Krooninen sairaus

tiivistelmä

pyritään tutkimaan kliinistä merkitystä ilmaisun uusien tukirakenteen proteiinin CARMA3 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja biologisen toiminnan CARMA3 NSCLC solulinjoissa. Havaitsimme kohtalaisesta suureen CARMA3 värjäystä 68,8% 141 NSCLC yksilöitä verrattuna vastaaviin normaaleissa kudoksissa. Yli-ilmentyminen CARMA3 korreloi merkitsevästi TNM (P = 0,022) ja kasvaimen tila (P = 0,013). CARMA3 ylössäätely korreloi myös lyhyempi eloonjäämisaste potilaiden imusolmukestatuksesta N0 (P = 0,042) sekä ilmentymisen epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) (P = 0,009). EGFR mutaatio positiivisia tapauksia, CARMA3 ilme oli paljon korkeampi (87,5%) verrattuna ei-mutaation tapauksessa (66,1%). Lisäksi havaitsimme, että knockdovvn CARMA3 estää kasvainsoluproliferaation ja invaasio, ja indusoi solusyklin pysähtymisen välisen rajan G1 ja S-vaiheessa. Olemme lisäksi osoittaneet suoran yhteyden CARMA3 ja NF-KB: n aktivoitumisen. Muutos biologista käyttäytymistä CARMA3 pudotus solut voivat olla NF-KB-sukua. Meidän havainnot osoittivat, ensimmäistä kertaa, että CARMA3 yliekspressoitui NSCLC ja korreloivat keuhkosyöpä etenemisen, EGFR, ja EGFR-mutaatio. CARMA3 voisi olla potentiaalinen kumppani lääke kohde, sekä NF-kB ja EGFR EGFR-mutantti keuhkosyövässä.

Citation: Li Z, Qu L, Dong Q, Huang B, Li H, Tang Z, et ai. (2012) yli-ilmentyminen CARMA3 in Non-Small-Cell Lung Cancer liittyy varten syövän etenemiseen. PLoS ONE 7 (5): e36903. doi: 10,1371 /journal.pone.0036903

Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong

vastaanotettu: 15 marraskuu 2011; Hyväksytty: 09 huhtikuu 2012; Julkaistu: May 15, 2012

Copyright: © 2012 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro 30972967) ja Research Fund tohtorikoulutuskeskukseen of Higher Education of China (nro 20092104110018). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

CARMA3 (tunnetaan myös nimellä CARD10 tai Bimp1) kuuluu CARMA perheen ja sisältää kolme jäsentä, CARMA1 (tunnetaan myös nimellä CARD11), CARMA2 (CARD14), ja CARMA3. Nämä kolme proteiinit samanlaisia ​​rakenteellisia motiiveja, sisältävät CARD verkkotunnuksen, Src-homologia 3 (SH3) domain, yksi tai useampi PDZ verkkotunnuksia, ja Guk verkkotunnuksen. Kuitenkin, niillä on selvä ilmentyminen profiilit; CARMA1 ilmentyy hematopoieettisissa soluissa, CARMA2 istukan, ja CARMA3 kaikki ei-hematopoieettisten solujen [1] – [4]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että CARMA3, tukirakenteena proteiinia, on ratkaiseva rooli GPCR-ligandien ja PKC-indusoitua NF-KB: n aktivaation [5] – [8]. Aikaisemmin on osoitettu, että NF-KB: n aktivaatio on osallisena kasvainten synnyssä ja kehityksessä hermo, sydän, ja immuunijärjestelmän sairaudet [9] – [13]. CARMA3 aktivoi NF-KB: n rekrytoimalla Bcl10 ja MALT1, kaksi välttämätöntä proteiineja, joita tarvitaan GPCR ja PKC-indusoitua NF-KB: n aktivaation [6], [14] – [16]. PKCa-CARMA3 signalointi akseli on keskeinen rooli LPA aiheuttama munasarjasyöpäsolu in vitro invaasiota [17]. Tuore tutkimus osoitti, että CARMA3 puute heikentää syövän proliferaatiota in vitro ja in vivo, ja esti selviytyminen, muuttoliike, ja hyökkäyksen ihmisen rintasyövän solulinjoissa MDA468 ja A431 [18]. CARMA3 Knockdown aiheutti huomattavan estymisen SDF-1α välittämää hyökkäys suun okasolusyöpä TB2-T4-solut [7]. Kuitenkin proteiini-ilmentymisen CARMA3 keuhkosyövän kudosten ja mahdollista roolia CARMA3 biologisen käyttäytymisen keuhkosyövän soluja ei ole tutkittu. Siten tutkimme ilmaus CARMA3 keuhkosyövässä kudoksissa ja sen suhde eri kliinis parametreja. Lisäksi arvioimme yhdistys CARMA3 ilmaisun kanssa leviämisen ja metastaattisen potentiaalin useiden NSCLC solulinjoista.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

Tämä tutkimus hyväksyttiin eettinen komitea China Medical University, ja kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan. 141 tapausta NSCLC näytteet saatiin muodossa ensimmäinen Affiliated sairaala China Medical University kaudella 2008 2011. histologiseen diagnoosiin ja arvosana erilaistumiseen kasvainten määriteltiin arviointi hematoksyliinillä ja eosiinilla värjätään kudosleikkeiden mukaan Maailman terveysjärjestön ohjeiden luokitusta. Kaikki 141 näytteet arvioitiin uudelleen suhteessa niiden histologinen alatyyppi, erilaistumista tila, ja kasvaimen vaiheissa. Sillä NSCLC näytteitä, SCC ja adenokarsinooma havaittiin 65 ja 76 141 tapauksessa vastaavasti. Imusolmukemetastaaseja havaittiin 68 141 potilasta. P-TNM taging järjestelmä International Union Against Cancer (seitsemäs painos) käytettiin luokitella yksilöjen vaiheet I (n = 64), II (n = 41), III (n = 30) ja IV (n = 6) .

Solulinjat

A549, H1299, HBE ja H460 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), LK2 saatiin japani Cancer Research Resources Bank (Tokio, Japani), SPC saatiin CCTCC (Chinese keskus Tyypillinen Culture Conserve, Wuhan, PRChina), H157 ostettiin Cell Bank, Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina), The BE1 ja LH7 olivat lahja Dr. Jie Zheng (College of Medicine, Beijing University, Kiina) kantavassa soluja viljeltiin RPMI 1640: ssä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia (Invitrogen), 100 IU /ml penisilliiniä (Sigma, St. Louis, MO , USA), ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Sigma). Soluja kasvatettiin steriileillä kudosviljelymaljoihin ja siirrostettiin joka 2 päivää käyttäen 0,25% trypsiiniä (Invitrogen).

immunohistokemia

Kirurgisesti leikattiin kasvain näytteet kiinnitettiin 10% neutraaliin formaliiniin, valettiin parafiiniin ja 4 um: n paksuisia leikkeitä valmistettiin. Immunovärjäys suoritettiin käyttämällä avidiini-biotiini-peroksidaasi-kompleksin menetelmä (Ultra Sensitive TM, Maixin, Fuzhou, Kiina). Osat poistettiin parafiini ksyleenillä, rehydratoitiin asteittai- sessa alkoholisarjassa ja keitettiin 0,01 M sitraattipuskurissa (pH 6,0) 2 minuutin ajan autoklaavissa. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin käyttämällä vetyperoksidia (0,3%), jota seurasi inkubointi vuohen normaalia seerumia voidaan vähentää ei-spesifisen sitoutumisen. Kudosleikkeet inkuboitiin CARMA3 kanin polyklonaalisella vasta-aineella (1:80 laimennos) (Sigma). Hiiren immunoglobuliini (samaan pitoisuus antigeenispesifisten vasta-aine) (Maixin, Fuzhou, Kiina) käytettiin negatiivisena kontrollina. Värjäys kaikkien primaaristen vasta-aineiden suoritettiin huoneenlämpötilassa 2 tunnin ajan. HRP-polymeeri-konjugoitu anti-hiiri-/Rabbit IgG (ready-to-use) (Maixin, Fuzhou, Kiina) käytettiin sekundaarisena vasta-aineena. Pesun jälkeen leikkeitä inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua streptavidiinia-biotiini, jota seurasi 3, 3′-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla kehittää Peroksidaasireaktio. Counterstaining jaksoissa tehtiin hematoksyliinillä, jotka sitten vesi etanolissa ennen mounting.Two riippumattomia tutkijat tutki kaikki kasvain dioja satunnaisesti. Viisi näkemyksiä tutkittiin kullekin levylle ja 100 soluja havaittiin per view 400 x suurennus. Normaali keuhkoputken epiteelin läsnä kasvainleikkeissä käytettiin negatiivisena kontrollina. Immunovärjäystä CARMA3 teki seuraavat puoliksi Paljousosuusmenetelmää arvioimalla edustavilla kasvain alueilla, intensiteetti ja solujen prosenttiosuus osoittaa korkeampi immuunivärjäystä kuin kontrolli soluja. sytoplasminen värjäys kasvainsolujen pidettiin positiivisena immunovärjäyksellä. Intensiteetti CARMA3 sytoplasmista värjäytymistä oli myös pisteytettiin 0 (ei värjäystä), 1 (heikko), 2 (merkitty). Prosenttiosuus pistemäärät määrätty 1- 1-25%, 2- 26-50% ja 3- 51-100%. Tulokset Kunkin kasvaimen näytteen kerrottiin antamaan lopullinen pistemäärä 0-6 ja koko ilmaus CARMA3 määritettiin joko negatiivisia tai heikkoa ilmentymistä (-): pisteet 3 tai positiivinen ilmaisu tai korkea lauseke (+): pisteet ≥3.

(A) Vahva CARMA3 ilmentyminen keuhkoadenokarsinooma (400 x). (B) Heikko CARMA3 ilmentyminen keuhkoadenokarsinooma (400 x). (C) Vahva CARMA3 ilmentyminen keuhkossa okasolusyöpä (400 x). (D) Heikko CARMA3 ilmentyminen keuhkossa okasolusyöpä (400 x). (E) Normaali keuhkoepiteeliverrokkiin osoittaa heikkoa värjäytymistä CARMA3 (400 x). (F) Negatiiviset kontrollit CARMA3 värjäystä ei-immuuni IgG-vasta-ainetta (400 x).

immunohistokemiallinen värjäys CARMA3 ja EGFR 2 edustavia NSCLC näytteitä. Yksi oli vahvaa ekspressiota CARMA3 (A) ja vahva EGFR (400 x) (B). Muut osoitti heikkoa ilmentymistä CARMA3 (400 x) (C) ja heikko EGFR (400 x) (D). (E, F) Korrelaatio CARMA3 ja EGFR NSCLC näytteissä EGFR-mutaatio (400 x).

Analyysi EGFR mutaatio

Parafiinisektioista 75 NSCLC yksilöille, EGFR-mutaatio analyysi saatiin First Affiliated Hospital of China Medical University vuodesta 2009 vuoteen 2011. Lyhyesti, DNA uutettiin parafinoidut kudosleikkeiden käyttäen TaKaRa DEXPAT Easy Kit (TAKARA Biotechnology, Dalian, Kiina) mukaan valmistajan protokollaa. EGFR mutaatioita todettiin käyttäen EGFR-mutaatio havaitseminen kit (GP Medical Technologies, Peking, Kiina) on 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia).

Quantitative Reaaliaikainen PCR (SYBR Green menetelmä) B

Quantitative real-time PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Green PCR master mix (Applied Biosystems) kokonaistilavuudessa 20 ui on 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) seuraavasti: 95 ° C 30 sekuntia, 40 sykliä 95 ° C 5 sekunnin ajan, 60 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Dissosiaa- vaihe suoritettiin tuottaa sulamiskäyrään vahvistaa spesifisyyden vahvistusta. β-aktiini käytettiin viite-geeniä. Suhteellisen geeni-ilmentymisen olivat edustettuina ACt = Ct-geenin -Ct viite, ja kertainen muutos geenien ilmentyminen laskettiin 2-ΔΔCt menetelmällä. Alukesekvenssit esitetään taulukossa S1, Kokeet toistettiin kolme kertaa.

Western blot -analyysi

Yhteensä proteiinien ensisijainen kudoksia ja solulinjoja uutettiin lyysipuskuriin (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) ja mittaamaan Bradfordin menetelmällä. Viisikymmentä mikrogrammaa proteiinia erotettiin SDS-PAGE (12%). Siirron jälkeen, polyvinyli- fluoridi (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, USA) inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa seuraavilla vasta-aineilla CARMA3 (1:200; Sigma), Bcl-10 ja β-aktiini (1:500 ; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-fosfo-ERK, anti-fosfo-IKK, anti-fosfo-IKB, anti-fosfo-Rb, anti-P27, anti-sykliini A, anti-sykliini D1, anti -Cyclin D3, anti-CDK4 ja anti-CDK6 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Inkuboinnin jälkeen peroksidaasiin kytkettyä anti-hiiri tai kaniinin IgG (Santa Cruz Biotechnology), 37 ° C: ssa 2 tunnin ajan, sitoutuneet proteiinit tehtiin näkyviksi käyttämällä ECL (Thermo Fisher Scientific) ja detektoitiin käyttämällä Bioimaging Systems (UVP Inc., Ontario, CA, USA). Suhteellinen proteiinin tasot laskettiin perustuen β-aktiini kuin latauskontrollina.

Sirna Treatment

Dharmacon siGENOME SMARTpool siRNA varten CARMA3, Bcl10 ja Dharmacon siGENOME Non-kohdistaminen siRNA # 1 oli ostettu Dharmacon (ThermoFisher Scientific). Transfektioihin, solut ympättiin 24-kuoppalevylle 24 tunnin ajan ennen koetta. Solut transfektoitiin siRNA: lla käyttäen DharmaFECT 4 (0,20 ul /kuoppa; ThermoFisher Scientific) mukaan valmistajan protokollaa. Transfektion jälkeen, mRNA ja proteiini-tasot arvioitiin 48 tuntia myöhemmin.

Cell Proliferation Test

Soluproliferaatiomääritys suoritettiin käyttäen Cell Counting Kit-8® liuosta (Dojindo, Gaithersburg, MD) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, solut ympättiin pitoisuutena 5 x 10

3 solua /100 ul /kuoppa 96-kuoppaisille viljelylevyille ja käsiteltiin 10 ul /kuoppa Cell Counting Kit-8® ratkaisu viime 4 tuntia kulttuuri. Optinen tiheys kuopista mitattiin 450 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa.

Colony muodostumisen määritys

pesäkemuodostusta määrityksiä, soluja kasvatettiin 6 cm: n maljoihin tiheydellä 5000 solua /malja , ja transfektoitu CARMA3, Bcl10 tai negatiivinen kontrolli siRNA. Pesäkkeet, pestiin kahdesti PBS: llä, kiinnitettiin ja värjättiin formaldehydiä kristallivioletilla 13-15 päivä transfektion jälkeen. Kaikki kokeet itsenäisesti toistettiin vähintään kolme kertaa samanlaisissa olosuhteissa.

(A) Western blot -analyysi CARMA3 ilmentymisen keuhkosyöpä transfektoitujen solujen siRNA. (B) Suhteellinen CARMA3 ilmentymisen profiilit paneelin ihmisen hengitysteissä solulinjoissa määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä.

(A) Cell kasvu määritettiin CCK-8-määritys, kuten on kuvattu § 2. tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmen erillisen kokeen. (B) (ylempi paneeli) H1299 ja A549-soluja transdusoitiin siRNA valvontaa, CARMA3 tai Bcl10 alistettiin pesäkemuodostusta. (Alempi paneeli) Histogrammi kvantifiointi. Virhe palkit osoittavat ± SD (* p 0,05, ** p 0,01).

(ylempi) CARMA3 ja Bcl10 siRNA hoito esti mitattavissa soluinvaasiota molemmissa solulinjoissa (200 x). (Alempi) Pylväsdiagrammi osoittaa keskimääräistä ja ero solujen määrä keskuudessa valokuvia, ja standardipoikkeama laskettiin keskiarvo solujen 10 kenttää (**, P 0,01).

Matrigel invaasiomääritys

Solun invaasiomääritys suoritettiin käyttäen 24-kuoppaista TranswellTM kammio, jonka huokoskoko 8 pm (Costar, Cambridge, MA). Insertit päällystettiin 20 ul: n kanssa Matrigeliä (1:03 laimennus, BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut trypsinoitiin ja 3 x 10

5 solua 100 ul: ssa seerumia siirrettiin ylempään Matrigel kammioon ja inkuboitiin 16 tunnin ajan. Inkubaation jälkeen ei-hyökkäsi solujen ylemmän kalvon pinnan poistettiin puuvilla kärki, ja solut, jotka suodattimen läpi kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja värjättiin hematoksyliinillä. Lukumäärä tunkeutuneet solujen laskettiin 10 satunnaisesti valittua HPF mikroskoopilla. Tämä koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Cell Cycle Analysis

Solut (500000) ympättiin 6 cm: n kudosviljelymaljoihin. 12 tunnin kuluttua inkubaation, solut transfektoitiin osoitetuilla määrillä siRNA. Solut kiinnitettiin 75% etanolilla 48 h transfektion jälkeen, pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja värjättiin 5 mg /ml propidiumjodidia PBS: ään lisättynä RNaasi A: lla (Roche, Indianapolis, IN) 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa . Tiedot kerättiin käyttämällä BD järjestelmiä.

lusiferaasimäärityssysteamiä

Solut aluksi transfektoitu CARMA3, Bcl10 tai negatiivinen kontrolli siRNA 24 h; Sitten solut ko-transfektoitiin 500 ng PNF-kB-Luc reportteriplasmidilla, ja 100 ng Renilla lusiferaasiplasmidin 24 tuntia. Soluja käsiteltiin 30 min ajan tai ilman EGF: ää (100 ng /ml), ja sitten hajotettiin; lusiferaasin aktiivisuus määritettiin dual-lusiferaasireportteri- määritystä (Promega, Madison, WI, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. NF-kB-aktiivisuus arvioitiin kun normalisointia tulikärpäsen lusiferaasin aktiivisuuden Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena kolmen erillisen kokeen.

Tilastollinen analyysi

SPSS versio 16.0 for Windows käytettiin kaikissa analyyseissä. Chi-neliö testiä käytettiin tutkimaan mahdollisia korrelaatioita CARMA3 ilmaisun ja ennusteeseen viittaavia tekijöitä. Kaplan-Meier -käyrät käytettiin selviytymisen analyysin ja log-rank määritettiin perustuen eroja. Studentin t-testiä käytettiin vertaamaan muita tietoja. p-arvot perustuvat kaksipuolinen tilastollinen analyysi, ja p 0,05 katsottiin osoittavan tilastollista merkittävyyttä.

(A) (ylempi) H1299 ja A549-soluja käsiteltiin CARMA3 erityisiä siRNA 48 h . Seuraavaksi solut otettiin talteen ja käsiteltiin RNaasi, ja värjättiin PI. Solusyklin jakautumisen analysoitiin virtaussytometrialla. (Alempi) solujen prosenttiosuus G1, S, G2 vaihe histogrammit. (* P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001) verrattuna kontrolliryhmään. Tulokset edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen. (B) H1299 ja A549-soluja käsiteltiin CARMA3 erityisiä siRNA: ssa 48 tuntia. Solulysaatit altistettiin immunoblottauksella analyysin avulla osoitti vasta-aineita.

(A) H1299 ja A549-soluja transfektoitiin ohjaus- tai CARMA3-spesifinen siRNA: ssa 24 tuntia, sitten käsiteltiin NF-KB-lusiferaasi ja ohjaus

Renillaa

toimittaja plasmideja 24 tuntia. Soluja käsiteltiin tai ilman EGF: ää (100 ng /ml) ennen sadonkorjuuta, ja tuloksena NF-KB: n induktion mitattiin laskemalla lusiferaasi /

Renilla

suhde. Data (mean_S.E.) Ovat vähintään kolmen erillisen määrityksen. (** P 0,01) (B) H1299 ja A549-solut transfektoitiin siRNA-allas kohdistaminen CARMA3 48 h, sitten käsiteltiin EGF: ää (100 ng /ml) ja osoitettujen ajanjaksojen ajan. Kokosoluliuotteista valmistettiin näistä soluista ja alistetaan sitten immunoblottauksella analyysi osoitti vasta-aineilla.

Tulokset

kliininen merkitys CARMA3 Protein Expression NSCLC Kudokset

Analyysissa proteiinin ekspressiotasot CARMA3 käyttäen immunohistokemiaa 91 NSCLC yksilöitä ja niitä vastaavat normaalit kudokset. CARMA3 havaittiin ilmentyvät pääasiassa sytoplasmisessa osastossa. Normaali keuhkoputken epithelia näytteille negatiivinen tai heikko CARMA3 värjäytymistä (Fig. 1 E), kun taas CARMA3 värjäytyminen oli merkittävästi vahvempi keuhkosyöpä kudoksissa. Löysimme kohtalaisesta suureen CARMA3 värjäystä 69% keuhkosyöpä yksilöt (Fig. 1A ja C). Käytämme myös western-blottauksella ekspression analysoimiseksi CARMA3 18 cases.The tulokset osoittavat, että 56%: n keuhkosyöpä näytteet osoittavat, kohtalainen tai suuri CARMA3 ilmentymistä (kuvio S2, S3).

korrelaatio CARMA3 ilmaisun ja clinicopathologicfactors NSCLC on esitetty taulukossa 1. CARMA3 yliekspressio osoitti merkittävää korrelaatiota TNM (P = 0,022) ja kasvaimen tila (P = 0,013), mutta mitään korrelaatiota ei havaittu koskevat ikä, sukupuoli, erilaistuminen, imusolmukemetastaaseja ja kasvainhistologiaa. Paremmin vaatia korrelaatio CARMA3 keuhkosyöpä etenemistä, arvioimme suhde ilmentymisen CARMA3 ja eloonjäämisaste N0 vaiheessa pienisoluista keuhkosyöpää (38 CAMRA3 + ja 16 CAMRA3 -). Sen jälkeen Kaplan-Meier selviytymisen analyysi, huomasimme, että potilailla, joilla on alhainen ilmaus CARMA3 oli tilastollisesti merkitsevä elinajan pitenemiseen (mediaanielinajassa = 32 ± 3,80 kuukautta; 95%: n luottamusväli +24,56-+39,44kuukausi) kuin ne, joilla on korkea ilmentymisen CARMA3 (mediaanielinajassa = 20 ± 3,91 kuukausi; 95%: n luottamusväli +12,33-+27,67kuukautta; P = 0,042; kuvio S4).

raportoi äskettäin, tutkimus osoitti, että CARMA3 ilmaisua tarvitaan EGFR indusoi NF-KB: n aktivaation [15]. EGFR yli-ilmentyminen on osoitettu monissa ihmisen syövissä, mukaan lukien keuhko-, paksusuoli-, haima-, rinta-, munasarja-, virtsarakko-, munuais-, ja hermoston [19], [20]. Siten tutkimme suhdetta CARMA3 ilmaisun ja EGFR asema NSCLC. Olemme havainneet, että EGFR: ää ilmentyy solukalvossa ja sytoplasminen. Merkittävä korrelaatio CARMA3 ilmaisun ja ilmentyminen EGFR havaittu (P = 0,009) että NSCLC näytteet (taulukko 1 ja kuvio. 2A-D). Sen määrittämiseksi, onko EGFR mutaatio korreloi koholla CARMA3 ilmaisu, tutkimme suhdetta CARMA3 ilmaisun ja EGFR-mutaatio. Käytimme EGFR-mutaatio havaitseminen pakki, ja löysi 16 75 kasvaimen näytteistä oli positiivisia EGFR-mutaatio (taulukko S2). Niistä 16 tapausta, 87,5% esillä positiivinen CARMA3 ilme, paljon korkeampi verrattuna ei-mutaation tapauksessa (66,1%). Huomasimme, että 86,67% EGFR myönteinen mutaatio tapauksissa myös näytteillä positiivinen CARMA3 lauseke (Fig. 2E ja F).

CARMA3 Auttaa Keuhkosyöpä Cell Growth ja Invasion

Ensin tarkasteltiin ilmentymisen CARMA3 useita keuhkosyövän solulinjat, kuten on esitetty kuviossa. 3B, H1299, A549, BE1 näytteillä korkea ekspressiotasot CARMA3 taas normaali keuhkoputken epiteelin (HBE) solut, LK2, ja LH7 esillä alemmilla CARMA3 ilmaisua. SPC, H157, ja H460 kohtalainen tasoja CARMA3 ilmaisun.

Seuraava palveluksessa RNA-interferenssi lähestymistapa onko CARMA3 ja CBM monimutkainen (CARMA3-Bcl10-MALT1) on rooli syöpäsolujen kasvua. CARMA3 ja Bcl10 ekspressiotasot olivat muuttumattomat, kun väliaikaisen transfektion kanssa negatiivisen kontrollin siRNA, kun taas CARMA3- tai Bcl10-spesifisiä siRNA merkittävästi tukahdutti sekä mRNA: n sekä proteiinin ilmentymisen tasot H1299 ja A549-solulinjoja (Fig. 3A ja kuvio. S1 ). Seuraavaksi tutkimme solujen kasvua. Kanssa CARMA3 tai Bcl10 siRNA, H1299 soluilla kasvunopeus laskee verrattuna negatiiviseen kontrolliin (Fig. 4A). Samanlainen kuin H1299-soluissa, havaitsimme, että pudotus on CARMA3 tai Bcl10 vähensi myös kasvu A549-solut (Fig. 4A). Olemme käytetään riippumaton menetelmä, pesäkkeiden muodostumisen määritykset, validoimiseksi antiproliferatiivisia vaikutuksia CARMA3 tai Bcl10 eston keuhkosyövän soluja. CARMA3- tai Bcl10 kohdistamisen siRNA johti selvään vähentämiseen pesäkemuodostuksen kapasiteetti kaksi testattu keuhkosyövän solulinjat vertailuryhmän siRNA-käsitellyt solut (Fig. 4B). Nämä menettämisestä toiminnon tutkimukset osoittivat, että CARMA3 ja CBM siRNA voisi estää kasvaimen solujen lisääntymistä verrattuna merkityksetön sinc. Edelleen tutkia CARMA3 ja Bcl10 edistää invasiivisia ominaisuuksia ei-pienisoluisen keuhkosyövän soluja, teimme matrigeeliä hyökkäystä määrityksissä. Tuloksemme osoittivat, että invasiivisia ominaisuuksia CARMA3- ja Bcl10-pudotus H1299 syövän solut väheni verrattuna negatiivisen kontrollin solut (Fig. 5). Samoin knockdovvn CARMA3 tai Bcl10 A549-soluissa vähensi myös invasiivisia ominaisuuksia näiden solujen (Fig. 5). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että CARMA3 ja CBM monimutkaisia ​​ovat positiivisia sääntelyviranomaisten soluinvaasiota.

CARMA3 Poisto Results in G1 pidätys ja kasvunestomenetelmää keuhkosyöpään Cells

Cell kaarianalyysien fluoresenssilla solulajittelulla (FACS) suoritettiin syöpäsolujen kanssa tai ilman CARMA3-pudotus, ja olemme havainneet, että solujen prosenttiosuus G1 faasi kasvoi ja solujen S-faasi väheni solujen CARMA3-pudotus verrattuna kontrollisoluihin (kuvio. 6). Nämä tulokset viittaavat siihen, että CARMA3 poistetaan indusoi solusyklin pysähtymisen G1 /S rajan. Tutkia taustalla oleva mekanismi induktion solusyklin pysähtymisen, testasimme vaikutus CARMA3-pudotus on sykliini A, sykliini D1, sykliini D3, CDK4, CDK6, P27, ja P-Rb tasolle. Kuten on esitetty (kuvio 6 B), Western blot-analyysi osoitti, että pudotus on CARMA3 vähensi proteiinin tasot sykliini D1, CDK4, CDK6, ja P-Rb, mutta lisäsi tasolla p27. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että esto CARMA3 ilmaisun indusoi solukierron pysähtymisen G1 vaiheessa ja tukahduttaa keuhkosyövän solujen kasvua.

vastustamisesta CARMA3 Estää p-IKB ja NF-KB: n aktivaatio

sen määrittämiseksi, onko CARMA3 välittää EGF-stimuloidun NF-KB: n aktivaation keuhkosyövän soluja, käytettiin H1299 ja A549-soluja. Solut, jotka oli tehty CARMA3 siRNA käsittely esillä NF-KB: n eston in läsnä ollessa tai ilman EGF. Vastaavasti tuloksemme osoittivat, että siRNA-välitteinen Bcl10-knockdown esti NF-KB lusiferaasiekspressio (Kuva7 A). Tutkimuksemme tulokset osoittavat selvästi olennainen rooli CARMA3-Bcl10-MALT1 signalointikompleksiin in EGF-indusoidun NF-KB keuhkojen syöpäsoluja. Edelleen todentamiseksi rooli CARMA3 ilmentymisen EGF-indusoidun NF-KB: n aktivaation syöpäsoluissa, H1299-solut ja A549-solut oli transdusoitu CARMA3 siRNA stimuloitiin EGF. Havaitsimme saarto kyky EGF aiheuttaa p-IKB samanaikainen knockdovvn CARMA3, mutta EGF aiheuttama IKK fosforylaatio ei vaikuta CARMA3-vajaiden solujen. Lisäksi CARMA3 knockdown ei heikentänyt EGF aiheuttama fosforylaatiota ERK (Kuva7 B). Yhdessä tuloksemme osoittavat, että CARMA3 kautta IKB fosforylaatio, välittää EGF-indusoidun NF-KB keuhkojen syöpäsoluja.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa arvioimme ekspressiokuviota ja biologiset roolia uuden telineen proteiini CARMA3 ihmisen NSCLC. Tuloksemme osoittivat, että CARMA3 proteiinin ilmentyminen keuhkosyövässä kudoksissa on suurempi kuin vastaavassa normaalissa keuhkojen kudoksiin. Proteiinitasolla, CARMA3 ilmentyminen rajoittui sytoplasmaan kaikissa näytteissä. Löysimme merkittävä korrelaatio CARMA3 ylössäätöä ja molemmat TNM ja kasvaimen tila. Lisäksi osoitimme, että CARMA3 ylössäätöä korreloi myös lyhyemmällä eloonjäämisaste potilaiden imusolmukestatuksesta N0 sekä EGFR tila. CARMA3 on aiemmin osoitettu olevan keskeisessä asemassa EGFR aiheuttama NF-KB: n [18]. EGFR-mutaatio on korreloi merkitsevästi koholla EGFR, sen loppupään signalointi, ja kliininen vaste gefitinibiä [21]. Niinpä vielä tarkasteltava suhdetta CARMA3 ilmaisun ja EGFR-mutaatio. Olemme havainneet, että ilmaus CARMA3 on merkittävästi suurempi EGFR mutaatio tapauksissa verrattuna ei-mutaation tapauksessa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että CARMA3 voi olla tärkeä rooli EGFR-mutantti keuhkosyöpä. Tuoreessa raportissa osoitettiin, että knockdown useiden komponenttien NF-kB-reitin nimenomaan parantaa solukuolemaa aiheuttama EGFR TKI erlotinibin EGFR-mutantti keuhkosyövän soluihin [22]. Koska yli-ilmentyminen CARMA3 proteiinien indusoi vankka NF-kB aktivaation [3], [4], CARMA3 ja NF-kB voi olla potentiaalinen kumppani lääkekohteita yhdessä EGFR EGFR-mutantti keuhkosyöpää.

CARMA3 on ollut raportoitu edistää munasarjasyöpäsolu etenemisen [17], kasvattaa ihmisen rinta- syöpäsolujen kasvua ja invaasiota [18], aiheuttaa hyökkäys suun okasolusyöpä (OSCC) [23]; CARMA3 myös tärkeä rooli aterogeneesissä [24] ja NF-kB aktivaation hengitysteiden epiteelisoluissa [25]. Kuitenkin toiminnallinen rooli on edelleen epäselvä. Valaista biologisen toiminnan CARMA3 keuhkosyövän, käytimme siRNA on pudotus CARMA3 ilmentymistä sekä A549 ja H1299 solulinjat, jotka ilmentävät korkeita CARMA3. Havaitsimme heikentynyt leviämisen määrä kumpaankin A549 ja H1299 solujen jälkeen CARMA3 knockdown. Knockdovvn Bcl10, joka on toinen komponentti CBM monimutkainen, myös alentunut soluproliferaatiota. Siten CARMA3 siRNA knockdown mahdollisesti heikentää pahanlaatuinen solujen lisääntymistä kautta tuhoaminen CARMA3-Bcl10-MALT1 monimutkainen. Useimmat proliferatiivinen tekijät vaikuttavat solujen kasvua vaikuttamalla solusyklin etenemisen. Tässä tutkimuksessa, solusyklin analyysit paljastivat, että solujen prosenttiosuus G1 faasi kasvoi, kun taas solujen prosenttiosuus S faasi väheni CARMA3-knockdown-soluja verrattuna kontrollisoluihin. Knockdovvn CARMA3 estyy G1 S siirtyminen solusyklin etenemisen, mikä viittaa rooliin CARMA3 keuhkosyövässä solujen lisääntymisen. Solusyklin etenemisen moduloidaan määrä molekyylejä. Voit selvittää mahdolliset mekanismia CARMA3 koskevat solukierron säätelyssä, tutkimme vaikutus CARMA3 Knockdown solusyklin liittyviä molekyylejä. Analysoimme tasot sykliini A, sykliini D1, sykliini D3, CDK4, CDK6, p-Rb, ja P27 ja havaitsi, että pudotus on CARMA3 vähensi proteiinin tasot sykliini D1, CDK4, CDK6, ja P-Rb, mutta nostivat p27. Sykliini D1, joka ohjaa etenemistä solujen proliferatiivisen vaiheissa solusyklin, on tärkeä rooli kasvainten synnyssä. Sykliini-D /CDK4, 6 /pRB reitin on aiemmin osoitettu muuteta yli 80% ihmisen kasvaimista [26], [27]. Se on keskeinen säätelijä kriittinen G1 S-vaiheeseen siirtymistä solusyklin. Aikana G1 vaiheen, pRB inaktivoituu peräkkäin fosforylaation välittämiä tapahtumia eri sykliiniriippuvaisten kinaasien (CDK: t), mikä vapauttaa E2F transkriptiotekijöiden, aktivointi monien geenien ja etenemistä solusyklin [28]. Sykliiniriippuvaisen kinaasi-inhibiittorin p27 (myös nimeltään Kip1) on kasvua inhiboiva proteiini, joka estää solusyklin etenemistä on G1 /S-siirtymä [29]. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että CARMA3 ohjaa solusyklin säätelemällä sykliini D1, CDK4, CDK6, p-Rb, ja p27.

On käynyt yhä selvemmäksi, että NF-KB signalointi on kriittinen rooli syövän kehittymistä ja etenemistä [30] – [34]. Tuloksemme osoittavat edelleen suora yhteys CARMA3 ja NF-KB: n aktivoitumisen. Muutos solusyklin etenemisen jälkeen CARMA3 Knockdown on mahdollisesti liittyvät NF-KB. NF-KB on tehty lukuisia lääkealan tutkimuksen tutkimuksia kohteena syövän hoitoon. Estää NF-KB: n mahdollisesti pidättää kasvainsolujen proliferaatiota ja aiheuttaa apoptoosia, tai parantaa herkkyyttä toiminnan syöpälääkkeitä. Tämä tutkimus osoitti, että CARMA3 Knockdown estää NF-KB: n aktivoitumisen, mikä estää keuhkosyöpä etenemistä ja viittaa mahdolliseen merkitykseen tämän havainnon uusille syövän hoitomuotoja.

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpäkuolemista yhdysvalloissa ja maailmanlaajuisesti. Suurimmat muoto keuhkosyöpä on NSCLC [35] .Despite etenee varhainen havaitseminen ja tavallinen hoito, NSCLC diagnosoidaan usein edennyt pitkälle ja on huono ennuste. Tutustu arvokasta biomarkkereiden havaitsemiseksi NSCLC alkuvaiheessa voi parantaa selviytymistä merkittävästi. Nyt on olemassa monia potentiaalisesti hyödyllisiä biomarkkereita keuhkosyöpä on vahvistettu, kuten CEA, CA-125, CYFRA 21-1, TPA [35] – [39]. Yhä useammat uusia potentiaalisia biomarkkereita keuhkosyöpä on löydetty, kuten VAS, DDH, EGFR, Mig-6 [40] – [43]. Tässä tutkimuksessa löydämme CARMA3 kuin toisen potentiaalisesti käyttökelpoinen biomarkkeri keuhkosyöpään. Tunnistettujen biomarkkerit johtavat enemmän ymmärrystä molekyyli reittejä mukana keuhkosyöpää ja auttavat vähentämään kärsimystä ja ihmishenkien menetyksiä aiheuttama tappava tauti [44].

Yhteenvetona Tutkimuksemme osoitti, että CARMA3 on