttää tuloksena muunnosmatriisi hankkeen kaikki näytteet tilaan virittämä ensimmäisen 2 pääkomponentit . Ensimmäiset kaksi komponenttia sisältävät 81% kumulatiivisesta kokonaismäärästä varianssi; joten voidaan odottaa niitä uskollisesti edustaa monimuuttujatestauksen jakeluun. Kuvio 7A osoittaa, että normaali ja LCM CRC näytteet ovat selvästi erillään, ja kun kasvain näytteet heijastetaan PCA tilaan, ne sijaitsevat normaalin ja CRC näytteitä, tukee oletusta, että adenooman on siirtymävaiheessa välillä normaalin ja CRC faaseissa [2], [41]. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin käyttämällä vain kuusi geeniä listattu kuviossa 2 (tuloksia ei ole esitetty). Syrjivyys sammuttaa valitun 154 geenit oli edelleen validoitu käyttäen aiemmin julkaistu aineistoja. PCA projektio jota laskettiin yksinomaan meidän LCM CRC ja normaali näytteet voisi myös täysin erillään normaalista ja adenooma osajoukkoja GSE8671 tutkimus (katso kuva 7C). Muiden GEO aineisto, GSE18105, erottaminen on lähes täydellinen sekä homogenoitu CRC ja LCM CRC näytteitä, vain yksi piste, merkitty nuolella kuvassa 7B on luokitellut väärin. Syyn selvittämiseksi luokitteluvirheen Euclidean etäisyyden analyysi suoritettiin, joissa tässä näyte osoittautunut harha (Täydennyskuvio S4).

pääkomponentit laskettiin log

2-ilmentymisen arvoja 154 valitut koetin sarjat normaali-CRC näytteitä meidän LCM asettaa, ja sitten kaikki 3 sarjaa heijastettiin osaksi pääkomponenttina koordinaattiavaruuden. Huomaa, että tämä menetelmä voidaan pitää valvomattoman luokitusta, koska emme käyttäneet nimenomaisesti luokkiin datan analysoinnin. Kuvio 7A osoittaa, että PC muunnos erottaa hyvin normaalia ja LCM CRC näytteitä ja asettaa adenooma näytteet normaalin ja CRC näytteitä. Validoida lista mahdollisista markkerigeeni, me muuttaneet tietojen kahden muun riippumattomia tutkimuksia samaan tietokoneeseen koordinaatit. Molemmat tutkimukset Gene Expression Omnibus mikrosirujen arkisto olivat GSE18105 normaali, CRC ja LCM CRC näytteitä ja GSE8671 normaali ja adenooma näytteitä. Sekä asettaa erottaminen luokkien on hyvä lukuun ottamatta yhtä harha pisteen B merkitty nuolella (katso keskustelu tekstissä).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa esittelemme novel high-throughput seulonta valinnan geenin ryhmän, jonka muuttunutta geeniekspressiota, koska poikkeava DNA-metylaatio voidaan liittyvät syöpään. Toiminta sellaisista geeneistä voivat estää syövän etenemistä, joten niiden tunnistaminen voisi parantaa määrittämisen ennustetta.

Edellisessä työssä olemme kehittäneet kokeellisen järjestelmän tunnistamiseksi metylaation geenien perustuu tarkasteluun geeniekspressiotasot kliinisissä LCM näytteistä ja 5-atsa käsitelty HT-29-soluja. 110 selostukset osoittivat vähentynyttä ilmentymistä kasvaimen kehityksen ja 71 ilmen- tymisen lisääntymisen transkriptit havaittiin ja tuloksena 5-atsa hoitoon. 17 selostukset kuului molempiin ryhmiin, ja nämä selostukset oletettiin säännellään DNA: n metylaatio [28].

Tässä työssä paljon laajempaa analyysiä strategiaa käytettiin, jolloin tunnistaminen 2533 vaimentua selostukset aikana kasvainten kehittymiseen ja 3000 ilmen- tymisen lisääntymisen transkriptien seurauksena 5-atsa hoitoon HT-29-solut (kuvio 1). Metylointi liittyvät 154 transkriptit olivat läsnä molemmissa ryhmissä, eli oli vähentynyt ilmentyminen kasvaimissa verrattuna normaaleihin paksusuolen limakalvon soluja ja osoittivat lisääntynyttä toimintaa sen jälkeen, demetylaation hoitoon HT-29 paksusuolen syöpäsoluja. Siksi nämä selostukset ovat todennäköisesti estävät metylaatio, suoraan tai välillisesti etenemisen aikana peräsuolen syöpä. Voimassaolo tämän luettelon tukee (i) läsnäolo monien geenien joista on aiemmin saatu vaimentua kolorektaalisyövässä (esim

cHga

,

FCGBP

,

GSN

,

LPP

,

MYH11

,

PLCG2

,

SST

,

NBL1

) [42], [43], (ii) että siinä on useita tunnettuja tuumorisuppressorigeeneille (esim

CDKN2B

,

MTUS1

,

RASSF6

,

PDCD4

,

KLF5

,

CDS1

), ja (iii) tulosten pääkomponenttina analyysit suoritettiin aiemmin julkaistu aineistoja. On olemassa erilaisia ​​geneettisiä ja epigeneettisiä tekijöitä, jotka voivat osaltaan laski geenien ilmentymistä kasvainsoluissa. Olimme kiinnostuneita geenejä, jotka voidaan hiljentää DNA: n metylaatio. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että monet geenit ovat inaktivoitu kolorektaalisyövässä solulinjoissa, mutta on olemassa suuria eroja eri solulinjojen [16], [17], mikä viittaa siihen, että kaikki inaktivoidut geenit liittyvät kasvaimien syntyyn. Mukaan meidän hypoteesin, aktiivisuutta useiden geenien tunnistaa lähestymistapamme voivat häiritä syövän etenemiseen. Tätä hypoteesia tukee läsnäolo sykliiniriippuvaisen kinaasi-inhibiittori 2B (

CDKN2B

) ja 2C (

CDKN2C

) tuumorisuppressorigeeneille yksilöidyllä geenin asetettu.

CDKN2B

geeni sijaitsee kromosomissa 9p21 lokus, jossa deleetioita esiintyy usein monissa ihmisen primaaristen kasvainten, mukaan lukien ruokatorven karsinooma [44] ja peräsuolen syövän [45].

CDKN2B

, joka vaimentua meidän adenooma ja peräsuolen kasvain näytteet myös vaiennetaan DNA: n metylaation erilaisia ​​hematologisia syöpäsairauksia [46].

CDKN2C

aikaisemmin raportoitu inaktivoituu promoottori hypermetylaation Reed-Sternberg-solujen Hodgkinin lymfooman, ja menetys CDKN2C osoittivat negatiivista korrelaatiota eloonjäämisaste potilaiden [47]. Retiinihapporeseptorin responder 1 (

RARRES1

) on myös tuumorisuppressorigeenin. Sen ilme on usein vaimentua kautta DNA hypermetylaation useaan eri pahanlaatuinen kudosten. Downregulation

RARRES1

ehdotettiin liittyvän vaiheessa D etenemistä paksusuolisyövän [48]. Ali useita muita geenejä, jonka tunnuksena on lähestymistapamme, oli aiemmin kuvattu liittyvän paksusuolen syöpään. Esimerkiksi metyyli-CpG sitovan domeenin proteiinia, MBD4, joka on mukana yhteensopimattomuuden korjausjärjestelmä on CpG sivustoja, vaikuttaa lukukehysmutaatioita yli 40% microsatellite epävakaa satunnaista paksusuolen syövistä [49]. Ihmisen polimeric immunoglobuliini-reseptorin (PIGR) havaittiin ali-ilmentynyt paksusuolen kasvaimia ja myös paksusuolen kasvainten solulinjoissa [50]. Samanlainen kuin meidän tuloksia, Efriini-A5-geenin (

EFNA5

) raportoitiin myös ennen kuin vaimentua geeni paksusuolen syöpä [51]. Ilmaus POU domain luokan 2 transkriptiotekijä 3 (POU2F3) oli vähentynyt adenooma ja tumorous paksusuolen epiteelin. CpG saaret

POU2F3

säätelyalueen ovat usein poikkeuksellisesti metyloitu kohdunkaulan syövän [52].

arvioimiseksi tarkkuutta lähestymistapamme, mittasimme ilmentymistä viisi geeniä RT-PCR: llä itsenäinen kudosnäytteitä. Nämä geenit havaittiin myös edellisessä pilottitutkimuksessa mutta niitä ei ole liitetty CRC ennen. Tapauksessa kaksi geeniä,

GCG

ja

NMES-1

, merkittävä väheneminen havaittiin geeniekspression jo adenooma vaiheessa. Molemmat geenit osoittivat vahvan uudelleenaktivointi seurauksena on demetylaatio hoidon HT-29-soluja, mikä viittaa siihen, että nämä geenit inaktivoidaan promoottorin hypermetylaatio.

NMES-1

geenin (myös nimetty

C15orf48

) ilmaistaan ​​pitkin tervettä ruoansulatuskanavassa ja se on usein vaimentua ruokatorven okasolusyöpää [53]. Poikkeava metylaatio

NMES-1

promoottorialueen havaittiin myös invasiivisen kohdunkaulan syövän (ICC), mutta ei normaalissa kohdunkaulan näytteissä [54]. Proteiini, jota koodaa glukagonin (GCG) geeni on preproproteiinia, joka pilkkoutuu neljään eri kypsä peptidejä. Nämä peptidit ovat mukana ylläpitää ravinteiden homeostaasiin, ja ovat sääntelyviranomaisten solujen lisääntymisen, erilaistumisen, ja apoptoosin [55].

FAM161B

on ennustettu geeni, jonka panos karsinogeneesi ei ole raportoitu vielä. Se on ali-ilmentynyt molemmissa vaiheissa kokeissa, mutta se ei osoittanut merkittävää aktivointia seurauksena 5-atsa hoitoon.

prostaglandiini D2-reseptorin (

PTGDR

) geeni sijaitsee että prostaglandiinireseptorin klusterin. Aikaisemmissa tutkimuksissa metylaatiostatuksen

PTGDR

havaittiin korreloivan käänteisesti sen ilmentymistä neuroblastooma solulinjoissa [56]. Meidän mikrosirujen tulokset ehdottivat, että PTGDR mRNA taso laskee pitkin adenooma-karsinooma järjestyksessä keskimäärin. Kuitenkin analyysi PTGDR mRNA tasolla RT-PCR ja PTGDR proteiinin taso immunohistokemiallisesti yksittäisissä kudosnäytteistä osoitti heterogeenisyys. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin analysoimalla aiemmin julkaistu GSE8671 ja GSE18105 geenien ilmentyminen aineistoja (kuvio 4). HRM määritys havainnut eri CpG metylaatio PTGDR promoottorialue yksittäisissä paksusuolisyövän näytteitä. Nämä havainnot viittaavat siihen, että

PTGDR

geeni vaiennetaan DNA hypermetylaation kehittämisen aikana tiettyjen Kolorektaalituumorien. Kuitenkin se tarvitsee lisätutkimuksia siitä PTGDR hiljentäminen näkyy korrelaatio taudin ennusteen.

microarray data yhdessä validointi tulokset viittaavat siihen, että DNA: n metylaatio osittain inaktivoi tiettyjen geenien jo varhaisessa adenooma vaiheessa. Tämä havainto voi olla tärkeitä tulevaisuudessa, koska sen jälkeen varhainen havaitseminen kolorektaalisyövän, geenispesifiseen hoitoja tai kohdennettuja geeniaktivaatioon menetelmät voivat olla asiaa tärkeänä. Mielenkiintoista, geenit, jotka ovat vaimentua siinä adenooma vaiheessa eivät aina näytä asteittain vähenevästi toimintaa pitkin adenooma-karsinooma järjestyksessä, eli ne on ilmaistu alemmalla tasolla adenooma kuin kasvain näytteissä. Lisäksi havaitsimme suurempi tasaisuus adenooma näytteistä kuin peräsuolen syövän näytteitä PCA analyysit geenien ilmentyminen tietojen sarjaa (Kuva 7C ​​vs 7B). Tämä havainto viittaa siihen, että tiettyjen geenien, joita tarvitaan inaktivoitua varten adenooma muodostumista uudelleen kasvaimen. On helpompi saada tällaisia ​​malleja geenien aktiivisuuden palautuva epigeneettisellä asetuksella kuin mutaatioita. Metylointi-säätelyyn voi vaikuttaa noin 60% ihmisen promoottorien [11], ja mahdollistaa hienosäätöä geenien toiminnan optimaalisen yhdistelmän ilmaisun. Tämä optimaalinen yhdistelmä voi riippua useista tekijöistä ja voi muuttua aikana syövän etenemiseen. Kuitenkin, koska rajallinen määrä näytteitä tässä työssä, tarvitaan lisätutkimuksia tarkistaa tätä päätelmää.

alassäätely monien geenien tunnistaa lähestymistapamme liittyy kasvaimien syntyyn. Kuitenkin lisätutkimuksia tarvitaan vastaamaan onko joukko underexpresed geenejä esitetään tässä tutkimuksessa on nimenomaan peräsuolen syöpä. Soveltamalla lähestymistapamme muihin kasvainmuodoista mahdollistaisi tutkinta kasvainspesifisyyden hypermetylaation välittämän geenin toiminnan malleja.

Materiaalit ja menetelmät

Näytteenotto

Tissue näytteestä saatujen kirurgisesti poistaa paksusuolen kudokset olivat snap-jäädytetty nestemäisessä typessä ja varastoidaan -80 ° C: ssa käyttöön asti.